8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

1/21

UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE PROTECIA MEDIULUIDOMENIUL: INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE

PROGRAMUL DE STUDIU: SIGURAN I SECURITATE AGROALIMENTAR

METODE OPTICEI CROMATOGRAFICE NINDUSTRIA ALIMENTAR

MASTERAND:

DULU F. GEORGIANA-FLORINA

ORADEA

2014

COORDONATORTIINIFICEF LUCR. DR. ING. CHI ADRIANA

DETERMINAREA OCHRATOXINEI A DIN CAFEA BOABEPRIN METODA HPLC

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

2/21

INTRODUCERE

Cafeaua este o buturde culoare neagr ce coninecofeincare se obinedin boabe de cafeaprjiteimcinateconinndvitaminaPP (acid nicotinic sau niacin). Genul Coffea cuprinde circa 60 speciidin care cea mai importantdin punct de vedere economic dar care estecrescuticaplantde interior este Coffea arabica.

Arborele de cafea (Coffea arabica) este un arbore tropical cufrunzi persistent originar din zona tropical a Africii, Madagascar i

insulele Oceanului Indian unde poate atinge nlimidepnla 56 m,ca plant de interior nlimea poate fi de 1,5 - 2,5 m. Frunzele auformascuitoval, sunt de culoare verde nchis iau margineaondulat.

Flor i leauformstelatiapar la baza frunzelor. Arborele decafea nflorete pe la mijlocul verii, f lorile sunt albe i intens

parfumate. Din aceste flori apar f ructele, care sunt bace de mrimeaunor viine. Fructele ajung la maturitate n 7 - 9 luni culoarea lor fiindrou stacojiu. Bacele conin de regul dou semine(boabe de cafea).

Concentraian cofeineste de 0,8 - 1,4%.Calitatea cafelei e influenat i de locul de cultivare,

depozitare iprjirea boabelor de cafea.

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

3/21

Compoziia chimic a cafelei

ap 2-3 % substane azotate 5 % substane grase 8-15 % zaharuri: zaharoz 6,5 %, glucoz 0,7 %,fructoz 0,3 % acid nicotinic 10-17 % acid glutamic 17,6 % cafein 0,9-2 % acizi aminai acizi organici acizi clorogenici compui sulfurici

Tipur i de cafea

sruri minerale: Ca 2,8 mg, Fe 1,8 mg,P 9 mg, Na 40 mg, K 10 mg, Mg 8 mg.

CafeinaFormul structural

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

4/21

Efecte pozitive

substanele antioxidante din cafeaprotejeazcelulele renale reduce incidenabolilor cronice de ficat influeneaz secreia gastric i ritmulrespirator rol important n stimularea arderii

grsimilordin organism efect pozitiv i n boala Parkinson sauAlzheimer.

Efecte negative tahicardie, nelinite, tremor, nervozitate,

stridepanic,insomnie, convulsii, anemie, ostare uoar de dependen, n lipsa cafeleipot sapardureri de cap.

Procesul tehnologic de obinere a cafelei

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

5/21

DETERMINAREA OCHRATOXINEI A DIN

CAFEA BOABE PRIN METODA HPLC

Ochratoxina A este un metabolit toxicprodus de specii din genul Aspergillus nzonele tropicale i subtropicale i de speciidin genulPenicillium n zonele temperate.

Ochratoxina A a fost izolat pentru

prima dat din culturi de Aspergillusochraceus de Van der Merwe i colab. nanul 1965 n timp ce testau capacitateatoxigen a unor tulpini de micromiceiizolate din diferite boabe de cereale ilegume.

F igura nr. 1 Ochratoxina Astructura chimic

Penicillium verrucosum este izolat frecvent din probe de cereale n timp ceA. ochraceus contamineazboabele verzi de cafea, condimentele, boabele de cacao, soiaiarahide.

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

6/21

ScopValidarea metodei de determinare a ochratoxinei A pri n cromatograf ie de li chide de nalt

performan(HPLC) iaplicarea acesteia pe probe de cafea boabeprjit.

Material imetodProbele de cafea au fost supuse extraciei cu un amestec de metanol i bicarbonat de sodiu,

CH3OH: NaHCO

3 (80:20). Extractele au fost purificate prin extracie n faz solid (C18) pentru

reinereaochratoxinei A. Micotoxina a fost eluatcu cloroform; faza organica fost evaporatla seciapoi, reziduul reluat cu 0,6 ml fazmobil. Un volum de 20 la fost supus analizei HPLC.Analizas-a realizat pe un cromatograf de lichide tip HP 1090 Series II, echipat cu o coloancromatografictip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m),folosind ca fazmobilun amestec de acetonitril:ap : acid acetic (99 : 99 : 2). Detecia ochratoxinei A s-a realizat n fluorescen(ex=228 nm iem=423 nm).

DiscuiiAceast lucrare contribuie la evaluarea prezeneiochratoxinei A n produsele al imentare

(cafea boabe) comercializate n Romnia iatrage ateniaasupra ri sculu i consumulu i de alimentecontaminate cu micotoxine.

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

7/21

Material i metod balan; baie de ultrasunete; micro-sering Hamilton; HP 1090 Series II lichid cromatograf echipat cu detector cu multidiode UV-VIS idetector de fluorescen; coloan cromatografic tip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m); standard ochratoxin A (Sigma-Aldrich); coloane SPE C18 (Lida, manufacturing corp.); hrtie de filtru cantitativ (Schleicher & Schuell MicroScience); acetonitril (puritate HPLC, gradient grade, Riedel de Han); cloroform (puritate HPLC, Sigma Aldrich); metanol ChromasolvR (puritate HPLC, Riedel de Han) acid acetic glacial 99,99% (Sigma Aldrich); sulfat de sodiu (A.C.S. reagent, Sigma Aldrich); ap (puritate HPLC, Merck); faz mobil: amestec acetonitril : ap : acid acetic (99: 99: 2).

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

8/21

Mod de lucru - Extraciaochratoxinei A ipurificarea extractului

Probele de analizat (cafea boabe prjit-vrac) au fost supuse extraciei n vedereaseparriiochratoxinei A. 20 g prob mrunit se agit 20 minute cu un volum de 20 ml amestecCH3OH : NaHCO33% (80 : 20); se filtreazprin hrtie de filtru cantitativ;

filtratul se trece prin coloana SPE (precondiionat prin splare succesiv cu 4 mlmetanol, respectiv cu 4 ml appurificat); ochratoxina A este eluatde pe coloancu un volum de 3 ml cloroform; faza organicse evaporla sec; reziduul obinutse reia cu un volum de 0,6 ml fazmobilise supune analizei HPLCprin injectarea unui volum de 20 ln condiiilemenionate.

Analiza HPLC s-a realizat astfel: un volum de 20 lproba fost supus analizei pe uncromatograf de lichide tip HP 1090 Series II, echipat cu o coloancromatografictip StableBond SB C18, folosind ca faz mobil un amestec de acetonitril : ap : acid acetic(99 : 99 : 2).

Deteciaochratoxinei A s-a realizat n fluorescen(ex= 228 nm iem = 423 nm).

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

9/21

Rezultate idiscuiiSpecificitateaPentru determinarea specificitii metodei au fost analizate probe coninnd

ochratoxina A ioprobconinndfaza mobilca solvent al probelor injectate. La timpulde retenie al ochratoxinei A nu s-a obinut nici un semnal n cromatogramacorespunztoarefazei mobile, rezultdeci faptul cnu existinterfereni.

Identificarea picurilor

Identificarea picului corespunztorochratoxinei A se realizeazn funciede timpul deretenie. n condiiilemenionate,timpul de reteniepentru ochratoxina A este de 9,5 min.n figura nr 2 esteprezentatcromatograma pentru soluiastandard de ochratoxinA.

Figura nr. 2 Cromatograma pentru soluia standard de ochratoxin A

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

10/21

VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A OCHRATOXINEI A PRIN

CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN (HPLC)

Metoda de analiz prin HPLC prezentat a fost validat, urmrindu-se urmtoriiparametri: stabilitatea n timp a soluiei, linearitatea, limita de detecie i limita decuantificare, precizia sistemului, precizia metodei, exactitatea metodei.

Stabilitatea soluieiPentru a determina stabilitatea soluieide ochratoxinA a fost analizato probcu o

concentraiede 19,5 ng/ml ochratoxinA dupce a fost meninutla temperatura camerei 2,3 i10 zile. Rezultatele experimentale sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Stabilitatea soluiei

n concluzie, probele n faz mobil coninnd ochratoxin A pot fi stocate latemperatura camerei cel puin 10 zile, fr a aprea degradarea acestui compus, avnd nvedere faptul c aria picului corespunztor ochratoxinei A este aproximativ constant (n

acest caz, deviaiastandard relativavnd valoarea de 4,1230%).

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

11/21

Linearitate, limita de detecieilimita de cuantificarePentru studiul lineritii au fost analizate ase serii de soluii, pentru fiecare

cromatogram a fost calculat aria picului corespunztor ochratoxinei A, iar valoarea ariei

medie a fost reprezentatgrafic funciede concentraie. Prin analizstatisticau fost calculateecuaia dreptei de regresie, coeficientul de corelaie (r) i eroarea standard de regresie.Folosind panta dreptei de regresie i eroarea standard a acestei drepte s-au calculat valorilelimitei de detecieia limitei de cuantificare.

n tabelul nr. 2 sunt prezentate ariile picurilor corespunztoareochratoxinei, iar n figuranr. 3 este reprezentatdreapta de calibrare a ochratoxinei A.

Tabelul 2.Ariile picurilor ochratoxinei A obinute n studiul linearitii metodei

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

12/21

Deoarece cantitatea de ochratoxinA din probe este mic,ecuaiacurbei de calibrare afost calculatpentru concentraiicuprinse ntre 9,765625 i39,0625 ng/ml.

F igur a nr. 3 Dreapta de cali brare a ochratoxinei A

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

13/21

Dupcalculul statistic s-a obinutecuaiacurbei de calibrare:

Arie pic = 1,0750780952381 x concentraia+ 7,325Valoarea coeficientului de corelaie (r) este 0,9983 iar eroarea standard a curbei deregresie (SE) este 1,3229431474665. Folosind aceste valori s-au calculat limita de detecie(LD) ilimita de cuantificare (LQ) cu formulele (1) i(2):

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

14/21

Precizia iexactitateaPrima etapn determinarea preciziei o reprezintstudiul preciziei sistemului. Astfel, o

soluie de concentraie de 20 ng/ml a fost analizat de cinci ori. Ariile picurilorcorespunztoareochratoxinei A pentru cele cinci determinrisunt prezentate n tabelul nr. 3.

Tabelul 3.Ariile picurilor corespunztoare ochratoxinei A pentru cele cinci determinri

Pentru aceste valori, deviaia relativ standard (RSD %) a fost calculat ca fiind8,6912%.

Pentru concentraii n prob de ordinul ng, valoarea este bun, deci sistemul esteprecis.

Precizia i exactitatea metodei au fost determinate prin calcularea valorii medii a 3determinrila trei concentraiidiferite n jurul valorii de interes 39.0625 ng/ml, 19.53125

ng/ml irespectiv, 9.765625 ng/ml (concentraiaurmrit50%).

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

15/21

Utiliznd ecuaiacurbei de calibrare iariile picurilor au fost calculate concentraiilepentrufiecare prob. A fost determinat regsirea ca procent din valoarea concentraiei teoretice,

regsirea medie i precizia metodei exprimat prin deviaia standard relativ din regsireacalculat.Pentru aceste dougrupuri de date (I iII), valorile obinutesunt prezentate n tabelul nr. 4.

Tabelu l 4. Ar ii le picur il or ochratoxinei A pentru grupul de date I i II

Dupprelucarea statistica ambelor seturi de determinria rezultat o valoare de 16,9629 % adeviaieistandard relative ceea ce demonstreazprecizia metodei; regsireamedie fiind de 99,2%(pe intervalul 61,6126,1%), ceea ce demonstreazexactitatea metodei.

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

16/21

APLICAIE LA DETERMINAREA OCHRATOXINEI ADIN PROBE DE CAFEA BOABE PRJT

Metoda de analizvalidata ochratoxinei A prin HPLC a fost aplicatla determinareaochratoxinei A din probe de cafea boabe.Probele au fost procurate din unitice comercializeazproduse vrac. S-au analizat 40

de probe de cafea boabeprjit,de diferite sorturi (Columbia10 probe, Jacobs10 probe,Indonezia 8 probe, Brazilia 4 probe, Robusta 2 probe, India 1 prob, cafeadecofeinizat5 probe).

n urma analizei prin HPLC, cromatogramele obinuteau fost prelucrate, stabilindu-searia picurilor corespunztoare ochratoxinei A i, folosind ecuaia dreptei de regresie, s-acalculate coninutuln ochratoxinA pentru probele de cafea (valori prezentate n tabelul 5).

Tabelul 5. Coninutul n ochratoxin A

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

17/21

Figura nr.4 Dou dintre cromatogramele obinute la analiza probelor de cafea boabeprin metoda HPLC

Din analiza datelor obinute n urma determinrii ochratoxinei A din cele 40

probe de cafea boabeprjit,s-a constatat cntr-o singurprob(2,5% din numrultotalde probe) ochratoxina A este prezent ntr-o cantitate mai mare dect limita maximadmisde legislaian vigoare (5 g/kgcafea boabeprjit); n 5 probe (2,5% din numrultotal de probe) ochratoxina A se gseten concentraiisub limita maximadmis,iar ntr-un numr de 34 probe (85% din numrul total de probe) ochratoxina A nu a fostidentificatprin metoda aplicat.

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

18/21

CONCLUZII

Metoda corespunde parametrilor de validare i a fost aplicat cu bune rezultate la

determinarea ochratoxinei A din probele de cafea boabeprjit.Aceast lucrare contribuie la evaluarea prezenei ochratoxinei A n produsele

alimentare (cafea boabe vrac) comercializate n Romnia.Avnd n vedere consumul crescut de cafea n rndul populaieiadulte este necesar

adoptarea unor msurin vedereaprotejriisntiiconsumatorului, o msurimportantfiind evitarea comercializriiproduselor cu un nivel ridicat de contaminare cu ochratoxin

A.n urma anal izei HPLC s-au obinuturmtoareler ezul tate:Din cele 40 de probe analizate: n 5 probe (12,5% din numrul total de probe),

ochratoxina A a fostprezentsub limita maximadmisde legislaian vigoare (5 g/kgcafea boabeprjit),ntr -o singurprobconcentraiaochratoxinei A a fost peste limitamaximadmisA iar n 34 de probe (85% din numrultotal probe) ochratoxina A nu afost identificatprin metoda aplicat.

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

19/21

ARTICOLE TIINIFICE PRELUATE DIN REVISTE DESPECIALITATE CARE SE REFER LA APLICAREA METODEI

DETERMINAREA OCHRATOXINEI A (HPLC)

Opinion of the Scienti fi c Panel on contaminants in the food chain

[CONTAM ] related to ochratoxin A in food

Sursa: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/365.htm

http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/365.htmhttp://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/365.htm

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

20/21

Code of practice for the prevention and r eduction of ochratoxin A contamination in coff eeCAC/RCP 69-2009

Sursa: http://www.codexalimentarius.org/search-results/?cx=018170620143701104933%3Ai-zresgmxec&cof=FORID%3A11&q=ochratoxin+a&siteurl=http%3A%2F%2Fwww.codexalimentarius.org%2F&siteurl=www.codexalimentarius.org%2F&ref=www.google.ro%2Furl%3Fsa%3Dt%26rct%3Dj%26q%3D%26esrc%3Ds%26source%3Dweb%26cd%3D1%26ved%3D0CDEQFjAA%26url%3Dhttp

%253A%252F%252Fwww.codexalimentarius.org%252F%26ei%3DBIDSUtiPL8va0QWgyIDQAg%26usg%3DAFQjCNE0-M9lFhfnmeh-

UF8gaKEYMh6R_g%26bvm%3Dbv.59026428%2Cd.Yms&ss=1993j443057j12&sa.x=0&sa.y=0

8/10/2019 Determinarea Ochratoxinei a Din Cafea Boabe

21/21

afeaua este o butur apreciat de milioane de oameni din toat lumea