Delia_Alexa_licenta_11

CANCERUL DE PIELE - SARCOMUL KAPOSI

FACULTATEA DE BIOLOGIE SPECIALIZAREA BIOCHIMIE

LUCRARE DE LICEN


Coordonator tiinific, Conf Dr Elena Ionic

Absolvent: Delia Ni20111


CuprinsCuprins..............................................................................................................................................2 CAPITOLUL 1: CANCERUL DE PIELE - SARCOMUL KAPOSI...............................................4 1.1 Clasificarea cancerului................................................................................................................4 1.2 Aspecte ale morfologiei cutanate................................................................................................6 1.3 Cancerul de piele noiuni introductive.....................................................................................6 1.4 Tipuri de neoplazii cutanate........................................................................................................8 1.5 Sarcomul Kaposi.........................................................................................................................9 1.6 Semne, simptome, diagnostic, tratament...................................................................................12 Semne i simptome.....................................................................................................................12 Manifestrile cutanate:................................................................................................................13 Manifestri oculare:....................................................................................................................13 Manifestri gastrointestinale:......................................................................................................14 Manifestrile pulmonare:............................................................................................................14 Diagnostic...................................................................................................................................14 Studii de laborator: .................................................................................................................14 Studii imagistice:.....................................................................................................................15 Tratament................................................................................................................................15 CAPITOLUL 2: HISTOLOGIA SARCOMULUI KAPOSI SI MARKERII IMUNOHISTOCHIMICI................................................................................................................19 2.1. Histologia sarcomului Kaposi..................................................................................................19 2.2. Markerii imunohistochimici in sarcomul Kaposi.....................................................................23 2.2.1 Markeri vasculari/endoteliali ............................................................................................24 2.2.2. Markeri musculari ............................................................................................................25 2.2.3. Markeri epiteliali...............................................................................................................26 2.3. Patogeneza Sarcomului Kaposi ( KS)......................................................................................29 2.3.1. Dereglarea imunitar i sarcomul Kaposi.........................................................................29 2.3.2.Factorul de cretere endotelial vascular i KS...................................................................31 2.3.3. Efectul litic al activrii KSHV, Viremia KSHV i KS.....................................................32 CAPITOLUL 3: CI DE SEMNALIZARE IMPLICATE N PATOGENEZA SARCOMULUI2


KAPOSI..........................................................................................................................................34 3.1. Familia Notch...........................................................................................................................34 3.2. Cile de semnalizare ale receptorului Notch: mecanismele normale.......................................39 3.3. Receptorul Notch ca un oncogen.............................................................................................41 3.3.1. Structura receptorului celular Notch ................................................................................42 3.3.2. Modul de semnalizare al receptorului Notch n tumorile canceroase...............................43 3.3.3. Cile de semnalizare ale receptorului Notch n controlul angiogenezei tumorale............46 3.3.4. Modul de semnalizare Notch............................................................................................48 3.4. Favorizarea angiogenezei tumorale de ctre Notch.................................................................49 BIBLIOGRAFIE.............................................................................................................................53

3


CAPITOLUL 1: CANCERUL DE PIELE - SARCOMUL KAPOSI

Cancerul (tumora malign) este termenul general utilizat pentru a descrie o categorie complex de boli caracterizate prin creterea anormal a numrului de celule n organul de origine ca urmare a diviziunii necontrolate, rezultatul fiind formarea unei mase celulare solide tumora. Stadiile iniiale n dezvoltarea cancerului se limiteaz, de obicei, la organul de origine spre deosebire de cancerele avansate care se extind n afara esutului de origine. n acest caz, via sistemelor hematopoietic i limfatic, celulele canceroase (celulele maligne) pot invada i coloniza esuturile nvecinate i chiar i esuturile la distan - metastaz (Schwab, M., 2001).

1.1 Clasificarea canceruluin funcie de capacitatea celulelor de a se detaa, de a migra i de a dezvolta tumori secundare n alte regiuni ale organismului, cancerele se clasific n dou mari categorii: tumorile benigne i tumorile maligne (Bunz, F., 2008). Procesul, denumit metastaz, este multistadial: iniial, celula canceroas se desprinde din masa tumoral primar, migreaz n spaiul intercelular pn vine n contact cu peretele vascular sau limfatic, stadiu n care cancerul este invaziv local, iar ulterior ptrunde n circulaia general i migreaz n diferite regiuni ale organismului, iniiind formarea de noi tumori. Se consider c fiecare pas n procesul de dezvoltare a caracterului invaziv i metastazare este controlat de un grup separat de gene. Desprinderea celulei canceroase de restul masei tumorale necesit ruperea legturilor chimice care, n condiii normale, menin celulele n interconexiune. Cele mai importante n acest sens sunt caderinele, proteine ale suprafeei celulare care faciliteaz adeziunea intercelular. n celulele canceroase, distrugerea legturilor4


intercelulare poate surveni n condiiile n care este produs o protein defectuoas prin codificarea unei gene mutante a caderinei. De asemenea, un pas crucial n procesul de metastazare l constituie dobndirea motilitii celulare. n acest sens, studiile au artat expresia crescut a genei Rho n cancerele metastatice agresive, fiind cunoscut implicarea acestei gene n reglarea motilitii celulare la protozoare i macrofage. Diferena dintre benign i malign este determinat de capacitatea invaziv i de metastazare. Asftel, spre deosebire de tumorile maligne, tumorile benigne sunt bine delimitate (ncapsulate), nu au caracter invaziv i nu metastazeaz (Panno, J., 2005). Arhitectura celulelor n tumorile benigne este asemntoare cu cea normal, spre deosebire de morfologia celulelor tumorilor maligne care este modificat fa de celulele de origine, iar structura normal a organului este distrus. Denumirea tumorilor maligne (cancere) folosete sufixele carcinom, - sarcom sau blastom, rdcina cuvntului fiind numele organului de origine n latin sau greac. Spre exemplu, hepatocarcinomul este o form de cancer hepatic, liposarcomul este cancerul celulelor adipoase. Tumorile benigne (non-cancere) sunt denumite folosind sufixul om alturi de numele organului. Spre exemplu, leiomiomul este tumora benign a musculaturii netede a uterului. Exist ns i unele cancere (melanom, semiom) care folosesc sufixul om. Medical, cancerul este clasificat n concordan cu tipul celular al esutului de origine. Din acest punct de vedere, se disting urmtoarele categorii: carcinoame tumorile maligne derivate din celulele epiteliale; sarcoame tumorile maligne derivate din esutul conjunctiv sau celulele mezenchimale; leucemia i limfomul maligniti derivate din celulele hematopoietice (blood-forming) din mduva osoas i respectiv, ganglonii limfatici; tumora blastic sau blastomul tumor (de obicei malign) care amintete de esutul imatur sau embrionar; frecvent la copii. Din punct de vedere genetic, cancerul poate fi non-ereditar, determinat de o mutaie somatic, sau ereditar, cauzat de o mutaie predispozant n linia germinal (Passarge, E., 2007).5


1.2 Aspecte ale morfologiei cutanatePielea are o suprafa de 1.5 2 m2 i reprezint 1/7 1/6 din greutatea corpului (Sterry, W. et al.2006).

Pielea este un organ complex care protejeaz gazda de factorii nocivi din mediu, n acelai timp facilitnd i interaciunea cu mediul extern. Este mai mult dect un simplu scut impenetrabil, static, mpotriva factorilor externi. Mai degrab, pielea este un aranjament integrat, complex i dinamic de celule, esuturi i elemente ale matricei care mediaz un divers spectru de funcii: reprezint o barier fizic permeabil, asigur protecia de agenii infecioi i de radiaiile UV, intervine n procesele de termoreglare i absorbie/excreie i astfel contribuie la meninerea homeostaziei, are rol n percepia senzorial, vindecarea rnilor, regenerare i metabolismul vitaminei D i asigur aspectul fizic exterior (Chu, D.H., 2007). Arhitectural, pielea este constant remodelat, iar n structura sa se delimiteaz trei straturi epidermul, dermul i esutul subcutanat (hipodermul) (Fig.2) (Rana Anadolu-Brasie et al. 2008). Anexele specializate ale pielii sunt reprezentate de pr i unghii (la suprafaa pielii) i glandele sebacee i sudoripare (n profunzimea pielii). Dou structuri speciale foliculii piloi i glandele mamare (derivate din epiderm) ne caracterizeaz ca mamifere (Fig. 2) (Sterry, W. et al. 2006). Cele 3 compartimente ale pielii sunt interdependente, formeaz uniti funcionale; fiecare regiune a pielii este conectat cu esutul nconjurtor pentru reglarea i modularea structurii normale i a funciilor la nivel molecular, celular i tisular (Chu, D.H., 2007).

1.3 Cancerul de piele noiuni introductiveCancerul de piele este cea mai comun form de cancer. Peste un milion de cazuri noi sunt estimate anual. Ratele de inciden raportate pentru toate tipurile de cancer de piele sunt n continu cretere; din acest motiv, cancerul de piele constituie o problem de sntate public de6


actualitate (http://www.medicinenet.com/skin cancer/article.htm). Modificarea aspectului normal al pielii (spre exemplu, o iritaie, o excrescen sau o ran care nu se vindec), ulceraiile, depigmentarea, modificrile de form i dimensiune a molelor existente sunt simptome asociate cancerului de piele. Radiaia solar, infecia viral (ex. infeciile cu virusul papilloma uman - HPV), dieta, imunosupresia posttransplant, carcinogenii chimici (arsenicul, crbunele) i mutaiile genetice induse sunt cauze posibile pentru cancerul de piele (Ahmed, A.H. et al. 2008). De asemenea, trsturile constitutive, genetice i pigmentare dobndite precum pielea alb, prul rocat sau blond, pistruii, asociate cu expunerea ndelungat la radiaiile ultraviolete constituie factori de risc pentru acest tip de cancer (Sturm, R.A., 2002). Kricker el al. au observat c incidena cancerului de piele (n special a melanomului), este mai ridicat la persoanele cu fenotip deschis ( Kricker, A.et al. 1994).

Radiaia ultraviolet penetreaz tegumentul; n funcie de lungimea de und, razele UV interacioneaz cu variate tipuri celulare localizate la diferite niveluri (superficial sau profund) n straturile pielii. Razele ultraviolete cu lungimi de und cuprinse ntre 280-320 nm (UVB) sunt n mare parte absorbite la nivelul epidermului i afecteaz predominant celulele epidermice (ex. keratinocitele), n timp ce razele UV cu lungimi de und ntre 320-400 nm (UVA) ptrund n profunzime i pot interaciona att cu keratinocitele epidermice, ct i cu fibroblastele dermice. UVB interacioneaz direct cu ADN i induce leziuni la nivelul ADN, dei poate genera, de asemenea, i specii reactive de oxigen care la rndul lor pot produce leziuni ADN. Spre deosebire de UVB, UVA acioneaz n special prin inducerea speciilor reactive de oxigen (ROS), care ulterior pot exercita multiple efecte: peroxidarea lipidelor, activarea factorilor de transcripie i generarea leziunilor la nivelul catenelor ADN (Berneburg, M. et al. 2000). Leziunea specific indus de radiaia UV la nivelul ADN const n generarea de fotoprodui - dimeri pirimidinici ( GigliaMari, G. & Sarasin, A., 2003).

ADN absoarbe radiaia UV i induce modificri n unele gene n

celulele int. Principalele inte ale radiaiei UV sunt gena p53 i gena PTCH (patched gene) (Lacour, J.P., 2002). Evitarea expunerii prelungite la radiaia UV, n special n primii ani de via poate reduce semnificativ riscul de dezvoltare a cancerului de piele.

7


Tratamentul pentru cancerul de piele depinde de tipul de cancer, mrimea i localizarea acestuia, vrsta i starea general de sntate a pacientului. De asemenea, este important dac cancerul este primar sau recurent. Tratamentul cel mai des utilizat este cel chirurgical, cu ndeprtarea sau distrugerea ntregii leziuni, inclusiv a unei margini de esut sntos din jurul acesteia. Majoritatea terapiilor sunt foarte eficiente, cu rate de succes de pn la 90% (http://en.wikipedia.org/wiki/Skin_neoplasm). Importante ci de semnalizare precum calea ARF-MDM2-P53, calea INK4ACDK4/6RB, cile de semnalizare Notch, Hedgehog (SHH), TGF Smad i PI3K-AKT-mTOR implicate n patogeneza cancerului de piele pot constitui poteniale inte terapeutice (Chin, L. et al. 2006; Rodolfo,M. et al. 2005; Gonin-Laurent, N. et al. 2007; Toftgard, R., 2000; Gambichler, T. et al. 2007; Balint, K. et al. 2005; Massi, D. et al. 2006; Curry, C.L. et al. 2005).

1.4 Tipuri de neoplazii cutanateProtecia mpotriva agenilor nocivi este una dintre funciile principale ale pielii; n consecin, pielea este expus leziunilor. Urmare a acestei disfuncionaliti, la nivel cutanat pot aprea cicatrice, arsuri, infecii i cancer. Factorul cel mai frecvent asociat cu dezvoltarea cancerului de piele este radiaia ultraviolet solar, un mutagen cunoscut. Acesta poate determina mutaii genetice la nivelul celulelor pielii responsabile de iniierea tumorigenezei (Ashton, K.J., 2002). Cele mai frecvente forme de cancer de piele sunt carcinomul cu celule bazale (BCC), carcinomul cu celule scuamoase (SCC) i melanomul malign cutanat (CMM) (Ricotti, C. et al. 2009; Lee, P.K.,2004).

Sarcoamele cutanate sunt leziuni rare ale esutului conjunctiv (Goldberg, B.R., 2007).

BCC i SCC constituie mpreun grupul cunoscut sub denumirea de non-melanoma skin cancer (NMSC) (Ricotti, C. et al. 2009). Carcinomul cu celule bazale (BCC) este tumora keratinocitelor epiteliale din stratul bazal al pielii. BCC este cel mai comun cancer de piele i are o rat foarte sczut de metastazare, dar este invaziv local. n general se dezvolt la nivelul capului, gtului, braelor i spatelui. Scalpul, pleoapele, urechile, nasul i buzele sunt cele mai frecvente situsuri de dezvoltare a BCC de la8


nivelul capului. Studiile moleculare sunt eseniale pentru clarificarea etiologiei i respectiv, prevenirea BCC, pentru aceast boal nefiind cunoscut o leziune precursor (Nouri, K., 2008). Carcinomul cu celule scuamoase (SCC) reprezint, de asemenea, proliferarea malign a keratinocitelor epidermice (Schwartz, R.A., 2008). Anumite modificri patologice precum keratoza actinic sau solar sunt considerate leziuni precursor (Arora, A. & Attwood, J., 2009). Frecvent, SCC se localizeaz la nivelul feei, minilor i antebraelor i apar predominant la indivizii peste 40 de ani. Evoluia SCC poate fi substanial influenat de starea imunologic a pacientului ( RanaAnadolu-Brasie, 2008).

Melanomul malign este tumora melanocitelor; n procent de aproximativ 40%, aceste leziuni se asociaz cu nevii comuni (mole) (Raymond L. Barnhill et al. 2008). Melanomul malign este cel mai letal neoplasm cutanat (Califano, J. & Nance, M., 2009). n general, melanoamele se caracterizeaz printr-un pattern de cretere bifazic n cadrul cruia faza de cretere radial, lent este succedat de faza de cretere vertical, invaziv (Clark, W.H. Jr. et al. 1986; Bani, M.R. et al. 1996). n cursul fazei de cretere radial, melanomul primar se dezvolt centrifug, pe orizontal. n aceast faz, melanomul poate prezenta margini neregulate, dar forma general este circular/oval. Perioada creterii radiale poate persista mai muli ani, timp n care dezvoltarea melanomului este lent, intervenia chirurgical n acest caz fiind n general, curativ. n cursul fazei de cretere vertical neoplasmul penetreaz esutul conjunctiv subiacent pn la nivelul vaselor de snge i limfatice, rezultatul fiind iniierea metastazei (Cohen, P.J. et al. 2008; Gray-Schopfer, V. et al. 2007). Alte melanoame pot aprea rapid i fr implicarea nevilor. Indicele Breslow este un indicator al profunzimii melanomului i este cel mai important factor de prognostic al acestei leziuni, avnd n vedere c tumorile mai profunde metastazeaz mai uor (Raymond L. Barnhill et al.2008).

1.5 Sarcomul KaposiSarcoamele tesuturilor moi sunt clasificate in functie de linia lor de diferentiere, ceea ce se poate evidentia prin microscopie optica si electronica, imunohistochimie si, in unele cazuri, prin9


demonstrarea unor modificari genetice specifice.Majoritatea sarcoamelor se gasesc sub fascia profunda, dar cateva tipuri apar, in mod caracteristic, in derm/subcutanat. Sarcoamele cutanate reprezinta un grup heterogen de tumori mezenchimale care include tumorile fibrohistiocitice intermediare si tumorile fibroblastelor, celulelor tecii nervilor (MPNST) sau endoteliale;leziunile adipoase;si neoplasmele cu descendenta necunoscuta Sarcoamele cutanate reprezinta 5-10% din totalul sarcoamelor.Ele necesita diferentierea de carcinomul cu celule fusiforme si melenom. Studiul sarcomului Kaposi a suscitat un real interes pentru cercetarea stiintifica medicala. Sarcomul Kaposi (KS) a fost pentru prima data descris acum mai bine de 120 ani.Prima definitie a acestei boli a fost data in anul 1872, de catre medicul Moritz Kaposi, cu ocazia comunicarii primelor cazuri.Kaposi a denumit boala studiata sarcom idiopatic multiplu pigmentar al pielii, in aceasta definitie remarcandu-se incadrarea afectiunii in categoria sarcoamelor, ca si carcterul multifocal al leziunilor clinice, dar denumirea cu care va ramane cunoscuta pana in prezent va fi de sarcom Kaposi. Dupa prezentarea primelor cazuri de sarcom Kaposi, acumularea de noi date au adus puncte de vedere noi asupra etiologiei si patogeniei acestei boli. Sarcomul Kaposi este un neoplasm multicelular, mezenchimal, localizat la nivelul dermului, care prezinta o histologie complexa, caracterizat prin prezenta celulelor tumorale fusiforme, angiogeneza, eritrocite extravazate, edem si infiltrat celular inflamator mononuclear.Leziunile se prezinta de obicei, in diferite stadii:stadiul de pata, stadiul de plaga si stadiul nodular. Sarcomul Kaposi poate fi clasificat n 4 tipuri: epidemic asociat cu SIDA,

imunocompromis,clasic sau sporadic si endemic. Sarcomul Kaposi asociat cu SIDA apare la pacienii cu infecie HIV avansat i este cea mai comun prezentare a sarcomului. Este cel mai frecvent neoplasm ntilnit la bolnavii cu SIDA, mai ales la cei la care terapia HAART este limitat. Reprezint forma cea mai agresiv clinic a sarcomului. Sarcomul Kaposi imunocompromis apare dup transplantul de organ solid sau la pacienii care primesc terapie imunosupresiv. Incidena sa este crescut de 100 de ori dupa transplant. Totui, persoanele cu status imunodeficient congenital nu prezint riscul de a dezvolta10


sarcomul Kaposi. Media de timp pna la dezvoltarea sa este de 15-30 de luni. Sarcomul Kaposi clasic apare mai ales la pacienii n vrsta din regiunea Mediteranean i Europa de Est, cu predominan masculin i debut ntre 50-70 de ani. Are o evoluie lent. Complicaiile comune includ staza venoas i limfedemul. Aceast form a bolii are rar implicare visceral, mucoas sau limfonodular. 30% dintre pacieni sunt predispui la dezvoltarea limfomului Hodgkin. Pacienii mai prezint comun i istoric de astm i alergie. Sarcomul asociat SIDA fa de alte forme ale sale tinde s fie agresiv. Morbiditatea i mortalitatea apar prin implicarea extins visceral, cutanat sau mucoas. La pacienii cu terapie HAART boala are o evoluie mai lent sau poate regresa spontan. Cauzele cele mai comune de morbiditate includ desfigurarea cosmetic a leziunilor cutanate, limfedemul, afectarea gastrointestinal sau afectarea pulmonar. Toate tipurile de sarcom Kaposi sunt influenate de terapia HAART (terapie antiretroviral nalt activ) care a sczut incidena i severitatea bolii. Controlul optim al HIV cu HAART este o parte integral a terapiei de succes a sarcomului Kaposi. Raspunsul la terapie variaz ntre 20-80% n funcie de stadiul bolii i pretratament. Terapia HAART este o soluie pentru afectarea cutanat, dar pentru cea visceral trebuie adugat chimioterapia. Excizia local poate fi o opiune pentru leziunile superficiale mici. Problema major este recurena local. Prezena unor margini curate de excizie nu nseamn c sarcomul a fost nlturat. Recurena local este foarte frecvent. Terapia intralezional cu vincristin i bleomicin este folosit pentru forma clasic de sarcom n care localizarea cutanat predomin. Rspunsul apare la 60-90% dintre cazuri. Se mai folosesc crioterapia, laser terapia i retinoizii locali. Terapia paliativ sistemic este indicat pentru simptome sau boala visceral amenintoare de via, rapid progresiv mucocutanat cu durere i ulcerare i limfedem simptomatic. Se practic imunomodularea cu interferon alfa avnd proprieti antiangiogenice, antivirale i imunomodulatorii. Rspunsul pacienilor este de 40%. Se adaug i chimioterapie paliativ. Decesul apare la 3 ani i este legat de febr, diaree i hemoptizie. Inaniia este un factor important, iar decesul este rezultatul obstruciei tumorale ale bronhiilor sau laringelui. Sarcomul11


Kaposi poate fi fatal prin perforarea intestinal, tamponada cardiaca, obstrucia pulmonar i metastazele cerebrale. Pacienii cu sarcom Kaposi asociat cu SIDA prezint afectare visceral extins. Pacientii cu sarcom iatrogen tind s prezinte sngerare dei chimioterapia determin regresia sarcomului. Sarcomul Kaposi al imunocompromisilor Sarcomul Kaposi imunocompromis apare dup transplantul de organ solid sau la pacienii care primesc terapie imunosupresiv. Incidena sa este crescut de 100 de ori dup transplant. Totui persoanele cu status imunodeficient congenital nu prezint riscul de a dezvolta sarcomul Kaposi. Media de timp pn la dezvoltarea sa este de 15-30 de luni. Aceast form de sarcom este rar dar comun la pacienii transplantai. Este frecvent evoluia agresiv visceral. ntreruperea imunosupresiei determin regresia sarcomului. Imunoterapia necesar pacienilor transplantai pentru a preveni rejectul pune pe acetia la risc pentru sarcom Kaposi. Sarcomul Kaposi clasic-sporadic Sarcomul Kaposi clasic apare mai ales la pacienii n vrst din regiunea Mediteranean i Europa de Est, cu predominan masculin i debut ntre 50-70 de ani. Are o evoluie lent. Complicaiile comune includ staza venoas i limfedemul. Aceast form a bolii are rar implicare visceral, mucoas sau limfonodular. 30% dintre pacieni sunt predispui la dezvoltarea limfomului Hodgkin. Pacienii mai prezint comun i istoric de astm i alergie. Sarcomul Kaposi endemic Sarcomul Kaposi endemic este regsit mai ales n Africa, la brbai i la copii cu HIV seronegativi cu evoluie lent sau agresiv.

1.6 Semne, simptome, diagnostic, tratamentSemne i simptomeSarcomul Kaposi asociat cu SIDA are o evoluie clinic variat de la boala mucocutanat pna la extindere visceral. Leziunile implic pielea, mucoasa oral, nodulii limfatici i organele12


viscerale. Cei mai muli pacieni se prezint cu boal cutanat. Boala visceral poate precede ocazional manifestrile cutanate. Leziunile afecteaz virtual fiecare organ.

Manifestrile cutanate:-leziunile pielii sunt multiple, multicentrice i n continu dezvoltare -se manifest pe faa i extremitile inferioare -durerea este asociat cu mersul prin traumatizarea leziunilor de pe tlpi -leziunile sunt maculare, papulare, nodulare sau cu aspect de plci -sunt palpabile -variaz de la civa mm la civa cm -sunt maro, roz, roii sau violacee -sunt discrete sau confluente i apar tipic n linie cu distribuie simetric. Exist cteva varieti de sarcom Kaposi: Sarcomul Kaposi teleangiectatic este o erupie de noduli roz transluceni cu teleangiectazii proeminente. Sarcomul Kaposi echimotic apare ca echimoze periorbitale cu cantiti de snge extravazat, fara amiloidoz i foci dermici de proliferare tumoral. Sarcomul Kaposi cheloid este evident prin noduli cheloizi maro-violacei. Sarcomul Kaposi cavernos este un tip rar de sarcom local agresiv caracterizat prin tumori cutanate care sunt similare hemangioamelor cavernoase. Sarcomul Kaposi limfangiomalike este o varianta rar n care spaiile vasculare dilatate produc o erupie pe extremitile inferioare. Leziunile sunt uor compresibile i apar umplute cu lichid.

Manifestri oculare:-sarcomul Kaposi oftalmic este lent ca evoluie -proliferarea tumoral determin distrugerea anexelor ochiului i a suprafeei ocular -afectarea pleoapelor determin desfigurare semnificativ i disfuncia pleoapei -tumorile mari ale pleoapei induc astigmatism cornean neregulat -afectarea conjunctivei determin hemoragii conjunctivale recurente -n final vederea poate fi pierdut prin disfuncia pleoapei, modificrile corneene, obstrucia13


vizual.

Manifestri gastrointestinale:-pot apare oriunde pe tractul gastrointestinal -leziunile sunt asimptomatice i clinic lente -boala gastrointestinal este un indicator al infectiei HIV avansate - grea, vrsturi, durere abdominal -hematemez, hematochezie, melena, obstrucie intestinal.

Manifestrile pulmonare:-sunt dificil de distins de infeciile oportuniste -tuse, durere toracic -leziunile pulmonare sunt asimptomatice la radiografie -pleurezia este frecvent exudativ i hemoragic. Sarcomul Kaposi clasic are o evolutie lenta de 10-15 ani sau mai mult cu cretere gradat a leziunilor cutanate i dezvoltare a altora noi. Aceste leziuni determin staza venoas i limfedem a extremitilor inferioare. Leziunile viscerale apar mai ales n tractul gastrointestinal, nodulii limfatici i alte organe dar sunt descoperite incidental la autopsie. O treime dintre pacieni dezvolt un al doilea neoplasm, cel mai adesea un limfom Hodkin.

Diagnostic

Studii de laborator:-glicemia reflect incidena crescut a diabetului zaharat la pacienii cu sarcom Kaposi clasic, cetoacidoza este neobisnuit -detectarea imunohistochimic a antigenului nuclear herpesului uman tip 8 este util n diagnosticarea sarcomului Kaposi14


-hemograma la pacienii nonimunosupresai cu sarcom Kaposi tinde s fie n limite normale, dar se noteaz eozinofilie i monocitoz -citopenia liniilor celulare este prezent -anemia este cauzat de hemoragiile intestinale sau anemia autoimun hemolitic sau un neoplasm hematologic.

Studii imagistice:Tomografia computerizat abdominal la pacienii cu SIDA arat implicarea limfatic i hepatosplenic. Se indic aspirarea pe ac fin pentru a avea confirmarea histologic. Angiografia selectiv poate demonstra sarcomul Kaposi. n evaluarea pulmonar, diferenierea ntre sarcom i infecii oportuniste este dificil. Radiografia toracic arat noduli interstiiali lineari. Poriunile medii i inferioare ale plmnilor sunt mai afectate dect cele superioare. Nodulii sunt descrii ca spiculai sau n form de flacr, cu dimensiunea de 1-2 cm i peste 10 ca numr. Afectarea cilor respiratorii este comun la 75% dintre pacieni i conduce la atelectazii distale. Pleureziile sunt comune i pot fi bilaterale sau unilaterale Diagnosticul diferenial se face cu urmtoarele afeciuni: angiomatoza bacilar, sindromul nevilor albatri, granulomul piogenic, melanomul, hemangiomul cavernos, angiokeratomul, carcinoma cutis, miofibromatomul nodal, sarcomul pseudo-Kaposi.

TratamentTerapia HAART este o solutie pentru afectarea cutanata, dar pentru cea viscerala trebuie adaugata chimioterapia. Pentru boala simptomatica locala este administrata radioterapia.

15


Terapia HAART.

Alegerea terapiei HAART trebuie individualizata si depinde de extinderea bolii, prezenta si natura simptomelor si rata de progresie a bolii. Toate tipurile de sarcom Kaposi sunt influentate de terapia HAART (terapie antiretrovirala inalt activa) care a scazut incidenta si severitatea bolii. Controlul optim al HIV cu HAART este o parte integrala a terapiei de succes a sarcomului Kaposi. Raspunsul la terapie variaza intre 20-80% in functie de stadiul bolii si pretratament.

Terapia chirurgicala.

Excizia locala poate fi o optiune pentru leziunile superficiale mici. Problema majora este recurenta locala. Prezenta unor margini curate de excizie nu inseamna ca sarcomul a fost inlaturat. Recurenta locala este foarte frecventa. Terapia intralezionala cu vincristina si bleomicina este folosita pentru forma clasica de sarcom in care localizarea cutanata predomina. Raspunsul apare la 60-90% dintre cazuri. Se mai folosesc crioterapia, laser terapia si retinoizii locali.

Radioterapia.

Este cea mai folosita si eficienta terapie locala. Poate ameliora singerarea, durerea. Este eliberata sub forma de fotoni sau electroni de voltaj redus. Raspunsul apare la 80-90% dintre cazuri. Recurenta este comuna in locurile adiacente, netratate. Pacientii cu HIV sunt mai predispusi la dezvoltarea mucozitei induse de radiatii si a hiperpigmentarii, descuamarii si ulceratiei leziunilor tratate.

Terapia intralezionala.

Se practica cu alcaloizi de vinca, doze reduse de vincristina si vinblastina ca si bleomicina pentru a trata sarcomul Kaposi localizat. Raspunsul apare la 90% dintre cazuri cu efecte sistemice limitate la interval de 4 saptamini. Efectele adverse includ modificari in pigmentatie, edem, veziculizare, ulcerare si durere.16


Crioterapia.

Presupune aplicarea de nitrogen lichid si este utila pentru leziunile faciale mici, sub 1 cm dimensiune. Crioterapia poate determina hipopigmentare. Induce raspuns in peste 85% din cazuri. Are avantajul unei durate scurte, discomfort minim si posibilitatea de a fi folosita repetat si in combinatie cu alte forme de tratament. Are o penetrare limitata si nu este recomandata pentru leziunile profunde.

Terapia laser.

Poate fi folosita local. Fotocoagularea laser poate micsora leziunile mari si poate ameliora singerarea si durerea. Similar crioterapiei are aplicabilitate limitata pentru leziunile mari.

Terapia retinoida topica.

IL-6 este o citokina implicata in patogeneza sarcomului Kaposi. Acidul retinoic scade expresia receptorului IL-6. Alitretinoin este disponibil comercial si poate fi aplicat topic de 2-4 ori pe zi. Este un agent bine tolerat si poate determina eritem local si iritatie. Induce raspuns la o treime dintre pacienti la 2-14 saptamini de la initierea terapiei. Efectele secundare comune sunt inflamatia locala si depigmentarea.

Terapia paliativa sistemica.

Terapia paliativa sistemica este indicata pentru simptome sau boala viscerala amenintatoare de viata, rapid progresiva mucocutanata cu durere si ulcerare si limfedem simptomatic. Se practica imunomodularea cu interferon alfa aviind proprietati antiangiogenice, antivirale si imunomodulatorii. Raspunsul pacientilor este de 40%. Se adauga si chimioterapie paleativa. Chimioterapia paleativa. Este indicata pentru boala viscerala simptomatica, cea mucocutanata rapid progresiva, boala diseminata care nu poate fi controlata prin modalitati locale. Initial vincristina, vinblastina si17


bleomicina au fost folosite. Regimurile cu etoposid si doxorubicina sunt a doua linie de tratament. Acesti agenti pot determina regresia tumorala rapida si ameliorarea simptomelor dar cu mielosupresie si riscul de infectii oportuniste.

Prognostic.

Decesul apare la 3 ani si este legat de febra, diaree si hemoptizie. Inanitia este un factor important, iar decesul este rezultatul obstructiei tumorale ale bronhiilor sau laringelui. Sarcomul Kaposi poate fi fatal prin perforarea intestinala, tamponada cardiaca, obstructia pulmonara si metastazele cerebrale. Pacientii cu sarcom Kaposi asociat cu SIDA prezinta afectare viscerala extinsa. Pacientii cu sarcom iatrogen tind sa prezinta singerare desi chimioterapia determina regresia sarcomului. Sarcomul asociat SIDA fata de alte forme ale sale tinde sa fie agresiv. Morbiditatea si mortalitatea apar prin implicarea extinsa viscerala, cutanata sau mucoasa. La pacientii cu terapie HAART boala are o evolutie mai lenta sau poate regresa spontan. Cauzele cele mai comune de morbiditate includ desfigurarea cosmetica a leziunilor cutanate, limfedemul, afectarea gastrointestinala sau afectarea pulmonara. Afectarea pulmonara este cauza cea mai comuna de mortalitate cu hemoragii pulmonara necontrolata.

18


CAPITOLUL 2: HISTOLOGIA SARCOMULUI KAPOSI SI MARKERII IMUNOHISTOCHIMICI

2.1. Histologia sarcomului KaposiTabloul histopatologic al Sarcoamele cutanate vasculare este alctuit din multiple spaii vasculare de diferite dimensiuni delimitate de celule endoteliale tumorale, atipice. n cazul sarcomului Kaposi, tabloul este completat de componenta sarcomatoas constituit din fascicule de celule fusiforme divers orientate, ntr-un pattern storiform. Histopatologic, sarcomul Kaposi prezint dou componente principale: sarcomatoas i angiomatoas i 3 stadii: stadiul de pat, stadiul de plac i stadiul tumoral. Componenta sarcomatoas este reprezentat de plaje celulare dense sau fascicule de celule fuziforme divers orientate i ntreesute; majoritatea celulelor sunt de talie mijlocie, cu citoplasm eozinofil, nucleu alungit situat central; atipiile sunt rare. Componenta angiomatoas cuprinde fante vasculare, vase sanguine i limfatice mai mult sau mai puin dilatate. Fantele vasculare se gsesc numai n interiorul proliferrilor fuzocelulare i au aspectul unor spaii nguste pline cu eritrocite; acestea apar tapetate de endoteliu discontinuu sau chiar lipsite de perete propriu, astfel nct hematiile vin n contact direct cu celulele tumorale. Vasele sanguine i limfatice sunt numeroase i se gsesc, n special, n esutul conjunctiv de la periferia tumorii; ele au perete subire i lumen lrgit, n care proemin, uneori, bulbi conjunctivi nvelii de endoteliu; ntotdeauna sarcomul Kaposi conine eritrocite extravazate. Infiltratele inflamatorii sunt mici i se dispun cu precdere n unele poriuni de la periferia plajelor fuzocelulare i n jurul vaselor; ele cuprind limfocite, plasmocite, histiocite i macrofage19


ncrcate cu hemosiderin. La nceput epidermul este normal, fiind separat de tumor printr-o band de esut conjunctiv, dar pe msur ce tumora se dezvolt,devine atrofic i se ulcereaz. Tumora voluminoas poate conine zone de necroz. Privit la nivel stadial, histopatologia sarcomului Kaposi arat astfel: Stadiul de pat (Fig.1, 2) se caracterizeaz prin apariia n dermul reticular a numeroase vase de neoformaie cu forme neregulate. Spaiile vasculare sunt delimitate de celule endoteliale turtite sau ovale, cu atipii rare. Se observ anastomoza vaselor sanguine, eritrocite extravazate i depozite de hemosiderin. De asemenea, sunt prezente rare limfocite i plasmocite. n stadiul de plac (Fig.3, 4), procesul de angioproliferare se extinde prin creterea numrului de canale vasculare, infiltratul inflamator este dens, sunt prezente numeroase eritrocite extravazate i siderofagi. n stadiul tumoral (Fig.5, 6), n jurul canalelor vasculare apar celule tumorale cu atipii nucleare i mitoze atipice. Celulele se dispun n fascicule ntr-un pattern storiform.

Fig.1. Sarcom Kaposi Stadiu incipient. Caz 71827. Pigment feric

20


Fig.2. Sarcom Kaposi Stadiu de pat. Caz 69117. Proliferare vascular i infiltrat inflamator. (HE, 10x).

21


Fig.3. Sarcom Kaposi Stadiu de plac. Cay 71815. Proliferare angiosarcomatoas n derm. (H-E, 10x)

Fig.4. Sarcom Kaposi Stadiu de plac. Caz 71815. Proliferare angiosarcomatoas profund (H-E, 10x)

22


Fig.5. Sarcom Kaposi Stadiu tumoral. Caz 63317. Imagine de ansamblu.(H-E, 10x)

Fig.6. Sarcom Kaposi Stadiu tumoral. Caz 60177. Celule tumorale fusiforme organizate n fascicule divers orientate. (HE, 20x)

2.2. Markerii imunohistochimici in sarcomul KaposiImunohistochimia i imunocitochimia au importante implicaii n domeniul biologiei celulare i tisulare, embriologiei i diagnosticului histopatologic. Aceste metodologii faciliteaz analiza precis a chimiei celulelor i esuturilor n relaie cu organizarea structural. Informaiile furnizate de tehnicile imunohistochimice vor continua s contribuie la nelegerea proceselor de dinamic molecular, a proceselor celulare i patologice. Astfel, imunohistochimia a revoluionat domeniul diagnosticului tumoral furniznd instrumente importante pentru o mai bun caracterizare i23


clasificare a neoplasmelor (Hayat, M.A., 2002). Imunohistochimia (IHC) este o tehnic cu specificitate ridicat i const n identificarea unui constituent tisular in situ pe baza interaciunii antigen anticorp, anticorpul fiind marcat ( S. VanNoorden & Polak, J.M. 1983).

Reacia antigen-anticorp depinde de o serie de factori: timpul de incubare cu anticorpul primar, temperatur, accesibilitatea antigenelor tisulare, fora ionic i pH-ul soluiei tampon (Bunea, M. &Zrnescu O., 2001).

IHC este o metod care demonstreaz att prezena, ct i localizarea subcelular a unei molecule de interes (ex. proteine) (Su-Yau Mao et al. 2000).

Fig.7. Metoda direct. Fig.8. Metoda indirect (sursa: http://en.wikipedia.org/wiki/Immunohistochemistry).

2.2.1 Markeri vasculari/endotelialiCD31 - reacioneaz cu o glicoprotein de 130 kDa denumit molecula 1 a adeziunii plachetecelule endoteliale (PECAM-1); marcheaz intens celulele endoteliale att normale, ct i patologice (reactive sau tumorale). Se consider c prezint o sensibilitate i specificitate de 100% pentru leziunile endoteliale. n angiosarcoame i hemangioame se exprim n procent de 80%-100%. Totui, este slab exprimat de carcinoame i mezotelioame i n artrita reumatoid (Longacre, T.A. & Rouse, R.V., 1994).

24


CD34 - recunoate un antigen al suprafeei celulare de aproximativ 110 kDa care este exprimat selectiv de ctre celulele su din sistemul hematopoietic uman, dar este exprimat i de endoteliul vascular. Celulele endoteliale proliferate exprim aceast molecul n cantitate mai mare dect celulele n repaus. Este exprimat de angiosarcoame (70%), sarcoamele Kaposi (90%) i hemangioendotelioamele epitelioide. Totui, CD34 prezint o reactivitate mult mai larg. Astfel, este exprimat de anumite celule din jurul structurilor anexe ale pielii i leziunile tecii nervilor, tumorile fibroase solitare benigne i maligne, tumorile gastrointestinale i 50% dintre sarcoamele epiteliode (Miettinen, M., et al. 1994). Coexpresia CD34 i a citokeratinei poate fi observat n sarcoamele epitelioide, angiosarcomul epiteliod i schwannomul glandular. De asemenea, 88% dintre dermatofibrosarcoamele protuberans exprim CD34 comparativ cu histiocitomul fibros benign i dermatofibromul. Coexpresia CD34 i F13a este utilizat pentru diagnosticul diferenial al leziunilor superficiale cu celule fusiforme. Ambii markeri se exprim n sarcomul Kaposi, dar sunt abseni n keloid. Dermatofibrosarcomul protuberans exprim CD34, dar nu exprim F13a spre deosebire de histiocitomul fibros benign i dermatofibrom, care exprim F13a i nu exprim CD34 (Cohen, P.R. et al. 1994).

2.2.2. Markeri musculariDesmina este filamentul intermediar al muchiului neted, miocardic i striat, unde se prezint sub form de filamente homopolimerice compuse din uniti de 55 kDa. n muchiul neted, desmina leag corpii deni citoplasmatici de plcile dense ale membranelor celulare. n muchiul striat, filamentele de desmin leag benzile Z i plcile dense de sarcolema miocitului. Se exprim n rabdomiosarcoame (95%) uneori numai focal i variabil n tumorile musculaturii netede. De asemenea, desmina se exprim n miofibroblaste, celulele reticulare ale ganglionilor limfatici, celulele stromale endometriale, mezoteliul fetal, celulele stromale ale rinichiului i vili corionici, i n 17% dintre tumorile non-miogenice de esut moale precum histiocitomul fibros malign, unele fibromatoze i rar n carcinoamele pulmonare (Truong, L.D. et al. 1990). Actina Aceste proteine contractile sunt clasificate ca alpha (musculatura neted, striat i muchiul cardiac), beta (citoplasmatic) i gamma (citoplasmatic i musculatura neted)25


(Franquemont, D.W., 1993). Anticorpul monoclonal corespunztor este un detector sensibil al diferenierii musculare. Exist un anticorp monoclonal ce recunoate doar -actina muchiului neted; acesta marcheaz doar celulele musculare netede, miofibroblastele i celulele mioepiteliale. Actina specific musculaturii (muscle-specific actin) recunoate toate actinele alpha (striat, neted, cardiac) i actina gamma a musculaturii netede. Nu reacioneaz cu actinele non-musculare. Se exprim la periferia citoplasmei. Leziunile fibromatoase i fibrohistiocitare, histiocitomul fibros malign i leziunile mioepiteliale pot exprima actina specific muchiului. Specificitatea actinei muchiului neted este mai resctrictiv; nu detecteaz alpha actinele muchiului striat i cardiac sau gamma actinele muchiului meted. Se exprim n neoplasmele musculaturii netede i leziunile cu difereniere mioid precum fasciita nodular i leziunile miofibroblastice, care sunt caracterizate prin expresia actinei muchiului neted i muscle-specific actin, dar fr expresia desminei (Carlos A. Muro-Cacho, 1998). Mioglobina - marker de difereniere muscular striat i cardiac ce evideniaz rabdomioblastele tumorale n rabdomiosarcoamele puin difereniate. Este necesar interpretarea atent deoarece poate fi eliberat de musculatura lezat adiacent i fagocitat de celulele neoplazice i nonneoplazice (Dias, P. et al. 1992).

2.2.3. Markeri epitelialiCitokeratina face parte dintr-un sistem de filamente intermediare (citokeratinele formeaz un grup de 19 polipeptide cu greutate molecular cuprins ntre 40-67 kDa) care se gsete n citoplasma epiteliilor simple i pluristratificate, ct i n unele celule de origine mezenchimal, precum celulele musculare netede i plasmocitele. Citokeratinele se exprim n majoritatea sarcoamelor epitelial-like precum sarcoamele epiteliod i sinovial, n multe tumori rabdoide i n mezotelioame. n particular, citokeratinele 8 i 18 se exprim tranzient n multe celule mezenchimale, fenomen mai puin evident pe crioseciuni i demonstrat la nivelul ARNm. Multe carcinoame sarcomatoide nu exprim difuz citokeratina, dar pot exprima aberant ali markeri mezenchimali (Miettinen, M., 1991).

26


Toate cazurile de sarcom Kaposi au exprimat CD34 att la nivelul vaselor sanguine (celulele endoteliale care delimiteaz canalele vasculare), ct i n celulele fusiforme tumorale care alctuiesc componenta sarcomatoas (Fig.9, 11). Profilul imunohistochimic al sarcomului Kaposi a fost completat de expresia CD31 (Fig.12), a vimentinei (Fig.13) i a actinei (vase) (Fig.10) .Tumorile au fost negative pentru citokeratin.

Fig.9. Sarcom Kaposi stadiu de plac. Caz 69117. CD34 pozitiv difuz n vase i n celulele tumorale. (IHC, 10x)

Fig.10. Sarcom Kaposi stadiu de plac. Caz 71815. Actin pozitiv n pereii vasculari. (IHC, 10x)

27


Fig.11. Angiosarcom Kaposi. Caz 2084445. CD34 pozitiv. (IHC, 20x)

Fig.12. Angiosarcom Kaposi. Caz 71241. CD31 pozitiv. (IHC, 20x)

Fig.13. Sarcom Kaposi stadiu tumoral. Caz 60177. Vimentin pozitiv difuz n celulele tumorale. (IHC, 10x)

28


2.3. Patogeneza Sarcomului Kaposi ( KS)KS este o celul tumoral multicentric angioproliferativ de origine endotelial [HW Wang et al, 2004], care este remarcabil pentru eterogenitatea patologic (W Grazson et al, 2008) i clinic , precum i pentru capacitatea acesteia la progresul sau regresul bazat pe factorii imunitari ai gazdei. Infecia KSHV este cauza necesar, dar insuficient a KS. Genomul KSHV se evideniaz printr-o piraterie molecular a genelor asemntoare cu genele celulare reglementare, care sunt n msur s contribuie la patogeneza KS prin multiple interaciuni cu sistemele imunitare umane i endoteliale (HW Wang et al, 2004; PS Moare et al, 1998; KW Wen et al, 2010).

2.3.1. Dereglarea imunitar i sarcomul KaposiDovezile de dereglare imunologic a gazdei n patogeneza KS se bazeaz pe evaluarea

populaiilor cu risc mare de KS, precum i o nelegere n creterea de defecte specifice sistemului imunitar. Asocierea KS-ului cu imunosupresia a fost observat prima dat ntr-un transplant de organe la pacieni (JH Siegel et al, 1969), precum i la ali pacieni cu imunosupresie cronic (OKlepp et al, 1978).

n plus, apariia unor multiple cazuri de CSM n San Francisco i New York la

nceputul anilor 1980 a fost un nceput al epidemiei de SIDA. Concomitent cu infecia HIV crete dramatic riscul de a se dezvolta KS (EA Engels et al, 2008), n special n absena terapiei antiretroviral (TARC) pentru a suprima virusul HIV. naintea terapiei anti-retroviral timp de 10 ani a existat riscul dezvoltrii sarcomului Kaposi n rndul brbailor co-infectai cu HIV, n San Francisco, de aproape 50% (JN Martin et al, 1998). Efectul necontrolat al virusului HIV i imunodeficiena celulelor T n patogeneza SK au fost accentuate n continuare de o scdere a incidenei KS de aproximativ 80% din randul persoanelor cu SIDA din SUA, care corespundea cu adoptarea pe scar larg a terapie anti-retrovirale (TARC) (RJ Biggar et al. 2007). Riscul pentru KS este puternic asociat cu o scdere a imunitii celulare. Scderea numrului de celule CD4 este asociat cu creterea riscului de mbolnvire pentru ambele cazuri, SIDA i KS29


clasic (EE Brown et al, 2006). n plus pacienii infectai cu KSHV, dar care prezint i KS, dup utilizarea unui test interferon-c ELISPOT i dup utilizarea unor peptide sintetice de proteine specifice ( AG Marcelen et al, 2007) LANA, K12, K15 i (A Guihot et al, 2006), s-a observat o scdere a KSHV n comparaie cu persoanele fizice co-infectate cu HIV fr KS. A fost asociat ca un rspuns la terapie creterea n ambele cazuri CD4 i KSHV a celulei T, msurat prin ELISPOT, la pacienii netratai anterior cu SIDA, precum i la pacienii cu transplant a cror SK a regresat datorit administrrii ciclosporinei (P Baroyyi et al, 2008). Pacienii cu transplant renal care dezvolt KS prezint o regresie la imuno-supresia bazat pe ciclosporin, dar acest lucru se ntmpl mai ales atunci cnd ciclosporina este schimbat cu rapamicina. Modelele transgenice de la oareci au artat c gena KSHV, ORF74/ vGPCR, activeaz calea PI3K-Akt i promoveaz proliferarea prin modalitatea mTOR, astfel n acest exemplu rapamicina inhib tumorigeneza prin inhibarea mTOR (A Sodhi et al, 2006). n plus, rapamicina poate avea efect anti-KS, datorit capacitii sale de a reduceVEGF-A de secreie i de semnalizare (P Gasperini et al, 2009), precum i secreia de interleukina-6 i interleukina-10 de la celulele infectate cu KSHV. Efectele rapamicinei anti-proliferative i anti-angiogenice n SK sunt efectele datorate att unui compartiment mic de celule active KSHV infectate, precum i efectele paracrinei de a scdea creterea endoteliului vascular de semnalizare prin factorul de crestere-A (VEGFA). Efecte privind imunitatea nnscut sunt ipotetic posibile, dup cum s-a constatat cu ajutorul rapamicinei c se poate inhiba interleukina-10 i se poate induce interleukina-12p70 in secreia monocitelor din infecia KSHV (T Weichhart et al, 2008; P Zarchoan et al, 2007). mpreun cu demonstraia de dezvoltare a KSHV , celulele T rspund la pacienii cu transplant renal mai ales la trecerea de la ciclosporin la rapamicin. Aceste date sugereaz c efectele anti-KS ale rapamicinei n stabilirea de transplant renal, aferente KS pot fi multifactoriale (P Baroyii et al,2008).

n timp ce funcia celulelor T este important n prevenirea KS, mai multe linii de dovezi sugereaz c defectele din sistemul imunitar pot juca, de asemenea, un rol n patogeneza SK. La nivel de populaie, dezvoltarea KS se coreleaz cu scderea numrului de celule CD 19 din ambele cazuri, i la persoanele cu HIV-negativ (AJ Stratigos et al, 2005) i la persoanelor infectate cu HIV (J Stebbing et al, 2004). Un potenial mecanism prin care sistemul imunitar se poate proteja30


mpotriva dezvoltrii cu SK este prin anticorpii de neutralizare. Comparnd subiecii cu SK cu cei care au fost infectai cu KSHV dar fr o dovad de KS, printr-un test cu anticorpi neutralizani s-a demonstrat c un nivel semnificativ de mic a ajuns n serul pacienilor cu KS. Mai recent, rituximab, un anticorp monoclonal CD20 de direcionare, a fost evaluat n tratamentul pentru KSHV asociat multicentric cu boala Castleman. O cretere tranzitorie a KSHV a fost detectat n cursul primei luni de terapie cu rituximab (L Gerard et al, 2007), dar asocierea tranzitorie a virusului KSHV i a KS nu au fost evaluat n acest studiu clinic i n faza II. n ciuda acestor observaii, procesele exacte prin celulele B i, probabil, anticorpi de neutralizare pentru protejarea mpotriva KS i a altor KSHV asociate cu tumori maligne rmne incomplet nelese.

2.3.2.Factorul de cretere endotelial vascular i KSMai multe modele de patogeneza SK, bazate pe limfomul de efuziune endotelial sau derivate din celule primare provin de la bolnavi de SIDA, n care genele KSHV sunt transduse n alte linii de celule sau n celulele infectate cu KSHV, sunt concentrate pe rolurile autocrine i paracrine angioproliferative de semnalizare din patogeneza SK. Studiile corelative efectuate pe probe umane, au avut n cele mai multe cazuri modele clinice. Testele au demonstrat c diversele linii de celule KS, care nu mai erau infectate cu genomul KSHV, exprimau o baza crescut a factorului de cretere fibroblast (bFGF) mRNA. Media de cultur de la aceste linii celulare KS a fost capabil s stimuleze din cordonul ombilical uman celule endoteliale (HUVEC) dar i celule de cretere KS, n timp ce anticorpii FGF au inhibat aceast semnalizare paracrina (B Ensoli et al,1989).

n mod similar, media de cultur a liniilor celulare SK-SIDA are un nivel ridicat de

VEGFA, i proliferarea HUVEC care are loc n prezena acestor medii de cultur este inhibat de anticorpi (S Nakamura et al, 1997) VEGF sau VEGFA SIRNA (R Masood et al, 1997). VEGFR2, un receptor pentru VEGFA, este detectat att n vasele stromale cat i in axul celulelor de ctre cele dou pete imunohistochimice ale biopsiei SK (LF Brown et al, 1996). Anticorpii mpotriva VEGFR2 i VEGFR2 SIRNA inhib de asemenea proliferarea celulelor. Mai recent, VEGFR3, un receptor a crui expresie este n general limitat de celulele endoteliale limfoide, s-a constatat a fi robust exprimat n liniile de celule KS (ZY Liu et al, 1997), precum i n celule KS din probele de biopsie31


(N Dupin et al, 1999; L Jussila et al, 1998). Atunci cnd KSHV infecteaz culturile celulare HUVEC, acestea sunt comparate cu celulele neinfectate HUVEC, iar creterile mRNA prin RT-PCR pentru VEGFA, VEGFB, VEGFC, i VEGFD precum i VEGFR1, VEGFR2, i VEGFR3 sunt considerabile iar IHC confirm expresia puternic a celor trei receptori din celulele infectate KSHV HUVEC. Cile de semnalizare implic mai multe gene KSHV, inclusiv vGPCR, interleukina-6 (vIL-6), K1 i LANA duc la creterea valorii VEGF. vGPCR, codificat de ORF74, este o gen constitutiv activat litic cel mai strns legat de receptorul uman CXCR2.Transferul celulelor NIH3T3 sau a liniilor celulare PEL (BC3), cu vGPCR duce la celulele care produc VEGFA. Culturile acestor celule transferate sprijin culturile de celule HUVEC, n timp ce anticorpii VEGFA inhib proliferarea. n plus, inocularea acestor celule transferate la oareci determin crearea de tumori vasculare cu trsturi histologice a KS. Liniile de celule HUVEC transferate cu vGPCR menin, de asemenea, un expresia mRNA ridicata a VEGFR2, aceste celule sunt supuse apoptozei atunci cnd este expus PTK787, o molecul care inhib toi receptorii VEGF (C Bais et al, 2003). vIL-6 este, de asemenea, o gen litic produs de KSHV cu 25% aminoacizi omologai cu acidul uman al interleukinei-6. Transfectarea Vil-6 n NIH 3T3 duce la creterea de 6-8 ori a VEGFAmRNA, n timp ce o injecie subcutanat a Vil-6 se transfer n celulele NIH3T3 de la soareci, i duce la tumori n form de arbore (Y Aoki et al, 1999). oarecii transgenici K1 dezvolt plasmacitoide i in tumorile sarcomatoide (O Prakash et al, 2002), i n ganglionii limfatici din VEGFA imunohistochimici. LANA, poate avea, de asemenea, un efect asupra trascrierii VEGF.

2.3.3. Efectul litic al activrii KSHV, Viremia KSHV i KSStudiile clinice sublinieaz c viremia KSHV este un factor de risc n dezvoltarea KS i c interveniile farmacologice ce degradeaz replicarea litic KS pot afecta istoria natural a KS. Cteva studii au demonstrat c viremia detectabil KSHV este un factor de risc pentru dezvoltarea KSHV printre pacienii cu HIV i acest fapt este adevrat dup corectarea32


seropozitivitii KSHV (D Whitbz). Controlarea replicrii litice KSHV descrete riscul dezvoltrii KS la pacienii cu HIV. Un studiu pilot de utilizare intermitent a agentului cidofovir KSHV (DHKedes et al, 1997)

ca monoterapie nu a controlat adecvat KSHV din sngele periferic detectat iar

pacienii din acest studiu au KS progresiv (RF Little et al, 2003). ntr-un mic studiu de control din cadrul studiului clinic ntmpltor al cART comparat cu cART si chemoterapia, pacienii ce primesc doxorubicin, bleomicin i vincristin (ABV) suplimentar la cART au o descrestere de 3 loguri n KSHV n luna 11, comparativ cu cART doar la membre, unde nu s-a observat nici o descretere (F Bihl et al, 2007). Din studiile clinice viitoare evaluarea medicamentelor ce au ntrerupt replicarea viral a KSHV din tratamentul bolilor asociate cu KSHV va beneficia din aceast diferen. Agenii antiherpetici pot fi de un interes particular n controlarea pacienilor cu KS i n tratarea bolii Castleman multicentric, o boal unde efectul litic al activrii KSHV este cel mai bine stabilit n patogeneza bolilor (C Casper et al,2004). Rolul activrii litice a KSHV din sindroamele inflamatorii asociate cu KS este o zon de un interes n cercetarea viitoare (TS Uldrick et al, 2007). Pacienii cu HIV asociat KS pot manifesta sindroame inflamatorii n MCD, sindromul inflamator de reconstituire imun KS (IRIS) sau n alte infecii asemntoare. Interesant, cteva din aceste sindroame inflamatorii cum ar fi MCD sau KS-IRIS, pot aprea n stabilirea controlului efectiv al HIV-ului.

33


CAPITOLUL 3: CI DE SEMNALIZARE IMPLICATE N PATOGENEZA SARCOMULUI KAPOSI

n dezvoltarea embrionar normal i organogenez, calea de semnalizare Notch joac un rol central n reglarea deciziilor legate de soarta celulei, cum ar fi autoreinnoirea celulelor stem adulte i diferenierea precursorilor spre o linie celular specific. n funcie de contextul celular i tisular, Notch acioneaz prin reglarea proliferrii celulare, migrrii, diferenierii i apoptozei. Semnalizarea Notch este implicat n controlul diferitelor aspecte ale dezvoltrii i homeostaziei tisulare, studiie demonstrnd asocierea dereglrii semnalizrii formei intracelulare Notch1 (ICN) cu un subset de limfoame celulare T (PEL) i cu tumorigeneza ntr-un model animal. Cunoscut fiind faptul c agentul etiologic al PEL, ca i n cazul sarcomului Kaposi, este KSHV, s-a artat c Notch1 ICN se acumuleaz n celulele KSHV-pozitive i c aceasta este mediat de KSHV LANA, rezultatul fiind creterea ratei de proliferare a acestor celule.

3.1. Familia NotchFamilia Notch este constituit din patru receptori notai Notch 1-4. Receptorul Notch este o protein transmembranar tipul 1 care trece prin doua clivri proteolitice dupa legarea ligandului. Liganzii Notch sunt mparii n dou subclase, Delta i Serrate-Jagged. La vertebrate, liganzii includ doi membrii din familia Serrate-Jagged 1 i Jagged 2 i trei membrii ai familiei Delta:Delta 1, Delta 3 i Delta 4. Aceti liganzi sunt proteine transmembranare cu un domeniu intracelular (IC) scurt i o regiune extracelular (EC) lung constituit din poriuni repetitive EGF-like, ca i receptorii, dar i cu o regiune amino-terminal denumit domeniul DSL (Delta, Serrate i Lag-1), specific pentru aceast clas de proteine. Aceste molecule interacioneaz via domeniilor DSL cu34


o regiune specific a domeniului extracelular (EC) a receptorului Notch determinnd clivajul proteolitic succesiv mediat de metaloproteinaze din familia ADAM la un sit N-terminal al domeniului transmembranar (TM) notat situl S2, pentru ca apoi, fragmentul Notch rmas s fie clivat n subunitatea transmembranar la situl S3 de ctre complexul proteic gama-secretazpreselin. Rezultatul acestui proces este eliberarea domeniului intracelular (ICN) care este translocat n nucleu unde particip la activarea transcripional a genelor int. Aceast eliberare a domeniului intracelular (ICN) a receptorului Notch i translocarea sa n nucleu faciliteaz legarea sa de CBF-1 (denumit de asemenea, CSL sau RBP-Jk), o protein de legare DNA. RBP-Jk este o protein monomeric de 60 kda care se leag la secvena DNA consens (C/T)GTGGGAA. Domeniul de legare DNA al RBP-Jk este localizat la nivelul miezului sau central, nalt conservat, constituit din 425 aminoacizi. Studiile au artat ca RBP-Jk interacioneaz cu activatorul transcripional RTA care favorizeaz switch-ul de la starea de laten la replicarea litic n cazul virusului KSHV. RTA este produsul genei virale ORF50. RTA activeaz expresia a numeroase gene virale n ciclul litic al virusului KSHV, inclusiv a propriului promotor, polyadenylated nuclear RNA, K12, ORF57, K14/Vgpcr (viral-G-protein-coupled receptor) i vIRF1. RTA activeaz promotorul sau inta prin legarea direct la o secven specific i/sau interaciunea cu diferii factori transcripionali celulari. Siturile de legare RBP-Jk sunt prezente ntr-un numr de promotori virali cu reglare RTA. RBPJk este nalt conservat n cursul evoluiei de la nematode la oameni. Studiile genetice i biochimice au artat c RBP-Jk acioneaz downstream de receptorul Notch. Activarea Notch i translocarea domeniului intracelular al acestuia (ICN) n nucleu permite activarea genelor prin interaciunea cu RBP-Jk. RTA poate fi privit ca un omolog funcional al proteinei Notch activate. Dovezile tiinifice cele mai recente au evideniat, de asemenea, dereglarea cii de semnalizare Notch n sarcomul Kaposi, fapt demonstrat de supraexpresia Notch activat n celulele de sarcom Kaposi. De asemenea, studiile realizate pn n prezent indic faptul c ntreruperea semnalizrii Notch inhib creterea celulelor sarcomului Kaposi, semnalizarea Notch cptnd astfel o potenial valoare terapeutic la pacienii cu KS.35


Semnalizarea Notch este reglat de proteine nucleare i citoplasmatice, extracelulare. Anumite enzime, ca i FRINGE, modific semnalizarea mediat de ligand. Dei calea Notch se pare c este activat n principal prin interaciunile celul-celul, clivajul proteolitic al receptorilor i respectiv, al liganzilor s-a dovedit important pentru semnalizare. Studiile genetice implic gena Kuzbanian (Kuz) care codific o metaloproteaz membranar din familia ADAM (cunoscuta ca ADAM10) i strans nrudit cu TACE (ADAM17) n calea Notch. Rolul precis al genei Kuz n cadrul acestei ci de semnalizare rmne controversat, dar activitatea sa pare a fi necesar pentru semnalizare.

Gena Notch 1 a fost descris pentru prima dat n 1917 de ctre Thomas Hunt Morgan la Drosophila melanogaster. Pn n 1980 s-au realizat studiul molecular al produsului genei Notch1 i secvenierea. Gena Notch1 cuprinde 51,418 bp i este localizat pe cromozomul 9 (9q34.3). Transcriptul Notch1 RNA conine 34 exoni i prezint 9,317 bp. Proteina Notch1, produsul genei Notch1, (2,556 aminoacizi, 272,500 Da) conine o unitate extracelular lung care se asociaz, printr-o interaciune non-covalent, calciu-dependent, cu o unitate secundar constituit dintr-o regiune extracelular scurt, o regiune transmembranar i o regiune intracelular scurt. Domeniul extracelular Notch1 este compus din 36 poriuni repetitive EGF-like. Fiecare repeat EGF-like are aproximativ 40 de aminoacizi, iar structura sa este definit de 6 resturi de cistein conservate care formeaz 3 legturi disulfidice. Aceast caracteristic este esenial pentru legarea ligandului. De asemenea, domeniul extracelular conine 3 poriuni repetitive bogate n cistein Notch/Lin12 (LN) necesare pentru blocarea semnalizrii n absena ligandului. Domeniul intracelular Notch1 (NICD) conine 3 domenii RAM23, 6 poriuni repetitive ankyrin/cdc10 implicate n interaciunile protein-protein, 2 semnale de localizare nuclear (N1 si N2), un domeniu de activare transcripional (TAD) i o secven PEST (prolin-acid glutamic-serintreonin) care regleaz negativ stabilitatea proteinei. Iniial, Notch1 este supus clivrii proteolitice de ctre furin la nivelul aparatului Golgi, n cursul transportului ctre suprafaa celular. Notch1 este supus mai multor modificri post-translaionale importante. Un zahar Oglucoz poate fi adugat ntre prima i a doua cistein, iar O-fucoza ntre a doua i a treia cistein. Adiia acestor zaharuri este mediat de o-glucosiltransferaz i respectiv, GDP-fucoza O36


fucosiltransferaza1 (POFUT1). Adiia O-fucozei de ctre POFUT1 este crucial pentru funcia Notch1. Notch1 are multiple funcii, i anume: funcie neuronal i n dezvoltare, n angiogenez, reglarea evenimentelor de comunicare celular ntre endocard i miocard n cursul formrii camerei ventriculare, formarea componentei citoscheletice, funcia limfocitar normal, .a.

Proteinele ADAM constituie o familie de peste 30 de protease Zn2+-dependente, glicozilate, implicate n interaciunile celul-celul, celul-matrice, precum i n diferite procese: fertilizare, fuziune muscular, secreia de TNF i modularea funciei neurogenice a Notch i Delta. Sunt proteine transmembranare tipul I constituite dintr-un domeniu propeptidic, un domeniu metaloproteazic, un domeniu disintegrin (integrin ligand), o regiune bogat n cistein, o secven EGF-like i o coad citoplasmatic. Funcia de adeziune celular a proteinelor ADAM a fost atribuit prezenei domeniului disintegrin i regiunii bogate n cistein, domenii implicate n legarea integrinelor. Studiile recente sugereaz c domeniul citoplasmatic al ADAM poate fi implicat n semnalizarea intracelular conducnd la activarea proceselor proteolitice. Proteinele ADAM sunt implicate i n dezvoltarea normal a pielii, cataliznd ndeprtarea peptidelor amino n procesele de transformare a procolagenului n colagen. n unele cazuri, domeniul propeptidic este nlocuit de o endopeptidaz furin-like, care conduce la activarea domeniului metaloproteazic. Majoritatea ADAMs conin acest domeniu proteazic catalitic (HAXGHXXGXXHD) a crui activitate este dependent de prezena zincului. Prin urmare, ADAMs sunt membrii ai familiei metazinc care include, de asemenea, matrix metaloproteinazele (MMPs) i ADAMs cu Trombospondin motifs (ADAMTS). ADAM difer de majoritatea proteinelor MMP i ADAMTS prin faptul c prezint un domeniu de legare a integrinei (desintegrina) i prin clivarea juxtamembranar a altor proteine asociate membranei. Aceast clivare activeaz adesea proteina substrat fie prin eliberarea peptidului extracelular activ (ex. TNF ), fie permind activarea intracelular a proteinei transmembranare (ex. Notch).

ADAM10 este localizat pe cromozomul 15 (15q2|15q22),. ADAM10 (Fig. 14 )este recunoscut ca un important reglator al neurogenezei i dezvoltrii axonale n cursul embriogenezei. ADAM10 este una dintre -secretazele care conduc la creterea APP solubil i reduce formarea37


proteinei -amiloid toxic. ADAM10 este un reglator major al activrii i semnalizrii Notch. In vitro, ADAM17 poate cliva Notch1, iar ADAM10 poate cliva ligandul Notch-Delta.

Figura 14. Domeniile multiple si activitile lor biologice permit ca ADAM s coordoneye procesele celulare. (A) Schema reprezint (1) activarea unei proteine substrat de situsul catalitic al domeniului metaloproteazei (MP), (2) legarea domeniului disintegrinelor (DI) cu un receptor heterodimeric integrin, (3) legarea ADAM la alte proteine ndeseori prin domeniul bogat n cistein (CR) i (4) semnalizarea intracelular prin domeniul citoplasmatic al unor ADAMs. T:domeniul transmembranar, E:factorul de cretere epidermal. (B) Presupusa structur 3D a ADAM21 este prezentat n partea stng i n stiluri cu spaii pline n dreapta i a fost produs pe serverul de predicie al structurii proteinelor cu lan ntreg Robetta (http://www.robetta.net /). De asemenea, este inclus n model pro-domeniul (PD), care este preyent n toate tipurile ADAM i este eliminat de endopeptidaze pentru a produce proteina matur ADAM. Acest lucru indic situsul catalitic a crui activitate este apoi dependent de prezena zincului i absena TIMP. Domeniul disintegrinelor este ezpus n mod clar la legarea de integrine.

TACE (TNF -converting enzyme)/ADAM17 este o metaloproteinaz care cliveaz precursorul TNF legat de membran pentru eliberarea TNF solubil. S-a demonstrat c ADAM17 posed trsturile unei proteaze care degradeaz colagenul, activnd TNF prin descuamarea ei de pe suprafaa celulei. TACE (TNF -converting enzyme)/ADAM17 este localizat pe cromozomul 2 (2p25).

PRESENILINELE (PS-1 si PS-2) sunt proteine membranare care conin 6-8 domenii38


transmembranare i funcioneaz ca aspartat-proteaze n cadrul unui complex multiproteic cu mas molecular ridicat care include, de asemenea, proteine nicastrin, Aph-1 si Pen-2. Presenilinele furnizeaz un situs activ pentru clivarea gama-secretazei i activarea n cascada a receptorilor Notch. Corelarea semnalizrii Notch cu proliferarea celular i pogresia tumoral reprezint o contribuie important pentru studiul sarcoamelor cutanate. Descoperiri recente au stabilit o corelaie ntre oncogeneza determinat de KSHV i Notch1, important factor de semnalizare cu implicaii n procese celulare i evideniaz un mecanism unic prin care KSHV poate inhiba calea de semnalizare, conducnd la oncogenez. n plus, un inhibitor al gamma-secretazei reduce proliferarea celulelor KSHV-pozitive i induce moartea celular a celulelor B primare infectate cu KSHV. Acestea sugereaz c manipularea cii de semnalizare Notch poate avea potenial terapeutic n tratarea cancerelor KSHV-pozitive.

3.2. Cile de semnalizare ale receptorului Notch: mecanismele normaleCei patru receptori ai mamiferelor, Notch 1-4, sunt receptori de tipul 1, proteine transmembranare compuse dintr-o serie de motive stucturale caracteristice (Figura 15). Proteina este formata dintrun domeniu extracelular, un domeniu transmembranar si unul intracelular. Domeniile extracelulare conin unitile repetitive 29-36 ale factorului de cretere epidermic (FEG), care se leag la liganzii transmembranari ai familiei Delta-Serrate-Lag-2 (DSL). De asemenea mai conine i un domeniu de heterodimerizare care este important n meninerea receptorilor Notch n starea off. Zona intracelular a fiecrui receptor include apte uniti repetitive ankirinice i domeniul PEST C-final (amino acizii prolin (P), glutamat (E), serin (S) i treonin (T). Calea de semnalizare specific receptorului Notch este cea tipic pe proteolize regulate. Receptorii Notch sunt clivai extracelular de furin la punctul S1, un eveniment unde se creeaz partenerul de ligand (NEC) i subunitile de transmembran (NTM) ce sunt susinute necovalent39


prin contactele de heterodimer. Partenerul de ligand red receptorul Notch sensibil la clivajul tipului ADAM metaloproteinele la punctul S2, posibil printr-o legtur fizic indus de endocitoza ligandului n celulele nconjurtoare, care i schimb conformaia din zona structurat negativ. Clivarea la S2 determin apariia pe o perioad scurt de timp a structurii NTM*, care este clivat rapid de -secretaz la nivelul domeniului transmembranar n punctul S3. Astfel se elibereaz domeniul intracelular al receptorului Notch (ICN), care va fi translocat la nucleu pentru a forma complexul de activare transcripional mpreun cu factorul ligand-ADN CSL (CBF1/Suppressor of Hairless/Lag1); sub influena co-activatorilor de tip MAML. Acest complex se formeaz rapid, i este n relaie direct cu etapele de fosforilare declanate de CCDK8 i de activitatea E3-ligaze Sel-10 (Fryer CJ, et al., 2004; Tetzlaff MT, et al., 2004; Tsunematsu R, 2004).

Figura 15: Transducia semnalului n calea Notch. (A) Receptorii sunt modificai n timpul secreiei prin adugarea de reziduuri de zahr de ctre proteinele Fringe, precum i de un clivaj Furin care produce un receptor heterodimeric legat printr-un pod metalic. (B) Ligandul duce spre o grupare receptoare care expune un situs clivat40


S2 fie prin izolarea ectodomeniului sau modificarea conformaional (C) . n urma clivrii S2, receptorul rmas n membran este clivat n S3 de ctre activitatea proteazei presenilin-dependent. (E) Clivarea elibereaz domeniul intracelular care apoi se mut la nucleu i se asociaz cu proteinele CSL. n absena NICD, proteinele CSL reprim transcripia prin asocierea cu co-represorii cu activitatea HDAC. Legarea NICD la proteinele CSL deplaseaz complexele de co-represori i recruteaz co activatorii incluznd proteinele mastermind MM, care la rndul lor recruteaz proteinele cum ar fi p300 i proteina de legare cREB (CBP) cu activitate histonic acetiltransferazic (HAT).

3.3. Receptorul Notch ca un oncogenCel mai clar exemplu al cii de semnalizare oncogenice a receptorului Notch se gsete n leucemia acut limfoblastic (T-ALL), un neoplasm agresiv al celulelor T imature. Notch 1 era identificat prin implicarea sa n (Malechi MJ et.al, 2006; Chiang MY et al.. 2006; van Vlierberghe P et al.,2006)

translocaie cromozomial aflat n 1% din celulele T-ALL. (Ellisen LW, 1991).

Un rol mai larg a fost cunoscut n 2004, odat cu descoperirea celor dou tipuri de mutaii activatoare din cadrul receptorului Notch1, cel puin unul dintre ele a fost gsit n ~55-60% din celulele umane T-ALL (Weng AP et al.. 2004). Primul tip implic domeniul heterodimerizaiei i cauzeaz schimbri n secvena de amino-acizi care duce la clivajul metaloproteic independent de ligand la punctul S2. (Malechi MJ et al., 2006). Al doilea tip este alctuit din codonul stop sau din mutaiile rezultate din tergerea domeniului PEST C-terminal i stabilizarea ICN1 (Weng AP et al.,2004).

Acestea ndeprteaz cteva posibile fosforilaii, inclusiv i secvenele de Sel-10/Fbw7

(Fryer CJ et al., 2004), plus secvena WSSSSP care influeneaz fosforilaia, stabilitatea i leucemogenitatea receptorului Notch1 la murine. (Chiang MY et al., 2006). Domeniul de heterodimerizare sinergic i cel mutaional PEST se gsesc mpreun n 10-20% din celulele umane T-ALL (Weng AP et al., 2004), i astfel a fost raportat i o amplificare minim a numrului de celule T-ALL din receptorul Notch1. Mutaiile din receptorul Notch1 sunt gsite n combinaie cu alte aberaii majore genetice cunoscute asociate celulelor umane T-ALL (Weng APet al., 2004)

i obinnd astfel mutaiile secundare n receptorii Notch 1 ai murinelor ce au fost

identificai n celulele T-ALL ce luau natere n multe medii diferite din punct de vedere genetic (Girard L et al., 1996; Feldman BJ, 2000; Lin YW, 2006; ONeil j, et al., 2006; Dumortier A, 2006; Reschly EJ etal., 2006).

Luate mpreun, aceste date indic c exist o selecie continu pentru creterea cilor41


de semnalizare a receptorilor Notch1 din timpul induciei celulelor T-ALL i progresiei, i astfel de mutaii pot fi fie evenimente iniiatoare fie evenimente cooperatoare secundare.

Figura 16 Structura receptorului celular Notch Este prezentat un receptor prototip Notch (Notch1). Clivajul la punctul S1 n timpul maturaiei receptorului creeaz 2 subuniti asociate necovalent (NEC i NTM) care sunt protejate n mod normal de activarea prematur prin intermediul zonei negative (NRR) compus din 3 uniti repetitive de LIN12NOTCH (LNRs) i domeniul de heterodimerizare (HD). Activarea Notch ncepe prin legarea ligandului partener la unitile repetitive EGF, care induce clivarea la punctul S2 de ctre metaloproteaya tip ADAM- aceasta creeaz expresia intermediar de scurt durat NTM*. Aceasta este urmat de un alt clivaj la punctul S3 de proteina g-secretaz, care elibereaz domeniul intracelular al Notch (ICN). Abrevierile: ANK 7 repetiii de ankirine; PEST - secvena degron bogat n aminoacizii prolin, glutamate, serin i treonin; RAM - domeniul RAM; TAD - domeniul activator transcripional.

3.3.1. Structura receptorului celular NotchEste prezentat un receptor prototip Notch (Notch1). Clivajul la punctul S1 n timpul maturaiei receptorului creeaz 2 subuniti asociate necovalent (NEC i NTM) care sunt protejate n mod normal de la activarea prematur prin intermediul zonei negative (NRR) compus din 3 uniti repetitive de LIN12NOTCH (LNRs) i domeniul de heterodimerizare (HD). Activarea Notch ncepe cu ajutorul ligandului partener la repetiiile EGF, care include un clivaj la punctul S2 de ctre tipul ADAM metaloproteic - aceasta creeaz expresia intermediar de scurt durat NTM*.42


Aceasta este urmat de un alt clivaj la punctul S3 de proteina g-secretaz, care decupleaz domeniul intracelular al Notch (ICN). Abrevierile: ANK 7 repetiii de ankirine; PEST secvena degron bogat n aminoacizii prolin, glutamate, serin i treonin; RAM - domeniul RAM; TAD - domeniul activator transcripional.

3.3.2. Modul de semnalizare al receptorului Notch n tumorile canceroaseActivarea Notch n tumorile solide i celule, cum ar fi celulele endoteliale pot fi stimulate prin liganzii de tip Jagged- sau Delta, acolo unde n celulele T-ALL, mutaiile din domeniul HD duc la generarea ligandului independent de Notch activat (ICN). Micii inhibitori moleculari de gsecretaz (GSI) previn generaia ICN. Majoritatea activitilor ICN este mediat printr-un complex nuclear de activare transcripional care conine factorul de transcripie CSL i coactivatorii familiei MAML. Activitile propuse de Notch activat (ICN) care contribuie la oncogenez sunt artate cu culoarea verde, iar acolo unde acestea reprim dezvoltarea tumoral este artat cu culoarea roie). Liniile continue i ntrerupte denot interaciuni ce apar direct i indirect. Numerele se refer la referinele citate n text care confirm interaciunile indicate.

43


Figura 17 Modul de semnalizare al receptorului Notch n tumorile canceroase.Activarea Notch n tumorile solide i celule, cum ar fi celulele endoteliale poate fi stimulat fie prin liganzii de tip Jagged- sau Delta, acolo unde n celulele T-ALL, mutaiile din domeniul HD duc la generarea ligandului independent al activrii Notch (ICN). Micii inhibitori moleculari de g-secretaz (GSI) previn generarea ICN. Majoritatea activitilor ICN este mediat printr-un complex nuclear transcripional de activare care conine factorul de transcripie CSL i co-activatorii familiei MAML. Activitile propuse de Notch activat (ICN) care contribuie la oncogenez sunt artate cu culoarea verde, iar acolo unde acestea reprim dezvoltarea tumoral este artat cu culoarea roie). Liniile continue i ntrerupte arat interaciuni ce par a fi directe, respectiv indirecte. Numerele se refer la referinele citate n text care confirm interaciunile indicate.

O alt gen important a receptorului Notch apare a fi expresia c-Myc, cruia i se diminueaz termocitele normale n timpul tranziiei de la DN3a la DN3b, dar formulat consistent ntr-un receptor Notch1 la murine i n celulele umane T-ALL ( Weng AP et al., 2006). Un rol pentru Notch144


n reglarea metabolismului celular al timocitelor normale i neoplastice este ajustat ulterior de salvarea parial a receptorului Notch1 prin intermediul activului Akt (Ciofani M, 2005), care acioneaz cu ajutorul mTOR la stimularea biosintezei proteinei i creterii celulelor. Receptorul Pre-T complexul (pre-TCR) produce semnale care necesit pentru ambele dezvoltri normale ale celulelor T i pentru inducia Notch1 -celule T-ALL, iar semnalele pre-TCR nu pot fi eseniale pentru o cretere continu a tumorilor stabilite (Campese AF, 2006). Alte date recente sugereaz c Notch1 reine funcia p53 la celulele T-ALL, (Beverly LJ et al., 2005), care poate promova oncogeneza printr-o supravieuire crescut a celulelor i printr-o instabilitate genomic. Dincolo de celulele T-ALL exist o eviden crescut i anume faptul c semnalele Notch sunt oncogenice n alte contexte celulare, n special n epiteliul snului i n melanocite. Pentru a le data, mutaiile ctigului de funcie ale celulelor autonome din receptorii Notch nu au fost gsite n tumorile solide umane, propunnd c activarea ligandului-mediat predomin n aceste contexte. Notch 4 a fost primul identificat ca un loc de integrare proviral n tratarea cancerului mamar la murine (Jhappan C et al, 1992), i studiile recente au punctat rolul receptorului Notch n cancerul uman de sn. Expresia receptorului Notch este dezvoltat n celulele snului uman (Weijzen S et al.,2002; Reedijk M et al., 2005),

i cea a liganzilor cum ar fi Jagged1 ce coreleaz cu o boal mai

agresiv n ambele tipuri de cancer, de sn i de prostat (Santagata S et al., 2004; Bismar TA, et al.,2006).

Mai mult, la cancerul uman de sn nivelele sczute ale receptorului Notch antagonist

Numb-ului se coreleaz cu ambele ci de semnalizare ale receptorului Notch i cu sensibilitatea la inhibitorii -secretaz. (Pece S et al., 2004). Mai multe rapoarte recente indic cile de semnalizare ale receptorului Notch1 sunt ridicate sub diferite tipuri moleculare de cancere de sn, i astfel asemenea cancere revin la un fenotip benign prin denumirea Numb. [ Stylianou S et al., 2006]. Ca i n celulele T-ALL, expresia c-Myc apare a fi un important punct de cretere al receptorului Notch1 n cancerul de sn (Klinakis A et al., 2006). De asemenea o alt important cooperare pozitiv oncogenic apare a fi la celulele cancerului de sn dintre receptorii Notch i Wnt (Ayyanan A et al., 2006), o alt cale unde erau iniial implicate n cancerul de sn prin intermediul analizei inseriilor retrovirale din tumorile murine. Alte lucrri despre celulele cancerului de sn propun c receptorul Notch1 inhib apoptoza mediat p53 prin stimularea cilor de semnalizare din PI3KAktmTOReIF4E (Mungamuri SK et al., 2006) i antagonizeaz efectele de cretere45


supresive al TGF- (factorul de cretere i transformare beta) semnaliznd calea (Sun Y et al., 2005), posibil prin intermediul interaciunii dintre Notch1 activat cu Smad3. Expresia receptorului Notch a genelor int crete n melanoamele umane primare (Ballint K et al.,2005; Hoek K et al., 2004)

sub aciunea receptorului activ Notch1 care accelereaz progresia

melanomului (Liu ZJ, 2006). Aceste efecte oncogenice se coreleaz cu activarea cilor de semnalizare Wnt din celulele melanomice (Ballint K et al., 2005), care accelereaz moleculele de adeziune cum ar fi caderin-N (Liu ZJ, 2006) prin intermediul factorului de transcripie TCF/LEF. Activitatea crescut a receptorului Notch a fost corelat cu activarea cii PI3KAkt din celulele melanomice (Liu ZJ, 2006); ca la cancerul de sn, baza interaciunii dintre aceste dou ci rmnnd a fi determinat.

3.3.3. Cile de semnalizare ale receptorului Notch n controlul angiogenezei tumoraleModul de semnalizare Notch este unul pstrat evoluional care controleaz deciziile sorii celulei din timpul dezvoltrii embrionice al vertebratelor i nevertebratelor. n 1919 s-a observat o mutaie la zburtoarele fructelor, mutaie ce cauzeaz crestturi pe marginea femelelor heterozigot. n 1980, aceast gen a fost clonat i identificat ca fiind un receptor Notch de atunci, multe studii s-au documentat despre rolul semnalizrii Notch n procese variate de dezvoltare. Exist patru gene mamifere, Notch1 Notch4, i 5 liganzi, Jagged1 i Jagged2 (omologii Drosophila Serrate-ca proteine) i Delta-de exemplu 1 (DLL1), DLL3 i DLL4. Receptorii i liganzii Notch conin domeniile transmembranei ce sunt exprimai pe suprafaa celulei i, din acest motiv, semnalizarea Notch este important n comunicarea mediat dintre celule adiacente ale receptorilor i liganzilor (Figura 18, Caseta 1).

46


Figura 18. Un model de semnalizare Notch. Liganzii Notch Jagged1-2, Delta-1, -3 sau -4 se leag la receptorii Notch 1, -2, -3 sau- 4 prin celule adiacente. Legtura receptor-ligand duce la dou evenimente de clivaj: clivaj S2 imediat n afara domeniului transmembranar prin factorul de necroz tumoral al unei enzime de conversie (TACE), care desparte domeniul extracelular de domeniul intracelular; urmat de clivajul de la S3 n cadrul domeniului transmembranar de o multiprotein din complexul secretaza (controlat de presin ilin) care elibereaz ntregul domeniu intracelular al receptorului Notch (NCID) din membran. Clivajul S1 (neartat) are loc n Aparatul Golgi de ctre furin, care desparte lungimea total de 300kDa a receptorului Notch n dou proteine ce se asocieaz la suprafaa celulei. NCID transloc la nuclei acolo unde se leag de CSL - proteina represoare transcripional. Legarea lui NCID cauzeaz eliberarea proteinelor co-represor transcripionale CoR ce conin activitatea histonei deacetilaz care pstreaz linitit cromatina transcripional. Dup legarea lui NCID, sunt transcrise genele int, inclusiv acelea ce codific proteinele helix-loop-helix, Hes1, -5, -7, Hey1, -2 i L. Aceste gene int Notch sunt cel mai bine47


caracterizate dar altele rmn a fi identificate. Semnalizarea Notch poate fi reglat prin diverse proteine, inclusiv Sel10, care direcioneaz NCID nuclear spre ubiquitinare i descompunere.

Liganzii Notch Jagged1-2, Delta-1, -3 sau -4 legai la receptorii Notch 1, -2, -3 sau- 4 la celule adiacente. Legtura receptor-ligand duce la dou evenimente de clivaje: clivaj S2 n afara domeniului transmembranar prin factorul de necroz tumoral ce convertete enzima (TACE), care desparte domeniul extracelular de domeniul intracelular; urmat de clivajul de la S3 n cadrul domeniului transmembranar de o multiprotein din complexul secretaza (controlat de presin ilin) care elibereaz ntregul domeniu intracelular al receptorului Notch (NCID) din membran. Clivajul S1 (neartat) apare n Golgi de ctre furin, care desparte lungimea total de 300kDa a receptorului Notch n dou proteine ce se asocieaz la suprafaa celulei. NCID transloc la nuclei acolo unde se leag de CSL - proteina represoare transcripional. Legarea de NCID cauzeaz eliberarea proteinelor co-represor transcripionale CoR ce conin activitatea histonei deacetilaz care pstreaz linitit cromatina transcripional. Dup legarea de NCID, sunt transcrise genele int, inclusiv acelea ce codeaz proteinele helix-loop-helix, Hes1, -5, -7, Hey1, -2 i L. Aceste gene int Notch sunt cel mai bine caracterizate dar altele rmn a fi identificate. Semnalizarea Notch poate fi reglat prin diverse proteine, inclusiv Sel-10, care direcioneaz NCID nuclear pentru ubiquitinare i descompunere.

3.3.4. Modul de semnalizare NotchReceptorii Notch sunt proteine heterodimerice compuse din proteine extracelulare i intracelulare care sunt sintetizate de o singur polipeptid i clivate [clivajul site-1 (S1)] de o convertaza de tipul furinei din Aparatul Golgi nainte de transportul la membrana celular. Domeniul extracelular al ambilor receptori i liganzi se compune dintr-un numr variabil al factorului de cretere epidermal (EGF. Proteinele glicozil transferaze pot modifica unitile repetitive EGF ale receptorului Notch din aparatul Golgi i aceast activitatea regleaz interaciunea receptor-ligand prin creterea abilitii receptorilor Notch de a se lega la celulele expresive de ligand (Bruckner, K et al, 1986). Deasupra legturii receptor-ligand, Notch este procesat la clivajul S2, mediat de48


metaloprotease TACE, care apare n ectodomeniul receptorului imediat n afara domeniului de transmembran astfel separnd domeniilor receptorilor intracelulari i extracelulari i elibernd ntregul domeniu extracelular al receptorului. Acesta este urmat de un clivaj la S3 n cadrul domeniuluji transmembranar de un complex multiproteic cu o greutate molecular ridicat, care include g-secretaza, presenilin i variai cofactori, astfel elibernd ntregul nivel intracelular al receptorului Notch (NCID) (De Strooper, B et al, 1999). NICD se poate apoi transloca la nucleu acolo unde se leag de factorul de transcripie CSL [Cpromoter binding factor-1 (CBF-1). Fr legtura NICD, CSL se asociaz cu un complex corepresor, care conine activitatea histonei deacetilaz, pstrnd cromatina ntr-o stare inactiv transripional. Legtura NICD elibereaz inhibiia sa, rezultnd gene int n transcripie, cum ar fi acelea ce codific represorii transcripionali helixloophelix Hairy/Enhancer of Split (HES) i genele HES i proteina HERP (HES proteina represor), HESR (HES-), HEY (HES- cu YRPW), CHF (Cardiovascular factorul helixloophelix), i HRT (factorul de transcripie Hairyrelated). Recunoaterea NICD de Sel-10 este dependent de hiperfosforilarea NCID a unei kinaze necunoscute. Modul de semnalizare Notch are un rol important n apoptoz, difereniere, proliferare i oncogenez. Cercetrile recente demonstreaz c semnalizarea Notch poate avea un rol crucial n angiogeneza tumoral care furnizeaz o direcie nou n terapia antiangiogenic.

3.4. Favorizarea angiogenezei tumorale de ctre NotchProteinele Notch au un rol important n controlarea angiogenezei tumorale (Tabelul 1).Tabelul 1.Proteinele

Notch au un rol important n controlarea angiogenezei tumorale.Fenotipul sau cercetrile Knockouts sunt embrionic letale de la defectele vasculare, neuronale i somitice Referinele (Krebs,LT et al, 2000; Huppert, S et al. 2000; Limbourg FP et al, 2005)

Componenta semnalizrii Notch Notch n dezvoltarea vascular embriononar Nocth 1

49


Notch 2 Notch 3 Notch 4

Deleia homozigotic a seriilor 1-2 EGF duce la o dezvoltare anormal a rinichilor, a inimii i a vascularizaiei ochilor Letalitate perinatal Dezvoltare embrionar normal, fertilitate i sntate la aduli Mutaie legat la CADASIL la oameni Dezvoltare embrionar normal, fertilitate i sntate la aduli Rezultatele activrii constitutive din anormalitile vasculare i moarte embrionar Mutaiile duble ale Notch 1 i 4 expun defecte vasculare severe

(McCright B et al, 2001) (Krebs, LT et al, 2003) (Joutel, A et al, 1996) (Krebs, LT et al, 2000) (Uyttendaele, H et al, 2001; Carlson, TR et al, 2005)

Jagged1

Mutaie conectat la sindromul Alagilles la oameni Knockouts expun defecte vasculare severe; moarte embrionar DLL1 Knockouts expun defecte n somitogenez; moarte embrionar de la hemoragii severe DLL4 Pierderea funciei duce la defecte n dezvoltarea arterelor i remodelarea vascular; moarte embrionar RBPJ Model knockout endotelial specific are defecte vasculare severe similare fenotipului Notch1/4; moarte embrionar Hey1, 2 Pierderea combinat duce la moartea embrionar din cauza lipsei remodelrii vasculare i hemoragiei (vasculogenez normal, angiogenez anormal Pierderea Hey1 cedeaz un fenotip normal Efecte cardiace i letalitate postnatal cu pierderea Hey2 Notch favorizeaz angiogeneza DLL4 Controlul n vasculatura tumorilor de sn grefate la oareci Cretere n vasculatura snului uman i esutul tumoral al rinichilor Cretere n condiii hipoxice i expresia reglat de HIF1, VEGF i bFGF Jagged1 Cretere n carconomuri celulare scuamoase de cap i gt (HNSCC) stimulate de factori de cretere Induce formarea tuburilor de celule endoteliale co-cultivate (EC) cu celulele HNSCC Notch 1,2,4 O activitate crescut n celulele sarcomului Kaposi (KS) in vitro i in vivo Inhibi

Date post:	06-Jul-2015
Category:	Documents
Upload:	bogdan-iancu
View:	940 times
Download:	0 times

Delia_Alexa_licenta_11

Documents