Genetica bacteriană:

studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii;suportul material al eredităţii este reprezentat de

genomul bacterian, suma genelor unui microorganism;

gena constituie unitatea funcţională de bază a informaţiei genetice;

Genetica bacteriană

genomul bacterian este reprezentat de - ADN cromozomal (include gene esenţiale)

- ADN plasmidic (conţine gene care codifică caractere de tulpină);

genotip = totalitatea informaţiei înscrisă în genomul bacterian;

fenotip = suma caracterelor observabile consecutiv interacţiunii genotipului cu mediul ambiant.

• De exemplu, cromozomul de Escherichia coli este format dintr-o:

• moleculă circulară dublu spiralată de ADN ce reprezintă 80% din greutatea lui;

• componentă proteică: ARN-polimeraza (reprezintă 10% din greutatea sa);

• ARNm şi ARNr în curs de sintetizare (10% din

greutatea sa).

Elemente extracromozomale

• Plasmid – informație genetică extracromozomală• Episom – o formă particulară de plasmid, care este o unitate

de material genetic, neesențială pentru genom, dar care se poate integra singură în genomul ADN al unei bacterii; rămâne mult timp stabilă, se replică o dată cu cromozomul bacterian și devine o componentă a acestuia (ex. episom care codifică pilii sexuali sau care codifică gene de rezistență la A).

• Bacteriofagi – implicaţi în transducţie; virusul infectant transferă material genetic al unei bacterii.

• Plasmidele pot fi:- conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de

exemplu plasmidele de rezistenta la antibiotice R,- neconjugative, care nu pot părăsi ele singure bacteria de origine, ci

numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau al unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifica secreţia de beta-lactamază la S.aureus);

- episomi, care se pot integra prin recombinare în cromozomul bacterian, pierzându-şi astfel autonomia de replicare (un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F) sau factorul de fertilitate).

• Plasmidele de virulenţă poartă determinanţii genetici ai unor factori de virulenţă la bacterii, ca de exemplu:

- secreţia de enterotoxina (termolabilă şi termostabilă) şi

factorul de colonizare la Escherichia coli,

- hemolizina la Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis şi E.coli,

- exfoliantina la S. aureus,

- gena de invazivitate la Shigella etc.

• Plasmidele R (de rezistenţă) la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau din doua regiuni genetice distincte: genele care codifica rezistenţa la antibiotice "R", care pot fi unice sau multiple şi genele care conferă plasmidului capacitatea de a se transfera "FTRA".

• Rezistenta la peste 90% din tulpinile de spital este de natura plasmidică.

Fenomenul de variabilitate genotipică

- modificare bruscă, transmisibilă la descendenţi a unuia sau a mai multor caractere prin două mecanisme:• mutaţia;• transferul de ADN de la un donor la un acceptor.

Variaţia fenotipică:

- indusă de interacţiunea genomului cu factori de mediu;

- este reversibilă şi nu se transmite ereditar;

- are la bază controlul transcripţiei genelor în ARNm şi traducerii în sinteza proteinelor, prin inducţia sau represia acestora.

Mutaţia: reprezintă o modificare în secvenţa nucleoti-

delor într-o genă, datorită unei erori în cursul replicării;

eveniment rar, spontan şi imprevizibil;mutaţiile acumulate de-alungul a miliarde de

ani, sub efectul selecţiei naturale, explică evoluţia speciilor;

Mutaţia:noile gene apărute prin mutaţie se numesc alele

şi ocupă acelaşi locus genetic ca gena de origine;mecanisme moleculare ale mutaţiei:

- substituţia unei perechi de baze printr-o altă pereche, cu înlocuirea unui codon printr-un alt codon;

- inserţia sau deleţia uneia sau a mai multor baze, cu decalarea citirii mesajului genetic.

Rata mutaţiei = probabilitatea de apariţie spontană a unei mutaţii într-o populaţie bacteriană;

rata mutaţiei este foarte scăzută (10-7 – 10-9) dar poate creşte în prezenţa unor agenţi mutageni (chimici sau fizici).

Frecvenţa mutaţiei = proporţia unui anumit mutant într-o populaţie bacteriană;

frecvenţa mutantului poate creşte ca urmare a selecţiei:- relative (mutantul are un timp de generaţie mai scurt)

- absolute (prin prezenţa unui factor de mediu favorabil mutantului, dar defavorabil restului populaţiei).

Exemple de mutaţii• Mutaţiile punctiforme afectează un singur

nucleotid în cadrul unei gene şi sunt reversibile.

Consecinţe:

- înlocuirea unui codon cu altul duce la înlocuirea unui aminoacid cu altul în structura unui polipeptid. Aceste mutaţii sunt numite „mutaţii în sens greşit”;

- apariţia unui codon nonsens (mutaţii nonsens).

Mutaţia nonsens împiedică sinteza în continuare a unui polipeptid;

- daca mutaţia nonsens se produce la începutul genei care codifică un polipeptid, se numeşte mutaţie polară şi acel polipeptid nu se va mai sintetiza deloc.

Mutaţii bacteriene observate în laborator: mutaţii privind morfologia coloniei bacteriene

(variaţia S – R); mutaţii nutriţionale (mutanţi auxotrofi – vezi LP); mutaţii care duc la pierderea unor factori de

patogenitate (mutanţi avirulenţi la S.pneumoniae care şi-

au pierdut capsula); mutaţii care conduc la apariţia fenomenului de

rezistenţă la antibiotice (atât ADN cromozomic cât şi

cel plasmidic poate fi sediul unor asemenea mutaţii).

Transferul genetic

• se realilează în sens unic, de la o bacterie donor la una receptor;

• exogenot = materialul genetic transferat;

• endogenot = materialul genetic propriu;

Transferul genetic

• evoluţia exogenotului în celula receptor:- recombinare: alinierea secvenţelor cu omologie structurală,

urmată de substiutirea uneia sau mai multor gene între exo- şi endogenot;

- integrare în genomul bacteriei receptor (transpozoni, fagi);

- menţinerea în poziţie extracromozomală dacă este un replicon (plasmide, fagi);

- supus acţiunii endonucleazelor de restricţie (informaţie genetică pierdută).

Replicon: cel mai scurt fragment de ADN sau ARN capabil de replicare independentă într-o celulă.

• Mecanisme de transfer:

- transformarea;

- transducţia: generalizată şi specializată;

- conjugarea,

Mecanisme de transfer ale exogenotului

I. Transformarea

- bacteria acceptor este capabilă să primească ADN exogen provenit din mediu, de la bacterii moarte (stare de competenţă);

- exogenotul trebuie să prezinte o structură bicatenară şi să reprezinte nu mai mult de 1% din mărimea genomului bacterian;

- fenomenul a fost descoperit prin experimentări pe şoarece cu S.pneumoniae, în 1928 (Griffith), şi explicat după două decenii mai târziu.

• ADN-ul pneumococilor virulenţi, capabili să sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urma dobândind capacitatea de a sintetiza capsula.

• Transformarea are loc şi intre specii diferite.

• Bacteria care primeşte materialul genetic trebuie să se afle în stare de competenţă.

II.Transducţia

- transfer de ADN bacterian prin intermediul bacteriofagilor transductori;

- există două tipuri de transducţie:• generalizată (transfer aleator al unui fragment din

genomul bacterian);

• specializată (transfer de gene localizate în cromozomul bacterian în vecinătatea locului de integrare a profagului).

Profag: există ca replicon sau episom

Bacteriofag

Morfologie.• Bacteriofagii sunt formaţi dintr-un cap hexagonal, un gât

şi o prelungire numită picior (coadă).

• Capul este alcătuit dintr-un înveliş proteic (capsidă) şi adăposteşte genomul ADN.

• Coada este un cilindru rigid învelit într-un manşon proteic şi se termină cu o placa hexagonală care conţine o enzimă de tipul lizozimului.

• De placa bazala se aprind 6 fibre cu rol in fixarea bacteriofagului pe suprafaţa bacteriei.

• Ataşarea bacteriofagului pe suprafaţa peretelui bacterian este determinată de existenţa unor receptori de perete, specifici.

• După ataşare are loc contracţia manşonului proteic şi bacteriofagul îşi injectează numai ADN-ul în celula bacteriană.

• După pătrunderea genomului fagic în celula bacteriană, acesta va determina sinteza de noi bacteriofagi identici cu cel de la care a provenit ADN.

• După asamblarea noilor virusuri ele vor părăsi celula bacteriana care se lizează. Acesta este ciclul litic al bacteriofagilor, iar ei se numesc fagi virulenţi.

• Transductia generalizata este mediata de fagi litici, care, dupa pătrunderea în celula bacteriană, se multiplică şi determina liza celulei gazda.

• In timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmentează. • Se poate întâmpla ca unul dintre aceste fragmente, cu o dimensiune

apropiată de cea a genomului fagic, să se integreze în capsida bacteriofagului, în locul genomului fagic.

• Aceşti bacteriofagi sunt defectivi şi nu se vor mai putea replica, dar pot pătrunde în alte celule bacteriene, injectându-le ADN-ul, ce provine din cel al celulei donoare. ADN-ul se va integra în cromozomul celulei receptoare prin recombinare, rezultând caractere noi ca modificări patogenice bacteriene, rezistenţa la chimioterapice.

• Dar nu întotdeauna relaţiile bacteriofag-bacterie evoluează în acest fel.

• Uneori genomul bacteriofagului se va integra in cromozomul bacterian încadrându-se şi funcţional în acesta.

• In aceasta situaţie el nu se mai replica decât în acelaşi timp cu cromozomul bacterian, deci in timpul diviziunii bacteriene şi se numeste profag.

• Acest ciclu este ciclul lizogen, iar bacteriofagii se numesc fagi temperaţi.

• Transductie specializată este mediata de fagii temperaţi.• După pătrunderea în celula bacteriana a ADN –ului

bacteriofagului temperat, ADN-ul suferă un proces de circularizare după care se insera în cromozom prin recombinare sub forma de profag (pe baza homologiei intre 10 perechi de baze ale ADN fagic si bacterian).

• Profagul devine parte integrantă a cromozomului bacterian, se va replica odată cu acesta, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazda.

Concluzie:• Transducţia reprezintă un transfer de gene

cromozomale de la o celula bacteriană la alta, mediat de bacteriofagi.

• Unii bacteriofagi sunt capabili să transfere orice genă bacteriană (transducţie generalizată) iar alţii numai anumite gene (transducţia specializată).

Transducţia generalizată

Transducţia specializată

Conversia lizogenă• Conversie lizogenă = informaţie genetică

adiţională, de origine fagică, având asemănări cu transducţia specializată (toxigeneza tulpinilor de Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes etc).

III. Conjugare

- transfer genetic consecutiv contactului fizic între două bacterii cu polaritate sexuală diferită;

- bacteria donor (”sex masculin”) posedă un plasmid conjugativ (factorul F+) cu gene care codifică sinteza de pili sexuali, prin care se ataşează la receptori specifici de pe suprafaţa unei celule receptor ( F-, de “sex feminin”);

Pil sexual

Pil sexual (E. coli)

Sex pilus

III. Conjugare

- retragerea pililor aduce cele două celule în contact, prin puntea citoplasmatică care se stabileşte, urmând să fie transferat ADN –ul plasmidic;

- consecutiv acestui tip de conjugare rezultă două celule F(+) ;

- plasmidul F poate purta gene adiţionale (ex. gene

de R la antibiotice) care pot fi transferate;

III. Conjugare

- plasmidul F integrat în cromozom poate conduce la transfer de gene cromozomale (între o bacterie Hfr -high frequency of recombination - şi una F(-));

- transferul începe din vecinătatea locului de inserţie al plasmidului F, care este ultimul transferat;

- cel mai frecvent bacteria receptor ramâne F(-)

deoarece nu se transferă şi factorul F;

- transferul de ADN la bacterii gram-pozitive este controlat de feromoni sexuali (molecule de suprafaţă prin care celulele bacteriene aderă între ele).

Elemente genetice transpozabile

reprezintă segmente de ADN capabile să se excizeze şi apoi să se insere în acelaşi replicon (cromozom sau plasmid) sau în unul diferit, putând determina blocarea expresiei unei gene în care se inseră (factor mutagen);

are loc cu intervenţia unei enzime, transpozaza, fără să fie necesară omologia genetică.

• Elementele genetice transpozabile sunt fragmentele de inserţie (IS) si transpozonii (Tn).

Elemente genetice transpozabile

Tipuri de elemente transpozabile:

• secvenţe de inserţie (SI) constituite din gena care codifică transpozaza, flancată de repetări inversate, a 20-40 perechi de baze;

• transpozoni, care posedă în regiunea centrală una sau mai multe gene care codifică anumite caractere (ex. rezistenţa la antibiotice), flancate de SI.

• Transpoziţia presupune integrarea într-un genom a unui element genetic transpozabil din aceeaşi moleculă de ADN sau din altă moleculă prezentă în aceeaşi celulă.

• Inserţia oricărei gene între doua elemente transpozabile face posibil transferul ei prin recombinare neomologă, în aceeaşi celulă pe o molecula de ADN neînrudită structural.

• Astfel, prin transpoziţie se pot produce deleţii, inversii, transpuneri de determinanţi genetici de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabilă a unor repliconi compleţi, de pildă a doua plasmide.

• Evolutia rezistenţei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi conceputa astăzi fără fenomenul de transpoziţie.

• Mecanismele transpoziţiei sunt responsa-bile de formarea plasmidelor cu multirezis-tenţă, prin inserarea succesivă pe un plasmid a determinanţilor genetici de rezistenţă situaţi între doua elemente transpozabile de pe alte plasmide.

Patogenitatea bacteriilorPatogenitate = ansamblul proprietăţilor biologice

ale unui microorganism care îi permit să determine îmbolnăvirea gazdei.

Clasificarea bacteriilor în raport de patogenitate

- nepatogene (prezenţa lor nu determină îmbolnăviri);

- înalt patogene sau patogene primare (determină cel mai frecvent îmbolnăviri la gazda normoreactivă dar lipsită de apărare specifică);

- condiţionat patogene sau oportuniste (prezente pe suprafeţele de înveliş, pot determina îmbolnăviri când:

• apar disfuncţii ale barierelor de apărare antimicrobiană

• variaţia genetică le conferă factori de patogenitate).

Atributele majore ale unei bacterii patogene

transmisibilitatea = posibilitatea de a trece de la o gazdă la alta;

infectivitatea = abilitatea de a pătrunde, de a persista prin depăşirea sau neutralizarea barierelor şi mecanismelor antimicrobiene, de a se multiplica şi de a invada organismul gazdei;

virulenţa = capacitatea microorganismului de a vătăma gazda.

I. Transmisibilitatea conferită de:

- prezenţa endosporilor care asigură indefinit supravieţuirea în condiţii nefavorabile (specii

Bacillus şi Clostridium);

- rezistenţa la condiţii de desicaţie/uscăciune (Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus,

Corynebacterium diphtheriae etc);

I. Transmisibilitatea conferită de:

- supravieţuirea şi chiar multiplicarea în medii umede, minimale nutritiv (specii din familia Enterobacteriaceae sau Pseudomonas aeruginosa);

- adaptarea la transmiterea directă (ex. transmitere sexuală) sau prin vectori biologici (artropode hematofage) în cazul speciilor extrem de fragile în mediul extern (Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, respectiv specii Rickettsia, Borrelia).

II. Infectivitatea1. Depăşirea barierelor externe de apărare

- discontinuităţi ale tegumentului;

- discontinuităţi ale stratului de mucus (plăcile Peyer);

- producere de neuraminidază (hidroliza stratului de mucus);

- forma spiralată şi mobilitatea (Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni);

- producere de urează (neutralizează bariera acidă gastrică , ex. Helicobacter pylori, H. heilmannii);

- sinteza de bacteriocine (afectează bariera biologică a suprafeţelor).

2. Menţinerea prin aderare la suprafeţele de înveliş

- necesită participarea a doi factori:

• adezină sau ligant – componente macromoleculare pe suprafaţa celulei bacteriene,

• receptori celulari prezenţi pe suprafaţa celulelor gazdei;

- adezinele şi receptorii interacţionează în manieră complementară şi specifică;

- conferă rezistenţă la spălarea mecanică (prin secreţii sau excrete) sau prin mişcări peristaltice;

- structuri de suprafaţă cu rol de liganzi: fimbrii, glicocalix, proteine de suprafaţă (proteina M, proteina F), acizi teichoici şi lipoteichoici.

AdhesionAdhesion

adhesinadhesin

EPITHELIUMEPITHELIUM

receptorreceptor

BACTERIUMBACTERIUM

S. pyogenesS. pyogenes

fibronectinfibronectin

F-proteinF-proteinlipoteichoic acidlipoteichoic acid

Tulpini uropatogene (E. coli - prezintă pili)

Absenţa pililor

3. Invazia majoritatea bacteriilor îşi exercită efectul patogen prin

invazia ţesuturilor, precedată de aderarea la suprafaţa mucoaselor;

invazia poate fi din:

- aproape în aproape,

- pe cale limfatică sau

- hematogenă; bacteriile invazive sunt capabile să penetreze în celulele

nefagocitare prin endocitoză, graţie unor proteine de suprafaţă – invazine;

3. Invazia

unele bacterii posedă: factori de difuziune (hialuronidază, colagenază, fibrinolizine), exoenzime care degradează ţesutul conjuctiv care se opune invaziei (ciment intercelular, membrană bazală, depozite de fibrină, fascii).

4. Supravieţuirea în organismul gazdei

- protecţia faţă de fagocite şi complement prin:• inhibarea chemotaxiei fagocitelor şi uneori a producerii şi

eliberării lor din măduva hematogenă;• sinteza de polizaharide capsulare;• supravieţuirea şi multiplicarea în celulele fagocitare;• liza celulelor fagocitare (prin leucocidine);

- eludarea supravegherii imune:• variaţia antigenică;• identitatea antigenică cu celulele gazdei;• diversitatea antigenică;• localizarea în situs-uri privilegiate anatomic sau celular;• supresia răspunsului imun.

5. Achiziţia de nutrienţi

- necesarul de Fe în medii feriprive este asigurat prin:• sinteza de siderofori (enterochelină, aerobactin);• legarea transferinei sau lactoferinei la receptori de pe

suprafaţă bacteriei;• reducerea Fe feric în Fe feros.

III. Virulenţa

- reprezintă capacitatea microorganismelor de a vătăma gazda;

- este un atribut de tulpină cuantificabil (DLM; DL50);

- condiţii majore pentru recunoaşterea unui constituient celular ca factor de virulenţă (postulatele moleculare Koch)

- genele de virulenţă sunt cel mai frecvent prezente pe elemente genetice mobile (plasmide, fagi, transpozoni).

Postulatele moleculare Koch:

• factorul de virulenţă este prezent numai la tulpinile virulente;

• inactivarea prin mutaţie a genei care-l codifică duce la pierderea virulenţei;

• reversia la gena sălbatică restaurează virulenţa;• produsul genei induce, de regulă, un răspuns imun

protector;

Mecanisme de lezare a gazdei

- mecanisme directe• exotoxine, produse de metabolism bacterian de

natură proteică, eliberate în mediul extracelular atât de bacterii gram-pozitive cât şi gram-negative;

• endotoxine, prezente numai la bacterii gram-negative, eliberate numai în momentul lizei celulei bacteriene;

• agresine, exoenzime capabile să determine alterări tisulare.

- mecanisme indirecte• reacţii de sensibilizare de tip II, III sau IV

(Coombs şi Gell) – vezi Imunologia

Proprietăţi comparative

exotoxine endotoxine - în general termolabile - termostabile

- intens antigenice - slab antigenice

- pot fi transformate în anatoxine - nu pot fi transformate

- DLM ng/Kg corp - DLM µg/Kg corp

- acţiune specifică (enterotoxine, - acţiune nespecifică neurotoxine, citotoxine) (febră, leucopenie urmată de leucocitoză, CID, şoc endotoxinic)

Clasificarea exotoxinelor- citolitice

• atacă fosfolipide din membrana citoplasmatică (fosfolipaze);

• crează pori prin membrana celulară (hemolizine, leucocidine).

- bipartite, constituite din două subunităţi• subunitaea B permite legarea toxinei la un receptor celular• subunitatea A, cu proprietăţi enzimatice, pătrunde în

celulă acţionând asupra unor ţinte moleculare.

- superantigene• activează limfocitele T prin legare simultană la receptori

de pe suprafaţa acestora şi la CMH clasă II de pe suprafaţa macrofagelor

• este stimulată eliberarea unor mari cantităţi de limfokine, mediatorii fenomenelor morbide.

• ProteasesProteases • PhospholipasesPhospholipases• Detergent-like actionDetergent-like action

Membrane damaging exotoxins

A-B toxinsA-B toxins

ActiveActive BindingBinding

AA

Cell surfaceCell surface

BB

Toxina tetatnică – tip ABInhibă acidul γ-aminobutiric

(influxul nervos nu mai este blocat – neuronii motori sunt stimulaţi în exces – contracturi spastice ale

musculaturii striate)

Superantigene

• activează limfocitele T prin legare simultană la receptori de pe suprafaţa acestora şi la CMH clasă II de pe suprafaţa macrofagelor

• este stimulată eliberarea unor mari cantităţi de limfokine, mediatorii fenomenelor morbide.

Efecte biologice ale endotoxinelor

- activarea complementului pe cale alternativă cu stimularea procesului inflamator;

- fixarea pe suprafaţa macrofagelor, cu eliberare de de citokine (IL-1, IL-6, IL-8, FNT etc), mediatori ai inflamaţiei şi şocului endotoxic;

- activarea unor factori ai coagulării, care conduce la CID;- activarea plasminei, cu apariţia de hemoragii;- fixarea pe celule endoteliale cu, creşterea permeabilităţii

vasculare. În infecţii cu bacterii gram-pozitive sau a.a.r., peptidoglicanul,

acizii teichoici şi respectiv arabinogalactanul pot determina efecte endotoxină-like.