+ All Categories
Home > Documents > Cursul 8, 9, 10 IG

Cursul 8, 9, 10 IG

Date post: 01-Dec-2015
Category:
Upload: ramona-dany
View: 108 times
Download: 2 times
Share this document with a friend
Description:
curs inginerie
49
CURS 9+10 Inginerie genetica Biologie III 15.05.2013
Transcript
Page 1: Cursul 8, 9, 10 IG

CURS 9+10

Inginerie geneticaBiologie III

15.05.2013

Page 2: Cursul 8, 9, 10 IG

Obţinerea Organismelor Modificate Genetic

Primul organism modificat genetic (OMG) a fost obţinut la specia Escherichia coli, de către Cohen, Boyer şi Berg, în anul 1973

În 1978, compania Genentech, fondată de Boyer, a creat o linie transgenică de E. coli, capabilă să sintetizeze insulina umană, iar astăzi majoritatea aplicaţiilor biotehnologice moderne sunt destinate sistemului sanitar.

Plantele (de cultură) modificate genetic (PMG) se bucură de cea mai mare notorietate, reprezentând subiectul celor mai intense controverse referitoare la introducerea şi utilizarea biotehnologiilor moderne.

Plantele transgenice reprezintă tehnologia agricolă cu cea mai rapidă răspândire din istoriea agricolă. Astfel de plante au fost obţinute încă din anii 1980 - varietăţi de tutun şi tomate rezistente la virusuri erau cultivate în China; tutunul rezistent la Virusul Mozaicului Castravetelui (Cucumber Mosaic Virus) a fost cultivat în scop comercial în China, începând din 1992.

Utilizarea PMG în alimentaţia umană a fost consemnată în 1996, odată cu comercialiyarea pastei de tomate obţinută din tomatele FlavrSavr, cu coacere întârziată,

Page 3: Cursul 8, 9, 10 IG

Obţinerea Organismelor Modificate GeneticOdată cu răspândirea PMG-urilor în culturile comerciale, a crescut

considerabil numărul liniilor transgenice disponibile şi numărul speciilor din care derivă liniile transgenice destinate cultivării, printre acestea:

plante cu o importanţă economia mondială: porumbul, orezul, soia, bumbacul, grâul, tomatele, prunul, inul, floarea soarelui sau rapiţa;

plante cu impact economic mai mic: papaia, broccoli, pepenele galben sau cicoarea.

Utilizarea PMG şi a produselor biotehnologice în general, a generat numeroase controverse:

Susţinătorii biotehnologiilor – în principal companiile producătoare, precum şi o mare parte a comunităţii academice – afirmă că utilizarea plantelor de cultură transgenice va determina:

- creşterea productivităţii agricole globale, - va contribui la asigurarea securităţii alimentare, - scăderea sărăciei în ţările în curs de dezvoltare - va reduce dependenţa agriculturii de inputurile chimice, ajutând

la diminuarea poluării Opozanţii noii tehnologii, reprezentaţi în principal de adepţii mişcărilor

ecologiste şi ai agriculturii biologice, contestă beneficiile menţionate mai sus, insistând asupra potenţialelor efecte negative pe care PMG-urile le pot provoca asupra echilibrului ecosistemelor, economiei, sănătăţii etc.

Page 4: Cursul 8, 9, 10 IG

Metode de obţinere a PMG-urilor

Biotehnologiile moderne sunt• Tehnici in vitro care utilizează acizii nucleici; sunt incluse în această

categorie: tehnica ADN-ului recombinant şi injectarea directă de acizi nucleici în celule sau organite celulare;

• Tehnici care depăşesc barierele naturale de recombinare sau reproducere fiziologică, în care nu sunt utilizate în procedeele tradiţionale de ameliorare şi selecţie.

Transformarea presupune introducerea unui segment de ADN, care reprezintă o combinaţie sintetică de elemente (promotori, gene structurale şi terminatori), în genomul unui organism denumit „receptor”.

Secvenţa promotoare, situată înaintea regiunii codificatoare, are rolul de a controla expresia acesteia în plantă.

Secvenţa terminatoare este responsabilă de: - întreruperea transcripţiei, - poliadenilarea capătului moleculei de ARNm, - marchează sfârşitul regiunii codificatoare.

Această construcţie, promotor-genă-terminator, se numeşte casetă genică

Page 5: Cursul 8, 9, 10 IG

Metode de obţinere a PMG-urilor

Pe lângă gena de interes şi elememntele regulatoare ale acesteia, într-un insert pot fi prezente şi alte elemente genetice, rolul acestora fiind de a controla şi stabiliza funcţia genei, sau de a facilita combinarea diferitelor elemente ale construcţiei genice

Insertul va fi integrat doar pe unul dintre cromozomii prezenţi în genomul di- sau poliploid (inserare neomoloagă) al organismului transformat care este astfel heterozigot (hemizigot). De aceea, transformarea este deseori urmată de backcrossing, în vederea obţinerii unei linii transgenice homozigote. Ulterior, cel puţin în cazul porumbului, companiile producătoare de seminţe încrucişează elita transgenică homozigotă cu linii netransformate, în vederea producerii unor hibrizi comerciali care prezintă, atât secvenţele transgenice, cât şi caracteristicile superioare obţinute prin ameliorare clasică. Aceşti hibrizi comerciali sunt astfel hemizigoţi pentru caracterul transgenic.

Promotor Gena T Promotor Gena T

Caseta 1 Caseta 2

Page 6: Cursul 8, 9, 10 IG

Biotehnologia modernă ≡ Ingineria genetică ≡ modificarea genetică

≡ transformarea genetică ≡ transgeneza Genele transferate sunt denumite transgene Produsele obţinute poartă numele de organisme modificate

genetic (OMG), sau organisme transgenice Avantajele transformării genetice comparativ cu metodele clasice

de ameliorare care au ca scop tot obţinerea de organisme noi (cu informaţie genetică modificată în scop favorabil), sunt:

Se transfera odată un caracter/mai multe caractere (gene pentru caracterele respective) a căror exprimare se determină şi se identifică la organismul modificat;

Gena transferată poate proveni din orice sursă (microrganism, plantă, animal);

Pentru testare în condiţii de cultură se folosesc strict plante selectate, purtătoare a informaţiei de interes.

Page 7: Cursul 8, 9, 10 IG

Crearea unei plante transgenice presupune parcurgerea a 4 etape:

1. Izolarea și clonarea unei gene de interes2. Construcţia unui vector care să posede semnalele utile

expresiei genei și selecţia transformanţilor3. Transferul genei4. Regenerarea, selecţia și caracterizarea plantelor

transgenice

Aspectele privind punctele 1 și 2 – privesc domenii de genetică moleculară. Izolarea și clonarea genelor implică introducerea de segmente de ADN în celule

bacteriene, care pe medii de cultură adecvate se vor înmulţi și vor forma colonii. Astfel, molecula de ADN introdusă se replică odată cu bacteria purtătoare.

Coloniile de bacterii, selecţionate ca fiind purtătoare a unei anumite informaţii genetice vor fi păstrate în bănci de gene. Aceste bănci de gene reprezintă colecţii de construcţii de ADN în vectori introduși în bacterii.

Page 8: Cursul 8, 9, 10 IG

Metode de obţinere a PMG-urilor

Pentru obţinerea plantelor transformate genetic, cele mai utilizate metode sunt : transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciens trasferul direct de ADN

I. Transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciensA. tumefaciens este o specie de bacterii patogene aerobe, care trăieşte în sol şi are

capacitatea naturală de a transfera un segment de ADN, denumit „T-ADN” localizat în plasmidul Ti (tumor inducing), în genomul plantelor superioare pe care le infectează. T-ADN-ul este integrat stabil într-unul dintre cromozomii celulei gazdă şi exprimat ulterior, determină proliferarea excesivă a ţesuturilor, sub forma de rădăcini (A. rhizogenes) sau excrescenţe canceroase specifice.

Procesul natural de transfer a constituit model pentru procedeele de laborator concepute de specialişti. Strategia transformării mediate de A. tumefaciens presupune eliminarea genelor bacteriene care produc tumora, în locul lor fiind plasat insertul ce trebuie transferat.

Aceasta are deci la bază proprietatea conform căreia orice fragment străin de ADN plasat între secvenţele ce mărginesc iniţial T-ADN-ul, poate fi transferat în celulele plantelor prin infecţie. Este astfel posibilă introducerea genei de interes în celulele plantei fără a cauza tumora. Secvenţele ce mărginesc T-ADN-ul sunt denumite „TR” (T-ADN right) şi „TL” (T-ADN left), doar prima fiind considerată indispensabilă procesului de transfer.

Sistemul a fost intens utilizat pentru trasformarea unor specii importante de cultură: tomate, canola, bumbac şi cartofi, obţinându-se peste 40 de linii MG.

Page 9: Cursul 8, 9, 10 IG

Identificarea, izolarea și clonarea genelor de interes

Plasmida Ti utilizată în transformare la plante este o plasmidă la care genele responsabile pentru inducerea formării tumorilor sunt îndepărtate prin tehnici de inginerie genetică și înlocuite cu alte gene de diverse origini (de la plante, bacterii, virusuri).

Promotor Terminator

Page 10: Cursul 8, 9, 10 IG
Page 11: Cursul 8, 9, 10 IG

Obtinerea plantelor transgenice folosind bacteria Agrobacterium tumfaciens

Page 12: Cursul 8, 9, 10 IG

Metode de obţinere a PMG-urilor

• II. Transferul direct de ADN

Transferul direct de ADN în celulele plantelor se poate realiza utilizând agenţi

• fizici sau chimici, care au rolul de a media pătrunderea şi integrarea informaţiei genetice. Pe aceste căi au fost obţinute o serie de varietăţi transgenice de porumb şi orez. Aceste metode implică uneori îndepărtarea peretelui celular şi obţinerea de protoplaşti. Acest tip de celulă reprezintă stuctura ideală pentru introducerea ADN-ului şi selecţia evenimentelor transgenice. Dezavantajul utilizării protoplaştilor este reprezentat de rata scăzută de regenerare a plantelor din protoplaşti, motiv pentru care această metodă nu este foarte mult aplicată.

Cele mai utilizate metode din această categorie sunt:

• 1. Transformarea cu ajutorul substanţelor chimice - polietilenglicolul (PEG), substanţă care are capacitatea de a modifica proprietăţile membranei plasmatice, determinând permeabilizarea reversibilă a acesteia şi permiţând pătrunderea macromoleculelor străine în citoplasmă. Primul succes utilizând această metodă a fost înregistrat în 1984 - transferul şi exprimarea T-ADN-ului provenit de la A. tumefaciens în protoplaşti de tutun.

• 2. Transformarea prin microinjecţie - Primele rezultate de transformare genetică utilizând această metodă au fost obţinute la şoarece.

• La plante datorită prezenţei peretelui celular eficienţa transferului şi integrarii ADN este mult redusă.

Page 13: Cursul 8, 9, 10 IG

Metode de obţinere a PMG-urilor

3. Transformarea prin electroporare - Expunerea protoplaştilor la impulsuri electrice care determină permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice, facilitând transferul ADN-ului

4.Transferul genelor prin metoda biolistică (bombardament cu microproiectile)

Este o metodă prin care se elimină limitele datorate dificultăţilor regenerării plantelor din protoplaşti şi capacităţii bacteriilor Agrobacterium de a infecta doar anumite specii de plante. Poate fi aplicată unei game foarte variate de explante, ca: suspensii de celule embriogenice, meristeme, embrioni, embrioni imaturi şi polen.

În principiu, metoda presupune bombardarea celulelor sau ţesuturilor cu particule de tugsten sau aur, de dimensiuni micoscopice, căptuşite cu ADN-ul care trebuie transferat. Avantajul acestei metode este faptul că aproape orice tip de ţesut care are potenţialul de a regenera plante poate fi utilizat ca ţintă pentru ADN-ul străin.

În anul 1988, soia a fost prima specie modificată genetic, utilizând metoda• biolistică, iar ulterior au fost obţinute linii transgenice la alţi peste 20 de

taxoni printre care porumbul, tutunul, soia şi bumbacul.

Page 14: Cursul 8, 9, 10 IG

Bombardamentul biolistic sau cu microproiectile

Page 15: Cursul 8, 9, 10 IG

Transformarea optimă se caracterizează prin: prezența unei singure copii a transgenei gena segregă mendelian în generațiile următoare gena se exprimă uniform de la o generaţie la alta.

Pentru ca agricultura să beneficieze de posibilitățile oferite de tehnologia transferului de informație genetică, genele de interes trebuie încorporate în varietăți comerciale trebuie demonstrat că ele funcționează eficient că nu a afectat celelalte caracteristici ale varietăților în cauză

Cu alte cuvinte, o linie transgenică trebuie să își demonstreze valoarea parcurgând o serie de teste, care încep în laborator și continuă în câmp, pe suprafețe din ce în ce mai mari, în condiții de producție.

Page 16: Cursul 8, 9, 10 IG

Selecţia plantelor care exprimă la un nivel optim caracterul transferat

Teste de laborator Orice experiment de transformare genetică se încheie cu analiza

moleculară și biochimică a popuţiei de plante obţinute, care urmărește stabilirea:

Prezenţei transgenei în genom: metoda PCR / real time PCR, cu primeri oligonucleici adecvaţi amplificării genei. ADN amplificat este evidenţiat prin electroforeză / curbă pe ecran.

Numărului de copii al transgenei - prin hibridare moleculară de tip Southern

Nivelul de expresie a transgenei - hibridare de tip Northern

Prezenţei proteinei codificate de transgenă - se pune în evidenţă proteina prin hibridare de tip Western, utilizându-se un anticorp corespunzător

Determinări biochimice: activitatea enzimelor ß-glucuronidaza, luciferaza

Page 17: Cursul 8, 9, 10 IG

Teste efectuate în condiţii de mediu controlate

Rezultatele estimării activităţii fenotipice a transgenei în plantele transformate- se efectuează în camere de creștere sau seră în scopul eliminării liniilor deficiente. Din materialul rămas, sunt selecţionate liniile cele mai promiţătoare, cu care se merge mai departe în teste de câmp.

Există caractere care nu pot fi evaluate corect decât în condiţii de izolare. De exemplu, în cazul rezistenţa la atacurile insectelor – pentru că într-un mediu închis se pot controla atât populaţia dăunătorilor, cît și pagubele pe care aceasta le produce.

Alte caractere nu pot fi însă evaluate corect decât în câmp. De exemplu rezistenţa la erbicidele sulfonil-ureice – erbicide care se aplică în doze atât de mici (4,5 g/ha) încât este aproape imposibilă administrarea lor uniformă în condiţii controlate (în ghivece).

Page 18: Cursul 8, 9, 10 IG

Situaţia la nivel mondial privind comercializarea culturilor MG (Biotech crops), în 2012

Clive James, Foundatorul şi preşedintele International Service for Acquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA): Suprafaţa cultivată cu Plante Modificate Genetic – culturi comerciale aprobate de forurile internaţionale a crescut de 100 ori în intervalul 1996-2012, de la 1,7 mil ha, la 170 mil.ha. Suprafaţa cultivată cu PMG a crescut in 2012 cu 6% comparativ cu 2011 Principalele Biotech crops: soia (80 mil ha), porumb (60 mil ha), bumbac (25 mil ha), rapita (10 mil.ha)Biotech crops: tolerante la erbicide (110 mil ha), rezistente la insecte (25 mil ha), telerante la erbicide + rezistente la insecte (45 mil ha) Proporţia PMG faţă de cele convenţionale: soia 81%, bumbac 81%, porumb 35%, rapiţă 30%

In anul 2011 erau in diferite etape ale procedurii de aprobare pentru cultură:•Soia -15 evenimente;•Sfecla de zahar - 3 evenimentae;•Orez - 1 eveniment pentru procesare si import•Rapita - 10 evenimente;•Cartof - 4 evenimente•Bumbac - 26 evenimente•Flori (garoafe) - 5 evenimente•Porumb - 66 evenimente

Page 19: Cursul 8, 9, 10 IG

PMG

În funcție de prioritățile economice pentru culturile agricole și ordinea cronologică a abordării diferitelor tehnici de transfer de gene, în mod arbitrar se disting 3 etape importante în obținerea plantelor transgenice.

I. Prima generație de plante transgenice Se referă la linii de plante care posedă unul sau, cel mult, două caractere noi:toleranţa la unul sau mai multe erbicide (TE)

toleranţă la un erbicid asociat cu rezistenţă la o insectă (TE/RI)

rezistenţă la dăunători

S-au ales acele caractere biologice care produc cele mai mari pagube speciei în cauză (1/2 până la 5/6 din producție).

Page 20: Cursul 8, 9, 10 IG

a) Plante tolerante la erbicide

Page 21: Cursul 8, 9, 10 IG

Rezultate remarcabile, aplicate la principalele plante de cultură Modificarea cantitativă şi calitativă a ţintei erbicidului

Erbicidul(substanţa activă)

Ţinta Sursa de gene

Funcţia genei

PMG

Sulfonil uree Enzima acetolactat sintaza (ALS) cu rol

în sinteza aminoacizilor:

valina, leucina şi izoleucina

Alte plante (ALS)

Gena mutantă

codifică o enzimă

insensibilă

Bumbac, in

Glifosat Enzima enolpiruvat şikimat fosfat

sintaza (EPSPS) cu rol în sinteza

aminoacizilor: fenilalanina,

tirozina şi triptofan

Alte plante (EPSPS),

Agrobacterium sp.

Gena mutantă

codifică o enzimă

insensibilă-----------------

Gena mutantă pentru

degradarea erbicidului

Soia, porumb, bumbac, rapiţa, sfecla de zahar

Enzima glifosat oxidoreductaza

Page 22: Cursul 8, 9, 10 IG

Introducerea unui sistem de degradare a erbicidului

Erbicidul(substanţa activă)

Ţinta Sursa de gene

Funcţia genei

PMG

Glucosinat de amoniu

Enzima glutamat sintaza(metabolismul azotului)

Streptomyces hygroscopicus,

S.viridochromo-genes

Gena mutantă pentru degradarea erbicidului

Soia, porumb, cicoare, rapiţa, sfecla de zahar

Bromoxinil Inhibitor al trasportului de electroni în cursul fotosintezei

Klebsiella ozaenae

Gena mutantă pentru degradarea erbicidului

Bumbac, rapiţă, tutun

Page 23: Cursul 8, 9, 10 IG

DE CE SOIA ROUNDUP READY?

Soia Roundup ReadySoia clasica

Page 24: Cursul 8, 9, 10 IG

b) Plante transgenice rezistente la atacul insectelor

Pentru obţinerea plantelor modificate genetic rezistente la atacurile unor insecte, au fost folosite gene de origine bacteriană şi / vegetală. Cea mai utilizată sursă de gene pentru rezistenţă este bacteria Bacillus thuringiensis (Bt).

Genele Bt care codifică produşii ce acţionează ca insecticide asupra unor specii de Lepidoptere, Diptere şi Coleoptere au fost transferate la peste 26 de specii cultivate de mono- şi di-cotiledonate.

Deoarece insecticidele biologice pe bază de Bacillus thuringiensis sunt scumpe și sunt rapid descompuse în condiții de camp, s-a decis introducerea genelor care codifică o toxina bacteriană în plantele care necesită protecție la atacul insectelor.

Dintre plantele de cultură la care s-au obţinut PMG, cele mai importante din punct de vedere economic sunt: porumbul, bumbacul, cartoful, rapiţa, soia, lucerna, mărul, viţa de vie, orezul, plopul, nucul, tutunul, vinetele, câteva specii de varză şi tomatele.

Page 25: Cursul 8, 9, 10 IG

Bacteriile Streptomyces constituie o altă sursă de transgene utilizabile pentru obţinerea unor plante rezistente la atacul insectelor. Ex: gena care codifică colesterol-oxidaza, o enzimă ce provoacă liza celulelor epiteliului intestinal la insectele

Anthonomus grandis care atacă bumbacul, Diabrotica undecimpunctata care atacă porumbul, Helithis virescens care atacă tutunul.

La fel bacteria Photorhabdus luminescens care traieşte în intestinele nematozilor entomofagi şi produce toxina active asupra unor insecte aparţinând mai multor ordine.

Se folosesc deasemenea transgene de origine vegetală care pot determina rezistența plantelor la atacurile insectelor. Acestea codifică inhibitori ai proteazelor și lectine.

Page 26: Cursul 8, 9, 10 IG

DE CE CULTURI MODIFICATE GENETIC?

Porumb modificat genetic Porumb clasic

Page 27: Cursul 8, 9, 10 IG

Avantajele cultivarii hibrizilorAvantajele cultivarii hibrizilor Yield Guard Yield Guard

Intensitatea atacului daunatorilor Helicoverpa armigera si Ostrinia nubilalis la hibrizii de porumb GMO si NON GMO

(%)

Page 28: Cursul 8, 9, 10 IG

Porumb SmartStax ™

Cele 8 transgene pe care le cumulează, conferă porumbului SmartStax:

toleranţă la dăunătorii părţilor aeriene (trei gene Bt): cry 1A.105 (Monsanto), cry 2AB2 (Monsanto) şi cry 1F (Dow);

toleranţă la dăunătorii din sol (trei gene Bt): cry 3BB1 (Monsanto), cry 34AB1 (Dow) şi cry 35AB1 (Dow);

toleranţă la erbicide (două gene): glifosat (Roundup Ready, Monsanto) şi glufosinat (Liberty Link, Dow cu licenţă de la Bayer).

Orezul BT

• Aprobat în China în anul 2009

• Exprimă genele cry1Ab/cry1Ac care-i conferă rezistenţă la un dăunător prezent pe 75% din suprafaţa alocată orezului

• Creşterea medie a producţiei cu 8% şi reducerea cu 80% a consumului de pesticide vor aduce beneficii de aproximativ 4 miliarde USD

Page 29: Cursul 8, 9, 10 IG

II. A doua generație de plante transgenice

Prin modificare genetică pot fi obținute nu numai plante care cresc mai bine, ci și produse vegetale cu însușiri nutritive ameliorate. De altfel se anticipează că cea mai mare valoare potențială adăugată plantelor de cultură transgenice rezidă în modificările produselor finite. Ex: Modificări ale conținutului de amidon, proteine, uleiuri și zaharuri Modificarea însușirilor de panificație (grâu), sau creșterea duratei de păstrare a fructelor, Sporirea conținutului de ß-caroten, pentru corectarea deficitului de vitamina A, ameliorarea digestibilității nutrețurilor și furajelor.

Page 30: Cursul 8, 9, 10 IG

Soia MGUleiul produs din soia Vistive® Gold: este asemănător uleiului de măsline în privinţa conţinutului de

acizi graşi mononesaturaţi şi uleiului de rapiţă în privinţa conţinutului de grăsimi saturate, fapt ce va permite eliminarea grăsimilor trans şi reducerea semnificativă a cantităţilor de

grăsimi saturate din produsele alimentare;

este mai stabil la prăjit decât uleiul din soia convenţională şi îşi păstrează aromele.

Soia RReady2Yield™ primul produs comercializat din a doua generaţie creşterea producţiei soiei RReady2Yield™ cu 7 pâna la 11% este

determinată de prezenţa a cel puţin trei boabe / păstaie

Page 31: Cursul 8, 9, 10 IG

Porumb Mavera ™

• Denumirea de piaţă a porumbului cu conţinut mare de lizină, creat pentru avicultură.

• A fost obţinut prin încorporarea în genom, prin metoda biolistică, a genei cordapA de la Corynebacterium glutamicum, care determină producerea în sămânţă a unei versiuni insensibile la reglarea prin retroinhibiţie a enzimei dihdrodipicolinat sintaza.

• Comercializarea porumbului Mavera a fost aprobată din anul 2005 în SUA şi, apoi, şi în Canada, Mexic, Japonia, Filipine, Australia şi Taiwan.

Page 32: Cursul 8, 9, 10 IG

Porumbul care sintetizează fitaza

• A fost creat de Academia de Ştiinţe Agricole din China și a fost licenţiat, după șapte ani de studiu, Origin Agritech Limited.

• Inclus în raţia suinelor, va determina metabolizarea semnificativ mai intensa a fosforului din hrană și, implicit, va asigura o creștere mai rapidă în greutate a porcilor, ceea ce înseamnă, în ultimă instanţă, producerea mai eficientă a cărnii.

• Includerea acestui porumb în dieta animalelor monogastrice va contribui, de asemenea, la reducerea poluării solului, apelor curgătoare și freatice cu fosfor provenit din dejecţii.

Page 33: Cursul 8, 9, 10 IG

Orezul auriu• WHO: 250,000 –500,000 copii

orbesc în fiecare an din cauza insuficienţei vitaminei A. Orezul convenţional nu conţine provitamina A

• Golden Rice a fost obţinut în 1999 printr-un proiect internaţional, care acumula 1.6 μg/g of β-caroten în bob.

• Numeroase linii au fost obţinute ulterior prin transfer de construcţii genetice care aveau diferiţi promotori pentru exprimare în diferite tipuri de ţesuturi vegetale.

• Golden Rice obţinut de firma Syngenta acumulează în bob o cantitate de peste 31 μg/g de β-carotene

Page 34: Cursul 8, 9, 10 IG

Amflora, cartof utilizat în industrie

• BASF a aşteptat 12 ani pentru aprobarea acestui eveniment de transformare

• În 2010, va fi cultivat în Suedia, Germania şi Republica Cehă

• BASF: obţinerea cartofului Amflora a fost inspirată de industria europeană a amidonului

• Spre deosebire de amidonul din grâu şi din porumb, amidonul din cartof este mai valoros pentru că are greutate moleculară mare (ceea ce-i conferă excelente proprietăţi de îngroşare), iar la extracţie este “însoţit” de cantităţi mai mici de grăsimi şi proteine

• Prin modificare genetică, BASF Plant Science a creat cartoful cu un amidon alcătuit în proporţie de 100% din amilopectină

• Acest amidon este folosit în scopuri tehnice, în industriile hârtiei, adezivilor şi textilă, iar deşeurile se pot folosi la hrana animalelor

Page 35: Cursul 8, 9, 10 IG

Tomatele comercializate în stare proaspătă Flavr Savr – primul produs alimentar aprobat pentru consum in Europa 1996. În vederea menținerii fermității pulpei roșiilor coapte pe durata transportului, s-au folosit 2 strategii: blocarea sintezei enzimei poligalacturonaza (PG) care în mod nomal degradează pereții celulelor; blocarea sintezei etilenei (hormon celular care declanșează și accelerează coacerea) și respectiv întârzierea duratei de coacere a tomatelor (transferul a două transgene implicate în sinteza etilenei). Cartof modificat genetic cu o genă de origine bacteriană – pentru mărirea conținutului de amidon de la 22 la 25% micșorarea absorbției uleiurilor în timpul preparării cartofilor prăjiți.

Cartof modificat genetic cu diferențe de structură moleculară privind raportul dintre amiloză și amilopectină. Aplicații în industria agroalimentară (amidon și agent de îngroșare) și industria hârtiei.

Page 36: Cursul 8, 9, 10 IG

Plante transgenice de plop, eucalipt producătoare de biomasă pentru obținerea etanolului

Plante transgenice de cartof cu lignina modificată pentru fabricarea hârtiei

Plante de rapiță și bumbac modificate pentru a produce un material plastic biodegradabil

Bumbac care sintetizează melanină - nu mai este nevoie de colorarea bumbacului

Plopul galben modificat genetic pentru decontaminarea terenurilor poluate cu mercur ionic și metil-mercur

Muștar modificat genetic pentru toleranță la terenuri contaminate cu Cd

Tutun care degradează hidrocarburile poluante (petrol)

Page 37: Cursul 8, 9, 10 IG

III. A treia generație de plante transgeniceCea de a treia generaţie de plante transgenice include: linii producătoare de molecule terapeutice sau vaccinuri, destinate animalelor domestice sau de crescătorie; linii producătoare de enzime farmaceutice active.

Pentru noile aplicaţii ale PMG se foloseşte termenul "molecular farming", însemnând folosirea plantelor pentru producerea de molecule. Dacă faţă de produsele transgenice ce constituie rezultatul aplicaţiilor încadrate în domeniul agriculturii există încă o puternică opoziţie din partea consumatorilor, cele din noua categorie sunt “ignorate”. Aşa se explică interesul crescând al investitorilor în domeniul ingineriei genetice la plante faţă de tehnologiile de producere de molecule cu destinaţii deosebite.

Producerea de molecule terapeutice sau vaccinuri în plantele transgenice prezintă o serie de avantaje:

Producția de materie vegetală este ușoară și ieftină Vaccinurile obținute pot fi păstrate la temperatura mediului ambiant,

ca material vegetal – fructe, rizomi, tuberculi Riscurile contaminărilor virale, sau bacteriene asociate utilizării

vaccinurilor produse pornind de la țesuturi umane, sau animale sunt eliminate

Page 38: Cursul 8, 9, 10 IG

Exemple de studii cu plante transgenice: Plante vaccinuri:

Porumb cu antigenă a virusului gastroenteritei porcine Cartof și salată purtătoare a unor gene anti hepatita B Cartof cu gene anti holeră

Plante producătoare ale unor enzime farmaceutice: Plante purtătoare ale genelor care determină sinteza

enzimei glucocerebrozida tratament în boala Gaucher Porumb purtător al genelor pentru sinteza de

ß-glucuronidazei și a avidinei (compuși utilizați în diagnostic)

Plante cu caracteristici deosebite: Rapiță cu cantitate de 2 ori mai mare de vitamina E Tomate cu capacitate de sinteză ridicată a antioxidanților Cartof cu metabolismul carbohidraților modificat, care nu

se brunifică la prăjire.

Page 39: Cursul 8, 9, 10 IG

TESTAREA OMG

Conform legislaţiei europene (i.e. Directiva 18/2001/CE), OMG-urile introduse pe

piață ca produse în sine sau componente ale altor produse trebuie etichetate

corespunzător. Pragul limită pentru etichetatarea OMG-urilor autorizate este de 0,9%, cu tendinţă de diminuare a acestui preg la minimum posibil pentru metodologiile de testare. Aceatea se aplică pentru:

produselor alimentare care urmează să fie furnizate ca atare consumatorului

• final şi care conţin sau constau din OMG-uri, sunt obținute din OMG-uri

• sau conțin ingrediente obținute din OMG-uri; această categorie include şi

• produsele organice;

OMG-urilor destinate utilizării ca furaje, furajelor care conțin sau constau

• din OMG-uri, furajelor produse din OMG-uri.

La testare, dacă un produs a fost identificat pozitiv pentru unul sau mai multe evenimente de transformare, următoarele etape ale analizei au ca scop determinarea cantitativă a conţinutului OMG, la nivel de ingredient.

În cazul în care un produs conţine mai multe evenimente de transformare derivate din acelaşi taxon, pentru compararea cu pragul de 0,9% proporţiile acestora sunt luate în considerate împreună.

Page 40: Cursul 8, 9, 10 IG

TESTAREA OMG

Testarea propriu-zisă implică:

EŞANTIONAREA probei de analiză - care este realizată de persoane autorizate, după proceduri acreditate, în condiţii speciale

EXTRACŢIA ADN

EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN (Cuantificarea spectrofotometrică, Evaluarea stării de fragmentare a moleculelor de ADN, Confirmarea absenţei substanţelor inhibitoare

Aplicarea METODELOR ANALITICE DE TESTARE OMG

Page 41: Cursul 8, 9, 10 IG

Metode disponibile pentru testările OMG

Page 42: Cursul 8, 9, 10 IG

Soia Roundup Ready (evenimentul de transformare GTS 40-3-2)

Motivarea alegeri evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pentru explicarea metodologiei de lucru:

soia transgenică prezintă o mare importanţă pentru agricultură - soia tolerantă la glifosat a fost cultivată pe mai mult de 70 milioane ha, ceea ce reprezintă aproximativ 80% din suprafaţa globală aferentă aceastei specii

În Europa importul şi utilizarea în alimentaţia oamenilor şi a animalelor a fost posibilă încă din 1996, iar din aprilie 2012 a fost autorizată cultivarea

Evenimentul de transformare la soia (Glycine max) GTS 40-3-2 este comercializat sub denumirea Roundup Ready (RR), a fost creat de Monsanto (www.monsanto.com) în scopul utilizării erbicidelor totale pe bază de glifosat pentru controlul buruienilor în culturi comerciale.

Glifosatul este o substanţă cu acţiune sistemică şi constituie ingredientul activ al erbicidului RoundUp produs de Monsanto. Acesta se aplică post-emergent, fiind utilizat în întreaga lume ca agent neselectiv de control al buruienilor.

Glifosatul inhibă enzima 5-enolpiruvishikimat-3-fosfat sintaza. EPSPS este esenţială căii biochimice a shikimatului, substanţă implicată în producerea aminoacizilor aromatici fenilalanină, tirozină şi triptofan. Inhibarea enzimei EPSPS are ca rezultat suprimarea creşterii şi în cele din urmă moartea plantei.

Page 43: Cursul 8, 9, 10 IG

Soia Roundup Ready (evenimentul de transformare GTS 40-3-2)

GTS 40-3-2 a fost obţinut prin introducerea în varietatea comercială A5403

de soia a genei pentru EPSPS, izolată din linia CP4 a speciei Agrobacterium tumefaciens. Gena introdusă codifică proteina EPSPS insensibilă la acţiunea glifosatului, astfel că planta poate metaboliza aminoacizii aromatici în cazul aplicării erbicidului Roundup.

Construcţia genetică introdusă în soia RR este alcătuită din: gena EPSPS promotorul constitutiv optimizat 35S (P-E35S) provenit de la Cauliflower

Mosaic Virus Terminatorul sintazei de nopalină (nos) provenit de la Agrobacterium

tumefaciens

Secvenţa CTP4, provenită de la Petunia hybrida, codifică o peptidă de

• tranzit în cloroplaste şi a fost clonată la capătul 5’ al genei de rezistenţă la glifosat. După transfer, peptida de tranzit este îndepărtată şi degradată rapid de o protează specifică.

Reprezentarea schematică a casetei genice introduse în soia Roundup Ready

Page 44: Cursul 8, 9, 10 IG

Soia Roundup Ready (evenimentul de transformare GTS 40-3-2)

Soia se regăseşte într-o gamă foarte variată de produse alimentare destinate consumului uman, gradul de procesare fiind de obicei ridicat şi afectând semnificativ pretabilitatea la testare, datorită degradării moleculelor de interes (ADN sau proteine). Pe piaţa din ţara nostră, produsele de larg consum ce conţin soia sunt:

produse în care extractul proteic din soia înlocuieşte ingredientele de origine animală (ex. cremă vegetală de brâză, pate vegetal, salam vegetal, cremwurşti vegetali, burger vegetal sau pastă vegetală);

lapte de soia, iaurturi şi băuturi răcoritoare;

tofu reprezintă cel mai răspândit produs cu specific asiatic;

batoane energizante;

orice sortiment de ciocolată (conţine lecitină ca aditiv);

unele sortimente de mâncare pentru nou-născuţi;

suplimente proteice;

produse ce conţin ulei vegetal obţinut din soia.

Page 45: Cursul 8, 9, 10 IG

Metodologia de lucru pentru testare şi verificare

Probele sunt colectate de persoane autorizate şi trimise la laboratoare care au acreditatarea pentru astfel de testări. Probele trebuie să fie reprezentative şi suficiente cantitativ pentru aplicarea procedurilor + să rămână un surplus de material pentru re-testări şi verificări.

Tipuri de probe: sămânţă, plante, făină, ştot, furaj, produs alimentar (lapte, biscuit, făină, ciocolată, etc).

Extracţia ADN şi purificarea ADN: metoda CTAB pentru produse procesate şi furaje metoda Qiagen pentru sămânţă şi plante

După testarea cantităţii şi calităţii ADN obţinut de la extracţie se aplică o metodă calitativă, de screening: PCR clasic, sau RT-PCR pentru kit de screening, având drept scop identificarea unor structuri comune pentru OMG, respectiv prezenţa unui promotor, sau a unui terminator. primeri specifici pentru p35S şi pentru terminator NOS. SureFood GMO 35S+NOS + FMV Screening Kit

Dacă proba este pozitivă, trebuie cuantificat evenimentul / evenimentele de transformare genetică prezente în produsul analizat. Pentru cuantificare se poate folosi o metodă clasică PCR, sau metoda RT-PCR cu kituri speciale pentru evenimentul genetic / evenimentele genetice presupuse a fi prezente în produs.

SureFood GMO MON810 Corn sau Roundup Ready Soya real-time PCR kit

Page 46: Cursul 8, 9, 10 IG

Metodologia de lucru pentru testare şi verificare

Tipul de analiză Scopul / metodele Răspunsul obţinut

1. Detectare Prezenţa oricărui tip de ADN străin, sau OMG

PCR sau Real-time PCR

DA / NU

2. Identificare Ce tip de OMG este /sunt prezent /e în probă (aprobate sau nu în UE)

Real-time PCR

Aprobat în UE / Nu este aprobat în UE

3. Cuantificare Ce cantitate de material genetic străin (modificat genetic) este prezent / sunt prezente în proba analizată.

Real-time PCR

-----------%(exprimat procentual, sau cantitativ ng ADN comparativ cu ADN de referinţă)

Page 47: Cursul 8, 9, 10 IG

DNA extraction and purification For each sample 2 DNA extraction + extraction control + positive extraction

control

The DNA extraction procedure implies physical and/or chemical treatments the final goal being removal inhibitors and obtaining enough amount of DNA with high quality.

Samples Quality

A260/A280Quantity

ng/µl

Seeds maize 1.73-1.85 24-35

Seeds soy 1.81-1.93 25-37

Plant maize 1.86-1.91 40-42

Plant soy 1.80-1.88 76-86

Flour 1.59-1.65 104-110

Groats 1.77-1.79 370-395

Forage 1.59-1.65 46-54

Soya Maize

Seeds

Plants

Groats Flour

Page 48: Cursul 8, 9, 10 IG

DNA extraction and purificationTo verify the DNA extraction methods and the accuracy

of the results with spectrophotometer

DNA dilution QualityA260/A280

Quantityng/µl

DSr% r

100 ng/µl 1.83 109.98 3.22 0.16

80 ng/µl 1.83 90.12 2.36 0.12

60 ng/µl 1.78 67.15 4.87 0.24

40 ng/µl 1.78 44.76 1.21 0.06

20 ng/µl 1.66 22.28 5.33 0.27

Repetition Regression line equation R2

1 Y=0.866x – 1.806 0.984

2 Y=0.832x – 5.073 0.998

3 Y=0.881x – 1.100 0.999

4 Y=1.045x – 3.501 0.987

Standard curve with DNA dilution

Page 49: Cursul 8, 9, 10 IG

Organization of the laboratory area

Homogenisation room DNA extraction room

Electrophoresis PCR set-up and gel analysis room Real Time PCR room


Recommended