1. METABOLISMUL MICROBIAN Metabolismul microorganismelor reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice implicate în activitatea biologică, prin intermediul cărora energia şi elementele biogene sunt preluate din mediu şi utilizate pentru biosinteză, degradare şi creştere, ca şi pentru alte activităţi fiziologice secundare (mobilitate etc). În urma acestor reacţii ale metabolismului, substanţele din mediu sunt transformate în constituenţi celulari, energie şi produşi de metabolism. Funcţiile metabolismului sunt, în principal, următoarele: a) eliberarea de energie şi stocarea acesteia sub formă de ATP şi alţi compuşi macroergici; b) producerea subunităţilor necesare în procesele de biosinteză; c) activarea subunităţilor şi formarea constituenţilor celulari şi d) formarea şi degradarea biomoleculelor necesare anumitor funcţii ale celulei. Căile metabolice reprezintă secvenţe de reacţii chimice, catalizate enzimatic, care permit organismelor vii să obţină din nutrienţi substanţele şi energia necesare vieţii. Reacţiile metabolice se pot desfăşura prin una din următoarele căi: catabolice, anabolice, amfibolice, anaplerotice.
Transcript
1. METABOLISMUL MICROBIAN
Metabolismul microorganismelor reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice implicate în activitatea biologică, prin intermediul cărora energia şi elementele biogene sunt preluate din mediu şi utilizate pentru biosinteză, degradare şi creştere, ca şi pentru alte activităţi fiziologice secundare (mobilitate etc). În urma acestor reacţii ale metabolismului, substanţele din mediu sunt transformate în constituenţi celulari, energie şi produşi de metabolism.
Funcţiile metabolismului sunt, în principal, următoarele: a) eliberarea de energie şi stocarea acesteia sub formă de ATP şi alţi compuşi macroergici; b) producerea subunităţilor necesare în procesele de biosinteză;c) activarea subunităţilor şi formarea constituenţilor celulari şi d) formarea şi degradarea biomoleculelor necesare anumitor funcţii ale celulei.
Căile metabolice reprezintă secvenţe de reacţii chimice, catalizate enzimatic, care permit organismelor vii să obţină din nutrienţi substanţele şi energia necesare vieţii. Reacţiile metabolice se pot desfăşura prin una din următoarele căi: catabolice, anabolice, amfibolice, anaplerotice.
Căile catabolice
Catabolismul este reprezentat de procesele biochimice implicate în degradarea diferiţilor compuşi nutritivi din mediu şi eliberarea de energie în celulă. Reacţiile catabolice sau de dezasimilare au loc în trei etape:- degradarea macromoleculelor din mediul extern până la unităţile mai mici constitutive. Proteinele sunt degradate la aminoacizi, polizaharidele la monozaharide, iar lipidele la glicerol şi acizi graşi. În urma acestei etape este eliberată o mică parte din energia chimică a acestor compuşi, aproximativ 1%, care se pierde sub formă de caldură şi nu este accesibilă celulei.- moleculele rezultate în prima etapă sunt degradate incomplet, până la producerea unor substanţe numite intermediari ai căilor metabolice
4 MICROBIOLOGIE II
centrale, cu eliberare de energie (aprox. 1/3 din total), CO2 şi H2O. Pe căi catabolice cunoscute: calea glicolizei, calea pentozofosfaţilor, Entner Doudoroff, calea Leloir etc, se obţin un număr redus de 12 intermediari ai căilor metabolice centrale, cum este piruvatul sau acetil-CoA. Energia rezultată este utilizată de celulă atât pentru biosinteze cât şi pentru formarea prin fosforilare a compuşilor macroergici.- cea de a treia etapă decurge diferit în funcţie de microorganisme. În cazul microorganismelor aerobe, reacţiile continuă cu ciclul acizilor tricarboxilici (TCA) şi cu fosforilarea oxidativă, rezultând în final, ca produşi principali, CO2 şi H2O. Aceasta cale se desfăşoară cu eliberarea unei mari cantitaţi de energie, sub forma compuşilor macroergici.
Microorganismele anaerobe sau facultativ anaerobe continuă etapa a doua prin procese de fermentaţie anaerobă (alcoolică, lactică, butirică, propionică, acetonobutilică), în care produşii căilor catabolice pot funcţiona ca donatori şi acceptori de H şi electroni, în reacţii de oxidoreducere cuplate. În aceste cazuri, cantitatea de energie eliberată este mult mai scăzută, în raport cu cea eliberată în cursul respiraţiei aerobe.Căile anabolice (de asimilare) sunt căi metabolice prin care celula utilizează compuşi simpli (de obicei intermediari ai căilor metabolice centrale) pentru sinteza blocurilor de construcţie ce intră în structura înalt organizată a celulei. Căile catabolice şi cele anabolice nu sunt complet reversibile şi sunt numai parţial comune. Procesele de biosinteză sunt procese consumatoare de energie şi sunt cuplate cu degradarea ATP la ADP şi Pi. Ca şi procesele de catabolism, procesele anabolice se desfăşoară în trei faze succesive, în sens invers. În urma acestor reacţii, moleculele cu masa mică produse în faza a treia a catabolismului sunt convertite la molecule cu masa mai mare (blocuri de construcţie), care sunt apoi asamblate în molecule proteice, glucidice sau lipidice specifice celulei microbiene.
Metabolismul microbian 21
2. NUTRIŢIA MICROORGANISMELOR
Viaţa microorganismelor şi strategiile de supravieţuire a acestora în diferite medii de viaţă sunt puternic influenţate de nutrienţi şi sursele de energie, de temperatura ambiantă, cantitatea de umiditate, prezenţa sau absenţa gazelor, presiunea osmotică, pH, prezenţa sau absenţa luminii şi a altor radiaţii, alte organisme. Microorganismele sunt atật de bine adaptate şi au un metabolism atật de flexibil încật au reuşit să prolifereze în toate tipurile de habitat (sau nişe), pậnă la cele mai nefavorabile condiţii.
Nutrienţii reprezintă substanţele folosite în biosinteze şi producerea de energie, fiind necesari totodată pentru creştere şi dezvoltare, pentru multiplicare şi pentru întreţinerea altor funcţii celulare. Dacă se cunosc mai multe date referitoare la cerinţele nutritive ale microorganismelor cultivate în laborator, despre nutriţia celulelor microbiene în habitaturile naturale, informaţiile sunt mai reduse, din cauza caracterului heterogen al acestor medii.
În procesul de creştere, microorganismele necesită aceleaşi elemente chimice care se regăsesc în compoziţia celulelor lor, în diferite proporţii. Cele mai deosebite grupe de microorganisme, prezentậnd cele mai diferite adaptări la mediu, prezintă de fapt aceleaşi cerinţe de bază faţă de nutrienţi, reprezentaţi de aşa-numiţii nutrienţi esenţiali. Cele două categorii majore de nutrienţi esenţiali sunt bioelementele majore (macronutrienţii) şi bioelementele minore (micronutrienţii).
Bioelementele majore (macronutrienţii)
Macronutrienţii, necesari în cantităţi mai mari, joacă un rol esenţial în structura celulei şi în metabolismul acesteia. Analiza compoziţiei celulei microbiene a demonstrat că mai mult de 95% din substanţa uscată este reprezentată de cậteva elemente chimice: carbon, hidrogen, oxigen, azot, sulf, fosfor, potasiu calciu, magneziu şi fier. Aceste elemente sunt necesare celulei în concentraţii relativ mari (mai mult de 10-4 M) şi reprezintă constituenţii majori ai biomasei celulare a microorganismelor. Primele 6
22 MICROBIOLOGIE II
elemente enumerate sunt componente esenţiale ale glucidelor, lipidelor, proteinelor şi acizilor nucleici. Celelalte 4 elemente se află în celulă sub formă de cationi şi îndeplinesc roluri diferite. De exemplu, K+ este necesar pentru activitatea unor enzime (inclusiv a celor implicate în sinteza proteinelor); Ca2+ contribuie la rezistenţa termică a endosporului bacterian; Mg2+ este cofactor enzimatic; Fe2+ şi Fe3+ fac parte din citocromi şi din proteinele FeS.
Bioelementele minore (micronutrienţii)
Bioelementele minore, “trace elements” (zinc, mangan, sodiu, clor, molibden, seleniu, cupru, nichel, cobalt), sunt necesare în cantităţi foarte mici, în concentraţii mai mici de 10-4M, fiind de obicei componente ale enzimelor şi cofactorilor şi avậnd rol în menţinerea structurii proteinelor şi în desfăşurarea reacţiilor enzimatice. Unele din aceste microelemente (zinc, mangan) sunt necesare tuturor microorganismelor, în timp ce altele numai în anumite activităţi.
Micronutrienţii sunt necesari în cantităţi atật de mici, încật pot fi preluaţi de microorganisme direct din apă, din unii componenţi ai mediilor de cultură sau din pereţii vaselor utilizate.
Zincul este necesar deoarece ADN şi ARN polimerazele sunt metaloproteide cu zinc, manganul favorizează acţiunea unor enzime care catalizează transferul de grupări fosfat, molibdenul intră în constituţia nitrogenazei, enzimă esenţială pentru procesul de fixare biologică a azotului, cobaltul este un component al vitaminei B12.
3. MEDII DE CULTURĂ Mediile de cultură sunt necesare pentru izolarea şi
identificarea microorganismelor, pentru testarea caracterelor lor morfologice şi fiziologice, pentru analiza apei şi a produselor alimentare, în microbiologia industrială şi alte activităţi. Deşi toate microorganismele necesită surse de energie, carbon, azot, fosfor, sulf şi diferite minerale, compoziţia precisă a mediului de cultură utilizat trebuie corelată cu cerinţele nutriţionale ale speciei ce va fi cultivată.
Mediul de cultură reprezintă un suport nutritiv sterilizat, care permite dezvoltarea unui microorganism în afara nişei ecologice naturale.
Metabolismul microbian 23
Un mediu de cultură conţine un substrat nutritiv complex, care asigură microorganismului cantităţile necesare de apă, surse de carbon, azot, săruri minerale, factori de creştere, necesare în procesele de creştere şi multiplicare şi alte funcţii ale celulei.
4. CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA MICROORGANISMELOR
În urma biosintezei de substanţă nouă, microorganismele cresc prin formare de noi constituenţi celulari, apoi se multiplică.
Prin creştere se înţelege mărirea coordonată a tuturor constituenţilor chimici ai unui organism uni- sau pluricelular, ca rezultat al formării de substanţă nouă. Mărirea masei nu reflectă în mod obligatoriu creşterea normală, echilibrată, deoarece ea poate rezulta din sinteza şi acumularea de materiale de rezervă, în absenţa biopolimerilor esenţiali (ADN, ARN, proteine). De asemenea, la microorganisme, mărirea masei se poate realiza şi prin creşterea conţinutului în apă.
Creşterea celulei microbiene nu se face la infinit, deoarece se ajunge la un moment dat când are loc diviziunea celulei. În felul acesta, creşterea unei populaţii microbiene este rezultatul creşterii şi diviziunii microorganismelor individuale.
Multiplicarea bacteriilor
Multiplicarea bacteriilor se face fie prin diviziune directă, prin înmugurire, prin fragmentare sau prin spori, în funcţie de specia bacteriană.
Multiplicarea prin diviziune este forma cea mai răspandită de multiplicare a bacteriilor, prin care celula-mamă se divide în două celule surori, cel mai adesea identice; deci bacteriile se divid prin sciziune binară izomorfă. Procesul de diviziune are loc în trei etape principale: a) formarea unei membrane care separa protoplaştii ce vor forma celulele-fiice; b) sinteza peretelui celular pe suprafaţa membranei respective sau formarea unui sept transversal prin creşterea spre interior a peretelui celular şi c) separarea celulelor rezultate.
24 MICROBIOLOGIE II
Măsurarea creşterii populaţiilor microbiene
Măsurarea creşterii populaţiilor microbiene poate fi efectuată în scopuri pur experimentale pentru studiul cineticii de creştere a unei specii date, în anumite condiţii de dezvoltare, sau în diferite domenii practice - medical, industrial, alimentar etc.
Tehnicile de măsurare a creşterii sunt în mod obişnuit bazate pe evaluarea numărului de microorganisme sau a masei acestora din unitatea de volum sau de masă a mediului de cultură. Numărarea directă a celulelor microbiene
Bacteriile sau drojdiile sunt considerate, în această tehnică, particule ce pot fi numărate în stare proaspătă sau după colorare. Metoda cea mai simplă este vizualizarea la microscop, cu ajutorul unei lame speciale, prevăzută cu un caroiaj de anumite dimensiuni. Această tehnică se aplică în mod curent în special în numărarea celulelor de talie mare cum sunt drojdiile sau sporii de mucegai, dar şi cazul bacteriilor. Principalele dezavantaje ale metodei sunt următoarele: nu deosebeşte celulele vii de cele moarte; este greu de folosit în cazul bacteriilor de dimensiuni mici; nu poate fi aplicată în cazul microorganismelor mobile; necesită suspensii celulare destul de dese; nu este foarte exactă.
Fig. 4.2 Camera Thoma – vizualizarea la microscop
Metabolismul microbian 25
Numărarea cu ajutorul dispozitivelor electronice poate determina numărul de celule dintr-o soluţie a unui electrolit. Trecerea fiecărei celule printr-un microorificiu modifică rezistenţa electrică a sistemului şi produce un impuls care este înregistrat de un dispozitiv de numărare.
Cu toate că rezultatele sunt rapide şi exacte, metoda nu deosebeşte celulele microbiene de impurităţile de aceeaşi mărime.
Determinarea numărului de celule viabile se poate aplica în cazul microorganismelor cultivabile (există microorganisme viabile care au un metabolism activ, fără a fi obligatoriu capabile să se multiplice şi să formeze colonii). Microorganismele cultivabile sunt cele care formează colonii pe medii de cultură corespunzătoare. Procedeul cel mai folosit este cultivarea în plăci Petri, numit şi “plate count”. Un volum fix din suspensia brută de celule sau din diluţiile acesteia este etalat pe suprafaţa mediului de cultură sau incorporat în mediu înainte de solidificare. După incubare la o temperatură corespunzătoare, numărul coloniilor apărute corespunde cu numărul celulelor microbiene prezente în volumul analizat. Rezultatele sunt exprimate în unităţi formatoare de colonii (UFC), şi nu în celule; aceste lucru se impune deoarece aglomerările de mai multe celule formează o singură colonie, iar numeroase celule izolate pot sa nu dea naştere nici unei colonii.
Măsurarea biomasei celulare
Determinarea greutăţii uscate presupune separarea microorganismelor prin centrifugare sau filtrare prin membrane. După o spălare riguroasă pentru indepartarea resturilor de mediu, biomasa este uscată la 100-110 oC, până la greutate constantă. În ciuda simplităţii aparente, metoda este dificil de pus în practică şi durează mult.
Măsurarea turbidităţii. Este procedeul cel mai simplu, cel mai rapid şi cel mai utilizat pentru evaluarea masei microbiene. Această metodă se numeşte opacitmetrie, bazată pe proprietatea pe care o prezintă toate soluţiile de a absorbi o parte din intensitatea unui fascicul de lumină care le traversează în linie dreaptă. Ea măsoră raportul - lumina incidentă (I0) / lumina transmisă (I). Log I0/I reprezintă absorbanţa (A).
26 MICROBIOLOGIE II
Estimarea creşterii microorganismelor
Cunoaşterea creşterii şi multiplicării microorganismelor este indispensabilă atât pentru studiul caracterelor morfofiziologice ale celulelor microbiene, cât şi în domeniul medical, industrial şi ecologic.
Ciclul de creştere începe din momentul formării celulei microbiene (când are o masă şi dimensiuni minime) şi continuă cu creşterea acesteia, până la diviziune. În timpul creşterii, fiecare microorganism se divide la intervale constante de timp. Astfel, populaţia îşi va dubla numărul într-o perioadă specifică de timp, numita timp de generaţie sau timp de dublare. De exemplu: presupunem că un tub cu mediu de cultură este inoculat cu o celulă care se divide la fiecare 20 minute. Populaţia va avea 2 celule după 20 minute, 4 celule dupa 40 minute şi asa mai departe. Deoarece populaţia îşi dublează numărul cu fiecare generaţie, creşterea populaţiei va fi 2n, unde n reprezintă numărul de generaţii. În acest mod, creşterea populaţiei va fi exponenţială sau logaritmică.
Tabel nr. 4.1 Estimarea creşterii microorganismelor
Fig. 4.4 a) determinarea numărului de celule pentru n generaţii; b) reprezentarea grafică a creşterii numărului de celule în timp
Se notează: N0 = numărul iniţial al celulelor dintr-o populaţieNt = populaţia la timpul tn = numărul de generaţii la timpul tAvând în vedere tabelul, rezultă că: Nt = N0·2n
Rezolvând ecuaţia în raport cu n, logaritmând în baza 10, rezultă:
lgNt = lgN0 + n·lg 2 şi
Metabolismul microbian 27
Rata de creştere într-o cultură discontinuă de tip batch este o constantă numită viteza sau rata medie de creştere. Această constantă reprezintă numărul de generaţii în unitatea de timp, adesea exprimată ca număr de generaţii pe oră.
Timpul necesar pentru ca o populaţie să se dubleze se numeşte timpul mediu de generaţie (g), care poate fi calculat. Daca populaţia se dublează (t = g), atunci
Nt = 2·N0
Se înlocuieşte 2N0 în ecuaţie rate medii de creştere şi se determină k:
,
Curba de creştere a populaţiilor microbiene
Creşterea populaţiilor microbiene este studiată prin analiza curbei de creştere a unei culturi microbiene. Când microorganismele sunt cultivate într-un mediu lichid, ele cresc în culturi discontinue sau “batch”, în sistem închis. Deoarece nu este adăugat mediu proaspăt, creşterea este limitată la un volum fix de mediu, în care concentraţia nutrienţilor scade şi creşte concentraţia de produşi de metabolism. Creşterea microorganismelor care se reproduc prin diviziune binară poate fi reprezentată grafic ca logaritmul numărului de celule în funcţie de timpul de incubare. În aceste condiţii rezultă o curbă care prezintă 6 faze succesive distincte: faza de lag, faza de accelerare, faza de creştere exponenţială, faza de încetinire, faza staţionară şi faza de declin.
28 MICROBIOLOGIE II
Fig. 4.5 Curba de creştere
Faza de lag 1 - (engl. to lag = a întârzia), numită şi faza de latenţă sau de creştere zero, este cuprinsă între momentul introducerii celulelor în mediul steril şi momentul în care ele încep să se multiplice. În cursul acestei faze, numărul celulelor din mediu rămâne neschimbat sau chiar scade temporar. Cultura nu este vizibilă macroscopic. În această perioadă nu are loc diviziune celulară, iar rata medie de creştere este nulă. În faza de lag celulele îşi refac stocul de structuri (ribozomi), sisteme enzimatice şi metaboliţi necesari creşterii, în cazul în care acestea lipseau sau erau deficitare din cauza condiţiilor de viaţă anterioare însămânţării. În cursul fazei de lag, celulele individuale cresc foarte mult ca mărime, au un conţinut
Metabolismul microbian 29
crescut în proteine, ARN şi fosfor. De asemenea, activitatea metabolică şi sensibilitatea la agenţi fizici şi chimici sunt mărite.
Faza de accelerare a creşterii 2 succede faza de latenţă şi se caracterizează prin creşterea din ce în ce mai accelerată a numărului de celule şi a biomasei, iar rata de creştere este şi ea crescătoare.
Atât faza de latenţă cât şi faza de accelerare a creşterii sunt determinate de vârsta culturii şi de necesitatea adaptării enzimatice, fiind facultative.
Faza exponenţială 3 numită şi faza logaritmică este caracterizată prin aceea că, după o scurtă perioadă de accelerare a ritmului de creştere, în care multiplicarea se face cu o viteză progresiv mărită, acest ritm devine constant şi maxim (rata de creştere este maximă). În cursul acestei faze, care în coordonate semilogaritmice se exprimă grafic printr-o linie dreaptă, mortalitatea celulară este practic nulă. Celulele aflate în faza logaritmică au o citoplasmă omogenă, nu conţin materiale de rezervă şi au o mare afinitate pentru coloranţii bazici datorită conţinutului lor ridicat în ARN. În această fază, populaţia este cea mai uniformă în termeni de proprietăţi chimice şi fiziologice; din acest motiv culturile în faza exponenţială sunt utilizate în studiile biochimice si fiziologice.
Faza de încetinire a creşterii 4 corespunde perioadei în care concentraţia “factorului limitant” al creşterii scade sub nivelul care asigură creşterea maximă. Sub denumirea de “factor limitant” se înţelege orice factor a cărui lipsă din mediu opreşte creşterea. Pe măsura ce factorul limitant este consumat, rata de creştere ia toate valorile intermediare între creşterea cu o rată maximă şi zero.
Faza staţionară 5 este faza în care numărul de celule viabile rămâne constant, iar rata de creştere este 0. Într-o cultură în care nutrienţii nu sunt reînnoiţi, creşterea exponenţială durează numai câteva generaţii, după care rata de creştere scade la 0, ca o consecinţă a acumulării de produşi toxici sau a epuizării unui nutrient. În cazul bacteriilor, faza staţionară este atinsă la valori de 109 celule / mL, în timp ce pentru alte microorganisme (protozoare şi alge), valoarea maximă a densităţii celulare este de 106 celule / mL.
Faza de declin şi moarte celulară 6 apare după diferite intervale de timp, în funcţie de natura microorganismelor şi a condiţiilor de cultură. Rata de creştere este negativă, iar populaţia descreşte numeric. Multe celule mor şi sunt lizate de enzimele pe care le eliberează (autolizine).
Din graficul curbei de creştere construit pe baza determinării numărului de celule din unitatea de volum se poate calcula timpul de generaţie şi viteza de creştere. Timpul necesat dublării numărului de celule este citit direct de pe grafic.
30 MICROBIOLOGIE II
5. INFLUENŢA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA CREŞTERII
MICROORGANISMELOR
Creşterea microorganismelor este puternic afectată de factorii chimici şi fizici din mediul înconjurător. Cunoaşterea acestor influenţe este importantă pentru a stabili conditiile optime de cultivare a microorganismelor, a prevedea rezultatul dezvoltării lor sau a inhiba multiplicarea lor în anumite situaţii. În biotehnologii şi în industria alimentară factorii fizici şi chimici sunt utilizaţi în controlul creşterii microbiene atât pentru procesele de obţinere a culturilor starter, a biomasei sau a unor metaboliţi, cât şi în studiul conservării alimentelor. Cei mai importanţi factori de mediu care influenţează creşterea microorganismelor sunt: temperatura, umiditatea, presiunea, pH, oxigenul, radiaţiile.
Temperatura
Temperatura mediului ambiant are o influenţă majoră asupra microorganismelor, fenomen ce se explică prin faptul că acestea sunt organisme unicelulare şi poikilotermice (adică temperatura lor variază cu temperatura mediului).
Creşterea microbiană este caracterizată de valorile temperaturilor cardinale - temperaturile minime, optime şi maxime de creştere, care sunt diferite în funcţie de specia microbiană, de unii factori externi şi de nutrienţi. Temperatura minimă de creştere poate fi definită ca temperatura cea mai scăzută la care mai poate avea loc creşterea; temperatura optimă este temperatura la care rata specifică de creştere este maximă; temperatura maximă este temperatura la care creşterea este încă posibilă, dar prin depăşirea căreia efectul este letal.
Temperatura optimă este cuprinsă în mod normal între 0 oC şi 75 oC, dar creşterea microbiană se poate întâlni la temperaturi cuprinse între -10 oC şi 100 oC.
Metabolismul microbian 31
În funcţie de valorile temperaturilor cardinale, microorganismele sunt clasificate în:Microorganisme psihrofile - cresc bine la 0 oC şi au temperatura optimă de creştere la 15 oC sau mai scăzută; maximul se situează în jurul valorii de 20 oC. Au fost izolate din habitaturile arctice şi antarctice şi reprezintă o mare parte din microbiota oceanelor. Microorganisme psihrotrofe sau facultativ psihrofile - pot creşte la 0 oC, au un optim între 20-30oC şi o temperatură maximă la 35 oC. Aceste microorganisme sunt principalii agenţi de degradare a alimentelor refrigerate. O mare parte din drojdii şi mucegaiuri sunt psihrotrofe.Microorganisme mezofile – au o temperatură minimă de 15-20 oC, temperatura optimă 30-40 oC, iar cea maximă în jurul valorii de 45 oC. Viteza de creştere este ridicată iar timpul de generaţie variază între 20 şi 30 de minute la 40 oC şi câteva ore la 20 oC. Microorganisme termofile - care pot creşte la temperaturi de 55 oC sau mai ridicate; au o temperatură minimă de creştere în jurul valorii de 45 oC, iar cea optimă între 55-65 oC. Există microorganisme termofile care au un maxim la valori de temperatură peste 100 oC. Aceste microorganisme, în majoritate bacterii, se întâlnesc în mai multe habitate cum sunt compostul, căpiţele de fân, izvoarele şi apele termale. Microorganismele termofile sunt utilizate industrial pentru obţinerea de produse lactate acide, a enzimelor termostabile, pentru purificarea apelor reziduale, ca bioindicatori pentru anumite tratamente termice. Pot produce alterarea conservelor şi încingerea cerealelor.
32 MICROBIOLOGIE II
Fig. 5.1 Temperaturile cardinale ale microorganismelor psihrofile, mezofile şi termofile
Umiditatea şi solvenţii
Deoarece microorganismele sunt separate de mediul extern printr-o membrană semipermeabilă, ele sunt afectate de modificările de presiune osmotică din mediu. Dacă un microorganism este plasat într-o soluţie hipotonică, apa va intra în celulă determinând apariţia unui fenomen de turgescenţă. Cele mai multe bacterii, alge şi fungi posedă pereţi celulari rigizi care menţin forma şi integritatea celulei.
Deoarece concentraţia osmotică a mediului extern are efecte profunde asupra microorganismelor, este necesar să se exprime conţinutul de apă accesibilă pentru celula microbiană. În acest scop, microbiologii
Metabolismul microbian 33
utilizează în general termenul de activitate a apei (aw). Activitatea apei unei soluţii reprezintă 1/100 din umiditatea relativă a soluţiei, fiind de asemenea echivalentă cu raportul dintre presiunea de vapori a soluţiei şi presiunea de vapori a apei pure.
Activitatea apei unei soluţii sau a unui solid poate fi determinată prin
închiderea ermetică a probei într-o incintă şi măsurarea umidităţii relative după ce sistemul a ajuns la echilibru. Activitatea apei este invers proporţională cu presiunea osmotică: dacă o soluţie are o presiune osmotică mare, activitatea apei este scăzută.
Microorganismele se pot dezvolta într-un domeniu larg de aw situat între valori de 0,62 - 1,00, fiind clasificate după acest criteriu în trei categorii:
- microorganisme xerofite care se pot dezvolta la aw de 0,62 - 0,75 din care fac parte mucegaiuri din genurile Xeromyces, Aspergillus, drojdii osmotolerante, bacterii halotolerante;
- microorganisme mezofite care se pot dezvolta la valori ale aw de 0,75 - 0,85, fiind reprezentate de majoritatea fungilor şi bacteriilor;
- microorganisme hidrofite - aw 0,85 - 0,99 sunt în general bacteriile.Microorganismele se dezvoltă preferenţial pe medii cu valori mari ale activităţii apei. Când aceste valori scad sub 0,97 se observă deja, pentru majoritatea celulelor microbiene, o scădere a vitezei de creştere. S-a constatat ca bacteriile necesită pentru creştere valori ale activităţii apei mai mari decât fungii.
Conservarea alimentelor prin uscare, congelare, sărare şi alte procedee are la baza fenomenul de scădere a activităţii apei sub o valoare critică, sub care nu se mai pot dezvolta microorganismele de contaminare; odată cu creşterea umidităţii, apare şi pericolul de degradare microbiană a alimentelor.
pH
pH-ul afectează dramatic creşterea microbiană, deoarece fiecare specie are un domeniu definit de pH în care se poate dezvolta, cu un pH
34 MICROBIOLOGIE II
optim de dezvoltare. În funcţie de aceste valori, microorganismele se clasifică în:
- microorganisme acidofile care au un pH optim de creştere cuprins între 1,0 şi 5,5; - microorganisme neutrofile, cu pH optim cuprins între 5,5 şi 8,0;- microorganisme alcalofile, care preferă valori ale pH cuprinse între 8,5 şi 11,5.
Concentraţia de oxigen
În funcţie de necesarul de oxigen, microorganismele sunt clasificate în 5 categorii majore:
- microorganisme aerobe, capabile să crească în prezenţa oxigenului din aer; dacă aceste microorganisme sunt complet dependente de oxigen, ele se numesc strict sau obligat aerobe. Oxigenul serveşte ca acceptor final de electroni în lanţul transportor de electroni în respiraţia aerobă. În plus, microorganismele aerobe folosesc oxigenul pentru sinteza sterolilor şi a acizilor graşi nesaturaţi.
- microorganisme facultativ anaerobe, care nu necesită oxigen pentru creştere, dar care cresc mai bine în prezenţa acestuia.
- microorganisme aerotolerante anaerobe, care ignoră pur şi simplu oxigenul şi cresc la fel în prezenţa sau absenţa acestuia.
- microorganisme strict sau obligat anaerobe, care nu tolerează oxigenul şi mor în prezenţa acestuia. Microorganismele aerotolerante şi cele anaerobe nu pot genera energie prin respiraţie aerobă şi folosesc calea fermentaţiei sau a respiraţiei anaerobe în acest scop.
- microorganisme microaerofile, care nu suportă concentraţia de oxigen normală din aer (20%) şi necesită valori ale concentraţiei de oxigen cuprinse între 2 şi 10% pentru creştere.
Metabolismul microbian 35
Fig. 5.2 Clasificarea microorganismelor în funcţie de necesarul de oxigen
Presiunea
Cele mai multe microorganisme nu sunt influenţate semnificativ de presiune, deoarece trăiesc în habitate cu valori ale presiunii de aproximativ 1 atmosferă. Există totuşi bacterii care s-au adaptat la valori extreme ale presiunii. În adâncul oceanelor, la adâncimi mai mari de 1000 metri presiunea poate ajunge la 1100 atm, la o temperatură de 2-3 oC. În ciuda acestor condiţii extreme, bacteriile se adaptează şi pot supravieţui.
Unele bacterii sunt barotolerante - creşterea presiunii le afectează, dar nu atât de mult ca în cazul bacteriilor nontolerante. Unele bacterii care trăiesc la adâncimi marine mari sunt barofile, crescând mai rapid la presiuni
36 MICROBIOLOGIE II
ridicate şi pot juca un rol important în reciclarea nutrienţilor la adâncimi marine mari.
Radiaţiile
Lumina solară reprezintă sursa majoră de radiaţii de pe pământ. Lumina este utilă bacteriilor din diviziunea Photobacteria, restul microorganismelor chimiosintetizante preferând să se dezvolte în întuneric. Radiaţiile electromagnetice sunt agenţi de sterilizare des utilizaţi, în special în industria alimentară, pentru conservarea alimentelor. Acţiunea antimicrobiană este cu atât mai ridicată cu cât lungimea de undă a radiaţiei este mai mică. Primele radiaţii cunoscute pentru această acţiune a lor sunt radiaţiile ultraviolete; sunt totuşi cele mai puţin eficace din cauza lungimii de undă mari. Radiaţiile X şi gamma eliberează o energie mai mare care penetrează mai în profunzime materia; radiaţiile X traversează câţiva centimetri de materie, iar cele gamma mai multe zeci de centimetri.
6. CONTROLUL MICROORGANISMELOR PRIN FACTORI FIZICI ŞI CHIMICI
Controlul nonspecific şi distrugerea microorganismelor din diferite medii prezintă importanţă practică în aproape toate domeniile. Deşi unele microorganisme sunt benefice şi necesare pentru bunăstarea omului, activitatea altor microorganisme poate avea consecinţe nedorite, ca alterarea alimentelor, transmiterea unor boli, degradarea unor materiale etc.
Terminologie
Metabolismul microbian 37Sterilizare (latină, sterilis, incapabil de a produce urmaşi, sterp) este procesul prin care toate celulele vii, sporii viabili, virusurile şi viroizii sunt fie distruşi fie îndepărtaţi dintr-un habitat sau obiect. Un obiect steril este în totalitate lipsit de microorganisme, spori sau alţi agenţi infectioşi. Dezinfecţia reprezintă omorârea, inhibarea sau îndepărtarea microorganismelor care pot cauza boli. Dezinfectanţii sunt agenţi chimici de obicei utilizaţi pentru tratamentul obiectelor, fără a fi neapărat necesară sterilizarea suprafeţei acestora, unii spori putând ramâne. Sanitizarea este strâns legată de dezinfecţie. Prin sanitizare, populaţiile microbiene sunt reduse la nivele considerate sigure de standardele de sănătate publică (sanitizarea ustensilelor de mâncat din restaurante).Cel mai adesea este necesar controlul microorganismelor de pe ţesuturile vii cu ajutorul agenţilor chimici. Antisepsia (greacă, anti = împotriva, sepsis = putrefacţie) reprezintă prevenţia infecţiei şi se efectuează cu antiseptice, agenţi chimici care se aplică pe ţesut şi omoară sau inhibă creşterea patogenilor şi reduc populaţia microbiană în ansamblu. Pentru a nu afecta prea mult ţesutul pe care sunt aplicate, antisepticele trebuie să aibă o toxicitate mai scăzută decât a dezinfectanţilor.
Pentru a denumi tipul de agent antimicrobian se foloseşte un sufix, în funcţie de efectul acestuia. Substanţele care omoară organismele primesc adesea sufixul cide (latină, cida, a omorî); un germicid omoară patogenii (şi mulţi nepatogeni) dar în mod obligatoriu endosporii bacterieni. Un dezinfectant sau un antiseptic poate fi eficient doar asupra unui anumit grup, caz în care este numit bactericid, fungicid, algicid sau viricid. Alte substanţe chimice nu omoară, dar inhibă creşterea. Denumirea acestora se termină în static (greacă, statikos, care cauzează oprirea), de exemplu bacteriostatic, fungistatic. Dacă aceşti agenţi sunt îndepărtaţi, creşterea se va relua.
O populaţie microbiană nu este omorâtă instantaneu când este expusă acţiunii unui agent letal. Moartea populaţiilor, ca şi creşterea, este în general exponenţială sau logaritmică, deci populaţia se va reduce cu aceeaşi fracţie la intervale constante. Dacă se reprezintă grafic logaritmul numărului de indivizi din populaţie în funcţie de timpul de expunere la agentul de control, rezultă o dreaptă. Când populaţia a fost redusă mult, rata de scădere poate incetini datorită supravieţuirii celor mai rezistente microorganisme.
Pentru studiul eficienţei unui agent letal, trebuie să se ştie când microorganismele sunt moarte. S-a considerat că o bacterie este moartă când nu mai creşte şi nu se reproduce când este inoculată într-un mediu care în mod normal îi favorizează creşterea.
38 MICROBIOLOGIE II
În acelaşi mod, un virus este inactiv când nu mai poate infecta celula gazdă.
Metabolismul microbian 89
8. METABOLIŢI MICROBIENI
Semnificaţia biologică a metaboliţilor primari şi secundari
Ca rezultat al activităţii lor metabolice, microorganismele sintetizează mai multe categorii de produşi care includ, pe lângă constituenţii structurali ai celulei, enzime intra- şi extracelulare, compuşi de rezervă energetică (glicogen, poli-beta-hidroxibutirat), produşi finali de metabolism, cărora li se adaugă o serie de compuşi cu importanţă practică incluzând metaboliţi primari, metaboliţi secundari şi produşi de bioconversie (bioderivaţi).
Metaboliţii primari
Metabolismul primar este identic la toate organismele vii şi este reprezentat de mai multe căi metabolice mediate de enzime, prin care celula produce energie, intermediari şi precursori de biosinteză care sunt apoi transformaţi în macromolecule specifice celulei. Metaboliţii primari sunt reprezentaţi de compuşi care au legătură cu sintezele din celula microbiană în faza de creştere. Aceştia includ aminoacizi, nucleotide şi produşi finali de fermentaţie ca alcoolul etilic şi acizii organici. De asemenea, microorganismele sintetizează ca metaboliţi primari o serie de enzime de uz industrial, cel mai adesea exoenzime, în timpul creşterii. Metaboliţii primari sunt sintetizaţi în faza de creştere exponenţială a celulelor (trofofaza), ca rezultat al metabolismului oxidativ sau fermentativ.
Metaboliţii secundari
Pe lângă metaboliţii primari, cu rol major în menţinerea viabilităţii microorganismului (proteine, hidraţi de carbon şi grăsimi), sunt sintetizaţi şi o serie de compuşi care includ terpene, steroizi, antociani, antrachinone, fenoli şi polifenoli, care aparţin aşa numitului metabolism secundar. Metaboliţii secundari se acumulează de obicei în perioada de limitare a nutrienţilor sau de acumulare a deşeurilor celulare, care urmează fazei de
90 MICROBIOLOGIE II
creştere. Aceşti compuşi nu au legătură cu sinteza materiei organice celulare şi cu creşterea, cei mai mulţi fiind antibiotice şi micotoxine. Metaboliţii secundari sunt prezenţi numai la anumite specii şi pot fi identificaţi numai într-un anumit stadiu al creşterii şi dezvoltării în cadrul unei specii, sau pot fi activaţi numai pe parcursul perioadelor de stres, cauzate de exemplu de sărăcirea nutrienţilor. Sinteza lor pare fără semnificaţie directă pentru celula sintetizatoare, dar poate fi decisivă pentru dezvoltarea şi funcţionarea microorganismului ca întreg. Cu toate că sinteza lor nu constituie o parte indispensabilă a programului expresiei genice şi dezvoltării, aceşti metaboliţi nu reprezintă simpli produşi catabolici, deoarece au o structură foarte diversificată şi pot fi adesea reincluşi în procesele metabolice. Metabolitii secundari aparţin unor clase numeroase de compuşi organici: glucide aminate, chinone, cumarine, alcaloizi, derivaţi indolici, glicozide, lactone, macrolide, naftalene, nucleozide, terpenoizi şi tetracicline. Mulţi metaboliţi secundari au aplicaţii practice, fiind utilizaţi antibioticele, unele toxine, pigmentii microbieni, biostimulatorii pentru creşterea plantelor. Adeseori metaboliţii secundari formează un amestec de produşi cu structură asemenătoare aparţinând aceleiaşi familii de substanţe chimice. Streptomyces griseus produce, de exemplu, 40 de antibiotice.
Metabolismul microbian 91
Fig. 8.1 Sinteza metaboliţilor primari şi secundari în faza exponenţială şi staţionară de creştere
În tabelul 8.1 este prezentată lista unor metaboliţi primari şi secundari de interes economic.
Tabel 8.1 Metaboliţi primari şi secundari de interes economicMetabolit Microorganism
Produse industrialeEtanol (din glucoză)Etanol (din lactoză)Acetonă şi butanol2,3 butandiolEnzime
