1

Curs 2

Proceduri

de bază

în laboratorul

clinic

•

Colectarea probelor, variabile preanalitice

•

Reactivi•

Conservarea probelor

2

Colectarea

probelor

de sânge

•

Colectarea şi prepararea probelor necesită măsuri de protecţie pentru personal

•

Colectarea

sângelui

pe nemâncate sau nu (ex. Glucoza şi colesterolul se determină pe probe colectate de la pacienţi dimineaţa, pe nemâncate)

Se fac analize pe probe de:

•

Sânge total•

Ser

•

Plasmă

3

Analiza sângelui

•

Testele se realizează pe sânge total, ser sau plasmă în funcţie de mai mulţi factori

•

Analit – cele mai multe teste hematologice necesită sânge total

•

Instrumentaţia utilizată

•

Procedura de analiză (validare pe ser sau plasmă)

•

Viteza de analiză – cele mai rapide testele pe sânge total; separarea de plasmă sau ser necesită centrifugare sau coagulare/centrifugare

•

Multe teste se referă la analiţi dizolvaţi speciment de analiză ser sau plasmă

•

Excepţii: analiza de hemoglobină, folat

în RBC, gaze din sânge

•

Electroforeza proteinelor – ser (fibrinogenul modifică tablou proteic)

•

Multe teste se pot realiza fie pe ser fie pe plasmă

4

Tuburi de colectare

Vacutainere–

Presiunea scăzută uşurează colectarea

–

Conţin diferiţi anticoagulanţi pentru colectarea sângelui total.

–

Pot conţine aditivi pentru teste specifice (glucoză, metale)

–

Sterile–

Codificare universală de culori a capacelor

5

•

Nu conţine anticoagulanţi sau agenţi de păstrare

•

Se foloseşte pentru preparare de ser–

10-15 min

necesare pt. coagulare înainte

de centrifugareRoşu

Galben

•

Conţine un

gel care formează

o barieră fizică între ser şi masa celulară după

centrifugare•

Nu conţine aditivi

Gri argintiu

•

Măsurarea glucozei•

Conţine NaF, Caox

pentru stabilizarea

glucozei prin inhibarea enzimelor glicolitice

•

Conţine heparinat

de

Na/K/Li. •

Nu se folosesc la măsurări de Na, K, Li

•

Po afecta

mărimea şi forma celulelor; nerecomandate pt. măsurări hematologice

Verde

6

•

Conţine EDTA ca sare de K•

Nepotrivită pt. teste de K şi Ca

•

Conţine EDTA citrat de Na•

Folosit la teste de coagulare deoarece r. este reversibilă

•

Test de Pb

•

Teste de alte elemente în urme

violet

albastru deschis

maro

albastru închis

7

SamplingSampling

Primul pas: colectarea adecvată a probei

“Unless the complete history of any sample is known with certainty, the analyst is well advised not to spend his time analyzing it”

(R.E.

Thiers, Methods

of Biochemical

Analysis. 1957)

8

VariabileVariabile

preanaliticepreanalitice

•

ControlabileFiziologice (poziţie, ex. fizice, variaţia circadiană)CălătoriiDietăStil de viaţă (fumat, consum de alcool)Medicamente

•

NecontrolabileBiologice (vârstă, sex, rasă)De mediu (altitudine, climat, etc.)Condiţie fizică proprie (obezitate, febră, traume, transfuzii, stres, sarcină, intervenţii chirurgicale, etc.)

9

Prepararea probei de sângePrepararea probei de sânge

Sânge

Cheag (fracţiunea celulară+fibrinogen)

Coagulare, CentrifugareSer

Hemoliza: ruperea membranei celulelor roşii cu eliberarea Hb

şi a altor constituenţi celulari în fluidul înconjurător; serul devine din incolor roz

colectat într-un tub curat şi uscat pentru a preveni contaminarea şi hemoliza

O substanţă poate fi prezentă în concentraţii diferite în ser şi în fracţiunea celulală Hemoliza poate introduce erori semnificative

Ex.: K, Fe, Mg, Zn, uree, proteine

Centrifugarea trebuie realizată cât mai repede după separarea serului

!

10

Prepararea probei de sângePrepararea probei de sânge

Când la analiză este necesar sânge total sau plasmă, proba se colectează în tuburi conţinând anticoagulant.

Sânge

Anticoagulant

Fracţiunea celulară

Centrifugare Plasmă

(Ser+fibrinogen)

11

Anticoagulanţi

Heparina

– (sare de Na/K/Li); este scumpă; dă unele interferenţe

Oxalat de potasiu

(1 mg/mL) – precipită Ca din sânge, ceea ce perturbă coagularea; nu se determină în probă Ca sau alte metale care precipită ca oxalaţi

Procedeu: se adaugă în tubul de colectare o soluţie ce conţine cantitatea necesară de Ca, apoi tubul se usucă la 1100

C pentru a evita diluarea probei

Citrat , EDTA, NaF

Temă: ce este warfarina?

12

InterferenInterferenţţee

•

Hemoliza (teste colorimetrice)•

Lipemia şi proteinemia (teste turbidimetrice)

•

Anticorpi umani +HAMA (teste imunologice)

13

Conservarea probei

•

Probe păstrate în condiţii anaerobe (determinarea CO2

) – colectarea probei pe ulei mineral

•

NaF+anticoagulant

-

conservarea probelor de sânge pentru analiza glucozei;

- este un inhibitor enzimatic al glicolizei; deoarece inhibă şi alte enzime, nu se adaugă, de ex. la analiza ulterioară a ureei (este inhibată ureaza)

•

Refrigerare (ser, plasmă) –

procesele enzimatice şi bacteriene sunt încetinite; se recomandă analiza cât mai rapid după colectare

•

Îngheţare (ser, plasmă) –

păstrare mai îndelungată: nu se aplică la sânge total deoarece se distrug celulele roşiiSerul (plasma) –

sunt fracţionate în timpul îngheţării şi trebuie

omogenizate după dezgheţare•

Filtrat liber de proteine (PFF)

–

precipitarea proteinelor în mediu

acid şi filtrare (centrifugare)

14

Filtrat liber de proteine (PFF)

Proteinele din fluidele biologice interferă cu mulţi analiţi

şi trebuie îndepărtate fără a fi distruse

Reactivi de precipitare (coagulare): acid tricloracetic, acid

fosfowolframic

Vser

+ V reactiv

filtrare (fără spălare) sau centrifugare

PFF în acest caz sunt acide dar adecvate pentru cele mai multe analize.

Reactivi de precipitare (coagulare): Ba(OH)2

+ZnSO4

PFF neutru

Avantaj: sunt eliminaţi mulţi interferenţi pentru analiza glucozei; glucoza este stabilă în PFF deoarece enzimele glicolitice

sunt îndepărtate

10 min

15

LiofilizareLiofilizare

(1) Îngheţare (între −50 °C şi −80 °C) . (etapa critică)

(2) Uscare primară• presiunea este coborâtă lent şi proba este încălzită pentru sublimarea apei •Aprox. 95% din apa prezentă este îndepărtată

(3) Uscare secundară• îndepărtarea moleculelor de apă neîngheţată

Conţinutul final al apei este 1-4%.

16

Probe de urinăProbe de urină

Colectare uşoară

•

Proba recoltată dimineaţa •

Proba recoltată /24 ore (conservare cu HCl, HNO3

, H3

BO3

, HAc, Na2

CO3

, timol, toluen, xilen, CHCl3

, etc.)•

Rolul

conservanţilor : reduc activitatea bacteriană şi împiedică descompunerea probei ori precipitarea anumitor constituenţi

•

Factori care afectează analiza:Variabile preanalitice- afectează probele înainte de efectuarea analizelor

Controlabile Necontrolabile (influenţe biologice, de mediu, ciclice pe termen lung)

17

AlteAlte

probe probe biologicbiologiciceice

analizateanalizate

•

Ţesuturi

•

Păr

•

Unghii

•

Salivă

•

Calculi

•

Dinţi

18

Păr Păr (analiza de urme (analiza de urme elementaleelementale))

Sângele şi urina

–

cele mai obişnuite probe pentru

analiza de urme în studii de nutriţie, evaluarea poluării, medicina muncii, etc.

Păr

–

poate furniza indicaţii despre expunerea la metale

Uşor de colectat

Uşor de conservat

Uşor de pregătit pentru analiză

19

Limitări Limitări îîn analiza urmelor n analiza urmelor elementaleelementale îîn părn păr

•

Lipsa de metode standardizate în colectarea, prepararea şi analiza probelor

•

Lipsa de valori de referinţă

•

Probleme datorate contaminării

Totuşi, analiza Pb, As, Hg

în păr este o metodă acceptată pentru evaluarea expunerii la aceste elemente.

20

SSurse de urse de contamincontaminare are îîn analizăn analiză

• Analist

• Reactivi

• Echipament

• Ustensile

21

Întrebări

•

Care sunt principalele fracţiuni ale sângelui?

•

Ce este hemoliza şi ce importanţă prezintă?

•

De ce se adaugă adesea HF probelor de sânge colectate pentru determinarea glicemiei?

•

Ce este filtratul liber de proteine?

•

Ce este liofilizarea?

22

Identificaţi codul de culori al flacoanelor !