Biologie Celulara

Capitolul 1. Unitatea de baza a vietii: celula 1.1. Ce este o celulă? 

elulele sunt unităţi structurale care compun corpul unei plante sau al unui animal dar pot forma şi organisme unicelulare. Unul din caracteristicile comune tuturor celulelor este aspectul de “saci care cuprind apă". Acesti “saci” sunt delimitaţi de un dublu strat fosfolipidic, numit membrană. Membrana

este semipermeabilă, permiţând numai anumitor particule să treacă în şi din celulă, blocând trecerea altora.

C Aşadar, o celulă este un "sac" membranar fluidic care înconjoară un spaţiu cu conţinut celular.

Fiecare component al acestui spaţiu va fi discutat detaliat în cele ce urmează. Celulele sunt în proporţie de 90% fluide (citoplasmă) care conţin aminoacizi liberi, proteine,

carbohidraţi şi numeroase alte molecule. Mediul celular cum ar fi conţinutul citoplasmei şi al nucleului, afectează expresia şi reglarea genelor şi sunt părţi foarte importante ale moştenirii genetice.

Procentual, o celulă este constituită din următoarele elemente:

• 59% Hidrogen (H) • 24% Oxigen (O) • 11% Carbon (C) • 4% Azot (N) • 2% Altele - Fosfor (P), Sulf (S), etc. Moleculele care constituie o celulă sunt: • 50% proteine • 15% acizi nucleici • 15% carbohidraţi • 10% lipide • 10% altele

In interiorul celulei găsim citoplasma formată din:

Citosol – în principal apa ca soluţie vâscoasă – totul cu excepţia organitelor celulare. Organite celulare (care sunt delimitate de membrană) prezente numai în organismele eucariote evoluate

(superioare): • Nucleu (în eucariote) – în care este localizat materialul genetic ADN şi produsul acestuia de

transcriere, ARN. • Reticul endoplasmic (RE) – important în cursul sintezei proteice. Este o reţea de transport

pentru molecule destinate unor modificări şi localizări speciale (cum ar fi suprafaţa celulară externă). Sunt de două feluri:

• RE rugos – prezintă ribozomi şi este grupat sub formă de teancuri plate. La nivelul lor are loc sinteza de proteine destinate compartimentelor delimitate de membrane.

• RE neted – nu are ribozomi şi se prezintă ca o reţea tubulară. • Aparat Golgi – cu rol în maturarea proteinelor prin glicozilare urmată de secreţie. • Lizozomi – Saci digestivi – principalele structuri care digeră componentele celulare şi se

întâlnesc numai în celule animale. • Peroxizomi – La nivelul lor oxigenul este utilizat pentru realizarea unor reacţii catabolice

atât la animale cat şi la plante. Ribozomi – particule nucleoproteice (compuse din acizi nucleici şi proteine); circa jumătate dintre ei sunt

grupaţi pe RE, iar cealaltă jumătate “înoată” liber în citosol. La nivelul lor ARN ajunge pentru a servi la translaţia (traducerea) proteinelor.

Microtubuli – filamente proteice, formate din tubulină; constituie "centrul" celular, cilii, flagelii, etc

1

Citoschelet – structura de susţinere a celulei; format din microtubuli, filamente de actină şi filamente intermediare.

Mitocondrii – Bateriile celulare, convertesc hrana în energie utilizabilă (producţie de adenozin trifosfat, ATP). La nivelul mitocondriilor conversia energetică se realizează prin respiraţie aerobă. Ele sunt delimitate de 2 membrane: internă şi externă. Membrana internă poate varia ca forma la diferite tipuri de celule iar ele formeaza prelungiri numite “criste”. Mitocondria are aproximativ mărimea unei bacterii şi contine propriul material genetic precum şi ribozomi particulari.

Vacuole – Sunt cel mai adesea prezente la plante iar în general, plantele au vacuole voluminoase. Vacuolele sunt absente din celulele animale

Cloroplaste – convertesc lumina şi hrana în energie utilizabilă (ATP) şi la nivelul lor are loc procesul de fotosinteză.

Plastide – structuri în care se depozitează substanţe de rezervă. Sunt prezente în celulele vegetale. Perete celular – prezent la organisme procariote şi celule eucariote vegetale; asigură suport şi protecţie. MATERIAL SUPLIMENTAR Simbolurile, greutăţile şi rolurile lor biologice ale elementelor chimice sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Tabel 1.1. Lista elementelor, simbolurilor, greutăţilor şi rolurilor biologice

Element Simbol Greutatea

atomica Rol biologic

Azot (nitrogen) N 14,0 Constituent al proteinelor şi acizilor nuceici Calciu Ca 40,1 In componenta oaselor, în contractia musculara Carbon C 12,0 In structura moleculelor organice Clor Cl 35,5 In digestie şi fotosinteza Cupru Cu 63,5 Parte a pigmentilor purtători de oxigen din sangele molustelor Fier Fe 55,8 Parte a hemoglobinei, molecula purtatoare de oxigen Fluor F 19,0 In dezvoltarea normala a dintilor Fosfor P 31,0 In componenta acizilor nucleici; formeaza legaturile purtatoare

de energie din structura ATP Hidrogen H 1,0 Component al apei şi a moleculelor organice Iod I 126,9 In componenta hormonilor (ex. tirozina) Magneziu Mg 24,3 Component al clorofilei, pigmentul fotosintetic; esenţial în buna

functionare a unor enzime Mangan Mn 54,9 Esenţial în buna functionare a unor enzime Oxigen O 16,0 In respiraţie; component al apei şi al majoritatii compuşilor

organici Potasiu K 39,1 In generarea impulsurilor nervoase ; echilibrul electrochimic al

membranelor Seleniu Se 79,0 In buna functionare a multor enzime Siliciu Si 28,1 Intra în structura cochiliilor diatomeelor şi a peretelui cellular

vegetal Sodiu Na 23,0 In generarea impulsurilor nervoase; echilibrul electrochimic şi

osmotic al membranelor Sulf S 32,1 Constituent al unor proteine şi polizaharide; în realizarea

structurii spatiale a proteinelor prin legaturile disulfidice; compuşii redusi ai sulfului sunt sursa de electroni

Zinc Zn 65,4 Esenţial pentru unele enzime (ex. ce oxideaza alcoolii)

 Mărimea celulelor 

Celulele eucariote (cu nucleu propriu şi organite delimitate de membrane) sunt de circa 10 ori mai mari decât celulele procariote (lipsite de nucleu şi membrane interne). Celulele unor plante sunt printre cele mai mari celule şi aceasta se datorează vacuolelor pline cu apă pe care la conţin.

2

Biologie Celulara

Mărimile aproximative ale moleculelor biologice şi celulelor sunt: Categoria “usoara”: • 0.1 nm (nanometri) diametru a atomului de hidrogen • 0.8 nm diametru un aminoacid • 2 nm diametru a unei molecule de AND sub forma de alfa helix • 4 nm, o proteină globulară • 6 nm, microfilamentele de actină • 10 nm grosime a membranelor celulare • 11 nm diametru are un ribozom • 25 nm, microtubulii • 50 nm, porii nucleari • 100 nm, un virus mare • 200 nm, centriolul • 200 nm (200 - 500 nm), lizozomii • 200 nm (200 - 500 nm), peroxizomii

Categoria “mijlocie”: • 1 µm (micrometru) • (1 - 10 um), marimea medie a celulelor procariote • 1 µm diametrul celulei umane neuronale • 2 µm, celula bacteriana de E.coli • 3 µm, mitocondria • 5 µm lungimea unui cloroplast • 6 µm (3 – 10 µm), nucleul • 9 µm celula rosie (hematia) umana

Categoria “grea”: • 10 µm • (10 - 30 µm) cele mai multe celule eucariote • 90 µm, amibele • 100 µm, ovulul uman

Categoria “super‐grea”: • 1 mm (1 milimetru, 1/10 dintr-un centimetru) • 0,75 mm diametrul exceptional al celei mai mari bacterii cunoscute: Thiomargarita namibiensis • 1 mm diametrul unei celule nervoase de sepie • 2 mm diametrul unui ou de broasca

1.2. Ce este viața? Definirea “vieţii” a fost un subiect intens disputat atât în plan filozofic cât şi în cel ştiinţific. Câteva

definiţii au fost totuşi elaborate iar pe scurt aceastea ar fi: 1. Calitatea care deosebeste un lucru viu şi funcţional de un corp mort sau o materie pur chimică. 2. Starea unui complex material sau individual caracterizată de capacitatea de a realiza câteva activităţi

funcţionale precum metabolismul, creşterea şi reproducerea. 3. Secvenţa de experienţe fizice şi mentale care constituie existenţa unui individ.

In viziunea acestor definiţii un lucru viu poate fi sau nu un virus care "trăieşte" doar atunci când inserează material genetic într-o celula vie.

Din cele de mai sus putem schiţa o definitie rezonabilă pentru "viu": substanţa vie interacţionează cu mediul său, creşte, se dezvoltă şi se reproduce.

3

Obiectul biologiei celulare Biologia celulară este una dintre cele mai dinamice domenii ale ştiinţelor vieţii. Studiul biologic al

celulei pleacă de la premiza că celulele sunt sisteme complicate prin ele însele iar în plus au o relatie complicată cu mediul înconjurător. Un organism precum omul are acelasi material genetic în toate celulele iar în acelaşi timp, un individ uman posedă peste 200 de tipuri de celule ce variază ca formă, mărime şi rol. Toate aceste celule au originea într-o singură celulă : celula ou.

Biologia celulară studiază: • Complexitatea • Inter-relaţiile şi • Intra-relaţiile celulelor • Unitatea celulară şi relaţiile cu mediul său. • Abilitatea celulei de a vieţui şi reproduce. • Capacitatea să de a creşte, a se dezvolta şi transforma. Biologia celulară este o stiinţă interdisciplinară, înţelegerea complexităţii structural-functionale a celulei implicând cunostinte de chimie (chimie organică şi anorganică, biochimie), fizică (electronică, optică, termodinamică) şi biologie. În cursul de faţă, destinat studenţilor chimişti de la secţia de Inginerie Biochimică (anul IV), vom prezenta aspecte ale structurii celulare, cu accent asupra relaţiilor funcţionale şi metabolice dintre organitele celulare. În parcurgerea acestui curs vom face apel la cunoştinţe de Biochimie, Biofizică şi Microbiologie dobândite în anii anteriori de studiu, anticipând în acelaşi timp cursul de Genetică Moleculară din anul V de studiu. Descrierea complexităţii celulelor va face referire în mod predominant la celule eucariote de tip animal deoarece considerăm că studenţii au deja cunoştinţe de biologia celulelor procariote (Microbiologie, anul III) iar detalierea biologiei celulei vegetale este de un mai mic interes pentru specializarea de Inginerie Biochimică. Totuşi, anumite structuri şi procese de interes major întâlnite la plante (conservarea energiei şi fotosinteza) vor fi detaliate la momentul potrivit.

Nivelurile de organizare ale materiei vii Materia vie este organizata de la simplu la complex iar aceasta

aranjare poate fi reprezentată ca în Fig. 1.1. Celula este considerata a fi unitatea de baza a viului iar nivelurile subcelulare aparţin în general neviului. Desi viruşii şi fagii nu sunt considerati a fi "vieţuitoare", ele neurmand un model celular de organizare, au capacitatea de a se reproduce în prezenta "viului".

Există niveluri de organizare suprapopulaţională: comunităţi de populaţii (consorţii), ecosistem, biom (ecosisteme caracterizate de acelaşi tip de climă) şi biosferă.

Fig. 1.1. Niv

Populatie

Organism

Sisteme de organe

Organ

Tesut

Celula

Organite celulare

Molecule

Atomi

Particule subatomice

elurile de organizare ale materiei.

4

Biologie Celulara

1.3. Tipuri de celule Diferenţa majoră dintre celulele de tip procariot şi cele de tip eucariot constă în faptul că procariotele

nu au nucleu şi doar în mod excepţional prezintă organite celulare delimitate de membrană (cazul bacteriilor cu vacuole). Ambele tipuri celulare conţin însă ADN ca material genetic, membrană externă (celulară), particule ribozomale, dezvoltă funcţii similare şi sunt foarte diversificate. Procariotele: • Sunt celule fără nucleu. Materialul lor genetic nu este dispus într-un “sac” membranar ci mai degrabă

grupat sub forma unui “nucleoid”. Procariotele includ bacterii şi cianofite (cianobacterii sau alge albastre-verzi). Prezintă un ADN circular dispus în citoplasmă. Recombinarea (cale de diversificare genetică) decurge prin transferal de plasmide (ADN circular scurt) care trec de la o bacterie la alta. Procariotele nu pot “inghiţi” particule solide şi nu au centrioli sau astre (centru celular sau centru de iniţiere a diviziunii). O reprezentare schematică a unei celule procariote este înfăţişată mai jos. Procariotele au un perete celular constituit din peptidoglicani.

PiliPili

Eucariotele: • Sunt celule cu nucleu în

delimitează celula. Celulfungi, plante şi animalecomplexaţi (asociaţi) cu

filamente inm

P

Absenti lamajoritatea

plantelor

filamente inm

P

Absenti lamajoritatea

plantelor

RibozomiADN

Motor rotativ

Flagel

CapsulaPerete celular

Membranaplasmatica

RibozomiADN

Motor rotativ

Flagel

CapsulaPerete celular

Membranaplasmatica

Fig. 1.2 Organizarea celulelor procariote.

care materialul genetic este inconjurat de o membrană asemănătoare membranei ce ele eucariote alcătuiesc corpul uman dar şi a multor altor organisme (protozoare, ). Materialul genetic este grupat sub forma mai multor cromozomi liniari şi

proteine ce servesc la împachetare şi reglarea transcrierii informaţiei genetice.

Reticulendoplasmic

rugos

Reticulendoplasmic

netedNucleu

Ribozomi

Aparat Golgi

Membranaplasmatica

Mitocondrie

Citoschelet:microtubuli,

termediare siicrofilamente

eroxizom

Flagel

Lizozom

Centriol

Reticulendoplasmic

rugos

Reticulendoplasmic

netedNucleu

Ribozomi

Aparat Golgi

Membranaplasmatica

Mitocondrie

Citoschelet:microtubuli,

termediare siicrofilamente

eroxizom

Flagel

Lizozom

Centriol

Fig. 1.3 Organizarea unei celule eucariote.

5

Eucariotele pot fi celule animale sau vegetale. Celulele vegetale se deosebesc de cele animale prin prezenta vacuolelor, peretelui celular, a cloroplastelor şi lipsa lizozomilor, centriolilor, pseudopodelor, cililor sau flagelilor, care sunt în schimb prezenţi în diferitele tipuri de celule animale. Diferenţele dintre celulele procariote şi eucariote sunt rezumate în tabelul de mai jos.

Tabel 1.2. Principalele deosebiri la nivel celular dintre organismele procariote şi cele eucariote Caracteristică Procariote Eucariote Nucleu Nu au nucleu distinct, materialul genetic fiind

dispus sub forma unui nucleoid. Nu au nucleol.

Au nucleu (eu-karyos, gr.= nucleu adevărat) delimitat de membrana nucleara şi conţinând nucleol

Material genetic Cromozom circular unic, de tip “bacterian”; Contin plasmide ca material genetic suplimentar

Materialul genetic este dispus sub forma liniara, în filamente de cromatina care, în decursul diviziunii, se condenseaza în mai multi cromozomi.

Genele Dispuse sub forma unui operon (constituit din promotor, gena reglatoare şi gene structurale). în general produsul de expresie a unei gene este o proteina.

Dispuse sub forma unor clustere (asociatii). Produsul de expresie a mai multor gene poate fi o singura proteina.

Ribozomi Ribozom de tip procariot cu greutatea de 70 S, format din 2 subunităţi: una de 30 S iar cealaltă de 50 S

Ribozom de tip eucariot dispus în citoplasma sau atasat de reticulul endoplasmic, cu marimea de 80 S avand două subunităţi: de 40 S şi 60 S

Membrana celulară

Prezenta şi delimiteaza intreaga celula, incapabila de endo- şi exocitoza. Nu contine carbohidrati şi steroli (cu unele exceptii care contin molecule asemanatoare sterolilor

Prezenta, delimitand celula şi contribuind la compartimentarea celulei formand un sistem de endomembrane. Membrana celulară participa la endocitoza şi exocitoza. Contine steroli şi carbohidrati.

Alte organite celulare

Nu au ; unele bacterii conţin vacuole. Nu au citoschelet. Flagelul bacterian nu este înconjurat de membrana şi are structura diferita de cel eucariot.

Vacuole şi cloroplaste în celulele vegetale; lizosomi, cili şi flageli în celulele animale; mitocondrii, reticul endoplasmic, aparat Golgi în ambele tipuri de celule prezintă citoschelet.

Perete celular Prezent la unele bacterii, format din peptidoglicani.

Prezent numai la celulele vegetale, format din celuloza ; absent în celulele animale

Metabolism Respiraţie aerobă (oxigenică) sau anaerobă (anoxigenică). Fosforilarea oxidativă are loc la nivelul membranei celulare.

Respiraţie exclusiv aerobă. Fosforilarea oxidativă are loc în mitocondrii.

Diviziunea celulară

Asexuată, prin fisiune binară (diviziune simplă) prin intermediul unui inel de diviziune.

Diviziune simplă prin mitoză, respectiv sexuată prin meioză, diviziunea celulară implică participarea unui aparat de diviziune, a centriolilor şi fusului de diviziune

Bibliografie  CRĂCIUN, C., Citologie generală, Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2005, p. 15-18;

6

Biologie Celulara

Probleme : 1. Care dintre următoarele lucruri nu este “viu” dar necesita viaţa pentru a se reproduce? A. Bacterii

B. Fungi

C. Protozoare

D. Viruşi 2. Care propozitie descrie corect funcţia RE rugos? A. Transport specific şi sisteme de semnalizare

B. Sinteza şi asamblarea membranelor şi proteinelor de secreţie

C. Producerea de energie în timpul fotosintezei

D. Procesarea membranelor şi a proteinelor de secreţie, incluzand glicozilarea 3. Care propozitie descrie corect funcţia aparatului Golgi? A. Transport specific şi sisteme de semnalizare

B. Sinteza şi asamblarea membranelor şi proteinelor de secreţie

C. Producerea de energie în timpul fotosintezei

D. Procesarea membranelor şi a proteinelor de secreţie, incluzand glicozilarea 4. Care este locul de sinteza şi asamblare a proteinelor ce constituie receptorii celulari? A. Nucleul

B. Mitocondriile

C. Reticulul endoplasmic

D. Lizozomii 5. Urmatorul organit este intalnit în celula procariotă dar nu şi în cea eucariotă animala: A. Mitocondriile

B. Cloroplastele

C. Nucleul

D. Peretele celular 6.Mitocondriile şi cloroplastele: A. Funcţionează pentru a furniza celulei sursa de energie

B. Sunt prezente la plante

C. Conţin ADN

D. Toate variantele de mai sus

7

MATERIAL SUPLIMENTAR

Giant Bacteria Discovered http://www.accessexcellence.org/WN/ By Sean Henahan

Washington, DC (4/16/99)- Thiomargarita namibiensis, a giant bacterium discovered off the coast of

Namibia, has a repertoire of survival techniques that would be the envy of any extremophile.

left Light-photomicrograph of three cells of Thiomargarita. The prokaryote, measuring up to 0.75 mm wide, is 100 times larger than its nearest competitor în the bacterial size contest. An international team of biologists were stunned to discover the organism while studying the sediments în the coastal waters of Namibia. The "Sulfur Pearl of Namibia" has adapted to an environment low în oxygen and high în hydrogen sulfide that would be toxic to most life forms. "When I told them, my colleagues at first didn't believe me because the bacteria were so big. But I've been working with exotic bacteria for a while now and I knew immediately that these were sulfur bacteria," said Heide Schulz, of the Max Planck Institute for Marine Microbiology. Microscopic analysis revealed that much of the volume of the cell is taken up by a

vacuole. The bacteria uses the vacuole to store the nitrates that it uses to oxidize sulfide. The researchers noted that nitrate concentraţions within the cell could be up to 10.000 times higher than în the surrounding sea water This combination of the oxidation of sulfide with the reduction of nitrate provides the bacteria with an energy source which is not accessible for most bacteria în the absence of oxygen. The massive vacuole allows Thiomargarita to "hold its breath" until the appropriate nutrients become available. Dr. Schulz was part of a team of scientists who were looking for two other kinds of sulfur bacteria, Beggiatoa and Thioploca, which they had found off the Pacific coast of South America. Both areas feature the hydrographic similar features, particularly an upsurgence of deep ocean water rich with the nutrients on which phytoplankton and other marine organisms depend. But the scientists found only minor levels of Beggiatoa and Thioploca, but quite a lot of Thiomargarita. The genetically similar Thioploca and Thiomargarita, have evolved separate adaptations to the same ecological challenge of surviving în the high sulfide environment. While nitrate is found în sea water, it does not penetrate the oxygen-poor, sulfide-rich sediment where these bacteria are found. Thioploca cells form filaments that cling to each other and secrete a sheath of mucous film. This sheath provides a vertical tunnel through the sediment up to the overlying water, allowing the Thioploca filaments to 'commute' between their food source and the nitrate they need to metabolize it. Thiomargarita, în contrast, do not commute. Rather, they form strands of single, unattached cells evenly separated by a mucous sheath, and wait for nutrients to pass by. The discovery of these organisms should stimulate research into the origins of life on planet Earth. The biosphere depends on the constant recycling of key elements including carbon, nitrogen, and sulfur. Microorganisms are major contributors to this recycling as they facilitate reduction and oxidation. This turn facilitates the transfer of elements to the oceans, sediments, and atmosphere, and to other organisms. The appetite of these bacteria for sulfide and nitrate also suggest another role for them. It might be possible to utilize the bacteria to remediate coastal waters polluted by excess nitrates from agricultural runoff. The research appears în the April 16, 1999 issue of Science.

8

Biologie Celulara

Capitolul 2. Originea vietii şi biodiversitatii 2.1. Ce spun teoriile clasice? 

roblema originii vietii este probabil subiectul cel mai dezbatut în istoria gandirii umane. Definindu-si locul şi rolul, incercand sa-si prezica viitorul din perspectiva apariţiei sale, omul a apelat inca din zorii

civilizatiei la explicatii dintre cele mai diverse pentru chestiunea originii sale şi a vietii în general. Primele idei privind provenienta lumii inconjuratoare au avut o baza mistica, metafizica, care la vremea lor erau importante, asigurand un confort psihic omului inspaimantat de fortele naturii. Cu timpul, odata cu progresul civilizatiei, acest confort a fost inlocuit de curiozitatea rebela a oamenilor, alaturi de fateta mistica, emotionala a gandirii facandu-si loc şi o fateta rationala, stiintifica. Pe baza acumularii unor informatii concrete, palpabile, a observarii obiective a naturii inconjuratoare, au fost elaborate şi teorii stiintifice care să explice originea vietii şi omului. Dintre teoriile stiintifice unele includ interventia Divinitatii iar altele sunt total materialiste Exceptand teoria creationista care face obiectul teologiei, vom incerca să prezentam pe scurt cele mai importante ipoteze clasice şi moderne ale originii vietii pe Pamant.

P

Ipoteza generației spontane.  Viaţa a aparut ca urmare a acţiunii fortelor mecanice ale naturii.

Exprimata pentru întâia oară de Democrit, în Antichitatea elenă, această idee susţinea apariţia vieţuitoarelor în mod spontan din apa, aer, foc şi pamant, cele patru elemente primordiale. Geniala este însă incercarea lui Democrit de a explica formarea materiei vii prin "unirea celor mai mici particule de pamânt umed cu atomii focului". Continuând în aceeasi temă, Aristotel susţinea apariţia larvelor, capuselor, licuricilor şi a altor vieţuitoare marunte din roua, lemn uscat, par, sudoare şi din carne. Ulterior alti cunoscuti oameni de stiinta precum W. Harvey (descoperitorul circulatiei sangvine), F. Bacon (intemeietorul experimentului stiintific şi utilizării gandirii metodice) sau matematicianul R. Descartes au imbratisat teoria generatiei spontane. Aceasta ipoteza a supravieţuit până la mijlocul secolului al XIX-lea cand, prin experimentele sale chimistul Louis Pasteur a demonstrat că bacteriile nu pot lua naştere direct din infuzii şi solutii organice.

Ipoteza panspermiei Viaţa exista pretutindeni în Univers şi ca urmare Pamantul a putut fi "insamantat" cu germenii vietii. Anaxagoras, filozof grec, a explicat ca germenii ("spermata") existenti pretutindeni ("pan") au fecundat pamantul umed, neinsufletit. Naturalistul L. Buffon a preluat aceasta idee a circulatiei "embrionilor de viaţa" peste mari distante în spatiu. în prezent ipoteza panspermiei este considerata viabila de multi oameni de stiinta dar sub forma mai nuantata, mai stiintifica astfel :

1. Litopanspermia este ipoteza conform căreia materia vie provine din meteoritii care strabat spaţiul cosmic. Mai exact este vorba de compuşi organici (prebiotici) care pot exista pe corpurile ceresti. în sprijinul acestei ipoteze vin descoperirea multor compuşi chimici care intra în alcătuirea unei celule : aminoacizi (alanina, glicina, valina), acizi grasi, hidrocarburi cu lanturi lungi de carbon, zaharuri (arabinoza, glucoza, manoza), compuşi azotati ciclici (adenina, guanina). La rândul lor originea acestor compuşi organici prebiotici este discutata: pe de o parte exista susţinatori ai originii biogene, provenind din activitatea unor organisme care au trait pe aceste corpuri ceresti din care au provenit meteoritii, iar pe de alta parte compuşii prebiotici din cosmos ar avea origine abiogena, rezultate din combinatii pur chimice.

2. Radiopanspermia ca ipoteza a fost elaborata de laureatul Premiului Nobel (1904) S. Arrhenius. El susţinea ca "viaţa e eterna" iar sporii vii, formati pe corpurile ceresti şi ajunsi accidental în cosmos, ar fi purtati radiatiile cosmice pe alte corpuri ceresti. Experimente efectuate cu spori bacterieni precum şi descoperirea unui microorganism (Deinococcus radiodurans) au aratat capacitatea acestora de a rămâne viabili sub acţiunea unor doze imense de radiatii UV, în tranzitii bruste de temperatura şi la temperaturi aproape de zero absolut.

3. Panspermia dirijata este o ipoteza care include o inteligenta ce ar fi trait cu mult inainte de apariţia Terrei şi care ar fi "dirijat insamantarea cu forme vii, elementare, de tipul microorganismelor, planete sterile precum Pamantul". Unul din partizanii acestei ipoteze a fost F. Crick, la rândul sau laureat al

9

Premiului Nobel, iar argumentele sale în favoarea insamantarii inteligente se rezuma la constatarea uniformitatii codului genetic (fapt greu de explicat în condiţiile în care viaţa ar fi aparut simultan în multiple locuri pe Pamant) şi a timpului relativ scurt dintre formarea Terrei (acum 4,7 miliarde de ani) şi apariţia bacteriilor albastre-verzi (sub forma asociatiilor de stromatolite, acum 3,7 miliarde de ani), mult prea scurt pentru a explica apariţia lor.

2.2. Ipoteze moderne ale originii vietii Am văzut anterior că în viziunea susţinatorilor generatiei spontane şi panspermiei, procesul apariţiei

primelor molecule biogene, respectiv a unor organisme gata formate, este fie o miscare magica a naturii, fie un dar facut de extraterestri, fara a explica însă cum au aparut acestia. Ipotezele asa-numite moderne incearca să aplice experimentul stiintific în demonstrarea apariţiei primelor biomolecule, treapta de organizare a materiei precursoare celei celulare. Din acest punct de vedere, ipotezele apariţiei vietii pot fi grupate în ipoteze ale formării moleculelor biogene şi ipoteze ale apariţiei primei celule.

Teoria evoluției biochimice (Oparin şi Haldane)  Pe scurt această teorie explică apariţia moleculelor biogene ca urmare a unor reacţii chimice sub acţiunea unor factori fizici favorabili. In mod independent, biochimistul rus A.I. Oparin (1922) şi cel englez, J.B.S. Haldane (1928) au formulat ipoteze similare privitoare la biogeneză. În viziunea lor au existat trei etape de dezvoltare de la materia anorganică la materia vie :

1. Etapa anorganică – a apariţiei hidrocarburilor primare. Este o etapă pur chimică ce a avut ca rezultat generarea metanului, apei, amoniacului etc. În primele momente ale existenţei sale ca planeta de sine stătătoare, Pământul avea foarte probabil o atmosferă reducătoare bogată în metan, vapori de apă, hidrogen, amoniac. Oxigenul sub formă liberă nu exista sau era în cantităţi infime.

2. Etapa organică – a apariţiei moleculelor organice de tipul aminoacizilor. Condiţiile fizico-chimice existente pe Terra tanara cum ar fi lipsa oxigenului, temperaturile inalte şi bombardamentul cu radiatii UV ar fi cauzat generarea de aminoacizi. Reproducerea posibilelor condiţii fizico-chimice ale atmosferei primitive în laborator a permis lui W. Loeb (1913), J. Haldane (1926) şi S. Miller (1953) să obtina aminoacizi şi alte molecule organice. Astfel Stanley Miller şi Harold Urey a supus timp de o săptamână descărcărilor electrice generatoare de raze UV un amestec de H2 (13%), CH4 (26%), NH3 (26%) şi vapori de apă (35%), inchis într-un balon de sticlă de 5 l, la temperatura de 60oC. Ei au reusit să obtină un număr remarcabil de compuşi : CO, CO2, HCN, acid formic, aldehida formica, glucide, grasimi, acid acetic, uree şi numerosi aminoacizi. Miller şi Urey au concluzionat ca primii compuşi care se sintetizeaza în prezenta descarcarilor electrice sunt acidul cianhidric şi aldehidele şi ca reacţiile au loc în absenta oxigenului, confirmand astfel caracterul chimic reducator al atmosferei primitive.

Pastrandu-se aproximativ aceleasi condiţii din experimentele lui Miller şi Urey, ulterior au fost obtinute şi alte molecule organice de interes biologic : baze purinice şi pirimidinice, pentoze precum riboza şi dezoxiriboza (C. Ponnamperuma şi C.Sagan), acizi nucleici (A. Kornberg, 1958), iar în prezenta esterilor polifosfatici, lanturi de nucleotide şi adenozin-monofosfat (Schramm, 1962; Ponnamperuma, 1965). Aceste descoperiri au evidenţiat posibilitatea ca Pamantul primitiv să adaposteasca o cantitate apreciabila de molecule organice cu potential biogen.

3. Etapa biologica – a formării unor sisteme capabile de metabolism. în 1932 s-a reusit obtinerea în laborator a unor agregate lipidice sferice cu diametre cuprinse intre 1 şi 100 µm, agregate formate spontan pe baza interacţiunilor hidrofobice ale coloizilor în soluţii slab organice (Fig. 2.1). Ele au fost botezate “coacervate” (coacervare, lat= a se aduna la un loc) şi văzute de Oparin ca precursoare ale membranelor celulare. Asemenea picăturilor de ulei într-o farfurie de supă, coacervatele se pot "divide" atunci când ating un volum critic. Mai mult, s-a constatat ca aceste agregate au o permeabilitate selectivă pentru anumiti compuşi organici. Este posibil ca în interiorul coacervatelor aparute spontan în Oceanul Primar să se acumuleze o serie de substanţe precum aminoacizi şi nucleotide. O etapă ulterioara ar fi contat în "selectia naturala" a celor mai stabile coacervate, capabile să reziste multa vreme. Suprafaţa imensa a Oceanului care adapostea "supa primara" precum

10

Biologie Celulara

şi timpul scurs ar fi putut fi suficiente pentru apariţia a unui număr imens de combinatii, adica o baza larga de selectie a coacervatelor stabile.

Fig. 2.1 Coacervate obtinute de Oparin din interacţiunea spontana a gelatinei cu guma

arabica

Cu toate rezultatele pozitive obtinute în favoarea teoriei Oparin-Haldane, problemele apariţiei biopolimerilor gigantici de tipul proteinelor, a asocierii dintre acestea şi acizii nucleici pentru a forma substratul informaţional al reproducerii şi metabolismului, raman fara raspuns. în anii urmatori experimentelor lui Miller, biochimistul american S. Fox a facut la rândul sau cateva descoperiri neasteptate, evidente ca l-au facut să elaboreze ipoteza protenoidelor.

Ipoteza proteinoidelor (Fox, 1959). Pornind de la constatarea ca acidul glutamic şi acidul aspartic sunt cei mai abundenti dintre cei 20 de

aminoacizi esenţiali, S. Fox şi colaboratorii sai (1956, 1959) au incalzit un amestec din cei doi aminoacizi, timp de 3 ore la 180oC obtinand un polimer asemanator proteinelor, structura denumita "proteinoid" (cunoscute în prezent drept "proteine termale"). S-a constatat ca aceste proteinoide pot atinge greutati moleculare de 3000 până la 10000 si, surprinzator, în condiţii experimentale identice, folosind aceleasi amestecuri de aminoacizi, se obtine o succesiune regulata şi reproductibila de aminoacizi. Ca şi când aceste rezultate nu ar fi indeajuns de spectaculoase, în urma racirii suspensiei de proteinoide, în apa sarata, se obtin niste sferule microscopice (1-2,5 µm diametru) mult mai stabile decat coacervatele, numite "microsferule". Aceste microsferule pot creste prin aditia altor proteinoide sau substanţe din mediu şi se pot divide. în plus, sub presiuni usoare, microsferulele se pot alinia în lanturi asemanatoare algelor coloniale microscopice. în sectiune, microsferulele prezintă chiar un invelis dublu de proteinoide, invelis care are o permeabilitate selectivă.

Obţinerea proteinelor termale şi microsferulelor l-au determinat pe Fox să afirme că acestea din urmă ar reprezenta o formă de protocelulă. Deosebirea esenţială dintre coacervate şi microsferule constă în faptul ca primele iau nastere prin separarea unor formatiuni sferice dintr-un amestec de apa şi macromolecule, în timp ce microsferulele apar prin condensarea proteinelor termale deindata ce ele se formeaza din aminoacizi.

Provenienta pe cale chimica a macromoleculelor sau biopolimerilor fiind intrucatva verificata experimental, la aceasta adaugandu-se şi cele cateva ipoteze privind formarea unui "invelis" protector, rămâne în discutie asocierea dintre acizii nucleici (polinucleotide) şi proteine (polipeptide) pentru a forma un metabolism coerent. în acest sens au fost elaborate două grupe de teorii, una vizand rolul primordial al ADN iar cealaltă clamand intaietatea ARN în stabilirea unui metabolism primitiv.

Teorii ale genotipului Cuprind o suma de ipoteze referitoare la capacitatea moleculelor de ADN, aparute spontan în supa

primara, de a se replica şi a suferi mutatii (sub acţiunea radiatiilor UV). Experimente efectuate cu ADN au aratat ca acesta poate servi ca matrita pentru formarea unor copii ale sale, e adevarat cu mari erori (Orgel,

11

1971). Un intreg scenariu a fost imaginat pornind de la cateva constatari experimentale. Astfel, în anumite condiţii fizico-chimice (temperatura, prezenta unor ioni metalici cu rol catalizator), polinucleotidele ar fi putut lega nucleotide complementare (adenina-timina, citozina-guanina) rezultând macromolecula dublu catenara de ADN, mai stabilă. La rândul său, ADN s-ar fi putut replica, chiar şi cu o acurateţe redusă. Mutaţiile rezultate sub acţiunea UV ar fi asigurat o mare heterogenitate intre moleculele de ADN. Saracirea Oceanului Primar în substanţe organice în general şi în nucleotide în particular, ar fi determinat apariţia unei "competitii" nemiloase intre molecule rivale. Doar cele mai stabile, posibil cele care au reusit sa-si asocieze unele polipeptide (viitoare proteine stabilizatoare sau chiar enzime) şi protejate în coacervate sau microsferule, să fie capabile să supravieţuiasca. In felul acesta, ca urmare a unei “lupte pentru existenta” la nivel molecular, ar fi aparut prima celula.

Teoria ribotipului (Barbieri, 1981) Aceste teorii pleaca de la constatarea ca ribozomii, structuri ribonucleoproteice, sunt universal

raspandite la procariote şi eucariote. La nivelul acestor organite are loc translaţia, adica asamblarea aminoacizilor în proteine. Mai mult, secvenţa de nucleotide din ARN ribosomal (ARNr) este una dintre cele mai conservate secvenţe din acizii nucleici. Sinteza abiotica a uracilului, nucleotid care substituie timina din ADN, a fost de asemenea demonstrata (S. Miller şi M.P. Robertson, 1995). Teoria ribotipului, formulata de Barbieri (1981), afirma ca viaţa a aparut odata cu stramosii primelor ribotipuri actuale, ribotipul fiind considerat sistemul ribonucleoproteic al fiecărei celule, adica suma ribozomilor dîntr-o celula. Conform acestei teorii, formele de viaţa ar fi aparut în trei etape : precelulară, protocelulară şi celulară.

1. Evolutia precelulară – a fost initiaţa de asocierea polinucleotidelor cu polipeptide pentru a forma ribozomii primitivi (ribozoizi). Exista diverse date experimentale care susţin rolul acidului ribonucleic în aceasta asociere, iar cea mai importanta este capacitatea ARN de autocataliza replicarea (si de aceea ARN a mai primit numele de "ribozima") (T.R. Cech şi S. Altman, Premiul Nobel în 1989). în primele momente ale asocierii ARN-polipeptide ar fi existat o diversitate foarte mare de ribozoizi. Unii dintre acestia, posedand ARN capabil de o replicare eficienta s-ar fi perpetuat în dauna altor ribozoizi. Secvenţe similare de ARN ar fi fost asociate cu polipeptide similare.Ulterior un avantaj competitive l-ar fi constituit capturarea acestora în coacervate sau microsferule, formand nucleozoizi. Nucleozoizii ar reprezenta asadar coacervate cu ribozoizi şi alti compuşi, foarte heterogene ca dimensiune, forma şi proprietate. Etapa mai avansata nucleozoizilor ar fi reprezentată de inglobarea moleculelor de ADN dublu catenar, acizi nucleici mai stabili decat ARN monocatenar.

2. Evolutia protocelulară – ar fi fost initiate din nucleozoizi cu ADN (heterozoizi) în care ribozoizii ar fi devenit mai mari, devenind ribozomi cu capacitate crescuta de replicare. Ei s-ar fi grupat specific într-o anumita zona ale heterozoidului (similara nucleolului). în prezent se stie ca la nivelul nucleolilor are loc transcriptia informaţiei genetice de pe ARN la ARN mesager. Heterozoizii, protejati de un invelis asemanator membranei şi capabil de replicarea informaţiei continute în acizii nucleici ar fi reprezentat protocelule sau "microcariote". în acest punct rămâne totusi nelamurita problema apariţiei codului genetic, a transferului de informatie ADN-ARN-proteine care constituie dogma centrala a biologiei.

3. Evolutia celulară – a urmat două cai importante şi anume microcariotele au dat nastere la procariote (arhebacterii şi eubacterii) respectiv microeucariotelor care prin endocitoza (incorporarea) unor procariote au dobandit mitocondrii şi cloroplaste devenind eucariote.

Apariţia celulelor de tip eucariot, posesoare ale unor organite celulare delimitate de o membrana lipidică proprie a fost explicata prin mai multe teorii dintre care cea endosimbiotica a lui Lynn Margulis, este cea mai larg acceptata.

Ipoteza endosimbiozei seriale (Margulis, 1981) Asemanarea dintre bacterii şi organitele celulare, plastide şi mitocondrii din eucariote, a fost semnalata cu mai bine de un secol în urma de Schimper (1883) respectiv Altman (1890). Dintre argumentele pentru originea procariotă a mitocondriilor şi plastidelor (cloroplaste) amintim : marimea relativa asemanatoare cu cea a bacteriilor, prezenta la suprafaţa acestora a două membrane bistratificate, prezenta enzimelor din lantul respirator în membrana internă a acestor organite, desfăşurarea fosforilării oxidative exclusiv în interiorul

12

Biologie Celulara

mitocondriilor şi cloroplastelor, material genetic propriu (ADN şi ARN mitocondrial şi plastidial) alaturi de ribozomi de tip procariot, codul genetic mitocondrial şi plastidial este usor diferit de cel nuclear, capacitatea acestora de automultiplicare. Sintetizând datele avute la dispozitie, L. Margulis (1981) a elaborat ipoteza originii endosimbiotice a plastidelor, mitocondriilor, flagelilor, centriolilor, citoscheletului, fusului de diviziune şi a altor structuri ce caracterizează celula eucariotă. In conceptia lui Margulis, o prima simbioză ar fi avut loc între un organism amoeboid heterotrof (cu nutritie organică) şi o bacterie aerobă autotrofa (capabila de sinteza propriilor substanţe organice pornind de la nutrienti anorganici). Bacteriile aerobe ar fi aparut abea dupa achizitionarea aparatului fotosintetic de către procariote, adica dupa apariţia cianobacteriilor. Acestea sunt considerate la ora actuala cele mai vechi forme de viaţa de pe planeta noastra. Ele ar fi format asociatii numite stromatolite (ce pot fi inca vazute în marile australe) şi ar fi contribuit la cresterea continutului de oxigen liber în atmosfera. Consecinta acestui fapt a fost disparitia atmosferei primitive, reducatoare şi apariţia organismelor capabile să utilizeze oxigenul ca acceptor final de electroni (aerobe). Revenind, rezultatul primei etape endosimbiotice a fost un protoeucariot amoeboid, aerob. Acesta se multiplica dupa atingerea unei mase critice, prin diviziune simpla. O a două simbioza ar fi constat în asocierea protoeucariotelor amoeboide cu bacterii aerobe de tipul spirochetelor sau spirililor, fapt finalizat cu apariţia flagelului. Spirilii şi spirochetele contin structuri microtubulare cu rol contractil şi de mobilitate. Organizarea similara a aparatului flagelar (a corpusculului bazal) şi centriolilor vin în sprijinul originii monofiletice a acestora. Ulterior microtubulii ar fi constituit aparatul de diviziune mitotica, specifica eucariotelor. Rezultatul celei de a două simbioze a fost un amoeboflagelat heterotrof asemanator protozoarelor actuale. Acest tip de organism ars ta la baza organismelor animale şi fungale actuale.

Un alt avantaj evolutiv l-ar fi constituit apoi endosimbioza cu o cianobacterie, celula eucariotă devenind astfel capabila de nutritie dubla: heterotrofa şi autotrofa (nutritie mixotrofa ca de ex. la speciile genului Euglena). Pierderea capacitatii de nutritie heterotrofa, prin dezvoltarea sistemului fotosintetic a dus la apariţia organismelor vegetale, fotoautotrofe.

Subordonarea diferitelor organite intregului celular a fost cauzata de un schimb de informatie genetica intre materialul ereditar al organitelor şi cel din nucleu, care devine astfel centrul coordonator al activitatilor celulare.

Teoria endosimbiozei seriale emisa de Margulis are la rândul ei puncte slabe, controversate mai ales în ceea priveste achizitionarea citoscheletului, centriolilor, fusului de diviziune şi a flagelilor. Ea explica însă relativ bine apariţia organitelor celulare de tipul mitocondriilor şi cloroplastelor

Optimizarea diviziunii mitotice odata completa a avut drept consecinta explozia evolutiva (radiatia

adaptativa) a protistelor (eucariotelor unicelulare) şi urmata la scurt timp de apariţia metazoarelor (plante şi animale) şi fungilor.

Teoriile apariției şi evolutiei codului genetic O problema spinoasa a biologiei moleculare moderne este explicarea modului în care s-a ajuns la codul genetic actual, universal raspandit la vieţuitoarele de pe planeta noastra.

Caracteristica principala a codului genetic este organizarea să sub forma de gene formate din "codoni" alcatuiti din trei nucleotide, codoni care codifică un anume aminoacid. Mai simplu spus, putem să facem o paralela intre informatia genetica şi dictionarul unei limbi: informatia genetica "spune" ce anume trebuie să execute o celula la fel cum cuvintele unei limbi ne permite să comunicam şi să interactionam cu mediul. Informatia genetica este formata din codoni, cuvinte ale dictionarului. Fiecare codon este format din 3 nucleotide (triplet de nucleotide), adica sunt niste cuvinte alcatuite din 3 litere. în total alfabetul genetic are 4 litere: A, T (inlocuit de U în ARN), C. G care trebuie să alcatuiasca 20 de cuvinte (cei douăzeci de aminoacizi esenţiali). Succesiunea cuvintelor alcatuiesc fraza dupa care celula funcţionează, adica succesiunea de aminoacizi care formeaza lantul polipeptidic sau proteinele.

Informatia biologica urmeaza calea ADN ARN Proteina.

13

ADN este transcris în ARN mesager (copie în oglinda, deci purtatoare de anticodoni) iar fiecarui anticodon de pe ARNm i se ataşează un ARN de transport purtător de codon complementar şi de aminoacid.

Astazi cunoastem în detaliu organizarea codului genetic asa cum a fost descris mai sus dar acum 50

de ani mesajul ADN-ului era inca nedescifrat. Iar daca ne intoarcem acum un secol, proteinele erau considerate a fi detinatoarele informaţiei ereditare. Tot atunci acizii nucleici, a caror existenta era cunsocuta, nu erau considerati esenţiali în ereditate. Experimentele ulterioare au aratat rolul acizilor nucleici, în speta a ADN în transmiterea informaţiei (exemplul transmiterii caracterului patogenic al unor bacterii de la un tip patogen mort la unul inofensiv, viu). Dupa clarificarea rolului ADN în transmiterea informaţiei (ereditare) s-a pus intrebarea "Care este legătură dintre macromolecula, formata din succesiunea celor 4 nucleotide (adenine, timina, citozina şi guanine) şi proteine?”. Respectiv modalitatea în care cele 4 litere pot codifică cei 20 de aminoacizi esenţiali ? Un caz ar fi codificărea unui aminoacid (un cuvant) de către un nucleotid (o litera), iar din aceasta ar rezultă doar 4 combinatii (41); un alt caz ar fi imprerecherea nucleotidelor, adica o pereche de nucleotide ar codifică un aminoacid esenţial : numărul maxim de combinatii ar fi fost 4 la puterea 2 (42) adica 16 combinatii, număr insuficient pentru a justifica cei 20 de aminoacizi. A treia optiune ar fi existenta tripletilor : 43, adica 64 de combinatii, număr mai mult decat suficient, aparent chiar prea mare. Intr-adevăr, în experimente care utilizau un lant polinucleotidic de tipul poli-(U) creat artificuial, a permis sinteza în vitro a lantului polipeptidic poli-fenilalanina. S-a demonstrat apoi ca un aminoacid poate fi codificăt de mai mult de 1 codon (caraterul "degenerat" al codului genetic). Exista o serie de codoni care codifică informatii de tipul START (AUG) sau STOP (UGA, UAG şi UAA) al informaţiei genetice, fara a fi exprimate ca aminoacizi. Pe scurt, "spargerea" codului genetic s-a realizat prin translaţia în vitro a ARN sintetic în lanturi polipeptidice.

Tabel 2.1. Codul genetic

U C A G

U

UUU Phe (F)UUC Phe (F)UUA Leu (L)UUG Leu (L)

UCU Ser (S)UCC Ser (S)UCA Ser (S)UCG Ser (S)

UAU Tyr (Y)UAC Tyr (Y)UAA STOPUAG STOP

UGU Cys (C)UGC Cys (C)UGA STOPUGG Trp (W)

C

CUU Leu (L)CUC Leu (L)CUA Leu (L)CUG Leu (L)

CCU Pro (P)CCC Pro (P)CCA Pro (P)CCG Pro (P)

CAU His (H)CAC His (H)CAA Gln (Q)CAG Gln (Q)

CGU Arg (R)CGC Arg (R)CGA Arg (R)CGG Arg (R)

A

AUU Ile (I)AUC Ile (I)AUA Ile (I)AUG Met(M) START

ACU Thr (T)ACC Thr (T)ACA Thr (T)ACG Thr (T)

AAU Asn (N)AAC Asn (N)AAA Lys (K)AAG Lys (K)

AGU Ser (S)AGC Ser (S)AGA Arg (R)AGG Arg (R)

G

GUU Val (V)GUC Val (V)GUA Val (V)GUG Val (V)

GCU Ala (A)GCC Ala (A)GCA Ala (A)GCG Ala (A)

GAU Asp (D)GAC Asp (D)GAA Glu (E)GAG Glu (E)

GGU Gly (G)GGC Gly (G)GGA Gly (G)GGG Gly (G)

Ne intrebam totusi cum s-a ajuns la o asemenea organizare universala, eficienta pentru transmiterea

informaţiei ereditare cu minimum de erori?

14

Biologie Celulara

F M

IpotezePot fi rez

Pentasoc Inter

GGG. Dove

(hidrofobcu nuclesunt hidrMai mulposibil C

O prtranslaţiasalt evolDovezilecorelata

IpotezaAsocselec

Eaminoacar fi fostCodul gesă modifconsuma

I Cse poate

ig. 2.2. Relatiile stuctural-functionale dintre aminoacizi/proteine şi nucleotide/acizi nucleici

ai multe ipoteze au fost emise până în prezent :

le asocierii stereo‐ şi fizicochimice dintre aminoacid şi codon  umate astfel : ru fiecare aminoacid exista o secvenţa de codificăre pentru care manifesta cea mai mare tendinta de iere. Asocierea dintre aceste secvenţe şi aminoacizi au influentat forma şi continutul codului genetic.

acţiunile stereochimice ar putea de exemplu explica asocierea dintre aminoacidul glicina şi codonul

zile de asociere fizicochimica sunt observatiile ca exista o legătură clara intre tipul de polaritate icitate sau hidrofilicitate) a aminoacizilor şi prezenta unui anume nucleotid în codon. Aminoacizii

otid U în a două pozitie a codonului sunt hidrofobici (Ile, Leu, Met, Phe, Val) în timp ce cei cu A ofilici (Asn, Gln, Glu, His); aminoacizii care au C sunt intermediari, iar cei cu G sunt amestecati. t, codonii care au în comun un dublet impartasesc aceeasi preferinta pentru polaritate (e.g. His şi Gln; ys şi Trp). oblema fundamentala nerezolvata de ipotezele asocierii stereo- şi fizicochimice este faptul ca în moderna aminoacizii nu sunt direct legati de nucleotidele din codoni sau anticodoni. A avut loc un utionar în decursul caruia asociatiile directe s-au pierdut dar logica a fost transmisa până în prezent. experimentale în favoarea acestor ipoteze sunt însă limitate iar originea codului genetic nu poate fi univoc cu asocierea chimica dintre trinucleotide şi aminoacizi.

 minimizarii erorii prin mutatii intamplatoare (randomizate) ierea dintre aminoacizi şi ARN purtători de codoni este optimizata în urma unui indelung proces de tie, adica eliminarea celor mai instabile asocieri aminoacid- ARN.

ste posibil mai multe "coduri genetice" initiale să fi presupus asocieri (intamplatoare sau nu) intre izi şi dubleti de nucleotide. Aceste coduri genetice ar fi fost extrem de ineficient în translatie, erorile foarte mari iar rezultatul, un amestec haotic de polipeptide produse într-o maniera nereproductibila. netic cu tripleti ar fi minimizat erorile iar unii aminoacizi ar fi putut fi inca inserati în proteine fara ice substantial funcţia acestora. Un cod genetic cu cuadrupleti ar fi în schimb prea complicat şi mare tor de energie. poteza minimizarii erorilor de expresie nu ofera solutii pentru logica asocierii aminoacid-ARN. a de obicei adevarul nu poate fi decat undeva la mijloc. Prin combinarea ipotezelor enuntate mai sus

descrie un scenariu plauzibil :

15

Cel mai probabil, în supa primara, când existau deja molecule (dublu catenare) de ARN, au aparut mai multe cai de prin care s-a stabilit o relatie intre diversi aminoacizi şi diversele secvenţe de nucleotide. Asocierile stereo- şi fizicochimice dintre nucleotide şi aminoacizi au evoluat spre asocieri cu molecule de ARN mai mari. Finalmente ARN a fost inlocuit ca material purtător de informatie ereditara de ADN dublu-catenar, o macromolecula mult mai stabila (fizic şi chimic). O parte din ARN s-a format ca o copie în oglinda a catenei ADN devenind ARN mesager (cu codoni) în vreme ce alte molecule ARN (de transfer, cu anticodoni) au ramas asociate (stereo- sau fizicochimic) cu anumiti aminoacizi iar în mediul oferit de ribozomi (cu ARN ribosomal) s-a putut optimiza procesul de translatie sau sinteza proteinelor. Unele proteine s-au dovedit a fi utile formelor de viaţa incipiente (de ex. devenind enzime care ar fi favorizat achizitia unor anumite lipide, a unor enzime care ar fi favorizat replicarea corecta a ADN sau transcriptia de mare acuratete a ADN în ARN mesager, etc).

Mai mult, o conservare a mecanismelor de transcriptie şi translatie ar fi putut fi eficienta doar în masura în care, în paralel cu perfectionarea aparatului genetic, au aparut primele cai metabolice, în principal cele care asigurau sursa de energie pentru protocelula (sinteza ATP) şi protectia să prin formarea membranei lipidice. Forta selectiei naturale a avut de ales dintre un număr enorm (se apreciaza 1020) de protocelule pe acelea care, accidental sau nu, au achizitionat cele mai favorabile schimbari.

2.3. Diversitatea lumii vii Pe baza caracteristicilor morfologice şi structurale organismele vii au fost până recent grupate în 5

regnuri : Plantae, Animalia, Fungi, Protista şi Bacteria (Monera). De la specificam faptul ca termenul de "organism evoluat" trebuie folosit cu moderatie. Conceptul de evolutie poate include şi modul în care organismul raspunde cel mai bine provocarilor mediului ambiant, pe langa complexitatea să structurala. Astfel o bacterie este capabila să supravieţuiasca unor condiţii de viaţa ce ar fi fatale omului (temperaturi de peste 100oC, medii extrem de acide sau bazice, în lipsa totala a oxigenului etc). La rândul lor aceste regnuri pot fi grupate în funcţie de complexitatea structurala în Eucariote (care cuprinde primele 4 regnuri enumerate) şi Procariote (in care sunt incluse bacteriile). Incepand cu anii ’80, pe baza dovezilor de biologie moleculara şi filogenie (stiinta care studiaza originea şi inrudirea dintre organisme), s-a stabilit o alta clasificare a organismelor în trei domenii : Eubacteria, Arheea (Arhebacteria) şi Eukarya. Aceasta clasificare se bazeaza pe descoperirea unui grup "stravechi" de procariote: arhee (arhebacterii), cu caracteristici mixte, de eucariote şi bacterii propriu-zise (eubacterii). Arheele sunt şi ele procariote deoarece nu au nucleu adevarat însă au o multime de aspecte structurale similare eucariotelor, în special în privinta aparatului genetic. Bacteriile (eubacteriile şi arheele) reprezintă de departe cel mai numeros grup de vieţuitoare cu mii de specii clasificate şi probabil alte milioane necunoscute. Se considera ca la ora actuala Planeta Albastra adaposteste cea mai mare biodiversitate din istoria de 4,76 miliarde de ani, cu circa 1,5 milioane de specii cunoscute. Dintre acestea o mica parte este reprezentată de mamifere (4000 specii), pasari şi pesti (circa 9000 specii), mai mult de 800 de mii de specii de insecte. Regnul vegetal număra circa 240 de mii de specii de plante superioare (angiosperme) şi alte 34 de mii de specii de alge, muschi, ferigi şi conifere. Fungii (ciupercile) cuprind circa 69 de mii de specii (Fig. 2.3). Numărul total de specii ca vieţuiesc în prezent este estimat cu o larga marja intre 3 şi 30 milioane. Stim de asemenea ca de-a lungul perioadelor geologice Terra a suferit 5 extinctii în masa, unele dintre ele finalizate cu eliminarea definitiva a 60 până la 90% din totalul speciilor existente. Astfel, putem realiza imensa putere creatoare a naturii, imaginatia să aproape nelimitata care a explodat din momentul în care a avut loc stabilizarea unui cod genetic şi cu ea apariţia unei populatii de celule primitive capabile de reproducere şi metabolism propriu.

16

Biologie Celulara

Procariote (eubacterii, arhee)

0,4 %

Insecte53%

Amfibieni0,3 %

Angiosperme16%

Crustacei, paianjeni13%

Fungi5%

Viermi2%

Alge si plante inferioare

2% Protozoare3%

Moluste3%

Mamifere0,3 %

Alte nevertebrate (corali, stele de

mare etc)1%

Pasari1%

Pesti1%

Reptile0,4 %

Fig. 2.3 Diagrama reprezentand ponderea principalelor grupe de organisme din totalul speciilor clasificate

în prezent. De notat faptul ca, desi bacteriile sunt considerate cel mai cuprinzator grup de organisme, datorita dificultatilor de cultivare, doar un mic procent de bacterii este cunoscut.

In viziunea actuala, originea tuturor vieţuitoare ar fi fost nu dîntr-o celula unica, un ancestor unic (progenot) ci mai degraba dîntr-o populatie de celule primitive care au reusit sa-si edifice un cod genetic relativ uniform şi între care existau schimburi de informatie genetica. Prin cresterea numărului de indivizi, o parte din celule aflate la periferia populatiei, au întâlnit condiţii de viaţă diferite fata de populatia centrala, de origine. Ele si-au readaptat metabolismul pentru a răspunde noilor provocări. Probabil, primele organisme au fost de tipul arheelor actuale din care s-au desprins bacteriile şi (proto)eucariotele.

 

 Bibliografie  CRUCE, M., Biologie celulară şi Moleculară, Editura Aius, Craiova, 1999, p. 14-23; VOICULEŢ, N., PUIU, L., Biologia moleculară a celulei, Editura ALL, Bucureşti, 1997, p. 8-21, 22-27

 

 

 

17

Probleme : 1. Planeta sau satelitul cu cea mai reducatoare atmosfera din Sistemul Solar este:  A. 96,5 % CO2, 3,5% N2, 0,005% SO2, 0,007% Ar (Venus)

B. 86% H2, 14% He, 0.1% CH4, 0,1% H2O, 0,02%NH3 (Jupiter)

C. 98,4% N2, 1,6% CH4 (Titan/Saturn)

D. 91% vapori de H2O, 4% N2, 3,2% CO2, 1,7% CH4 (Enceladus/Saturn) 2.  Privind în figura 2.2. putem adauga o funcție suplimentara : A. Functia catalitica a nucleotidelor

B. Functia informaţionala a proteinelor

C. Functia autocatalitica a polinucleotidelor

D. Functia informaţionala a aminoacizlor 3. Locul şi rata de sinteza a ADN într‐o celula poate fi urmarita prin adaugare de timidina marcata cu tritiu (3H‐Td) în mediul de crestere. De ce ? A. Timina marcata radioactiv poate fi detectata prin autoradiografie

B. Timidina este incorporata mai rapid în ADN decat adenozina

C. Deoarece 3H-Td este mai radioactiv (60-90 Ci/mmol) decat 14C-Td (40-60 mCi/mmol); 1 Ci= 1 Curie

D. Timina nu se regaseste în structura ARN 4. De ce timina este utilizată în locul uracilului în molecula de ADN ? A. Timina este mai uşor de sintetizat decât uracilul

B. Uracilul rezultat prin dezaminarea citozinei, poate forma o legătură U-A în locul unei legaturi C-G corecte, existand riscul de alterare a informaţiei genetice din ADN

C. Uracilul este forma de-metilată a timinei, fiind un compus mai ieftin din punct de vedere energetic, fiind preferată în sinteza ARN ce are durată scurtă de viaţă

D. În decursul evoluţiei uracilul a apărut mai devreme decât timina 5. Considerând o cale biochimică ipotetică G‐H‐I‐J‐K‐L, care dintre etape este cea mai recentă din punct de vedere evolutiv? A. G-H

B. H-I

C. K-L

D. J-K

 6.Mitocondriile şi cloroplastele:  A. Provin din procariote anaerobe

B. Provin prin endosimbioza unor bacterii autotrofe cu o gazda heterotrofa

C. Provin din cianobacterii primitive, incorporate şi retinute de un organism protoeucariot

D. Au origine arhebacteriana

18

Biologie Celulara

MATERIAL SUPLIMENTAR From Primordial Soup to the Prebiotic Beach An interview with exobiology pioneer, Dr. Stanley L. Miller, University of California San Diego By Sean Henahan http://www.accessexcellence.org/WN/NM/miller.html In 1953, a University of Chicago graduate student named Stanley Miller working în Harold Urey's lab flipped a switch sending electric current through a chamber containing a combination of methane, ammonia, hydrogen and water. The experiment yielded organic compounds including amino acids, the building blocks of life, and catapulted a field of study known as exobiology into the headlines. Since that time a new understanding of the workings of RNA and DNA, have increased the scope of the subject. Moreover, the discovery of prebiotic condiţions on other planets and the announcement of a bacterial fossil originating on Mars has brought new attention to the study of life's origins. I spoke with Dr. Miller în his lab at UCSD about the field he has helped to make famous, exobiology.

Let start with the basics. Can you give a simple definition of exobiology? The term exobiology was coined by Nobel Prize winning scientist Joshua Lederberg. What it means is the study of life beyond the Earth. But since there's no known life beyond the Earth people say its a subject with no subject matter. It refers to the search for life elsewhere, Mars, the satellites of Jupiter and în other solar systems. It is also used to describe studies of the origin of life on Earth, that is, the study of pre-biotic Earth and what chemical reactions might have taken place as the setting for life's origin. Some 4.6 billion years ago the planet was a lifeless rock, a billion years later it was teeming with early forms of life. Where is the dividing line between pre-biotic and biotic Earth and how is this determined? We start with several factors. One, the Earth is fairly reliably dated to 4.55 billion years. The earliest evidence for life was 3.5 billion years based on findings at the Apex formation în Western Australia. A new discovery reported în the journal Nature indicates evidence for life some 300 million years before that. We presume there was life earlier, but there is no evidence beyond that point. We really don't know what the Earth was like three or four billion years ago. So there are all sorts of theories and speculations. The major uncertainty concerns what the atmosphere was like. This is major area of dispute. în early 1950's, Harold Urey suggested that the Earth had a reducing atmosphere, since all of the outer planets în our solar system- Jupiter, Saturn, Uranus and Neptune- have this kind of atmosphere. A reducing atmosphere contains methane, ammonia, hydrogen and water. The Earth is clearly special în this respect, în that it contains an oxygen atmosphere which is clearly of biological origin. Although there is a dispute over the composition of the primitive atmosphere, we've shown that either you have a reducing atmosphere or you are not going to have the organic compounds required for life. If you don't make them on Earth, you have to bring them în on comets, meteorites or dust. Certainly some material did come from these sources. în my opinion the amount from these sources would have been too small to effectively contribute to the origin of life. So while these are potential sources of organic compounds they are not essential for the creation of life on Earth? As long as you have those basic chemicals and a reducing atmosphere, you have everything you need. People often say maybe some of the special compounds came în from space, but they never say which ones. If you can make these chemicals în the condiţions of cosmic dust or a meteorite, I presume you could also make them on the Earth. I think the idea that you need some special unnamed compound from space is hard to support. You have to consider separately the contributions of meteors, dust and comets. The amount of useful compounds you are going to get from meteorites is very small. The dust and comets may provide a little more. Comets contain a lot of hydrogen cyanide, a compound central to prebiotic synthesis of amino acids as well as purines. Some HCN came into the atmosphere from comets. Whether it survived impact, and how much, are open to discussion. I'm skeptical that you are going to get more than a few percent of organic compounds from comets and dust. It ultimately doesn't make much difference where it comes from. I happen to think prebiotic synthesis happened on the Earth, but I admit I could be wrong.

There is another part of the story. în 1969 a carbonaceous meteorite fell în Murchison Australia. It turned out the meteorite had high concentraţions of amino acids, about 100 ppm, and they were the same kind of amino acids you get în prebiotic experiments like mine. This discovery made it plausible that similar processes could have happened on primitive Earth, on an asteroid, or for that matter, anywhere else the proper condiţions exist.

19

Meteorite Photomicrograph This meteorite was found in Allende, Chihuahua, Mexico. It is a type of meteorite known as a carbonaceous chondrite and it has several extremely interesting qualities. It appears to be older than the solar system - over 4.5 billion years. In addition, meteorites of this type contain many of the same amino acids that are found in living tissue. Recently, microscopic diamonds were found in this type of meteorite. These diamonds are thought to have formed when carbon in the material was compressed by a nearby exploding supernova. This photomicrograph is part of a series of photographs documenting all of the various types of meteorites found on Earth, including some that are thought to be pieces of the planet Mars.

Doesn't the Panspermia theory looks at the question of ultimate origins of life în a slightly different way? That's a different controversy. There are different versions of the theory. One idea is that there was no origin of life, that life, like the universe, has always existed and got to the Earth through space. That idea doesn't seem very reasonable since we know that the universe has not always existed, so life has to happen some time after the big bang 10 or 20 billion years ago. It may be that life came to Earth from another planet. That may or may not be true, but still doesn't answer the question of where life started. You only transfer the problem to the other solar system. Proponents say condiţions may have been more favorable on the other planet, but if so, they should tell us what those condiţions were.

Along these lines, there is a consensus that life would have had a hard time making it here from another solar system, because of the destructive effects of cosmic rays over long periods of time. What about submarine vents as a source of prebiotic compounds? I have a very simple response to that . Submarine vents don't make organic compounds, they decompose them. Indeed, these vents are one of the limiting factors on what organic compounds you are going to have în the primitive oceans. At the present time, the entire ocean goes through those vents în 10 million years. So all of the organic compounds get zapped every ten million years. That places a constraint on how much organic material you can get. Furthermore, it gives you a time scale for the origin of life. If all the polymers and other goodies that you make get destroyed, it means life has to start early and rapidly. If you look at the process în detail, it seems that long periods of time are detrimental, rather than helpful. Can you review with us some of the history and basic background of your original prebiotic experiments? In the 1820's a German chemist named Woeller announced the synthesis of urea from ammonium cyanate, creating a compound that occurs în biology. That experiment is so famous because it is considered the first example where inorganic compounds reacted to make a biological compound. They used to make a distinction between organic, meaning of biological origin, and inorganic- CO2, CO and graphite. We now know that there is no such distinction. However, it remained a mystery how you could make organic compounds under geological condiţions and have them organized into a living organism. There were all sorts of theories and speculation. It was once thought that if you took organic material, rags, rotting meat, etc, and let it sit, that maggots, rats etc. would arise spontaneously. It's not as crazy as it seems, considering DNA hadn't been discovered. It was then reasonable to hold those views if you consider living organisms as protoplasm, a life substance. This all changed în 1860 when Pasteur showed that you don't get living organisms except from other living organisms. This disproved the idea of spontaneous generation. But spontaneous generation means two things. One is the idea that life can emerge from a pile of rags. The other is that life was generated once, hundreds of millions of years ago. Pasteur never proved it didn't happen once, he only showed that it doesn't happen all the time. A number of people tried prebiotic experiments. But they used CO2F, nitrogen and water. When you use those chemicals, nothing happens. It's only when you use a reducing atmosphere that things start to happen.

20

Biologie Celulara

Who came up with the idea of the reducing atmosphere? Oparin, a Russian scientist, began the modern idea of the origin of life when he published a pamphlet în 1924. His idea was called the heterotrophic hypothesis: that the first organisms were heterotrophic, meaning they got their organic material from the environment, rather than having to make it, like blue-green algae. This was an important idea. Oparin also suggested that the less biosynthesis there is, the easier it is to form a living organism. Then he proposed the idea of the reducing atmosphere where you might make organic compounds. He also proposed that the first organisms were coacervates, a special type of colloid. Nobody takes that last part very seriously anymore, but în 1936, this was reasonable since DNA was not known to be the genetic material.. In 1951, unaware of Oparin's work, Harold Urey came to the same conclusion about the reducing atmosphere. He knew enough chemistry and biology to figure that you might get the building blocks of life under these condiţions. Tell us about the famous electrical discharge experiment. The experiments were done în Urey's lab when I was a graduate student. Urey gave a

lecture în October of 1951 when I first arrived at Chicago and suggested that someone do these experiments. So I went to him and said, "I'd like to do those experiments". The first thing he tried to do was talk me out of it. Then he realized I was determined. He said the problem was that it was really a very risky experiment and probably wouldn't work, and he was responsible that I get a degree în three years or so. So we agreed to give it six months or a year. If it worked out fine, if not, on to something else. As it turned out I got some results în a matter of weeks.

In the early 1950s Stanley L. Miller, working în the laboratory of Harold C. Urey at the University of Chicago, did the first experiment designed to clarify the chemical reactions that occurred on the primitive earth. în the flask at the bottom, he created an "ocean" of water, which he heated, forcing water vapor to circulate through the apparatus. The flask at the top contained an "atmosphere" consisting of methane (CH4), ammonia (NH3), hydrogen (H2) and the circulating water vapor. Next he exposed the gases to a continuous electrical discharge ("lightning"), causing the gases to interact. Water-soluble products of those reactions then passed through a condenser and dissolved în the mock ocean. The experiment yielded many amino acids and enabled Miller to explain how they had formed. For instance, glycine appeared after reactions în the atmosphere produced simple compounds - formaldehyde and hydrogen cyanide. Years after this experiment, a meteorite that struck near Murchison, Australia, was shown to contain a number of the same amino acids that Miller identified and în roughly the same relative amounts. Such coincidences lent credence to the idea that Miller's protocol approximated the chemistry of the prebiotic earth. More recent findings have cast some doubt on that conclusion. Taken from Leslie Orgel's Scientific American article "The Origin of Life on Earth" (Scientific American, October, 1994)

You must have been excited to get such dramatic results so quickly, and with what, at the time, must have seemed like an outlandish hypothesis? Oh yes. Most people thought I was a least a little bit crazy. But if you look at methane/ammonia vs CO2/nitrogen there was no doubt în my mind. It was very clear that if you want to make organic compounds it would be easier with methane. It's easy to say that but it is quite a bit more difficult to get organized and do the experiment. The surprise of the experiment was the very large yield of amino acids. We would have been happy if we got traces of amino acids, but we got around 4 percent. Incidentally, this is probably the biggest yield of any similar prebiotic experiment conducted since then. The reason for that has to do with the fact that amino acids are made from even simpler organic compounds such as hydrogen cyanide and aldehydes. That was the start. It all held together and the chemistry turned out to be not that outlandish after all. What was the original reaction to your work în the science community? There was certainly surprise. One of the reviewers simply didn't believe it and delayed the review process of the paper prior to publication. He later apologized to me. It was sufficiently unusual, that even with Urey's backing it was difficult to get it published. If I'd submitted it to "Science" on my own, it would still be on the bottom of the pile. But the work is so easy to reproduce that it wasn't long before the experiment was validated. Another scientist was sure that there was some bacterial contamination of the discharge apparatus. When you see the organic compounds dripping off the electrodes, there is really little room for doubt. But we filled the tank with gas, sealed it, put it în an autoclave for 18 hours at 15 psi. Usually you would use 15 minutes. Of course the results were the same. Nobody questioned the chemistry of the original experiment, although many have questioned what the condiţions were on pre-biotic Earth. The chemistry was very solid. How much of a role did serendipity play în the original setup?

21

Fortunately, Urey was so adamant at the time about methane that I didn't explore alternate gas mixtures. Now we know that any old reducing gases will do. CO2/hydrogen and nitrogen will do the trick, although not as well. There was some serendipity în how we handled the water. If we hadn't boiled it and run it for a week, we wouldn't have gotten such good yields of amino acids. We knew right away that something happened rather quickly because you could see a color change after a couple of days. The fact that the experiment is so simple that a high school student can almost reproduce it is not a negative at all. That fact that it works and is so simple is what is so great about it. If you have to use very special condiţions with a very complicated apparatus there is a question of whether it can be a geological process. The original study raised many questions. What about the even balance of L and D (left and right oriented) amino acids seen în your experiment, unlike the preponderance of L seen în nature? How have you dealt with that question? All of these pre-biotic experiments yield a racemic mixture, that is, equal amounts of D and L forms of the compounds. Indeed, if you're results are not racemic, you immediately suspect contamination. The question is how did one form get selected. în my opinion, the selection comes close to or slightly after the origin of life. There is no way în my opinion that you are going to sort out the D and L amino acids în separate pools. My opinion or working hypothesis is that the first replicated molecule had effectively no asymmetric carbon You are talking about some kind of pre-RNA? Exactly a kind of pre-RNA. RNA has four asymmetric carbons în it. This pre-RNA must have somehow developed into RNA. There is a considerable amount of research now to try and figure out what that pre-RNA compound was, that is, what was the precursor to the RNA ribose-phosphate. Peter E. Nielsen of the University of Copenhagen has proposed a polymer called peptide nucleic acid (PNA) as a precursor of RNA. Is this is where PNA comes in? Exactly, PNA looks prebiotic. Currently that is the best alternative to ribose phosphate. Whether it was the original material or not is another issue. Can you clarify one thing? Have all of the amino acids been synthesized în pre-biotic experiments, along with all the necessary components for making life? Just turning on the spark în a basic pre-biotic experiment will yield 11 out of 20 amino acids. If you count asparagine and glutamine you get thirteen basic amino acids. We don't know how many amino acids there were to start with. Asparagine and glutamine, for example, do not look prebiotic because they hydrolyze. The purines and pyrimidines can alos be made, as can all of the sugars, although they are unstable. Your original work was published only a month apart from Watson and Crick's description of the DNA molecule. How has the field of molecular biology influenced the field of exobiology? The thing that has probably changed the outlook the most is the discovery of ribozymes, the catalytic RNA. This means you can have an organism with RNA carrying out both the genetic functions and catalytic functions. That gets around the problem of protein synthesis, which is this incredibly complicated thing. There is a problem with RNA as a prebiotic molecule because the ribose is unstable. This leads us to the pre-RNA world. The idea of the pre-RNA world is essentially the same as the RNA world, except you have a different molecule that replicates. Another thing worth remembering is that all these pre-biotic experiments produce amino acids. To have these amino acids around and not use them în the first living organism would be odd. So the role of amino acids în the origin of life is unknown but still likely. Tell us about your recent work and the lagoon idea. The primitive Earth had big oceans, but it also had lakes, lagoons and beaches. Our hypothesis is that the condiţions may have been ideal on these beaches or drying lagoons for prebiotic reactions to occur, for the simple reason that the chemicals were more concentrated în these sites than în the middle of the ocean. Is this because of the temperatures and also the presence of minerals as well? Temperature is an important factor. Minerals have been thought by some to play a role în the origin of life, but they really haven't done much for us so far. People talk about how minerals might have helped catalyze reactions, but there are few examples where the mineral makes any difference. Our most recent research tackled the problem of making pyrimidines- uracil and cytosine, în prebiotic condiţions. For some reason it just doesn't work very well under dilute condiţions. We showed that it works like a charm once you get things concentrated and dry it out a bit. This changed my outlook on where to start looking for prebiotic reactions. Another example is our work with co-enzyme A. The business end of co-enzyme A is called pantetheine. We showed you could make this under these kind of pre-biotic "dry beach" condiţions. We found that you didn't need it to be very hot, you can make it at 40 degrees C. This indicates the ease with which some of this chemistry can take place. Temperature seems to be a talking point regarding prebiotic hypotheses. We know we can't have a very high temperature, because the organic materials would simply decompose. For example, ribose degrades în 73 minutes at high temperatures, so it doesn't seem likely. Then people talk about temperature gradients în the submarine vent. I don't know what these gradients are supposed to do. My thinking is that a temperature between 0 and 10 degrees C would be feasible. The minute you get above 25 degrees C there are problems of stability.

22

Biologie Celulara

How does the discovery of the Martian meteorite factor în to the discussion? Are you convinced these are the fossilized remains of extraterrestrial microorganisms? I think the data is interesting and suggestive, but not yet conclusive. Let's accept that the meteorite does come from Mars. You have apparently got very small bacterial fossils also iron sulfide and magnetite sitting next to each other. Then there are these PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons). All of this is suggestive but not compelling. There are just two possibilities. Either there was life on Mars or there was not. I have no problem with the idea of life on Mars, the question remains whether this evidence is adequate. If it is correct, it has an implication for one of the big questions of prebiotic research. That is, is it easy or difficult to produce life from prebiotic compounds în prebiotic condiţions? It seems that it would be difficult on Mars. If it turns out to be the case on Mars, where the condiţions do not look very favorable, then it should apply to anywhere în the universe, or any planet with a suitable atmosphere and temperature. Can you tell us about the field of exobiology today în context of the world of science research? It is a very small field. There is a society, the International Society for the Study of the Origin of Life. It has only 300 members, a rather small society. My own lab is part of program called NSCORT (NASA Specialized Center of Research and Training). This program is conducted în close cooperation with NASA and supports five researchers along with graduate students, post-docs and undergraduate students. The more important research are the experiments these days, rather than the trading of ideas. Good ideas are those that when reduced to an experiment end up working. Our approach is to do experiments and demonstrate things, not just talk about possibilities. What advice do you have for students interested în pursuing studies în exobiology? Well we are talking about solving chemical problems. Therefore a background în basic chemistry is essential along with knowledge în the fields of organic chemistry, biochemistry and some background în geology and physics. Exobiology is a small field with a lot of interaction. It is one of few fields where an undergraduate would be able to work with top people în the field almost immediately. This interview was conducted în October, 1996

 

23

Capitolul 3. Membrana celulară  3.1. Structura membranei celulare 

embrana celulară (sau plasmatică) este în esenta formata din lipide, proteine şi carbohidrati, acestia din urma atasati fie de lipide, fie de proteine. Raportul molar dintre lipide şi proteine variaza intre 1:4 şi 4:1.

3.1.1. Lipidele membranare 

M Principalele lipide ale membranei eucariote sunt fosfolipidele, glicolipidele şi colesterolul.

Colesterolul lipseste din membrana procariotă cu exceptia unui grup restrans de bacterii, paraziti intracelulari, numite micoplasme (care provoaca, de exemplu, unele forme de pneumonii). Lipidele membranare sunt molecule amfipatice, adica au capat polar, hidrofil şi unul nepolar, hidrofob (Fig. 3.1).

Fig. 3.1 Structura lipidelor membranare

Proprietatile lipidelor membranare sunt : a) In solutii apoase, membranele lipidice se grupeaza în mod spontan în micelii sau în bistrat. Spre

interiorul bistratului se dispun capetele hidrofobe iar spre exterior, cele hidrofile (Fig. 3.2).

Miceliu Lipozom

Bistrat lipidic

Fig. 3.2 Dispunerea spontana a lipidelor în micelii, lipozomi sau lame bistratificate.

b) Lipidele din membrana nu sunt imobile ci executa mai multe tipuri de miscari: de difuzie laterala sau translatie (foarte rapide, ele schimbandu-si locul cu vecinii lor în mai puţin de 1µs); de rotatie în jurul propriei axe; de flexie a capetelor hidrofobe, respectiv a lanturilor de acizi grasi (cu o mobilitate ridicata pentru acizii grasi saturati în timp ce lanturile de acizi grasi nesaturati, avand duble legaturi cu orientare cis, sunt mai rigide) şi miscari de flip-flop sau de difuzie

24

Biologie Celulara

transversala (trecerea unei molecule de pe o fata a bistratului pe alta; este o miscare foarte lenta, putand dura ore). Prezenta colesterolului în diverse concentraţii poate reduce mobilitatea translationala şi de flexie (Fig. 3.3).

Fig. 3.3 Miscarile lipidelor în membrane plasmatică

Difuzie laterala (10-6 s)

Flexie (10-9 s) Rotatie

Flip-flop (difuzie transversala, 105 s)

c) Lipidele sunt distribuite asimetric pe cele două fete ale membranei. Membrana prezintă o fata externă (de

regula bogata în fosfolipide cu colina: fosfatidilcolina) şi una interna, citoplasmatică (mai bogata în lipide cu amine: fosfatidiletanolamina). Tot în aceasta idee, glicolipidele sunt dispuse pe fata externă a membranei, cu grupările glucidice proiectate în afara celulei, aceste glicolipide avand un rol importand în comunicarea celulară.

3.1.2. Proteinele membranare Gruparea proteinelor membranare se poate face în funcţie de interacţiunea lor cu lipidele : a) Proteine integrale. Sunt greu de disociat de lipidele inconjuratoare deoarece interacţionează puternic cu capetele lor hidrofobe, unele dintre proteine formand adevarate retele în profunzimea membranei. Proteinele transmembranare sunt proteine integrale care sunt expuse atat la exteriorul membranei cat şi pe fata citoplasmica, cu alte cuvinte strabat membrana pe toata grosimea ei (Fig. 3.4). Aceste proteine pot prezenta capetele C (carboxi, -COOH) respectiv N (amino, -NH2) orientate spre aceeasi fata a membranei sau spre fete opuse. b) Proteinele periferice (proteine solubile) interacţionează prin legaturi de hidrogen sau forte electrostatice cu capetele polare ale lipidelor sau cu partea care proemineaza în afara membranei a proteinelor integrale (Fig. 3.4). Fig. 3.4 Dispunerea proteinelor în membrana lipidică

 

3.1.3. Miscarea proteinelor în membrane 

25

La fel ca lipidele, proteinele nu sunt imobilizate în bistratul lipidic ci executa o serie de miscari. Cea mai improbabila miscare este cea de flip-flop care este puternic restrictionata. Din aceast cauza, membrana lipidică manifesta de asemenea o tendinta de polarizare (distributie inegala) a proteinelor pe cele două fete.

In 1972, Singer şi Nicholson au propus modelul "mozaicului fluid" al membranei în care proteinele executa miscari laterale, aceste miscari fiind influentate de fluiditatea membranei (Fig. 3.5). Modelul "mozaicului fluid" este în mare parte valabil cu exceptia faptului ca proteinele nu se misca haotic. Cauzele pentru care miscarile proteinelor în fluidul membranar sunt limitate sunt: cantonarea în anumite domenii membranare, jonctiunile celulare, agregarea şi cresterea masei, stabilizarea prin legarea de elemente externe, pe fata citoplasmica unele proteine sunt legate de componente ale citoscheletului.

Miscarea glicoproteinelor este la rândul lor limitata de necesitatea ca resturile glucidice să proemine pe fata extracelulară a membranei.

Fig. 3.5 Reprezentarea modelului "mozaicului fluid" al membranei celulare.

3.1.4. Fluiditatea membranei Este o proprietate fundamentala a membranelor plasmatice şi a celor care delimiteaza organitele celulare, permitand deplasarea proteinelor în bistratul lipidic, miscari care sunt importante pentru indeplinirea multor functii celulare. Fluiditatea membranelor este influentata de urmatorii factori: a) Natura împachetarii şi a interacţiunilor dintre lanturile de acizi grasi (AG) aparţinand fosfolipidelor

membranare. Lanturile lungi ale acizilor graşi interacţionează mai puternic intre ele rezultând o împachetare stransă, deci o fluiditate mai redusă decat în cazul portiunilor membranare cu lanturi scurte de AG. Prin creşterea temperaturii se poate de asemenea creşte fluiditatea membranei (legaturile duble trans se rotesc cu 120o). Există, de asemenea, o relaţie direct proportională între temperatura de topire (Tm) şi lungimea lanţurilor acil. Lanturile AG nesaturaţi cu legături duble cis nu se impachetează strans, rezultând o creştere a fluidităţii şi scădere a Tm. Cu cât este mai mare numărul de legături duble, cu atăt Tm este mai scazută iar fluiditatea mai ridicată.

b) La animale, colesterolul se insinueaza intre lanturile de AG reducandu-le mobilitatea şi crescand rigiditatea membranei. Aceasta este o adaptare a membranei animale în lipsa peretelui celular (cu rol protector la plante şi bacterii). Cercetari recente arata ca efectul colesterolului asupra mobilitatii moleculelor membranare este diferit, în funcţie de distanta fata de suprafaţa membranei şi de temperatura. La temperaturi ridicate (peste temperatura de tranzitie a fosfolipidelor), colesterolul miscoreaza fluiditatea membranei datorita scheletului rigid al inelelor sterolice, în timp ce la temperaturi joase, colesterolul mentine distanta dintre capetele hidofope ale lipidelor, diminuand interacţiunile dintre acestea şi contribuind la ridicarea gradului de fluiditate a membranei

26

Biologie Celulara

3.2. Rolul membranei celulare – procese de transport Membrana plasmatică are trei proprietati fundamentale:

1. Este un mozaic fluid (vezi la 3.1.) permitand miscarea limitata a proteinelor; 2. Este polarizata (vezi 3.1.) avand o distributie diferita de lipide şi proteine de o parte şi alta a ei; 3. Are permeabilitate selectivă, permitand trecerea unor substanţe şi blocand tranzitul altora.

Membrana plasmatică indeplineste mai multe roluri, vitale pentru celula :

Compartimentalizarea celulelor eucariote (aspect ce va fi discutat în capitolele următoare) ; Suport pentru desfăşurarea unor reacţii biochimice Bariera de protectie cu permeabilitate selectivă Transportul nutrientilor (ioni, molecule organice); Mediaza raspunsul la semnalele din mediul extern sau intern Participa la comunicarea intercelulară

3.2.1. Permeabilitatea selectivă a membranei pentru neelectroliti şi ioni Membrana lipidică bistratificata nu este o structura inerta, impenetrabila ci este un sistem dinamic, care permite trecerea activa sau pasiva a unor categorii de compuşi. în general prin permeabilitate se pot intelege fenomenele de difuzie simpla, nefacilitata de alte structuri decat de cea a membranei propriu-zise. Difuzia simpla Proprietatea prin care membranele lipidice bistratificate permite trecerea unor substanţe şi blocheaza tranzitul altor substanţe se numeste permeabilitate selectivă. Aceasta proprietate a fost descoperita experimental, mai intai în modele artificiale, în bistraturi lipidice, apoi în modele naturale, în membranele plasmatice. Primul care a enuntat o regula privind permeabilitatea bistratelor lipidice a fost Overton (1900): coeficientii de permeabilitate se coreleaza cu coeficientii de partitie ulei/apa ai diferitelor substanţe. Cu alte cuvinte, cu cat o substanta este mai hidrofobă cu atat patrund în celula cu o viteza mai mare. Termeni utilizati în relatie cu permeabilitatea bistratelor lipidice :

Coeficientul de permeabilitate este raportul dintre fluxul (J, cantitatea de substanta ce traversează suprafaţa membranei în unitatea de timp, mol·cm-2·s-1) şi diferenta de concentraţie (∆c, a

substanţei de pe ambele fete ale membranei, mol·cm-3) astfel : c

JP∆

= (cm/s) ;

Coeficientul de difuzie D este direct proportionala cu coeficientul de permeabilitate P şi cu grosimea membranei x : (cmxPD ⋅= 2/s) Coeficientul de partitie (Kp) reprezintă raportul de distributie a substanţei intre membrana

(cm) şi solutie (c) : c

cKm

p =

Daca integram cele trei ecuatii de mai sus pentru a le aplica unei membrane lipidice

bistratificate, obtinem următoarea relatie : x

DKP p ⋅

= , coeficientul de permeabilitate fiind

produsul dintre coeficientii de partitie şi difuzie în membrana, impartit la grosimea membranei

Cea mai importanta substanta neelectrolitica cu molecula mica este apa. Membranele biologice sunt partial permeabile pentru apa care traversează bistratul lipidic prin difuzie libera (avand un coeficient de permeabilitate de 10-3-10-4 cm/s). Difuzia libera este un proces pasiv, care nu necesita consum de energie. Exista cazuri în care circulatia apei de o parte pe alta a membranei este controlata de către celula, prin intermediul aquaporinelor (proteine-canal pentru apa) din membrana eritrocitelor (hematii sau globule rosii din sange).

27

In ceea ce priveste electrolitii, masuratorile au evidenţiat gradul ridicat de impermeabilitate a membranelor lipidice artificiale pentru cationi (cu coeficienti de permeabilitate de cca 10-12-10-13 cm/s). Prezenta proteinelor în membranele naturale determina o crestere considerabila (de până la 1000 de ori) a permeatiei ionilor. Acest lucru dovedeste implicarea proteinelor în transportul electrolitilor, transport care nu se mai realizează în mod dominant prin difuzie pasiva ca în cazul apei, ci prin transport activ. Principala bariera în calea difuziei pasive a ionilor o constituie cel mai probabil interiorul hidrofob al bistratului lipidic. Cresterea temperaturii urmata de o fluidizare mai pronuntata a membranelor lipidice artificiale determina şi o crestere a permeabilitatii pentru ioni. Pe de alta parte, anionii sunt mult mai permeanti decat cationii datorita potentialului de dipol care este pozitiv şi care favorizeaza trecerea prin scaderea energiei de transfer al anionilor. Cel mai permeant anion anorganic este Cl- din motive inca discutate. In privinta protonilor (H+) respectiv a ionilor hidroxil (HO-), s-a constatat ca în membranele artificiale acestia prezintă proprietati de permeare apropiate cu ale apei (P=10-4-10-6 cm/s) în funcţie de compozitia lipidică. în schimb, membranele naturale prezintă o permeabilitate şi mai mare (10-3 cm/s) fapt care indica din nou implicarea proteinelor în transportul acestor ioni.

Difuzia simpla (a extern.

3.2.2. TransportTransportul diferiteşi transportori. Daatunci se numeste tconsum de energie Difuzia facilitata Am vazut sau ureea, protoniilipidic. Exista înssubstanţelor de o pionoforilor şi a pro Ionoforii sioni prin membrasemiciclizare şi traintre fetele membrnigericina (K+ şi H

IoniMolecule mari, polare, neutre

Molecule mici, polare, neutre Liposolubile

Na+, K+, H+

Ca++, Mg++,Cl-, HCO3

-

Zaharuri:GlucozaSucroza

H2O, CO2,Uree

O2, N2,Gaze

anestezice

IoniMolecule mari, polare, neutre

Molecule mici, polare, neutre Liposolubile

Na+, K+, H+

Ca++, Mg++,Cl-, HCO3

-

Zaharuri:GlucozaSucroza

H2O, CO2,Uree

O2, N2,Gaze

anestezice

Fig. 3.6. Difuzia simpla la nivelul membranei lipidice

apei) are o contributie esenţiala la realizarea izotonicitatii celulelor în raport cu mediul

ul mediat de structuri speciale lor substanţe prin membrana celulară poate fi mediat de o serie de molecule numite canale

ca transportul nu necesita consum de energie, decurge în sensul gradienilor electrochimici, ransport pasiv (ex. difuzia simpla şi difuzia facilitata). în schimb daca transportul reclama , şi se desfasoara impotriva gradientului chimic sau electric, se numeste activ.

anterior ca unii compuşi precum apa dar şi alti compuşi neelectrolitici precum glicerolul , ionii hidroxil şi într-o foarte mica masura anionii şi cationii, pot difuza liber prin bistratul ă şi alte cai pasive, neconsumatoare de energie, prin care se realizează transportul arte şi alta a membranei, în sensul gradientilor de concentraţie, şi anume prin intermediul teinelor-canal. unt polipeptide din categoria antibioticelor capabili de a realiza trecerea selectivă a unor ne lipidice. Ionoforii incapsuleaza de obicei ionii printr-un proces de ciclizare sau nsporta prin membrana conform gradientului electrochimic, printr-un proces de dute-vino anei. Exemple de ionofori ciclici şi ionii transportati sunt : valinomicina (K+) (Fig. 3.7) şi +).

28

Biologie Celulara

Valinomicina

OO O

O O

Exterior hidrofob

O

K+

Miezhidrofi

Valinomicina

Exterior hidrofob

OO O

O OO

K+

Miezhidrofi

N CH C OHC

CHCH3H3C

O

C N

CHCH3H3C

OHC

CHCH3H3C

C O CH

CH3

C

O

H

O

H3

L-valina Acid D-hidroxiizovaleric

D-valina Acid lactic

N CH C OHC

CHCH3H3C

O

C N

CHCH3H3C

OHC

CHCH3H3C

C O CH

CH3

C

O

H

O

H3

N CH C OHC

CHCH3H3C

O

C N

CHCH3H3C

OHC

CHCH3H3C

C O CH

CH3

C

O

H

O

H3

L-valina Acid D-hidroxiizovaleric

D-valina Acid lactic

Fig. 3.7 Relatia structura-funcţie a valinomicinei. Valinomicina este o molecula circulara constituita din 3 repetitii ale secvenţei prezentate, inelul fiind stabilizat de legaturi de hidrogen. Ionul de potasiut este strans

infasurat de inel, fiind legat de cei sase atomi de oxigen care inlocuiesc atomii de oxigen din apa de hidratare. Alti ionofori sunt capabili de transportul ionilor prin asamblarea lor sub forma de canale sau pori

membranari (gramicidina, nistatina, amfotericina). Ionoforii sunt însă substanţe de origine artificiala şi au semnificatie experimentala, în studiul fenomenelor de transport la nivelul membranelor. O aplicatie practica, direct resimtita de noi este efectul antibiotic al acestor ionofori, prin permeabilizarea totala a celulelor bacteriene patogene, cu consecinte letale pentru acestea (dezechilibru ionic poate fi fatal celulei).

O alta categorie de molecule implicate în difuzia facilitata a ionilor şi apei este cea a proteinelor-canal. Ei sunt transportori naturali prezenti în membrane şi care poti fi operati în cateva moduri : a) Canale operate de voltaj (voltage-gated channels), se deschid sau inchid ca raspuns la o schimbare a

potentialului electric transmembranar. în aceasta categorie intra canalele de Na+, K+ şi Ca+ din membranele excitabile (din muschi şi sistemul nervos) si

b) Canale operate chimic care raspund unui stimul chimic (hormoni sau neurotransmitatori). Aceste canale se gasesc la nivelul membranelor postsinaptice din jonctiunile neuromusculare.

c) Canale care nu sunt reglate de un factor anume şi canale care sunt operate fizic (de exemplu sub acţiunea presiunii osmotice). Unii cercetatori le incadreaza în categoria porilor deoarece nu sunt considerate canale propriu-zise.

t(

Ms

e

In concluzie, functia majora a canalelor ionice este de a facilita si de a regla pentru o foarte scurta perioada de timp, miscarea ionilor in sensul gradientului de concentratie stabilit initial de o parte si alta a membranei plasmatice (celulare) sau membranei organitelor intracelulare; aceasta disipare temporara a gradientului ionic determina o perturbare a functiilor celulare sau apare ca o necesitate de folosire predominanta a canalelor ionice pentru traducerea semnalelor si transferul de informatie (ex. la nivelul sinapselor nervoase).

O a treia categorie de molecule care mediaza transportul pasiv al substanţelor este cea a proteinelor-

ransportor (carriers sau "carausi"). Ele realizează trecerea unidirectionala în sensul gradientului chimic pentru o specie neutra) sau electric (ioni) a unei singure substanţe (transport uniport).

Din punct de vedere enzimatic, difuzia facilitata mediaţa de transportori are o cinetica de tip Michaelis-enten, fiind caracterizata de o viteza maxima (Vmax) şi o constanta Michaelis (KM) spre deosebire de difuzia

impla care are o cinetica liniara (Fig. 3.8 a) Exemple de transportori pasivi de tipul proteinelor-caraus sunt transportorul glucozei din membrana

ritrocitara (Fig 3.8 b) şi transportorii unor aminoacizi din membrana bacteriana.

29

a b

Fig. 3.8 Cinetica difuziei simple şi facilitate (a) şi difuzia facilitata a glucozei în care proteina-caraus adopta

mai multe stari conformaţionale (b)

3.2.3. Transportul activ Cand transportul unei substanţe este dependent de transportul altei substanţe, afirmam ca transportul

este cuplat. Exista două categorii de transport cuplat: antiport (contratransport sau difuzia de schimb, substanţele sunt transportate în sens opus) şi simport (cotransport, ambele specii chimice sunt transportate în acelasi sens) (Fig. 3.9) Teoretic, transportul cuplat poate fi pasiv ca în cazul unor ionofori care realizează de exemplul contratransportul K+/H+ (nigericina). în realitate, în membranele naturale vii, diferenta (gradientul) electrochimic este mentinut prin procese consumatoare de energie iar simportul sau antiportul unor compuşi în sensul gradientului electrochimic este posibil numai în condiţiile în care celula mentine activ acest gradient. în acest caz putem spune ca transportul este cuplat secundar cu energia (transport activ secundar). Pe de alta parte, o serie de transportori proteici realizează procese de transport cuplate direct cu consumul de energie (in speta cu hidroliza legaturilor macroergice ale ATP). în acest caz transportorii sunt cuplati primar cu energia (transportori activ primar sau “pompe primare”)

Transport cuplat

Uniport Antiport Simport

Fig. 3.9 Trei tipuri de transport mediat de proteine “carausi”: uniport, simport şi antiport.

3.2.3.1. Transportul activ primar In transportul activ primar sunt implicate proteine care cupleaza translocarea unei substanţe (ioni sau molecule), impotriva gradientului chimic, cu o sursa de energie. Aceste surse de energie pot fi : 1. Hidroliza ATP, iar în acest caz transportorii proteici se numesc "pompe (ionice) activate de ATP". Astfel

de pompe cuplate cu activitatea ATP hidrolazica (ATPazica) sunt exemplificate cel mai bine de Na+-K+-ATPaza, care funcţionează ca transportor activ al ionilor de Na+ dintr-un compartiment intracelular

30

Biologie Celulara

(cu concentraţie mica de Na+) spre compartimentul extracelular (cu concentraţie ridicata de Na+) la schimb cu ionii de K+ care sunt translocati dinspre o concentraţie redusa din fluidul extracelular spre o concentraţie de K+ ridicata din compartimentul intracelular (citosolic). Aceasta pompa este una dintre sursele majore de mentinere a potentialului electrochimic transmembranar.

2. Razele luminoase. Proteinele a caror funcţie transportoare este energizata sub acţiunea luminii se numesc “pompe (ionice) activate de lumina”. Pompele activate de lumina se intalnesc în membranele unor bacterii (de exemplu proteinele numite halorodopsina şi bacteriorodopsina).

Pompele ATPazice Transportorii primari de tipul ATPazelor indeplinesc roluri vitale pentru celula şi sunt raspanditi în toate organismele vii (procariote şi eucariote: celule vegetale şi animale deopotriva). Pompele activate de ATP pot fi impartite în patru clase în funcţie de caracteristicile lor structural-functionale: P-ATPaze, V-ATPaze, F-ATPaze şi proteine de tip ABC. A. P-ATPazele sunt o clasa de transportori inruditi genetic şi structural. Ele includ antiportorul Na+-K+-

ATPaza (al carui rol a fost explicat mai sus), antiportorul K+-H+-ATPaza (implicat în generarea aciditatii din stomac prin transportul de protoni spre exteriorul celulei, în cavitatea stomacala, la schimb cu ionii de K+ care patrund în celula) şi Ca2+-ATPaza (prezenta în membrana celulară şi membrana reticului endoplasmic, transporta ionii de Ca2+ din citosol spre exteriorul celulei sau spre interiorul RE, mentinand concentraţia Ca2+ din citosol la un nivel redus, astfel ca acesti ioni pot actiona ca semnale celulare).

P-ATPazele sunt astfel denumite (“P”) deoarece translocarea ionilor de o parte pe alta a membranei implica o modificare temporara, covalenta, a proteinei, cu transferul fosfatului de pe ATP la gruparea carboxilica a acidului glutamatic (Glu) sau aspartic (Asp) din situsul activ. Se formeaza o legătură cu energie inalta. Într-o etapă ulterioara, fosfatul anorganic (Pi) este eliberat, la fel şi ionul, proteina revenind la starea initiala. Pentru ca aceste proteine adopta două stari conformaţionale diferite (denumite E1 şi E2), ele au mai fost numite şi E1.E2.ATPaze. Mai jos va fi detaliaţa structura şi functionarea antiportorului Na+-K+-ATPaza: Na+-K+-ATPaza Este un complex proteic membranar larg raspandit în celulele eucariote. Se estimeaza ca circa 25% din totalul ATP citosolic din celulele umane în repaus este consumat de pompele de sodiu în vreme ce în celulele nervoase acest procent atinge 70% din ATP total.

Na+-K+-ATPaza este un tetramer compus din patru subunităţi, două subunităţi alfa (~113 kD) care sunt responsabile pentru transportul propriu-zis al ionilor şi de legarea ATP, continand situsul de fosforilare, şi două subunităţi mai mici, beta (~35 kDa). Subunităţile beta sunt glicoproteine necesare activităţii complexului, facilitand localizarea membranara şi activarea subunităţilor alfa (Fig. 3.10). Transportul cationilor decurge prin intermediul unui ciclu de modificări conformaţionale (Fig. 3.10 b) datorate fosforilarii de la nivelul situsului activ din subunitatea alfa:

• Pompa cu ATP legat (starea conformaţionala E1), capteaza 3 ioni de Na+ de pe fata citosolică. • ATP este hidrolizat, fosfatul este transferat unei grupări carboxil din situsul de fosforilare aflat pe fata

citosolică a pompei, cu eliberare de ADP. • Prîntr-o modificare conformaţionala (starea E2) a carui mecanism este inca incert, pompa expune

ionii de Na+ pe fata extracelulară, unde ei sunt eliberati. • Pompa leagă 2 ioni de K+ din mediul extracelular, iar subunitatea alfa este defosforilata. • ATP se leagă din nou iar pompa se reorienteaza eliberand ionii de K+ în citosol. • Cu ATP legat de subunitatea alfa, pompa (E1~ATP) este pregatita să lege ionii de Na+ iar ciclul se

repeta.

31

B

C

oligozaharideoligozaharide

ATP

2K+

3Na+

ADP+Pi

exterior

citosol

Na+

K+ATP

2K+

3Na+

ADP+Pi

exterior

citosol

Na+

K+

A

Fig. 3.10 Reprezentarea schematica a pompei Na+-K+ ATPaza (A) şi a mecanismului de transport activ al ionilor de Na+ şi K+ (B)

. V-ATPazele au fost initial identificate la eucariote şi mai exact, în membrana vacuolelor (“V”) din celulele vegetale. Ulterior V-ATPazele au fost descrise şi la bacterii. Ele funcţionează ca pompe primare ce transporta protoni (in majoritatea cazurilor) sau ioni de Na+. Ele contribuie la realizarea gradientilor transmembranari de protoni.

. F-ATPazele se deosebesc de celelalte pompe ATPazice prin faptul ca sunt capabile nu numai de hidroliza ATP ci şi de sinteza ATP, reprezentand enzime care contribuie la procesul de fosforilare (“F”) oxidativă (sinteza ATP cuplata cu respiratia). F-ATPazele sunt prezente la eucariote, exclusiv în membrana mitocondriala şi cloroplastidiala interna, în membranele bacteriilor şi arhebacteriilor (unde poarta numele de A-ATPaze). Desi funcţia principala este de a genera ATP pe seama gradientului

2Na+ 2 K+Fata extracelulara

E2~P[2Na+] E2~P[2K+] E2~P

E1~ATP[2K+]

E2~ATP[2K+]

ATP

E2[2K+]

PiNa+

ADP

E1~P[3Na+]

E1~ATP[3Na+] B E1~ATP

Fata citosolica 2K+

32

Biologie Celulara

telectrochimic transmembranar susţinut în urma respiraţiei, la unele bacteriui funcţia să este predominat hidrolazica, generand potential electrochimic pe baza consumului de ATP. în laborator (in vitro) F-ATPazele pot functiona în ambele directii depinzand de condiţiile experimentale. Majoritatea F-ATPazelor sunt pompe de protoni dar exista şi F-ATPaze dependente de Na + descoperite exclusiv la unele bacterii patogene, anaerobe. Mai jos vom exemplifica F-ATPazele cu complexul F1F0-ATP sintetazic prezent în membrana mitocondriala internă la celulele eucariote

Desi prezintă o anumita diversitate de izoforme, F-ATPazele cuprind complexe multimerice compuse din două parti:

Complexul F1- hidrofil, orientat spre citosol şi constituit din 3 subunităţi alfa şi 3 beta (α3β3), cate o subunitate gama (γ), delta (δ) şi epsilon (ε);

Complexul F0 (“zero”) – hidrofob, puternic atasat membranei lipidice, cu 1 subunitate a, una b şi un număr variabil (10-13) de subunităţi c.

Fiecare dintre aceste subunităţi au un rol bine definit în complexul F-ATPazic astfel : • subunităţile α şi β contin situsurile catalitice de legare a ATP/ADP şi Pi ; • subunităţile γ, δ şi ε constituie suportul subunităţilor catalitice, cu rol de legare a complexului

hidrosolubil F1 de complexul membranar F0; • subunităţile a şi b ale complexului F0 constituie un canal pentru scurgerea ionilor de H+ (sau Na+) ; • subunităţile c ancoreaza intreg complexul ATPazic în membrana şi constituie “motorul" acestuia, avand

capacitatea de a se roti în curul unui ax central imaginar. Elucidarea functionarii complexului F1F0-ATP sintetazic (sau ATPazic) a reprezentat una dintre cele mai

mari provocari şi surprize din istoria biologiei celulare. S-a constatat ca el reprezintă o masinarie rotativa, asemenea unei mori de apa. Curgerea de protoni în sensul gradientului de pH (analoaga curgerii apei) determina rotirea subunităţilor c care, la rândul lor conduc la rotirea subunităţilor catalitice din complexul F1, miscare intermediaţa de subunităţile de sprijin, γ, δ şi ε. Rotirea subunităţilor catalitice α şi β provoaca modificări conformaţionale la nivelul acestora şi adoptarea a trei stari: T, L şi O. în starea T, subunitatea beta leagă slab ADP şi Pi, în starea L, legarea devine mai puternica iar în final, în starea O este sintetizat ATP care este ulterior eliberat

Exista un raport intre numărul de protoni ce traversează complexul şi numărul de molecule de ATP formate. în principiu, cu cat este mai mare gradientul de pH (∆pH), cu atat sinteza de ATP decurge mai eficient. Pe de alta parte, în absenta unui gradient de pH (parte a potentialului electrochimic transmembranar) F-ATPaza va functiona în sensul hidrolizei ATP cu exportul protonilor din citosol şi generarea diferentei de pH (acid la exterior).

F-ATPaza

Fig. 3.11 Structura F1F0-ATP sintetazei

33

D. Proteinele transportoare de tip ABC ("ATP-binding Cassette”) au fost relativ recent descoperite şi reprezintă o clasa de proteine localizate atat în membrana plasmatică cat şi în membranele organitelor celulare. Ele mediaza translocarea unor substrate variate: ioni, molecule organice (lipide, acizi biliari, conjugati glutationici şi glucuronici, peptide mici), compuşi de sinteza (medicamente, droguri). Majoritatea proteinelor ABC utilizează energia furnizata de hidroliza ATP (transport activ) însă unele pot forma canale membranare specifice (de exemplu proteina CFTR, reglatorul de conductanta transmembranara al fibrozei cistice care este un canal de clor).

Aceste proteine sunt prezente la toate organismele vii, de la bacterii la om (din cele peste 1000 de proteine ABC identificate, 48 sunt tipic umane). Mutatii ale genelor ce codifică aceste proteine ABC au fost asociate cu numeroase maladii genetice (ex. fibroza cistica). Avand posibilitatea de a lega şi transporta medicamente din şi inspre interiorul celulei, proteinele ABC sunt raspunzatoare pentru esecul majoritatii tratamentelor medicale asupra bolnavilor de cancer care manifesta rezistenta la o serie de substanţe citotoxice (utilizate în chimioterapie), în rezistenta unor forme de malarie, în dificultatea tratarii SIDA. Aceste proteine ABC capabile de transportul medicamentelor şi apariţia rezistentei la tratamentele medicamentoase se numesc proteine MDR (“Multi-drug resistance”).

Un alt rol atribuit transportorilor de tip ABC este de facilitare a miscarii flip-flop (difuzie transversala) a lipidelor membranare şi de aceea aceste grup de proteine ABC se mai numesc flipaze dependente de ATP. în general, aceste translocaze de lipide transporta lipide din stratul intern, pe fata externă a bistratului membranei cuplat cu transportul altor compuşi (acizi biliari, medicamente).

MATERIAL SUPLIMENTAR Mecanismul de baza al rezistentei la medicamente (MDR) în tratamentul cancerului

Mecanismul general acceptat al rezistentei la medicamente multiple este ca proteinele de tip MDR expulzeaza activ medicamentele citotoxice din celule, mentinand nivelul acestora sub pragul toxic pentru celule. Exportul medicamentelor din aceste celule se face cu consum de energie prin hidroliza ATP. Cea mai intriganta caracteristica prin care proteinele MDR se deosebesc de alti transportori de la mamifere este larga lor specificitate de susbtrat. Spre deosebire de alte proteine de transport clasice (care sunt selective), transportorii MDR recunosc şi transporta o mare varietate de substrate. Acest caracter explica rezistenta multipla la cateva medicamente de sinteza, neînrudite, proprietate intalnita la asa-numitul “fenotip cu rezistenta multipla” pe care il posedă unii oameni.

Diferitele tumori cu proteine MDR supraexprimate (ex. hepatoamele, carcinoamele de plamani şi stomac) prezintă adesea o rezistenta primara (sau intrinseca) la chimioterapia cancerului. Mai mult, chimioterapia insasi poate induce supraexprimarea acestor proteine, astfel incat noile clone (celule nascute din celulele tumorale initiale) devin mai puţin sensibile la chimioterapie (rezistenta secundara la medicamente). Esecul tratamentelor în cazul rezistente la medicamente multiple este de asemenea evidenţiaţa şi în cazul altor maladii cum sunt bolile autoimune şi cele infectioase. Structura tipica a unei proteine de tip ABC constă din cel puţin 2 domenii transmembranare (TMD, “Transmembrane domains”) şi minimum 2 domenii de legare a ATP (ABC). Regiunile TMD ancoreaza proteina în membrana formand un por prin care trec o varietate remarcabila de substanţe Domeniul de legare al ATP este orientat spre fata citoplasmica şi la nivelul ei se elibereaza energia ATP (Fig. 3.12). Nu se cunoaste modalitatea prin care energia este convertita de situsul ABC pentru a fi utilizată în transport şi nici mecanismul exact al transportului

Fig. 3.12 Structura transportorilor de tip ABC în sectiune transversala (A) şi dispunerea peptidelor în spatiu (B)

CITOSOL

Domenii de legare a ATP

34

Biologie Celulara

3.2.3.2. Transportul activ secundar Transportorii activi secundari cupleaza miscarea unei substanţe impotriva gradientului de

concentraţie la schimb cu transportul altui ion în sensul gradientului sau de concentraţie. Transportul activ secundar este intotdeauna un proces de co-transport: fie de tip simport (ex. simportorii de Na+/glucoza şi Na+/aminoacizi) sau antiport (ex. antiportorul Na+/H+). Activitatea acestor transportori nu este, asadar, direct energizata de ATP ci indirect, prin functionarea unor pompe primare de ATP care genereaza gradienti electrochimici. Acesti gradienti constituie apoi motorul pentru transportorii secundari. Cinetica transportului activ secundar este similara cu cea a difuziei facilitate. La concentraţii foarte mari de substrat, transportul este franat de lipsa unui număr suficient de proteine capabile să lege substratul existent. Două exemple importante merita să fie amintite aici: Simportorul Na+/glucoza Transportorii secundari ai hexozelor sunt proteine transmembranare localizate în principal în celulele intestinale şi renale.

O semnificatie deosebita o au transportorii hexozelor (glucoza, galactoza) de la polul apical al celulelor din invelisul inestinal intern. Simportorul Na+/glucoza (prescurtat, SGLUT) faciliteaza preluarea specifica a unei molecule de glucoza (si galactozei) din lumenul (cavitatea) intestinal(a) unde monozaharidele apar ca urmare a procesarii digestive a hranei. Glucoza este transportata din exteriorul celulei spre interior, unde concentraţia acesteia este mult mai mare (impotriva gradientului de concentraţie) la schimb cu 2 ioni de sodiu. Acest transport este posibil numai cu consum de energie iar forta motrice a functionarii simportului este gradientul chimic de Na+ stabilit în urma functionarii pompelor primare dependente de ATP (Fig. 3.13). Glucoza este ulterior “descarcata” în sange de unde ajunge la toate celulele organismului, asigurand nutritia lor.

Transportorul (carausul) de glucoza (difuzie facilitata)

Pompa Na+-K+ ATPaza

Glucoza Cotransportorul Na+/glucoza

Na+

Glucoza

Na+

Na+ Na+

K+ K+ K+ K+

Na+ Na+ ATP ATP

ADP ADP

Glucoza

Lumenul intestinal

Polul bazal al celulei intestinale

Jonctiuni celulare

Polul apical al celulei intestinale

Vas de sange

Fig. 3.13 Transportul cuplat (simport) al glucozei cu ionii de Na+, în sensul gradientului de concentraţie al

ionilor de sodiu, gradient generat prin activitatea pompei primare Na+-K+ ATPaza. Glucoza patrunsa în

35

celula intestinala este transportata ulterior prin difuzie facilitata de către proteina-caraus pentru glucoza, în sensul gradientului de concentraţie, spre lumenul vasului de sange.

Antiportorul Na+/H+

O parte din echilibrul ionic al celulelor este mentinut şi cu ajutorul unei clase de proteine care transporta ionii de sodiu la schimb cu protoni. Acestia sunt antiportorii Na+/H+ (sau prescurtat Nha) care sunt prezenti în membrana plasmatică a celulelor bacteriene, la celulele vegetale şi animale. Forta motrice pentru functionarea acestor antiportori il reprezintă gradientul de pH generat în urma activităţii lantului respirator sau în urma functionarii unor pompe primare de H+. Astfel, 2 protoni sunt introdusi în citosol (in sensul gradientului de concentraţie) la schimb cu 3 ioni de sodiu care sunt expulzati impotriva gradientului de concentraţie. Acest antiport are o semnificatie deosebita în cursul adaptarii la condiţii saline, când concentraţia de saruri (NaCl sau NaHCO3/Na2CO3) din mediul extern este foarte mare. Celula bacteriana şi vegetala au tendinta de a mentine concentraţia internă de ioni de sodiu în limite normale tocmai prin activitatea intensa a acestor antiportori.

In celulele animale, antiportorii de Na+/H+ sunt distribuiti predominant la nivelul polului apical al celulelor renale implicate în formarea urinei. Aceste celule au capacitatea de a “recupera” Na+ din urina (la nivelul membranei apicale) printr-un mecanism activ secundar de simport Na+/H+. Preluarea sodiului este posibila datorita “aciditatii” mediului intern celular care constituie motorul de deplasare a ionilor de sodiu spre interior (impotriva gradientului de concentraţie) Ionii de sodiu sunt mai departe transportati spre sange pentru a se asigura tonicitatea acestuia prin polul bazal printr-un antiportor secundar Na+/HCO3

-. Mecanismele de transport ale Na+, K+, H+, apei, glucozei sunt însă mult mai subtile la acest nivel, celulele renale avand capacitatea de a orienta migrarea acestor compuşi pentru asigurarea unui echilibru chimic, electric şi de pH intre sange şi urina (Fig. 3.14).

Orice dezechilibru genetic şi metabolic la acest nivel declanseaza boli ale rinichiului numite nefropatii şi boli ale sistemului cardiovascular (ex. hipertensiune).

Fig. 3.14 Transportul cuplat (antiport) al ionilor de Na+ şi protonilor la nivelul celulei renale. Acidificarea

sangelui este urmata de acidificarea celulei renale şi tendinta de eliminare a excesului de protoni în lumenul tubular (acidificarea urinei). Ionii de sodiu sunt astfel recuperati din urina şi transportati spre sange. O alta

cale de transport al ionilor şi apei o reprezintă calea paracelulară.

Vas desange

celula din tubul renal Lumen tubular

3Na+2H+

K+membrana

apicala

3Na+

2K+

ATP

ADP + Pi

Antiportorul Na+/H+ Na+

3HCO3-

membrana bazala Pompa Na+-K+

ATPaza Anhidraza carbonica

CO2+H2O

K+

36

Biologie Celulara

IMPORTANT

33

cdţirc

p

orCîdcsd

mo

In concluzie, prin procesele de transport la nivel membranar sunt asigurate urmatoarele functii majore: 1. Stabilirea si mentinerea un gradient electrochimic transmembranar al anionilor si cationilor cu

importanta fiziologica (ex. Na+-K+ ATPaza); 2. Generarea energiei prin cuplarea potentialului electrochimic transmembranar cu sinteza ATP (ex.

F1Fo-ATP sintetaza); 3. Asigurarea izotonicitatii celulare cu cea a mediului extern prin controlul distributiei apei si

moleculelor osmotic active (ex. difuzia simpla, difuzia facilitata); 4. Nutritia celulara prin transportul unor molecule organice in interiorul celulei, molecule care vor

intra ulterior in ciclurile metabolice celulare (ex. transportul glucozei); 5. Detoxificarea prin asigurarea unei concentratii intracelulare scazute al unor compusi toxici de tipul

drogurilor, medicamentelor, metalelor grele si a metabolitilor ca urmare a exportului lor in afaracitoplasmei (ex. proteinele MDR, V-ATPazele);

6. Secretia unor compusi de importanta fiziologica pentru organism (ex proteinele ABC caretransporta acizii biliari);

7. Semnalizarea intra- si intercelulara prin eliberarea unor mesageri cu rol in medierea unorraspunsuri la stimuli externi (ex. Ca2+-ATPaza din RE, proteinele-canal activate de voltaj de lanivelul sinapselor neuronale si jonctiunilor neuromusculare, etc)

.3. Adeziunea celulară .3.1. Asocierea celulelor în tesuturi şi organe la organismele pluricelulare 

Majoritatea celulele organismelor pluricelulare (plante şi animale) sunt organizate în structuri ooperative numite ţesuturi, care la rândul lor se asociază în diverse combinaţii în unităţi funcţionale de imensiuni mari numite organe. Frecvent, celule aparţinând unui anumit tip celular se agregă şi formează un esut, pentru a coopera în îndeplinirea unei funcţii comune: muşchii se contractă; ţesutul nervos conduce un mpuls electric; ţesutul xilem în plante transportă apă. Diferite ţesuturi se pot organiza într-un organ cu scopul ealizării unor funcţii specifice. De exemplu, muşchii, valvele şi vasele sangvine ale inimii funcţionează orelat pentru a pompa sângele prin organism (organul numit inima).

Funcţiile coordonate ale multor tipuri de celule din ţesuturi, cât şi a multiplelor ţesuturi specializate, ermit organismului să:

i) funcţioneze ca un tot unitar; ii) se mişte; iii) metabolizeze hrana; iv) se reproducă; v) desfăşoare alte activităţi esenţiale.

Diversitatea şi complexitatea morfologică a plantelor şi animalelor sunt exemple ale faptului că rganismul ca întreg este mai important decât suma părţilor individuale. De exemplu, la plante, organizarea ădăcină – tulpină - frunze le permite obţinerea simultană de energie (de la lumina solară) şi carbon (din O2), din aerul atmosferic, apă şi din nutrienţii din sol. Proprietăţile mecanice distincte ale oaselor tari,

ncheieturilor flexibile, şi ale muşchilor contractili permit vertebratelor să se mişte eficient şi să prezinte imensiuni substanţiale. Straturi de celule epiteliale ataşate foarte compact, pot acţiona ca bariere reglabile, u permeabilitate selectivă, care permit generarea unor compartimente distincte chimic şi funcţional în tructura unui organism (exemplu stomacul, circuitul sangvin). Din acest motiv, într-un organism se pot esfăşura simultan funcţii complementare cum sunt digestia şi sinteza.

De asemenea, compartimentalizarea permite o reglare mai sofisticată a diverselor funcţii biologice. În ulte privinţe, rolul ţesuturilor complexe şi al organelor într-un organism, este analog cu cel al

rganitelor şi al membranelor într-o celulă individuală.

37

3.3.2. Moleculele de adeziune Asamblarea ţesuturilor distincte şi organizarea lor în organe este determinată de interacţiuni moleculare, la

nivel celular, şi nu ar fi posibile fără expresia, reglată temporal şi spaţial, a unui spectru larg de molecule de adeziune. Prin intermediul lor, celulele pot interacţiona fie cu alte celule (adeziune celulă-celulă) fie ramân în contact cu o reţea complexă de macromolecule extracelulare, matricea (sau matrixul) extracelulară (adeziune celulă-matrice). Interacţiunile intercelulare pot fi temporare (de exemplu, între celulelor sistemului imunitar din sânge, permiţând alunecarea şi trecerea acestora prin peretele vaselor de sânge, în timpul unui răspuns imun) sau stabile (ca în cazul celulelor epiteliale care aderă strâns unele de altele). Interacţiunile stabile au rol foarte important în dezvoltarea şi integrarea anatomică a ţesuturilor.

Adeziunea celulă-celulă se realizează prin intermediul unor proteine membranare specializate numite molecule de adeziune celularã (CAMs – Celular Adhesion Molecules), care adesea se organizează sub forma unor joncţiuni celulare specializate. Celulele din ţesuturile animale aderă indirect (adeziune celulă-matrice) şi la componente ale matricei extracelulare prin intermediul unor receptori de adeziune din membrana plasmatică. Aceste două tipuri de interacţii mediază agregarea şi organizarea celulelor în ţesuturi distincte şi susţin transferul bidirecţional al informaţiei între exteriorul şi interiorul celulei.

CAM pot fi grupate în patru mari familii: - caderinele, - superfamilia imunoglobulinelor (Ig), - integrinele, şi - selectinele. Mai există şi alte tipuri de proteine implicate în procesul de adeziune celulară în anumite ţesuturi dar

care nu aparţin nici unei clase majore de CAM. Adeziunea asigurată de caderine, integrine şi selectine este dependentă de prezenţa ionilor de Ca2+, în

timp ce superfamilia imunoglobulinelor un necesită prezenţa calciului pentru funcţia de adeziune. În general, selectinele, integrinele şi imunoglobulinele mediază interacţiuni temporare celulă-celulă (ca de exemplu cele dintre leucocite şi celulele endoteliale în timpul migraţiei leucocitelor spre locul inflamaţiei tisulare) sau participă la interacţiunile dintre celulă şi matricea extracelulară (integrinele). Caderinele asigură în mod specific interacţiuni intercelulare stabile, facând parte din structuri moleculare numite joncţiuni celulare.

În figurile 3.15 şi 3.16. sunt prezentate topologiile (poziţiile spaţiale) şi structurile schematice a unor CAM. Ele sunt formate prin îmbinarea mai multor domenii distincte, unele dintre aceste domenii aparţinând mai multor tipuri de CAM. O caracteristică a unora dintre aceste proteine sunt domeniile „repetate” (care se găsesc în mai multe exemplare în aceeaşi moleculă). Unele din aceste molecule sunt responsabile de specificitatea de legare caracteristică anumitor proteine.

Fig. 3

Adeziune celula-celulaAdeziune celula-celula

.15. Relatiile dintre moleculele de adeziune celulară, celula şi matrice extracelulară

Molecule de adeziunecelulara

Proteine de fixareintracelulara

Proteinele citoscheletului

Glicozaminoglicani Proteoglicani aisuprafeteicelulare

Proteoglicanidin matrice

Proteinemultiadezive

Fibre de colagen

Adeziunecelula-matricecelulara

Membranaplasmatica

Molecule de adeziunecelulara

Proteine de fixareintracelulara

Proteinele citoscheletului

Glicozaminoglicani Proteoglicani aisuprafeteicelulare

Proteoglicanidin matrice

Proteinemultiadezive

Fibre de colagen

Adeziunecelula-matricecelulara

Membranaplasmatica

38

Biologie Celulara

Moleculele de adeziune pot fi considerate un fel de receptori, adică proteine transmembranare

capabile să fixeze un ligand. În general, liganzii care interacţionează cu moleculele de adeziune sunt insolubili.

Prin intermediul domeniilor extracelulare, moleculele CAM mediază interacţii de adeziune între celule de acelaşi tip (adeziune homotipicã) sau între celule diferite (adeziune heterotipicã). O moleculă CAM poate să se lege de acelaşi tip de moleculă aparţinând unei celule adiacente (interacţie homofilicã), sau se poate lega de o altă clasă de molecule CAM (interacţie heterofilicã).

Moleculele CAM pot fi localizate la nivelul regiunilor membranei plasmatice care vin în contact cu alte celule, sau pot fi comasate în regiuni discrete numite joncţiuni celulare.

Fig. 3.16. S

Caderinele Caderinele s

în diferenţierea tisuldând formă organisaderenţă şi situsuriledisting trei tipuri mai) caderina epitelialăii) caderina placentaiii) caderina neurală

Celulele carCaderinele a

lor celulară. Sunt mMolecula unei cader

1) În regiurecunoaş

2) Un dome3) domeniu

asigură jo

tructurile schematizate ale celor patru familii de molecule de adeziune celulară

unt molecule-cheie în procesul de adeziune şi semnalizare celulară, şi joacă un rol critic ară. Sunt glicoproteine care leagă ioni de calciu şi asigură o separare spaţială a celulelor mului. Există mai multe tipuri de caderine. Unele dintre acestea asigură joncţiunile de punctiforme de contact dintre celulele bogate în molecule de aderenţă. La mamifere, se jore de caderine: (E-caderina); ră (P-caderina); (N-caderina) e posedă aceleaşi caderine pot adera unele la altele, dar nu încrucişat. u rol important în recunoaşterea selectivă a celulelor embrionare şi stabilesc polaritatea olecule de adeziune a căror catenă peptidică traversează membrana o singură dată.

ine are trei părţi: nea proximală (capătul amino- al proteinei) are un situs de legare homofilică adică te un situs identic al unei alte caderine care asigură contactul între celule (Figura 7.2.). niu transmembranar care se continuă cu l terminal, citoplasmatic care interacţionează cu alte tipuri de proteine (cateninele) ce ncţiunea cu reţeaua citoplasmatică a microfilamentelor de actină.

39

În interiorul celulei, caderinele sunt conectate cu citoscheletul prin doi intermediari: ß-catenina şi dimerul de actină F. Fixarea la citoschelet consolidează legarea celulă-celulă.

Caderinele „clasice” E, P, N sunt cele mai abundent exprimate, în special în diferenţierea timpurie. Straturi de celule epiteliale polarizate, asemănătoare celor care căptuşesc intestinul subţire şi tubulii renali, conţin E-caderina pe suprafaţa lor laterală. Deşi E-caderina este concentrată în joncţiunile aderente, ea este prezentă pe toată suprafaţa laterală şi se asociază cu membranele celulelor adiacente. Creierul exprimă cel mai mare număr de caderine, probabil datorită nevoii de a forma numeroase contacte specifice celulă-celulă necesare stabilirii reţelei complexe de conexiuni.

3.3.3. Joncțiunile celulare Structura tisulară este activ susţinută de afinitatea dintre celule. Moleculele de adeziune formează

baza acestei afinităţi specifice. Ţesutul conjunctiv şi cel epitelial reprezintă două extreme în care matricea şi sistemele de adeziune intercelulară au roluri structurale complet diferite.

În ţesuturile conjunctive, matricea extracelulară este abundentă şi suportă cea mai mare parte a tensiunilor la care sunt supuse ţesuturile. Interacţiunile între celule sunt limitate. În epiteliile care căptuşesc toate cavităţile şi suprafeţele externe ale corpului, celulele sunt strâns asociate în straturi. Matricea extracelulară estemai puţin abundentă, formând un strat fin, numit membrană bazală, subiacentă celulelor. Cea mai mare parte a tensiunilor este suportată de către celule. Graţie joncţiunilor celulare specializate, epiteliul şi endoteliul sunt suficient de rezistente pentru a constitui o barieră capabilă să separe două compartimente. Joncţiunile celulare prezente în epiteliile animale pot fi clasificate, după structură şi funcţie, în:

i) joncţiunile „înguste”, strânse sau dense („tight”), formează bariere capabile să limiteze permeabilitatea epiteliului (sau endoteliului);

ii) joncţiunile de ancorare sau aderente („adherens”) şi desmozomii, care permit ataşarea mecanică a celulelor între ele;

iii) joncţiunile de comunicare („gap”), care permit pasajul semnalelor chimice sau electrice între celule.

Dintre cele trei tipuri de joncţiuni prezente în celulele epiteliale, două participă la adeziunea celulă-celulă, iar a treia, la adeziunea celulă-matrice.  1. Joncțiunile înguste 

Etanşeitatea la molecule şi ioni a epiteliuliilor şi endoteliilor este asigurată de joncţiunile „înguste” sau „etanşe” („tight”). Ele realizează o apropiere strânsă şi localizată a membranelor dintre două celule vecine fapt ce limitează considerabil trecerea solviţilor prin spaţiul intercelular (constituind, aşadar, o barieră paracelulară). Această barieră obligă solvitul să tranziteze stratul celular prin intermediul transportorilor membranari selectivi (transport transcelular). Aşadar, joncţiunile înguste separă domeniul apical de cel bazolateral al membranei plasmatice. Joncţiunile nu sunt în totalitate etanşe. În funcţie de tipul de ţesut, anumiţi solviţi pot sau nu să o traverseze. Joncţiunile înguste se formează datorită interacţiilor homofile dintre lanţuri proteice paralele, dispuse pe întreaga circumferinţă a celulei. Fiecare lanţ al acestei reţele este format din CAM cu mar fi ocludina, care se leagă de proteine similare de pe celule adiacente, sigilând asfel spaţiul dintre membranele plasmatice. Numeroasele posibilităţi de combinare ale acestor molecule pot explica diferenţele de permeabilitate ale joncţiunilor înguste din diferite ţesuturi.

40

Biologie Celulara

Microvili

Jonctiunestransa

SpatiuintercelularConexiune dintreproteine ale unorcelule invecinate

Sir de proteine

jonctionale

Microvili

Jonctiunestransa

SpatiuintercelularConexiune dintreproteine ale unorcelule invecinate

Sir de proteine

jonctionale

Jonctiunestransa

Membranaapicala

Caletranscelulara

Caleparacelulara

Membranabazolaterala

Jonctiunestransa

Membranaapicala

Caletranscelulara

Caleparacelulara

Membranabazolaterala

Figura. Schema unei joncţiuni strânse (A) si a rolului şi poziţiei joncţiunilor stranse în epitelii (B). 2. Joncțiunile de ancorare şi desmozomii 

Sunt localizate aproape de suprafaţa apicală, imediat sub joncţiunile dense. Joncţiunile de ancorare sau aderente conectează membranele laterale ale celulelor epiteliale adiacente şi

permit grupurilor de celule să acţioneze ca unităţi structurale solide în asociere cu elementele citoscheletului (la nivelul anumitor celule). La nivelul joncţiunilor de aderare există situsuri de legare pentru filamentele de actină. Desmozomii au situsuri de legare pentru filamentele intermediare (de exemplu keratina din celulele epiteliale). Cele două tipuri de joncţiuni sunt conectate cu citoscheletul şi formează centura de aderenţă circumferenţiară în stratul epitelial, funcţionând ca un cablu de tensiune care controlează forma celulei..

Centura circumferentiaraCentura circumferentiara

Princip

Fig. 3.18. Alcătuirea joncţiunilor de ancorare şi a desmozomilor

CITOSOL

CITOSOL

Cadherine

Desmozomi

Actina F KeratinaProteine adaptoare

Jonctiuniaderente

CITOSOL

CITOSOL

Cadherine

Desmozomi

Actina F KeratinaProteine adaptoare

Jonctiuniaderente

alele molecule CAM din joncţiunile de ancorare şi dezmozomi aparţin familiei caderinelor.

41

Celulele epiteliale şi de alte tipuri, precum celule musculare netede, sunt legate strâns împreună prin intermediul desmozomilor punctiformi. Hemidesmozomii, poziţionaţi de obicei pe faţa bazală a celulelor epiteliale, ancorează epiteliul la componentele matricei extracelulare adiacente. Forma şi rigiditatea celulei dar şi a întregului epiteliu sunt conferite de mănunchiuri de filamente intermediare, dispuse paralel cu suprafaţa celulară sau care străpung şi interconectează desmozomii punctiformi şi hemidesmozomii. Aceste joncţiuni sunt foarte importante în menţinerea integrităţii epiteliului pielii. 3. Joncțiunile de comunicare („gap”) 

În unele regiuni intercelulare membranele plasmatice sunt conectate punctiform prin canale de comunicare realizate prin cuplarea fizică a mai multor celule. Prin aceste canale pot trece ioni şi molecule mici de tipul metaboliţilor cu mai puţin de 1000 Da (glucide, aminoacizi, nucleotide) (Fig. 3.19). Prin aceste joncţiuni nu trec proteine sau acizi nucleici. Joncţiunile de acest tip sunt importante pentru comunicarea intercelulară.

Celulele din ţesuturi excitabile, cum este muşchiul cardiac, sunt cuplate printr-un flux rapid de ioni care traversează joncţiunile de comunicare şi care asigură un răspuns rapid şi sincron la stimuli. Joncţiunile de comunicare sunt esenţiale şi pentru hrănirea celulelor situate la distanţă de vasele de sânge cum sunt cele din cristalin şi din os. De asemenea, canalele de comunicare sunt importante în dezvoltare şi diferenţiere. Capacitatea anumitor celule de a forma joncţiuni de comunicare între ele şi nu cu alte celule duce la formarea ansamblurilor celulare cu proprietăţi fiziologice omogene. Această proprietate este importantă în coordonarea dezvoltării embrionului.

Joncţiunile de comunicare sunt formate din proteine transmembranare numite conexine (Fig. 3.20). Şase conexine se asamblează formând un cilindru (conexon), ca un por apos deschis median. Un astfel de conexon al unei celule se aliniază cu un conexon al celulei învecinate formând un canal deschis (“ON”) între cele două celule. În funcţie de anumite semnale intracelulare (determinate, de exemplu, de saturarea celulei cu ioni sau molecule difuzate) conexonii se pot închide (stare “OFF”) ca rezultat al unor modificări conformaţionale ale conexinelor.

 

Spatiu extracelular

Interior celulă 2

Interior celulă 1

Membrana plasmatică

Canal de conexiune

Joncţiune de comunicare între celule animale

42

Biologie Celulara

Fig. 3.19. Rolul joncţiunilor de comunicare în facilitarea transportului dintre celule

Membrane celulare adiacenteMembrane celulare adiacente

3.3.4. AdeziSpaţiul

extracelulară. Afibroblastele sunosteoblastele pro

La animcelulare, prin acgenică. Multe dicomponentele coadaptor. Principaanumite ţesuturide adeziune imp

PolizahaÎn structura prote

i) o prii) o a

implConstituenţi

plasă), dacă e boglicoproteine desau înconjurate d

Conexine Conexoni Canale intercelulareHeteromerice

Homomerice

Homotipice Heterotipice

Doi conexoni cap la cap formeaza un canal aposdeschis intre celuleadiacente

Spatiu de 2-4 nm intre

membrane

Canal de 1,5 nm diametru

Conexon compusdin 6 subunitati

Canal de 1,5 nm diametru

Conexine Conexoni Canale intercelulareHeteromerice

Homomerice

Homotipice Heterotipice

Doi conexoni cap la cap formeaza un canal aposdeschis intre celuleadiacente

Spatiu de 2-4 nm intre

membrane

Canal de 1,5 nm diametru

Conexon compusdin 6 subunitati

Canal de 1,5 nm diametru

Fig. 3.20. Topologia (A) şi structura (B) jonctiunilor de comunicare

unea celulă‐matrice extracelular conţine un amestec complex de macromolecule care constituie matricea numite celule sunt specializate în producerea matricei extracelulare. De exemplu, t implicate în construcţia ţesuturilor conjunctive, condroblastele elaborează cartilajul hialin, duc osul şi sinoviocitele sunt responsabile de producerea lichidului sinovial în articulaţii. ale matricea extracelulară susţine organizarea celulelor în ţesuturi şi coordonează funcţiile lor tivarea căilor de semnalizare care controlează creşterea celulară, proliferarea şi expresia n funcţiile matricei necesită receptori de adeziune transmembranară, care se leagă direct de mplexului matricial şi care interacţionează şi cu citoscheletul prin intermediul proteinelor-la clasă de receptori de adeziune care mediază adeziunea celulă-matrice sunt integrinele. În

non-epiteliale există şi alte tipuri de molecule care, de asemenea, funcţionează ca receptori ortanţi. Matricea extracelulară este compusă dintr-un ansamblu de polizaharide şi proteine. ridele sunt glicozaminoglicani (GAG) conectaţi cu o proteină pentru a forma proteoglicani. ică a matricei se disting următoarele componente:

ima grupă, constituită din colagen şi elastină, responsabile esenţial de structura matricei; două grupă, mai puţin abundentă , constituită din fibronectină şi laminină. Aceasta este icată mai ales în organizarea structurii şi adeziunea celulă-matrice. i se asamblează într-o reţea, membrana (lamina) bazalã, care poate fi laxă, reticulată (ca o gată în colagen, sau suficient de densă, cu aspectul unui film continuu, dacă este bogată în

aderenţă. La animale, epiteliul şi majoritatea grupurilor organizate de celule sunt susţinute e lamina bazală care este organizată diferit în funcţie de ţesut. În epiteliul columnar sau alt

43

tip (epiteliul intestinal, piele), lamina bazală este un fundament pe care stă doar o faţă a suprafeţei celulelor. În alte tipuri tisulare, cum ar fi muşchi sau ţesutul adipos, lamina bazală înconjoară fiecare celulă. Lamina bazală joacă un rol important atât în regenerarea ţesuturilor deteriorate cât şi în dezvoltarea embrionară. De exemplu, lamina bazală ajută aderarea celulelor embrionare în embrionii timpurii (embrioni de patru până la opt celule). Astfel, lamina bazală este importantă pentru:

i) organizarea celulelor în ţesuturi; ii) procesul de reparare tisulară; iii) ghidarea migrării celulelor în timpul formării ţesuturilor.

Fig. 3.21. Alcătuirea ţesutului epitelial (a) şi muscular (b) cu participarea laminei bazale în stabilizarea

celulelor din interiorul ţesuturilor

(a) Strat epitelial

(b) Tesut muscular

LUMEN

Lamina bazala

Lamina bazala Tesut conjunctiv

Tesut conjunctiv

Celula musculara Membrana plasmatica

(a) Strat epitelial

(b) Tesut muscular

LUMEN

Lamina bazala

Lamina bazala Tesut conjunctiv

Tesut conjunctiv

Celula musculara Membrana plasmatica

44

Biologie Celulara

P

snPmpmmd

Complexejunctionale

Actina

Filamenteintermediare

Lamina bazala

Nume

Jonctiunistranse

Jonctiuniaderente

Desmozomi

Jonctiuni de comunicare

Hemidesmozomi

Complexejunctionale

Actina

Filamenteintermediare

Lamina bazala

Nume

Jonctiunistranse

Jonctiuniaderente

Desmozomi

Jonctiuni de comunicare

Hemidesmozomi

Fig. 3.22. Rezumatul tipurilor de jonctiuni Tabel rezumativ

Joncţiunile celulare şi rolurile lor

Numele joncţiunii Funcţia îndeplinită Joncţiuni strânse (“tight”) Uneşte celulele dintr-un strat epitelial pentru a preveni

difuzia moleculelor şi ionilor printre celule Joncţiuni aderente (“adherens”) Uneşte filamentele de actină dîntr-o celulă cu actina din

celula învecinată Desmozomi Uneşte filamentele intermediare dîntr-o celulă cu

filamentele intermediare din celula învecinată Joncţiuni de comunicare (“gap”) Permite trecerea ionilor hidrosolubili şi a moleculelor

mici Hemidesmozomi Ancorează filamentele intermediare ale unei celule cu

lamina bazală

lasmodesmele Deşi fiecare celulă vegetală este încadrată într-o “cuşcă” rigidă, de natură celulozică (perete celular),

-a constatat că există o comunicare permanentă între celule. Dintr-o celulă, prelungiri fine de citoplasmă, umite plasmodesme, se extind prin pori ai peretelui celular, conectându-se cu citoplasma celulei învecinate. lasmodesmele oferă o cale de deplasare a ionilor, moleculelor mici (zaharuri, aminoacizi) şi chiar a acromeloculelor (ARN, proteine) între celulele unui ţesut vegetal. Moleculele mari traversează

lasmodesmele cu ajutorul microfilamentelor de actină. Structural, plasmodesmele sunt mărginite de embrană plasmatică ce prezintă astfel o continuitate între celulele conectate prin plasmodesme. Studiul icroscopic a mai relevat şi continuitatea RE dintre celulele conectate, sub forma unei structuri membranare

erivate din RE şi care străbate puntea de citoplasmă din plasmodesme (Fig. 3.23)

45

Membrana plasmatică

Fig. 3.23. Comun

Bibliografie TARBA, C., Biomembr

39-46, 72MIXICH, F., Biologie c

Perete celular

Nucleu RE

RE cu ribozomi

Plasmodesmă

icarea celulelor vegetale (delimitate de perete celular rigid) prin plasmodesme

ane, transport şi energetică celulară, Editura Academiei Române, Bucureşti, 1996, p. -78, 83-97, 169-210 elulară şi moleculară, Editura Sitech, 1997, p. 66-73, 74-88

46

Biologie Celulara

Capitolul 4. Compartimentarea celulară şi traficul vezicular 1. Introducere în organizarea celulară 

elulele eucariote, vegetale şi animale se deosebesc esenţial de celulele procariote prin faptul ca prezintă o compartimentare, adica exista o serie de zone celulare separate unele de altele prin membrane

lipidice, de aceeasi natura chimica cu membrana celulară. în primal rand materialul genetic este delimitat de o membrana proprie alcatuind astfel nucleul. în afara nucleului, citoplasma adaposteste alte organite celulare delimitate de membrane lipidice: reticulul endoplasmic, aparatul Golgi, lizozomii, peroxizomii, mitocondriile, cloroplastele etc.

C

Compartimentarea celulelor eucariote (asadar, cresterea complexitatii strucurale) a parut ca o necesitate pentru separarea unor procese biochimice ca urmare a cresterii complexitatii functionale, rolurile indeplinite de celulele eucariote fiind extrem de diversificate. Fiecarui compartiment distinct ii revine o funcţie particulara, fara de care viaţa celulei intregi nu ar fi posibila.

Nucleul adaposteste informatia genetica necesară multiplicarii celulei şi bunei desfăşurari a intregului metabolism celular, este sediul sintezei ADN şi ARN, a coordonarii activităţii şi mentinerii integritatii tuturor celorlalte organite celulare.

Citoplasma care inconjura nucleul este compusa din citosol şi citoschelet. Ea cuprinde organitele celulare. Este sediul sintezei proteinelor la nivelul ribozomilor liberi, adaposteste majoritatea reacţiilor metabolismului intermediar. Ocupa mai mult de jumătate din volumul celular.

La nivelul reticulului endoplasmic neted (REN) şi rugos (RER), organit ramificat, detinator a mai mult de jumătate din totalul suprafetelor membranare dîntr-o celula, are loc sinteza lipidelor şi a multor proteine cu destinatie membranara şi extracelulară.

In aparatul Golgi, organizat sub forma unor “cisterne” membranare, lipidele şi proteinele provenite de la RE sufera procese de maturizare.

Mitocondriile şi cloroplastele sunt sediul fosforilarii oxidative generatoare de molecule de ATP. In lizosomi are loc degradarea resturilor celulare etc.

In afara nucleului şi compartimentului citoplasmic, exista un set minim de organite celulare, prezente atat în celule animale cat şi în cele vegetale (RE, aparat Golgi, mitocondrii) în timp ce alte organite sunt specifice celulelor animale (lizozomi) sau vegetale (vacuole, plastide - dintre care cloroplastele sunt sediul fotosintezei). La rândul lor, organitele celulare de acelasi tip indeplinesc cam aceleasi roluri la plante sau animale insa, în funcţie de specificul fiecărei celule, abundenta organitelor celulare poate varia. în celule cu functii metabolice şi secretorii intense (asa cum sunt celulele hepatice şi pancreatice) suprafaţa totala a RE este de 12-25 de ori mai mare decat suprafaţa membranei plasmatice. în tabelele de mai jos sunt prezentate volumele, respectiv suprafetele totale ale membranelor diferitelor organite celulare din celulele hepatice şi pancreatice.

Tabel 4.1.

Volumele relative ocupate de compartimentele majore din interiorul unei celule hepatice

Compartimentul intracelular Procentul din volumul total al celulei (%)

Citosol 54 Mitocondrii 22 Reticulul endoplasmic rugos 9 Reticulul endoplasmic neted şi aparatul Golgi 6 Nucleu 6 Peroxizomi 1 Lizozomi 1 Endozomi 1

47

Tabel 4.2.

Suprafetele relative ocupate de membranele compartimentelor majore din interiorul celulelor hepatice (cu rol metabolic intens) şi a celor pancreatice (cu rol secretor)

Procentul din totalitatea membranelor celulare (%) Tipul membranei

Celula hepatica Celula pancreatica Membrana plasmatică 2 5 Membranele RER 35 60 Membranele REN 16 <1 Membranele aparatului Golgi 7 10 Membrana mitocondriala externă

Internă 7 32

4 17

Membrana nucleara (interna) 0,2 0,7 Membranele lizozomale 0,4 Nedeterminata Membranele peroxizomale 0,4 Nedeterminata Membranele endozomale 0,4 Nedeterminata

2.  Relatiile  topologice,  genetice  şi  functionale  dintre  compartimentele celulare 2.1. Localizarea diferitelor compartimente în spațiul intracelular 

Distributia diverselor compartimente în interiorul celulelor eucariote un este intamplatoare. Ele sunt “fixate” în pozitii stabile în raport cu rolurile lor astfel incat comunicarea dintre ele şi functionarea lor să fie optime, necesitand un consum energetic minim. Imobilizarea organitelor celulare este realizata de citoschelet, un sistem ramificat de microtubuli (polimeri de natura proteică) care ancoreaza diversele structuri membranare şi care, la rândul sau este ancorat prin structuri particulare de membrana plasmatică, Distrugerea experimentala a citoscheletului cu ajutorul unor medicamente ce impiedica polimerizarea microtubulilor este urmata de dezintegrarea aparatului Golgi şi a reticulului endoplasmic.

Deoarece exista o continuitate structurala intre diverse compartimente (nucleu, reticul endoplasmic, aparat Golgi, vezicule intracelulare precum lizozomii, endozomii etc), sistemul de membrana intracelulare este practic distribuit în tot volumul celular. Cu toate acestea, de exemplu aparatul Golgi este cel mai adesea localizat în apropierea nucleului la fel şi reticulul endoplasmic neted. în schimb, reticulul endoplasmic rugos (cu ribozomi atasati) este dispus predominant spre periferia celulelor, în imediaţa vecinatate a membranei plasmatice în directia carora vor fi exportate lipidele şi proteinele de secreţie. De altfel, în funcţie de abundenta să (vezi tabelul de mai sus), RE poate fi dispersat în aproape toata masa celulei. în multe celule vegetale, plastidele detinatoare de substanţe de rezerva sunt distribuite tot la periferia celulei, la fel şi cloroplastele, care sunt astfel mai “aproape” de sursa de lumina.

2.2. Subordonarea genetica dintre diferite compartimente Totalitatea materialului genetic al unei celule se mai numeste “genom”. în funcţie de localizarea

diferitelor parti ale sale, în celulele eucariote distingem un genom nuclear, un genom mitocondrial şi unul cloroplastidial. Intr-adevăr, nucleul nu este singurul organit care adaposteste material genetic în celulele eucariote. Mitocondriile şi cloroplastele detin la rândul lor un echipament genetic minimal, cu gene specifice care codifică proteine destinate exclusiv bunei functionari a acestor organite. Mai mult, aceste organite se pot multiplica oarecum independent de nucleu, acesta fiind şi motivul pentru care echipamentul lor genetic este cel mai “conservat” (vechi şi relativ puţin modificat) din totalitatea genomului celular.

Cu toate acestea, genomul detinut de nucleu este cel mai important din totalitatea genomului celular şi el are capacitatea de a subordona activitatea tuturor celorlalte organite celulare, mitocondriile şi cloroplastele neputand functiona complet independent de nucleu.

48

Biologie Celulara

Descoperirea genoamelor mitocondriale şi cloroplastidiale a dus, alaturi de alte argumente amintite în capitolul de teorii şi ipoteze ale evolutiei materiei vii, la concluzia ca aceste organite celulare ar avea origine bacteriana. Subordonarea mitocondriilor şi cloroplastelor fata de informatia genetica existenta în nucleu constă în esenta in:

(A) Subordonarea directa prin codificărea nucleara a unei serii de proteine de importanta vitala pentru aceste organite. Aceste proteine cu destinatie mitocondriala şi cloroplastidiala, sintetizate la nivelul ribozomilor liberi din citosol, sunt ulterior transportate spre organitele celulare corespunzatoare.

(B) Dependenta acestor organite mai este data indirect, prin utilizarea unor compuşi chimici a caror sinteza are loc exclusiv citosolic (de exemplu glicoliza, biosinteza de novo a acizilor grasi, unele etape ale ureogenezei, biosinteza bazelor purinice şi pirimidinice) sau în reticulul endoplasmic (biosinteza acizilor grasi nesaturati).

La rândul lor mitocondriile sunt detinatoare exclusive ale capacitatii de fosforilare oxidativă (sinteza ATP cuplata cu respiratia), ale echipamentului enzimatic necesar ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs), a sintezei corpilor cetonici, a degradarii AG prin β-oxidarea lor etc. în cloroplaste, organite particulare plantelor, are loc procesul fotosintetic care constă în fotoliza apei, fosforilarea ADP la ATP şi fixarea (reducerea) CO2 în glucide, lipide, aminoacizi etc. Detinand exclusivitatea acestor procese biochimice, practic, mitocondriile (la toate celulele eucariote) şi cloroplastele (la organismele vegetale) “supun” la rândul lor viaţa intregii celule eucariote. Celelalte componente ale sistemului de endomembrane (RE, aparatul Golgi, lizozomii, peroxizomii, endozomii etc) nu detin informatie genetica, ele fiind extensii, ramificatii, prelungiri sau fragmente ale unei vaste retele de membrane ce delimiteaza spatii, canale, cisterne, vezicule ce adapostesc proteine proaspat sintetizate, enzime specifice, diversi produsi metabolici de sinteza sau de degradare (glucide, lipide, aminoacizi).

2.3. Legaturile structurale şi functionale dintre compartimente Membranele care delimiteaza celula şi organitele celulare au în esenta aceeasi compoziţie chimica,

fosfolipidică, formata din 2 straturi (bistratificata) (vezi capitolul 3). în aceasta membrana lipidică sunt incorporate proteine cu functii structurale (de fixare a citoscheletului de exemplu), de comunicare (proteinele care formeaza receptorii celulari) sau enzimatice (transportori, catalizatori a unor reacţii biochimice). Pentru membrana care delimiteaza celula se foloseste denumirea de membrana plasmatică. Membranele compartimentelor intracelulare primesc denumirile organitelor pe care le delimiteaza: membrana nucleara, membrana RE, membrana aparatului Golgi, membrana lizozomala, etc. Ele sunt “compatibile” chimic, astfel ca se pot recunoaste şi pot fuziona.

Deoarece exista o continuitate structurala şi functionala intre aceste membrane intracelulare, totalitatea lor a fost denumita sistemul de endomembrane. Din sistemul de endomembrane fac parte:

- membrana (anvelopa) nucleara, - membranele RER şi REN, - membrana aparatului Golgi, - membranele lizozomale şi endozomale. Intre aceste membrane exista o continuitate structurala şi functionala, comunicarea dintre ele fiind

directa sau indirecta, realizata prin intermediul veziculelor membranare desprinse din unele organite (de ex, din aparatul Golgi) şi capabile de fuzionare cu alte membrane.

ATENTIE ! Mitocondriile şi cloroplastele (plastidele) sunt oarecum diferite de organitele de mai sus, fiind structuri de sine statatoare, de origine diferita (posibil bacteriana) şi delimitate de cate 2 membrane bistratificate. Membrana lor externă este foarte asemanatoare sistemului de endomembrane şi asadar, compatibila cu acestea. Membranele interne mitocondriale şi plastidiale sunt în schimb diferite, cu compoziţie asemanatoare cu a membranelor bacteriene (vezi Fig. 4.1.).

49

Anvelopa nucleara cu pori nucleari

Celula procariota straveche

Celula eucariota straveche

Internalizarea membranei celulare

ADN

Ribozomi atasati de membran

RE cu ribozomi

Mitocondria cu membrana interna (de origine

procariota) si externa derivata din celula eucariota

“gazda”

Celula procariota

Internalizarea procariotului odata cu o

parte a membranei

Fig. 4.1. Relatiile istorice (filogenetice) dintre diferitele organite delimitate de membrana proprie. Odata importate o serie de substanţe strict necesare sintezei lipidelor, proteinelor şi glucidelor, este

nevoie de o coordonare exacta a distributiei lor intre compartimente.

50

Biologie Celulara

Sinteza lipidelor are loc la nivelul RE. Ele sunt produse şi se incorporeaza în membrana RE dupa care veziculele care se desprind prin inmugurire din aceasta structura fuzioneaza cu toate celelalte structuri membranare compatibile (membrana plasmatică, aparat Golgi, anvelopa nucleara), membranele externe ale mitocondriilor şi plastidelor.

Sinteza proteinelor cu plecare de la aminoacizi (fie sintetizati de novo, fie importati din mediul extracelular) are loc la nivelul ribozomilor liber sau atasati de RE. în funcţie de destinatia lor, proteinele poarta secvenţe de recunoastere (secvenţe-semnal) care permite transportul directionat al acestora spre compartimentul de destinatie. în funcţie de natura spatiala şi chimica, transportul proteinelor intre diferite compartimente poate fi de 3 feluri: A. Transport de poarta, când traficul proteinelor se realizează intre spatii topologic asemanatoare, prin

intermediul unor “porti” selective (numite pori). Acest transport este continuu şi are loc numai intre nucleu şi citosol.

B. Transport transmembranar, când traficul de proteine se realizează intre spatii topologic diferite, izolate. Este mediat de proteine translocatoare inserati în membrana şi care recunosc şi transporta specific o proteina sau alta. Acesti translocatori faciliteaza transferul proteinelor de o parte pe alta a membranei prin desfacerea (despachetarea) lor. Proteinele trec prîntr-o miscare de “serpuire” în spaţiul de destinatie. Transportul transmembranar are loc în cazul proteinelor care trec în din citosol în lumenul RE şi cele care trec din spaţiul citosolic în spaţiul mitocondrial/plastidial.

C. Transport vezicular, când traficul proteinelor se face ca o incarcatura tip "cargo" în interiorul unor vezicule membranare. Proteinele acumulate intr-un spatiu sunt invelite de o membrana lipidică, incarcatura care se desprinde de compartimentul respectiv, circula prin citosol apoi la destinatie fuzioneaza cu compartimentul-tinta. Acest transfer se face intre spatii topologic echivalente şi nu necesita prezenta translocatorilor. Proteinele sunt apoi “descarcate” în spaţiul de destinatie. Acest transport are loc intre RE şi aparatul Golgi, intre aparatul Golgi şi membrana plasmatică.

Diferitele tipuri de transport intre compartimentele celulare sunt schematizate în figura 4.2.

CITOSOL

NUCLEU

MITOCONDRII PLASTIDE

PEROXIZOMI

RETICULUL ENDOPLASMIC

ENDOLIZOZOM VEZICULE SECRETOARE

LIZOZOM

ENDOZOM

AP. GOLGI

SUPRAFATA CELULEI / MEMBRANA PLASMATICA

Fig. 4.2. Traficul celular al proteinelor: traficul de poarta (sageata hasurata), transmembranar (sageti negre) şi vezicular (sageti albe)

51

In toate variantele de transport, proteinele trebuie să prezinte un “pasaport”, adica o secvenţa de aminoacizi care este recunoscuta de receptorii din porii nucleari, membranele RE sau mitocondriale sau de receptorii din vezicule. Aceste secvenţe se numesc secvenţe-semnal iar dupa ce si-au indeplinit rolul de semnal, vor fi clivate şi indepartate astfe ca proteina matura sa-si indeplineasca funcţia.

3. Nucleul şi transportul nuclear. 

Materialul genetic sub forma ADN este dispus în mod caracteristic în celula eucariotă, predominant la nivelul nucleului. Continutul celular (nucleoplasma) este topologic echivalenta cu citoplasma, existand cai directe de comunicare intre aceste compartimente. Nucleoplasma este inconjurata de anvelopa nucleara, un invelis membranar dublu. Se numeste asadar, anvelopa deoarece are un invelis extern (membrana nucleara externă) şi unul intern (membrana nucleara interna), intre care se afla un spatiu perinuclear (Fig. 4.3.). Curios, spaţiul perinuclear se continua cu lumenul reticulului endoplasmic deoarece memrana nucleara externă se ramifica inspre citoplasma sub forma unor canale labirintice care constituie ansamblul reticulului endoplasmic. Mai mult, la fel ca şi membrana RE, membrana nucleara externă poate fi pigmentata cu ribozomi atasati.

In compartimentul nuclear au loc o serie de procese de importanta deosebita pentru viaţa celulei. Acestea sunt: replicarea ADN (sinteza ADN) în cursul diviziunii celulare, sinteza ARN şi formarea ribozomilor, ultimele două procese fiind esenţiale în sinteza proteinelor care are loc în citosol. Apare asadar, necesitatea ca intre spaţiul nuclear şi citosol să existe o comunicare (permanenta practic) în care ARN şi robozomii tineri sunt exportati în citosol iar proteinele, nucleozidele şi alte molecule necesare asamblarii şi functionarii genomului nuclear să fie importante din citosol în spaţiul nuclear. Asa cum am amintit anterior, transportul moleculelor intre nucleu şi citosol se face prin “porti” sau pori nucleari - este un transport de poarta.

Fig. 4.3 anvelopa nucleara, spaţiul perin

Structura porilor nucleari  Porii nucleari sunt complexe proteice care perforeaza microscopul electronic, anvelopa nucleara apare ca o sita, cu nenIntr-adevăr, porii nucleari nu sunt niste simple orificii, ci sunt ansamcu mai multe grade de permeabilitate. Proteinele porilor nucleari totalitatea lor sunt grupate în clasa nucleoporinelor. Un por nuclear are, în ansamblu, diametrul de 50 nm, cu orificiu este de doar 9 nm. Canalul apos este marginit de nuclsprijinindu-se anterior, spre membrana nucleara, de nucleoporine ccomplexul porului este ancorat de membrana nucleara de proteine lmembrana nucleara asemanator unor capse. în sfarsit, de o parte şprezintă proteinele inelare dispuse circular, şi de la care protrud finucleara. Pe fata nucleara, fibrilele (nucleare) converg formand unB, C).

. Reprezentarea relatiei topologice dintre uclear şi nucleoplasmei cu RE şi citosolul

anvelopa nucleara, astfel ca, vazuta la umărate orificii structurate (Fig. 4.4. A).

bluri de proteine care formeaza o poarta pot fi de multe zeci de feluri (50) iar în

un canal apos dispus central dar al carui eoporine anulare, acestea la rândul lor olumnare. Proteinele columnare şi intreg umenale. Proteinele lumenale traversează i alta a anvelopei nucleare, porul nuclear brile, atat pe fata citosolică cat şi pe cea ansambul asemanator unui cos (Fig. 4.4.

52

Biologie Celulara

B

A

C

Fig. 4.4. Microelectronofotografie a anvelopei nucleare (A), reprezentarea în spatiu a complexului poral (B) şi categoriile de molecule care pot traversa porul prin difuzie sau prin transport activ (C)

La nivelul complexului poral, membrana nucleara este continua, adica membrana nucleara externă se continua cu cea interna.

Diametrul foarte redus al canalului apos permite circulatia pasiva a moleculelor mici, inclusiv a mileculelor lipidice mici, a peptidelor,si altor compuşi cu diametrul redus. în schimb majoritatea proteinelor, unele avand mase moleculare de peste 100 kDa se gasesc în imposibilitatea de a difuza liber prin acesti pori. Ca urmare a selectivitatii porilor nucleari, citosolul şi spaţiul intranuclear posedă echipamente diferite de proteine. Totusi, procesele de replicare, transcriptie, asamblarea acizilor nucleici care necesita diverse proteine de stabilitate, formarea complexelor ribozomice (nucleoproteice) sunt posibile datorita trecerii proteinelor mari sintetizate în citosol sau a ARN şi robozomilor formati în nucleu, prin porii nucleari, în ambele directii. Transportul nuclear al macromoleculelor  Secvențele de localizare nucleara ‐ necesare pentru importui nuclear  Extragerea experimentala a proteinelor nucleare (specifice nucleului) şi reintroducerea lor în citosol, a pus în evidenta reacumularea lor în nucleu. Acest fapt indica prezenta la aceste proteine a unor secvenţe-semnal de localizare nucleara (NLS – “Nuclear localization signals”). în majoritatea proteinelor nucleare aceste secvenţe (1 sau 2) constau într-o succesiune de aminoacizi incarcati pozitiv precum lizina şi arginina, secvenţa exacta variind de la o proteina la alta. Prin atasarea unei astfel de secvenţe de localizare nucleara de particule de aur de diferite dimensiuni a permis vizualizarea procesului de import nuclear. S-a constatat de exemplu ca porul nuclear nu este o structura rigida ci se poate dilata până la 26 nm pentru a permite trecerea moleculelor mari. Structura-canal din miezul porului pare să functioneze ca o diafragma, permitand dilatarea exact până la diametrul necesar pentru transport. Aceasta modalitate unică de transport (de poartă) este unică pentru nucleu şi este complet diferita de transportul proteinelor prin membrana sau prin vezicule.

53

  Receptorii de import nuclear – recunosc nucleoporinele  Prezenta NLS este necesară dar nu suficienta pentru asigurarea importului proteinei în nucleu. în citosol exista o serie de proteine care au rol de “ghizi”, adica sunt receptori ai importului nuclear (NIR). Acestea se leagă de proteinele cu destinatie nucleara pe baza NLS şi le aduc în apropierea porilor. Asa cum am aratat anterior, porii prezintă fibrile citosolice, care sunt prelungiri proteice formate din secvenţe FG-repetate de aminoacizi (Fenilalanina-Glicina). Aceste fibrile recunosc şi leagă receptorii de import nuclear. Odata adusa proteina la nivelul porului, aceasta nu este direct importata ci sufera o serie de modificări (legare, disociere, re-legare de secvenţele FG ale fibrilelor ) în urma carora se “scurge” practic prin porul nuclear. în interiorul nucleului, secvenţele NLS şi proteinele NIR se cliveaza respectiv, disociaza de proteina nucleara. NIR sunt transportate din nou în citosol unde îşi vor relua funcţia. Fenomenul este însă mai complicat, celula a dezvoltat şi alte molecule cu rol în importul nuclear, şi anume molecule adaptoare, care se intercalează în unele cazuri, între NIR şi NLS de pe proteina nucleară. Exportul nuclear – reversul importului nuclear 

Moleculele produse în interiorul nucleului precum ARN mesager şi subunităţile ribozomale, trebuie să ajungă în citosol pentru a intra în procesul de sinteza proteică. Aceste molecule prezintă la rândul lor secvenţe-semnal de export nuclear, secvenţe recunoscute şi legate specific de receptorii de export nuclear (NER). La rândul lor, acesti receptori recunosc fibrilele de pe fata internă a porilor şi faciliteaza transferul moleculelor cu destinatie citosolică.

S-a constatat ca NIR şi NER sunt înrudite genetic, fiind codificăte de gene care codifică aceeasi clasa de receptori nucleari, clasa carioferinelor (karyos, gr. – nucleu; forensis, gr. – transport). Activarea transportului nuclear – rolul Ran GTPazelor  Transportul directionat al proteinelor în şi dinspre nucleu este un proces activ, cu consum energetic. Deoarece este un transport de poarta ci nu unul transmembranar (care ar fi decurs prin intermediul unui translocator ce ar cupla hidroliza ATP cu transportul proteinelor), energizarea trecerii proteinelor prin pori nu se face la nivelul porilor. El se realizează prin intermediul legarii NIR şi NER de proteine Ran care hidrolizează GTP (Ran GTPaze). Proteinele Ran pot adopta două stari conformaţionale în funcţie de natura chimica a moleculei macroergice GTP sau GDP. Hidroliza GTP din Ran este stimulata în prezenta unei proteine reglatoare, numita proteina de activare a GTPazei (GAP – “GTPase activating protein”) cu localizare exclusiv citosolică. Legarea GTP în locul GDP la Ran este activata în prezenta unei proteine exclusiv nucleare: factorul de schimb al guaninei (GEF – “Guanine exchange factor”). Astfel Ran-GTP se schimba în Ran-GDP în citosol şi invers, în nucleu. De aici rezultă localizarea predominanta a Ran-GDP în citosol, repectiv a Ran-GTP în nucleu. Acest gradient al celor două stari conformaţionale Ran este cea care direcţionează transportul nuclear.

A. In cazul importului nuclear, NIR se leagă de NLS a proteinei destinate nucleului. Recunoaste secvenţele FG-repetate ale fibrilelor şi finalmente ajunge în spaţiul nuclear. în nucleu, NIR întâlneste Ran-GTP, se disociazî de proteina nucleară şi leagă Ran-GTP. Complexul NIR-Ran-GTP este exportat în citosol. în citosol Ran-GTP este imediat recunoscut de o proteina de legare la Ran (“Ran-binding protein”) şi desprins de pe NIR. Ran-GTP liber este transformat de proteina Ran-GAP în Ran-GDP. Ran-GDP este ulterior transportat în nucleu pentru a fi transformata în Ran-GTP în prezenta Ran-GEF.

B. In cazul exportului nuclear, lucrurile decurg similar. De aceasta data însă NER (receptorul de export nuclear) se leagă de molecula de export, în prezenta Ran-GTP. Acest complex este legat de secvenţele FG-repetate ale fetei nucleare a complexului poral. Odata ajunsă în citosol, molecula elibereaza NERsi Ran-GTP. în prezenta acelorasi proteine de legare şi a proteinei Ran-GAP, molecula de Ran-GTP hidrolizează GTP la GDP, devenind Ran-GDP.

54

Biologie Celulara

Pentru a intelege acest mecanism, schema activării transportului direcţionat de la nivelul nucleului este prezentată mai jos (Fig. 4.5.)

Fig. 4.5. Schema prin care hidroliza GTP asigură direcţionalitatea transportului nuclear.

Fenomenul de transport nuclear constă într-o multime de procese reglatoare, de marire sau micsorarea numărului de pori (in funcţie de necesar), de sinteza sau degradare a diferitelor molecule receptoare, a proteinelor lor reglatoare. Exista mecanisme subtile de reglare a numărului, cantitatii şi calitatii proteinelor necesare nucleului în anumite momente. Unele proteine reglează expresia genelor iar transportul lor este permanent modulat: uneori prezenţa lor în nucleu este necesară, alteori nu. Aceste proteine au localizare citosolică şi ele sunt activate în momentul în care celula primeste semnale din exterior. Mecanismul de activare şi transport în nucleu a proteinelor reglatoare a expresiei genelor sunt subiectele domeniului de semnalizare celulară. Rolul anvelopei nucleare nu este numai în asigurarea unui mediu intim (izolator) materialului genetic sau în facilitarea transportului diferitelor molecule în şi dinspre nucleu, dar şi în iniţierea, realizarea şi finalizarea optimă a procesului de diviziune celulară. Aceste aspecte vor fi discutate în cursul destinat diviziunii celulare.

55

4. Reticulul endoplasmic 

Reticulul endoplasmic (RE) este un compartimend de

endomembrane organizat sub forma unei retele tubulare (cilindrice sau aplatizate – ca niste cisterne), raspandita aproape în toata masa celulei eucariote. Membranele RE pot atinge până la 50-60 % din totalul membranelor celulare în vreme ce spaţiul intern al RE poate atinge 10% din volumul total al celulei.

Din punct de vedere al compoziţiei chimice, membranele RE sunt similare cu cele ale anvelopei nucleare (cu care exista o continuitate structurala), a veziculelor secretoare, a aparatului Golgi, a lizozomilor şi endozomilor. Spaţiul intern al RE se mai numeste lumenul RE sau spaţiul cisternal al RE.

Rolul central al RE consta in: - sinteza majoritatii lipidelor celulare; - sinteza proteinelor de secreţie (destinate spaţiului

extracelular), a proteinelor transmembranare a majoritatii organitelor celulare şi membranei plasmatice, şi în preluarea unor proteine hidrosolubile sintetizate în citosol şi destinate spatiilor echivalente (lumenului RE, aparatui Golgi, lizozomilor).

Un al rol al RE este de rezervor de ioni Ca2+, care sunt capturati sau eliberati ca raspuns la anumite semnale (chimice, electrice, mecanice) din mediul extern.

CITOSOL

NUCLEU

MITOCONDRII PLASTIDE

PEROXIZOMI

RETICUL ENDOPLASMIC

ENDOLIZOZOM VEZICULE SECRETOARE

LIZOZOM

ENDOZOM

SUPRAFATA CELULEI / MEMBRANA PLASMATICA

AP. GOLGI

56

Biologie Celulara

In funcţie de prezenta sau absenta ribozomilor de pe suprafaţa sa, RE poate fi de două feluri: RE rugos (RER), cu ribozomi atasati de suprafaţa citosolică, şi RE neted (REN), lipsit de ribozomi.

4.1. Ribozomii Ribozomii sunt structuri ribonucleoproteice cu rol în biosinteza proteinelor. Ribozomii se ataşează de

moleculele de ARN mesager (ARNm) produs în nucleu şi initiaza sinteza proteinelor, fenomen numit translatie. Din punct de vedere istoric, ribozomii au fost evidenţiati pentru intaia oara de un roman, George Emil Palade (n. 1912), profesor la Yale University. El a ramas singurul om de stiinta de origine romana care, în 1974, a fost laureat cu Premiul Nobel în Medicina şi Fiziologie, pentru aceasta descoperire.

Ribozomii sunt prezenti atat la bacterii (procariote) cat şi la eucariote. La bacterii, ribozomii sunt atasati de fata citoplasmica a membranei celulare. La eucariote o parte din ribozomi sunt suspendati în fluidul citosolic, liberi sau asociati de-a lungul unei

singure molecule de ARNm, aparand ca un sirag de margele insiruite pe o sfoara (=poliribozomi) . O alta parte din ribozomi se gasesc atasati de membrana RE unde indeplinesc practic aceeasi funcţie de sinteza a proteinelor. Factorul care determina starea libera sau atasata a unui ribozom este existenta unei secvenţe de nucleotide (respectiv peptidice) care să “indice” necesitatea directionarii în RE a proteinei. Cu alte cuvinte, prezenta în peptidul nascent al unei secvenţe-semnal de localizare în RE. Ribozomii liberi sunt identici cu cei atasati, doar prezenta acestei secvenţe-semnal RE determina migrarea ribozomilor pe RE. Odata ce proteina destinata RE este sintetizată, ribozomii se desprind de membrana RE şi isi reiau locurile în citosol. în absenta secvenţe-semnal RE, ribozomii raman liberi în citosol şi intervin în sintetza proteinelor cu localizare exclusiv citosolică (cum ar fi de exemplu enzimele implicate în reacţii biochimice din citosol). în majoritatea lor, proteinele citosolice sunt hidrosolubile.

Ribozomii sunt formati din două subunităţi, una mare şi alta mica. Subunităţile mare şi mica au compoziţie ribonucleoproteică diferita la eucariote şi la procariote. Aceasta diferenta a permis catalogarea ribozomilor în ribozomi de tip “eucariot” şi ribozomi de tip “procariot”. în schema de mai jos sunt redate principalele caractere structurale ale celor două tipuri de ribozomi.

- estre totala - subu ARN - subu

Ribozomul de tip eucariot - are greutatea totala de 80 S; - subunitatea mare are 60 S si contine un amestec de 3 tipuri de ARNr, de 5S, 28S si 5,8S; - subunitatea mica are 40 S si contine ARNr de 18S.

M

Ribozomul de tip procariot mai mic decat cel eucariot, avand greutateade 70 S (unitati de sedimentare Svedberg); nitatea mare are 50 S si contine 2 tipuri de

ribozomal (ARNr), de 5S si de 23S; nitatea mica are 30 S si contine ARNr de 16S.

50 S

30 S70 S

r 2.7 x 106

Procariote

50 S 30 S

60 S 80 SMr 4.2 x 106

Eucariote

60 S 40 S

40 S

Mr 1.8 x 106

5S ARNr(120 nte)

23S ARNr(3,200 nte)

36 proteine

Mr 0.9 x 106

16S ARNr(1,540 nte)

21 proteine

Mr 1.4 x 106

18S ARNr(1900 nte)

~32 proteine

Mr 2.8 x 106

5S ARNr(120 nte)

28S ARNr(4,700 nte)

5.8S ARNr(160 nte)

~49 proteine

57

O unitate de sedimentare Svedberg exprima viteza de sedimentare a unei particule şi este echivalenta cu un coeficient de sedimentare de 10-13 secunde (S = 10-13 s). Subunităţile mici ale ribozomilor procarioti şi eucarioti au coeficienti de sedimentare de 30x10-13 s respectiv 40 x 10-13 s, ceea ce corespunde la 30 respectiv 40 unitati S.

In celula eucariotă, în afara ribozomilor de 80S (de tip eucariot) localizati citosolic, mai exista şi ribozomi de 70S (de tip procariot) cu localizare în matricea mitocondriilor şi cloroplastelelor. Acesti ribozomi intervin în translaţia proteinelor în interiorul spaţiului mitocondrial şi plastidial, proteine codificăte de genomul celor două organite.

O celula eucariotă tipica posedă milioane de ribozomi. Subunităţile ribozomale sunt asamblate în nucleu, într-o regiune speciala numita nucleol. Aici, ARNr, sintetizat pe baza informaţiei genetice din ADN, este împachetat impreuna cu proteinele ribozomale care sunt importate în nucleu dupa ce au fost la rândul lor sintetizate în citosol. Subunităţile ribozomale sunt apoi exportate în citosol printr-un mecanism de transport de poarta care a fost discutat în cursul anterior.

Legarea subunităţilor ribozomale de ARN este posibila deoarece contin 4 situsuri specifice de legare a acestor molecule de ARN:

- un situs specific de legare a ARNm, purtător de informatie genetica sub forma anticodonilor; - trei situsuri de legare a ARN de transfer (situsurile A, P, E) care aduce aminoacidul la locul de

sinteza a proteine; La situsul A se ataşează aminoacil-ARNt. La situsul P, gruparea aminoacil de pe ARNt proaspat atasat se

leagă de aminoacilul lantului polipeptidic în crestere. La situsul E, ARNt lipsit de aminoacil este eliberat. Pe masura ce lantul de ARNm este “citit” de situsul de legare a ARNm, ribozomul se “deplasează” de-a lungul acestuia iar în acelasi timp lantul polipeptidic este sintetizat.

Fig. 4.6. Situsurile de legare ale ARN din ribozomi şi modul în care are loc translaţia ARNm în proteine

la nivelul subunităţilor ribozomale.

4.2. Rolul reticulul endoplasmic rugos Am văzut anterior ca la nivelul ribozomilor are loc sinteza lanturilor polipeptidice prin translaţia

(“traducerea”) informaţiei continute de ARNm. în absenta unei secvenţe-semnal de RE de pe polipeptidul nascent (in stare de nastere), ribozomii se localizează citosolic iar produsul de sinteza sunt proteine cu localizare citosolică în principal. Daca secvenţa-semnal de RE este citita, ribozomii se orienteaza spre RE, atasandu-se de acesta. S-a constatat că ribozomii nu se ataşează la întâmplare, în orice domeniu al RE, ci

Situsul de legare al ARNm

Situsurile A, P, E

Subunitatea mică

Subunitatea mare

5’

E P A

ARNm

3’

E P A A E P P A E

5’

Aminoacil-ARNt ARNt

5’

3’5’3’ 3’5’

58

Biologie Celulara

dimpotrivă exista o preferinţă a ribozomilor pentru anumite arii ale RE. Aceste zone sun mai bogate în anumite tipuri de proteine şi se deosebesc astfel de ariile RE care rămân “netede”, nelegând niciodată ribozomi. Intr-adevăr, analiza biochimică a RER şi REN au evidenţiat diferenţe de compoziţie lipidică şi proteică intre acestea fapt confirmat şi de rolurile oarecum diferite pe care le indeplinesc acestea:

- RER are un rol dominant în sinteza proteinelor, prin cuplarea sintezei cu importul acestora în

- rol predominant în biosinteza lipidelor respectiv în preluarea proteinelor din spaţiul

ecanismul de directionare al ribozomilor spre RER 

Membranele RER posedă o serie de receptori proteici capabili să lege un ansamblu de peptide numite par

al peptidului din sub

Fig. 4.7. Mecanismul ataşării ribozomului de membrana RE şi iniţierea transferului cotranslaţional al

 

lumenul RE; REN are un lumenal şi formarea de vezicule membranare (aşadar, rol în transportul vezicular al proteinelor şi lipidelor).

M

ticule de recunoastere a secvenţei-semnal (SRPs) care la rândul lor se ataşează specific de secvenţa-semnal RE din peptitul nascent. Secvenţa-semnal RE al proteinei în curs de formare constă în principal dîntr-o succesiune de 8 aminoacizi hidrofobi (Leu, Ile, Val, Phe etc) iar mediul hidrofob al SRP este capabil să lege aceasta succesiune de aminoacizi nepolari. Pentru o scurta perioada de timp, translaţia este oprita, suficient însă ca ribozomii să se apropie de RE şi să fie atasati prin intermediul receptorilor de SRP.

Ataşarea ribozomilor de membrana RE se face în aşa fel încât canalul de ieşire unitatea mare, să fie suprapus cu un canal existent deja în membrana RER. Acest canal este format din

câteva proteine transmembranare ale RE (complexul Sec61) şi poate fi asemănat unui por umplut cu mediu apos. Odată ataşat ribozomul, SRP se desprinde de secvenţa-semnal şi de receptorul de SRP. Secvenţa-semnal RE este cea care, la rândul ei, iniţiază deschiderea porului din membrana RE. Putem vorbi astfel de o dublă cale de recunoaştere a unei proteine cu destinaţie în RE; mai întâi SRP recunoaste secvenţa-semnal în citosol, iar apoi această secvenţă este recunoscută de complexul poral din membrana RE.

Lumenul R

Citosol

SRP

Secventa-semnal RE

Ribozomul se porul orientează spre

care se deschide recunoscand secventa-semnal RE. Proteina trece in lumenul RE.

SRP este recunoscut de receptoprul SRP din membrana RE. Ribozomul se ataşează de membrana RE. Ulterior SRP se desprinde şi ajunge în citosol

Por blocat Receptorul SRP

SRP se leagă de secvenţa-semnal RE şi aduce ribozomul aproape de RE

E

proteinelor în lumenul RE.

 

59

Transferul cotranslațional al proteinelor în lumenul RER 

Procesul prin care proteina în stare nascentă este transferată în lumenul RE în timp ce este sintetizată se num

eţie extr

rosolubile) ajung fara modificări în lumenul RE; ele sunt transferate în intr

ă) posedă o secvenţa hidr

inele transmembranare şi mai ales cele care au regiuni multiple ce traversează membrana (loop-uri tran

Fig. 4.8. Proteinele a caror sinteză are loc la nivelul RE şi care trec cotranslaţional fie în într ime în

Împachetarea şi glicozilarea proteinelor– fenomene importante din lumenul RE 

Odată ajunse în lumenul RE, unele proteine hidrosolubile destinate spaţiilor echivalente ale RE, aparatu

butiei proteinelor la nivelul membranelor este data şi de glicozilarea protein

licozilate (glicoproteinele) sunt destinate transportului spre aparatul Golgi, lizozomi, membra

nele incorect sintetizate, impachetate sau asambla

eşte transfer cotranslaţional, spre deosebire de transportul proteinelor gata sintetizate în membrana altor organite celulare (mitocondrii, plastide, peroxizomi), care se numeşte transfer posttranslaţional. Există însă cazuri în care unele proteine ajung în lumenul RE prin transfer posttranslaţional, proteine care sunt sintetizate citosolic dar care trebuie să ajungă în lumenul RE pentru a suferi anumite ajustări structurale.

In funcţie de natura (hidrofilă, hidrofobă) şi de rolul pe care îl vor indeplini (proteine de secracelulară, proteine transmembranare, integrale, periferice), proteinele pot fi transferate cotranslational

spre lumenul RE în mod diferit astfel: - proteinele de natura hidrofilă (hidegime şi isi vor indeplini functiile ca atare fie în lumenul RE, fie în spatiile echivalente din aparatul Golgi,

lizozomi, endozomi şi chiar în spaţiul extracelular unde ajung prin transport vezicular; - proteinele periferice şi integrale (care au o parte integrata în membrana lipidicofobe care le ancoreaza în bistratul lipidic, fie la capatul C (carboxi-) terminal, fie la cel N (amino-)

terminal; - protesmembranare sau regiuni alfa-helix) posedă secvenţe hidrofobe care permit ancorarea multipla a lor în

bistratul lipidic. în acest caz proteina traversează inainte şi inapoi membrana pe masură ce este sintetizată, pe masura ce are loc sinteza secvenţelor de integrare în membrană.

eg

COOH H2N

COOH

H2N

H2N

LUMENUL RE

Proteina lumenală hidrosolubilă Proteina integra Protein nsmembra

CITOSOL

lă e tra nare

lumenul RE (proteine hidrosolubile), fie parţial (proteine integrale şi transmembranare).

lui Golgi, lizozomilor etc, sunt asamblate şi/sau împachetate pentru a fi pregatite pentru rolul lor. Împachetarea proteinelor în lumenul RE are loc sub acţiunea unor proteine speciale numite chaperonine. Chaperoninele sunt complexe proteice care asigura modificarea formei unei proteine cu consum de energie, ele utilizand GTP în acest scop.

In plus, asimetria distrielor, un proces major care are loc în lumenul RE. Glicozilarea din lumenul RE este nespecifică şi se

realizează sub acţiunea enzimelor glicoziltransferaze. O glicozilare specifică a proteinelor va avea mai târziu, în complexul Golgi.

Proteinele gnă plasmatică şi spaţiul extracelular. În membrana plasmatică, resturile glicozil emerg spre exteriroul

celulei servind în fenomenul de comunicare şi recunoaştere celulară. Dacă în timpul transferului cotranslaţional survin erori, proteite din lumenul RE sunt retranslocate prin acelaşi complex poral (Sec61) şi expulzate în citosol unde sunt

deglicozilate şi capturate de proteazomi, organite membranare purtătoare ale unui echipament de liza proteică.

60

Biologie Celulara

4.3. Rolul reticulului endoplasmic neted. Sinteza lipidelor. Şi în cadrul RE există o adevarată “diviziune a muncii”. Dacă RER are ca funcţie dominantă sinteza

şi transferul cotranslaţional al proteinelor în lumen sau în membrana lipidică, REN posedă enzime specifice care participă la o serie de reacţii de biosinteza a lipidelor. în plus, REN este capabil de formare a veziculelor membranare, prin inmugurirea capetelor sale, vezicule în care proteinele şi lipide ajung la alte organite celulare (transport vezicular).

Deoarece majoritatea substanţelor necesare sintezei lipidelor se gasesc în citosol (AG, glicerol, aminoacizi), o parte consistenta a enzimelor implicate în acest proces se gasesc pe fata citosolică a REN. Fosfatidilcolina (lecitina) este formata din metaboliti precum 2 AG, glicerol-fosfat şi colina în trei etape, fiecare catalizata de o alta enzima. Prima etapă constă în transferul AG pe glicerol-fosfat cu formarea acidului fosfatidic, proces catalizat de acil-transferaza. Acidul fosfatidic este suficient de hidrofob pentru a rămâne în membrana. Ulterior gruparea fosfat este indepartata de o fosfatază, iar colina adaugată de o colin-fosfotransferaza. în mod asemanator sunt sintetizate fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina şi fosfatidilinozitolul. Sinteza fosfolipidelor pe fata citosolică a membranei RE nu rezultă într-o crestere neta a suprafeteelor membranelor RE deoarece, pe masura ce noi lipide se formeaza, altele sunt transferate pe diverse cai celorlalte organite celulare. Odata formate, fosfolipidele trebuie distribuite echilibrat intre cele două fete. Fosfolipidele noi ajung pe fata lumenala a RE într-o mica masura prin prin miscari de flip-flop spontane ci mai mult ajutate de interventia unor translocaze specializate numite scramblaze. în principiu diferitele tipuri de fosfolipide sunt egal distribuite pe ambele fete ale bistratului lipidic.

In membrana plasmatică, în afara de scramblaze, exista o serie de translocaze specifice, numite flippaze, proteine care aparţin clasei transportorilor de tip ABC (vezi Capitolul 3). Flippazele realizează translocarea specifica a fosfolipidelor cu grupări aminice libere (fosfatidilserina şi fosfatidiletanolamina) din stratul extracelular spre fata citosolică a membranei celulare. Această translocare se face cu consum energetic, prin hidroliza ATP. în urma activităţii flippazelor, membrana plasmatică are un caracter asimetric în privinta distributiei fosfolipidelor.

Colesterolul şi ceramidele sunt de asemenea produse în membrana RE. în ceea ce privesc ceramidele, odata ajunse în membranele aparatului Gogi, devin precursori ai glicolipidelor şi sfingomielinelor. Deoarece sinteza acestor molecule lipidice este tarzie şi are loc exclusiv pe fata lumenala a aparatului Gogi, localizarea membranara a acestora este predominant pe fata lumenala (noncitosolică).

Transferul lipidelor spre organite care nu aparțin sistemului de endomembrane 

Mitocondriile, plastidele şi peroxizomii sunt organite care nu aparţin sistemului de endomembrane. Cu toate acestea ele nu sunt capabile sa-si sintetizeze lipidele necesare constituirii propriilor membrane. Este astfel necesară o comunicare intre ele şi fabrica de lipide reprezentată de RE. De asemenea, o mare parte a proteinelor necesare acestor organite sunt sintetizate în citosol. în ambele cazuri este nevoie de mecanisme speciale de transport. De transportul proteinelor în aceste organite ne vom ocupa în cursul dedicat mitocondriilor, plastidelor şi peroxizomilor.

Membrana mitocondriala externaMembrana

RE

Intr-adevăr, exista o modalitate de transport al lipidelor sintetizate în membranele RE care nu implica formarea de vezicule membranare ci transferul specific al fosfolipidelor de către proteine de schimb fosfolipidic. Acestea recunosc un anume fosfolipid din membrana generatoare de fosfolipide, leagă compusul şi il transporta aleatoriu prin celula, dar odata ce întâlneşte o membrană a cărei

Fig. 4.9. Transferul de lipide mediat de proteine de schimb fosfolipidic intre membrana RE şi membranele organitelor care nu fac parte din sistemul de endomembrane.

61

compoziţie în lipidul respectiv este saraca, proteina de schimb descarca fosfolipidul în acea membrana. Fosfatidilcolina este transferata în stare intactă în vreme ce fosfatidilserina ajunsă în mitocondrie poate fi decarboxilată la fosfatidiletanolamina. Transferul specific de lipide este facilitat în unele cazuri şi de strânsa apropiere spaţială dintre mitocondrii şi membrana RE.

MATERIAL SUPLIMENTAR

George E. Palade – Autobiography I was born în November 1912 în Jassy (Iasi), the old capital of Moldavia, the eastern province of Romania. My education was started în that city and was continued through a baccalaureate (continental style) at the "Al Hasdeu" Lyceum în Buzau. My father, Emil Palade, was professor of philosophy and my mother, Constanta Cantemir-Palade, was a teacher. The family environment explains why I acquired early în life great respect for books, scholars and education. My father had hoped I was going to study philosophy at the University, like himself, but I preferred to deal with tangibles and specifics, and - influenced by relatives much closer to my age than he was - I entered the School of Medicine of the University of Bucharest (Romania) în 1930. Early în my student years I developed a strong interest în basic biomedical sciences by listening to, and speaking with, Francisc Rainer and André Boivin, professors of Anatomy and Biochemistry, respectively. As a result, I started working în the Anatomy laboratory while still în medical school. I

went, nonetheless, through six years of hospital training, mostly în internal medicine, but I did the work for my doctorate thesis în microscopic anatomy on a rather unusual topic (for an M.D.): the nephron of the cetacean Delphinus delphi. It was an attempt to understand its structure în terms of the functional adaptation of a mammal to marine life. I graduated în 1940 and, after a short period as an assistant în internal medicine, I went back to Anatomy, since the discrepancy between knowledge possessed by, and expected from, the medical practitioners of that time made me rather uneasy. During the second world war, I served în the medical corps of the Romanian Army, and after the war - encouraged by Grigore Popa, Rainer's successor - I came to the United States în 1946 for further studies. I worked for a few months în the Biology Laboratory of Robert Chambers at New York University and, while there, I met Albert Claude who had come to give a seminar on his work în electron microscopy. I was fascinated by the perspectives opened by his findings and extremely happy when, after a short discussion following his seminar, he asked me to come to work with him at The Rockefeller Institute for Medical Research în the fall of the same year. This was truly a timely development, since Chambers was retiring that summer. At The Rockefeller Institute, Claude was working în the department of Pathology of James Murphy with George Hogeboom and Walter Schneider as direct collaborators; Keith Porter was în the same department but had developed his own line of research on the electron microscopy of cultured animal cells. At the beginning, I worked primarily on cell fractionation procedures, and I developed with Hogeboom and Schneider the "sucrose method" for the homogenization and fractionation of liver tissue. This first "Rockefeller group" had a rather short existence: Schneider returned to the University of Wisconsin, Hogeboom moved to the National Cancer Institute, and Claude went back to Belgium în 1949 to assume the directorship of the Jules Bordet Institute. Only Porter and I remained at The Rockefeller Institute; two years later, upon Murphy's retirement, we became "orphans" and were adopted by Herbert Gasser then the director of the Institute, since none of us had the rank required to head a laboratory. Around that time, I started working în electron microscopy with the general aim of developing preparation procedures applicable to organized tissue. This line of research had been tackled before by a few investigators, Claude included, but there was still ample room for improvement. Taking advantage of whatever techniques were already available, Porter and I worked out enough improvements în microtomy and tissue fixation to obtain preparations which, at least for a while, appeared satisfactory and gratifying. A period of intense activity and great excitement followed since the new layer of biological structure revealed by electron microscopy proved to be unexpectedly rich and surprisingly uniform for practically all eukaryotic cells. Singly, or în collaboration with others, I did my share în exploring the newly open territory and, în the process, I defined the fine structure of mitochondria, and described the small particulate component of the cytoplasm (later called ribosomes); with Porter, I investigated the local differentiations of the endoplasmic reticulum and with Sanford Palay I worked out the fine structure of chemical synapses. With all this activity, our laboratory became reasonably well known and started functioning as a training center for biological electron microscopy. The circumstances that permitted this development were unusually favorable: we didn't have to worry about research funds (since we were well supported by Herbert Gasser), we had practically complete freedom în selecting our targets, strong competitors who kept us alert, and excellent collaborators who helped us în maintaining our advance. In the middle 1950's, I felt that the time was ripe for going back to cell fractionation as a means of defining the chemical composition and the functional role of the newly discovered subcellular components. The intent was to use electron microscopy for monitoring cell fractionation. I was starting from structural findings and morphological criteria seemed appropriate for assessing the degree of

62

Biologie Celulara

homogeneity (or heterogeneity) of the cell fractions. Philip Siekevitz joined our laboratory în 1955 and together we showed that Claude's microsomes were fragments of the endoplasmic reticulum (as postulated by Claude în 1948) and that the ribosomes were ribonucleoprotein particles. To find out more about the function of the endoplasmic reticulum and of the attached ribosomes, we started an integrated morphological and biochemical analysis of the secretory process în the guinea pig pancreas. In 1961, Keith Porter who had been the head of our group since 1953 joined the Biological Laboratories of Harvard University and, with his departure, the history of the second "Rockefeller group" came to an end. It was during this period that cell biology became a recognized field of research în biological sciences and that the Journal of Cell Biology and the American Society for Cell Biology were founded. Our group participated actively în each of these developments. In the 1960's, I continued the work on the secretory process using în parallel or în succession two different approaches. The first relied exclusively on cell fractionation, and was developed în collaboration with Philip Siekevitz, Lewis Greene, Colvin Redman, David Sabatini and Yutaka Tashiro; it led to the characterization of the zymogen granules and to the discovery of the segregation of secretory products în the cisternal space of the endoplasmic reticulum. The second approach relied primarly on radioautography, and involved experiments on intact animals or pancreatic slices which were carried out în collaboration with Lucien Caro and especially James Jamieson. This series of investigations produced a good part of our current ideas on the synthesis and intracellular processing of proteins for export. A critical review of this line of research is presented în the Nobel Lecture. In parallel with the work on the secretory process în the pancreatic exocrine cell, I maintained an interest în the structural aspects of capillary permeability, that goes back to the early 1950's when I found a large population of plasmalemmal vesicles în the endothelial cells of blood capillaries. Along this line of research, Marilyn Farquhar and I investigated the capillaries of the renal glomeruli and recognized that, în their case, the basement membrane is the filtration barrier for molecules of 100A diameter or larger; a byproduct of this work was the definition of junctional complexes în a variety of epithelia. Visceral (fenestrated) capillaries were investigated with Francesco Clementi, and muscular capillaries with Romaine Bruns and Nicolae and Maia Simionescu. The capillary work has relied primarily on the use of "probe" molecules of known dimensions detected individually or în mass (after cytochemical reactions) by electron microscopy. It led to the identification of the passageways followed by large water-soluble molecules în both types of capillaries and by small molecules în visceral capillaries. The pathway followed by small, watersoluble molecules în muscular capillaries is still under investigation. In the middle of the 1960's our laboratory began a series of investigations on membrane biogenesis în eukaryotic cells using as model objects either the endoplasmic reticulum of mammalian hepatocytes (with P. Siekevitz, Gustav Dallner and Andrea Leskes), or the thylakoid membranes of a green alga (Chlamydomonas reinhardtii) (With P. Siekevitz, Kenneth Hoober and Itzhak Ohad). These studies showed that "new" membrane is produced by expansion of "old" preexisting membrane (there is no de novo membrane assembly), and that new molecules are asynchronously inserted, and randomly distributed throughout the expanding membrane. Asynchrony also applies to the turnover of membrane proteins în the endoplasmic reticulum as shown by work down with P. Siekevitz, Tsuneo Omura and Walter Bock. In 1973, I left the Rockefeller University to join the Yale University Medical School. The main reason for the move was my belief that the time had come for fruitful interactions between the new discipline of Cell Biology and the traditional fields of interest of medical schools, namely Pathology and Clinical Medicine. Besides, my work at the Rockefeller University was done: when I left there were at least five other laboratories working în different sectors of cell biology. At present I am investigating, together with my collaborators, the interactions which occur among the membranes of the various compartments of the secertory pathway, namely the endoplasmic reticulum, the Golgi complex, the secretion granules, and the plasmalemma. I have been a member of the National Academy of Sciences (U.S.A.) since 1961, and I have received în the past a number of awards and prizes for my scientific work, among them: the Lasker Award (1966), the Gairdner Special Award (1967), and the Hurwitz Prize - shared with Albert Claude and Keith Porter (1970). Since my high school years I have been interested în history, especially în Roman history, a topic on which I have read rather extensively. The Latin that goes with this kind of interest proved useful when I had to generate a few terms and names for cell biology. I have a daughter, Georgia Palade Van Duzen, and a son Philip Palade from a first marriage with Irina Malaxa, now deceased. în 1970 I married Marilyn Gist Farquhar who is a cell biologist like myself. From Les Prix Nobel en 1974, Editor Wilhelm Odelberg, [Nobel Foundation], Stockholm, 1975

This autobiography/biography was written at the time of the award and later published în the book series Les Prix Nobel/Nobel Lectures. The information is sometimes updated with an addendum submitted by the Laureate.

63

5. Aparatul Golgi 

Aparatul Golgi este un alt sistem

endomembranar cu rol central în elaborarea numeroaselor proteine şi trierea lor în funcţie de destinaţia finală. Se prezintă sub forma unei reţele sau saci arcuiţi care constituie dictiozomii. Fiecare dictiozom prezintă o faţă convexă, de formare sau cis, în relaţie topografică strânsă cu RER, şi o faţă concavă, de maturare, sau faţa trans. Ansamblul dictiozomilor unei celule constituie aparatul sau complexul Golgi (vezi îmaginea alăturată).

CITOSOL

NUCLEU

MITOCONDRII PLASTIDE

PEROXIZOMI

RETICUL ENDOPLASMIC

ENDOLIZOZOM VEZICULE SECRETOARE

LIZOZOM

ENDOZOM

SUPRAFATA CELULEI / MEMBRANA PLASMATICA

AP. GOLGI

64

Biologie Celulara

5.1. Glicozilarea proteinelor în aparatul Golgi 

Proteinele concentrate în RER suferă un proces de glicozilare nespecifică. Restul glicozidic specific este adăugat în aparatul Golgi. Transformările finale ale glicozilării depind de destinaţia proteinelor. Proteinele lizozomale suferă doar modificări minore, în timp ce proteinele de secreţie suferă transformări complexe şi variate. Din catena oligozaharidică achiziţionată în RER sunt eliminate unele resturi glucidice, în timp ce altele sunt adăugate într-o ordine minuţios aleasă. Fiecare adăugare sau eliminare furnizează un produs care va fi substratul specific al unei alte enzime care va produce o altă modificare. Astfel se obţin mai multe oligozaharide. Ele sunt subdivizate în două tipuri diferite: i) Oligozaharide bogate în manoză provenite din

mărirea catenei achiziţionată în RE sub acţiunea glucozidazelor şi manozidazelor din Golgi.

ii) Oligozaharidele complexe rezultă din eliminarea glucozei şi manozei şi înlocuirea lor cu alte resturi glucidice al căror număr şi natură determină diversitatea glicoproteinelor. Adăugarea secvenţială a acestor resturi este determinată de natura enzimelor numite glicoziltransferaze şi localizarea lor în dictiozomi.

În principiu, reînnoirea membranelor golgiene se face graţie transferului de proteine şi lipide de la RE. Transferul se realizează pe calea veziculelor netede către partea cea mai apropiată a feţei de formare. Într-o etapă ulterioară, alte vezicule transferă o parte a materialului către regiuni din ce în ce mai apropiate de faţa de maturare. Fig 4.10. Glicozilarea proteinelor în ap. Golgi (prelucrat

dupã Biology, N. A. Campbell, J. B.Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings,

6th Edition, 2002)

65

5.2. Trierea proteinelor în aparatul Golgi Trierea proteinelor destinate mediului extracelular sau organitelor intracelulare este una din funcţiile

aparatului Golgi. Se realizează prin veziculele care se formează de pe faţa de maturare a dictiozomilor. Aceste vezicule au pe faţa lor luminală receptori pentru recunoaşterea proteinelor de transportat şi pe fata externă proteine pentru ghidarea către destinaţia lor (Fig. 4.11)

5.3. LizozLi

lipaze, glimacromoledigestia prapărarea facelula faţăsimilar altRER undeglucidică. multor resteliminarea

Fig. 4.11. Eliberarea proteinelor destinate mediului extracelular

(prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

omii zozomii sunt organite intracelulare care conţin enzime care provoacă liza (fosfataze, proteaze, cozidaze, nucleaze, etc.). Acestea sunt hidrolaze acide capabile să degradeze toate tipurile de cule. Echipamentul enzimatic le permite lizozomilor să asigure numeroase funcţii, mai ales oduşilor nutritivi ingeraţi de celulă. Prezenţi în celule specializate ca macrofagele, ei participă la ţă de microorganismele străine (Figura 4.19). Impermeabilitatea membranei lizozomale protejează de propriile sale enzime. Enzimele lizozomale sunt glicozilate şi sunt elaborate după un proces or glicoproteine. În cursul sintezei lor de către ribozomi, secvenţele peptidice sunt transferate în vor suferi primele glicozilări. După migrarea în Golgi cis, ele achiziţionează specificitatea Mai întâi are loc îndepărtarea resturilor terminale, mai ales glucoza, apoi fosforilarea unuia sau mai uri de manoză prin două reacţii succesive: legarea N-acetilglucozaminei fosfat la C6 din manoză şi grupării N-acetilglucozamină de către o fosfodiesterază.

66

Biologie Celulara

Manoza-6-fosfat astfel formată este caracteristică proteinelor lizozomale. Proteinele lizozomale sunt apoi transferate în compartimentul trans. Graţie markerului lor, manoză-6-fosfat, ele se fixează la receptorii situaţi pe faţa luminală a cavităţilor golgiene. Una din etapele cheie ale transportului proteinelor lizozomale, pornind de la Golgi, este separarea de toate celelalte proteine şi segregarea lor în vezicule de transport (Fig. 4.12). Astfel veziculele care conţin numai enzime lizozomale se detaşează de aparatul Golgi. Acestea sunt acoperite de o reţea proteică numită clatrină. pH acid al veziculelor de transport al proteinelor lizozomale favorizează separarea proteinelor lizozomale de receptorii lor. O etapă de defosforilare a resturilor de manoză este efectuată adesea pentru prevenirea unei eventuale reasocieri a proteinelor cu receptorii lor. Veziculele de transport pierd învelişurile de clatrina şi vor constitui două compartimente esenţiale: unul va recicla receptorii liberi şi altul, care conţine proteinele lizozomale, va fuziona cu lizozomii.

Fig. 4.12. Eliberarea proteinelor destinate mediului extracelular (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

67

6. Transportul vesicular prin endocitoza şi exocitoza 

CITOSOL

NUCLEU

MITOCONDRII PLASTIDE

PEROXIZOMI

RETICUL ENDOPLASMIC

ENDOLIZOZOM VEZICULE SECRETOARE

LIZOZOM

ENDOZOM

AP. GOLGI

SUPRAFATA CELULEI / MEMBRANA PLASMATICA

Transportorii transmembranari nu pot vehicula macromolecule de tipul proteinelor, sau particule ca

bacteriile sau resturile celulare. Mecanismele folosite de celula implică formarea de vezicule. Transportul către citoplasma se numeşte endocitoză, în timp ce transportul de la citoplasmă către mediul extracelular se numeşte exocitoză. În interiorul celulei, un flux de vezicule permite transportul macromoleculelor între diferite compartimente. Pornind de la fiecare organit, mecanisme specifice permit împachetarea selectivă, în vezicule, a proteinelor şi lipidelor destinate altui compartiment. O ipoteză adevărată ar fi că vezicula de transport posedă la suprafaţa să două categorii de proteine: i) una capabilă să recunoască moleculele transportate de veziculă; ii) cealaltă pentru recunoaşterea organitului ţintă. Formarea veziculei este asigurată prin asamblarea clatrinei. Procesul se numeşte endocitoză dependentă de clatrină şi presupune organizarea acestei proteine sub forma unei reţele poliedrice. Endocitoza - desemnează formarea veziculelor prin includerea membranei plasmatice care înconjoară o particulă sau lichid extracelular. Se disting trei forme de endocitoză care diferă prin mărimea veziculelor şi specificitatea pentru moleculele transportate (Fig. 4.14).

(1) Pinocitoza, cu vezicule care nu depăşesc 150 nm în diametru, înglobează lichid extracelular şi eventual molecule mici.

(2) Fagocitoza corespunde mecanismelor de ingestie a microorganismelor şi resturilor celulare, graţie veziculelor de mărime mare, peste 250 nm, fagozomii. La vertebrate, ea se limitează la celule specializate cum sunt granulocitele şi macrofagele.

(3) Endocitoza mediatã de receptori este un proces specific. Intervin proteine membranare care recunosc şi fixează liganzii determinaţi specific. Legăturile ligand-receptor induc o regrupare localizată a complexului şi formarea unei invaginări a membranei tapetată pe faţa să citoplasmatică cu proteine fibroase care formează o manta în jurul veziculei. Cele mai bine caracterizate dintre proteinele mantalei sunt clatrina şi adaptina (Fig. 4.13). După interacţiile dintre receptori şi adaptine, clatrinele se fixează progresiv la adaptine. Rearanjamentele între clatrina şi adaptine duc la deformarea membranei şi la

68

Biologie Celulara

formarea ulterioară a unei vezicule acoperită de o manta de clatrină (endozom). Vezicula pierde rapid proteinele din manta şi migrează către destinaţia sa. Un astfel de mecanism de endocitoză este cunoscut pentru internalizarea colesterolului sub forma lipoproteinelor de densitate mică (LDL) şi pentru transferul fierului fixat de transferină. Pentru că endocitoza este un proces permanent şi induce dispariţia receptorilor de la suprafaţa membranei, o reciclare a receptorilor este realizată de vezicule neîncărcate permiţând compensarea pierderii de componente de pe suprafaţa membranară provocată de endocitoză.

Fig. 4.13 Aspectul electronomicroscopic al mantalei de clatrină şi adaptină (A) respectiv structura de tripod al

clatrinei şi contribuţia adaptinei la organizarea mantalei şi ataşarea ei de vezicule..

A

Exocitoza

Veziculele de transport conduc către membrana plasmatică a celulelor eucariote molecule care, după natura lor, sunt fie integrate în membrană pentru a asigura reînnoirea, fie sunt eliberate în mediul extracelular (hormoni, enzime, nutrienţi, deşeuri celulare, etc.). Modificările structurale şi trierea proteinelor înainte de ieşirea lor se efectuează în aparatul Golgi. Faza de migrare care conduce vezicula către membrana, este sub dependenţa microfilamentelor citoscheletului şi microtubulilor. Membranele se unesc prin fuziunea stratului extern al veziculei cu stratul intern al membranei plasmatice. O deplasare laterală a proteinelor intramembranare din zona de fuziune provoacă deschiderea veziculei şi excreţia. Exocitoza necesită prezenţa ATP şi Ca2+ (Fig. 4.14). Se disting două căi de exocitoză:

i) calea constitutivă care funcţionează în toate celulele. Veziculele de transport duc în mod continuu moleculele nou sintetizate către membrana plasmatică (Fig. 4.13);

ii) calea reglată care funcţionează în celulele specializate doar ca răspuns la un stimul, de exemplu un

mesager chimic care se fixează la suprafaţa membranei plasmatice.

69

Fig 4.14. Transport cu ajutorul veziculelor şi sinteză de proteine (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

70

Biologie Celulara

7. Mitocondriile şi cloroplastele. Conservarea energiei celulare. 

CITOSOL

NUCLEU

MITOCONDRII PLASTIDE

PEROXIZOMI

RETICUL ENDOPLASMIC

ENDOLIZOZOM VEZICULE SECRETOARE

LIZOZOM

ENDOZOM

AP. GOLGI

SUPRAFATA CELULEI / MEMBRANA PLASMATICA

În acest subcapitol ne vom focaliza asupra mitocondriei şi cloroplastului pentru a studia morfologia, membranele şi rolul lor primordial în producţia de ATP necesar derulării funcţiilor celulare (furnizor universal de energie).

Pentru producerea ATP de către mitocondrie este necesară o aprovizionare susţinută cu metaboliţi de tipul glucozei şi acizilor graşi. Metaboliţii vor fi convertiţi în NADH şi FADH2 (plus CO2) în procese precum glicoliza, ß-oxidarea acizilor graşi şi ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs), pentru a alimenta în final lanţul respirator şi a determina producerea de ATP. Procesele se desfăşoară la nivelul unor situsuri bine definite şi trecerea metaboliţilor de la un situs la altul este asigurată de numeroşi transportori. Pe lângă rolul de producător de energie, mitocondria intervine şi în sinteza steroizilor, moarte celulară programată (apoptoză) şi homeostazia celulară a calciului.

7.1. Mitocondriile  Mitocondria a luat probabil naştere prin fuziunea (acum câteva miliarde de ani) a două bacterii, o

bacterie anaerobă (gazdă) şi o protobacterie aerobă (simbiontă) pentru a da un eucariot primitiv din care au derivat toate eucariotele actuale. Cuvântul “mitocondrie” derivă din grecescul mitos, “filament”, şi chondros, “sămânţă” datorită aspectului acestui organit în microscopie (optică şi electronică). De exemplu, în celulele care elaborează hormoni steroidieni (corticosuprarenale şi gonade) mitocondriile sunt filamentoase, în timp ce în hepatocite (ficat) sunt granulare. Mitocondriile au un diametru de aproximativ 1 µm. Celulele conţin numeroase mitocondrii (în hepatocitul de şobolan aproximativ 1000). Mitocondriile nu sunt organite statice. Ele se scindează sau pot fuziona, aceste procese explicând polimorfismul evidenţiat în aceeaşi celulă (Fig. 4.14).

71

Fig. 4.15 Forma şi structura mitocondriei 7.1.1. Organizarea mitocondriei 

Mitocondria este delimitată de un înveliş format din două membrane: membrana externă şi membrana internă (Fig. 4.15). Membranele sunt foarte diferite în compoziţie şi funcţii. Între cele două membrane există un spaţiu intermembranar al mitocondriei.

Membrana externă este permeabilă pentru orice moleculă de 5 kDa sau mai puţin datorită prezenţei

porinelor. De asemenea conţine şi translocaze, transportori proteici, implicaţi în importul proteinelor (exemplu, translocaza membranei externe, TOM).

Membrana internă delimitează spaţiul matricial şi este impermeabilă pentru cei mai mulţi compuşi.

Membrana internă se pliază pentru a forma numeroase criste având drept consecinţă creşterea suprafeţei totale. Cristele au diferite forme: tubulare, saculare, laminare şi triunghiulare, pot coexista în aceeaşi mitocondrie şi pot evolua în timp. Baza unei criste este adesea constituită dîntr-o structură tubulară îngustă numită tubul de joncţiune al crestei care stabileşte o comunicare între spaţial interior al cristei şi spaţiul intermembranar periferic al mitocondriei (Fig. 4.14). Compoziţia lipidică a membranei interne este particulară deoarece conţine majoritar fosfatidilcolină şi cardiolipină. În această membrană se găseşte lanţul respirator al transportorilor de electroni, F1F0-ATP sintetaza şi numeroşi transportori care asigură pasajul unor metaboliţi precum piruvat, acizi graşi, ATP, ADP şi AMP, compuşi necesari producerii ATP. Membrana internă conţine şi translocaze (Translocaze ale membranei interne, TIM), implicate în importul de proteine.

În spaţiul matricial se află un amestec concentrat de numeroase enzime necesare oxidării

piruvatului, acizilor graşi şi ciclului acidului citric (Krebs). De asemenea, conţine ADN (genom mitocondrial) şi proteine necesare transcrierii sale şi apoi traducerii ARNm în proteine. Proteosinteza mitocondrială este

72

Biologie Celulara

relativ restrânsă fiind sintetizate aproximativ 13 proteine, marea majoritate a proteinelor mitocondriale (în jur de 300 proteine diferite) fiind importate din citoplasmă. MATERIAL SUPLIMENTAR

Genomul mitocondrial

ADN mitocondrial este o moleculă bicatenară circulară. Este un ADN bogat în citozină şi guanină, adesea prezent în mai multe copii în aceeaşi mitocondrie. La om, mărimea materialului genetic este de 16569 perechi de baze (pb), secvenţa nucleotidică fiind cunoscută în totalitate. Codifică ARNr, ARNt şi câteva proteine. În mitocondriile umane au fost descoperite 37 de gene din care 22 codifică ARNt, 2 codifică ARNr şi 13 codifică subunităţile polipeptidice care intră în constituţia proteinelor lanţului respirator mitocondrial. Astfel citocrom C oxidaza (complexul IV din lanţul respirator) este constituit din 7 subunităţi, din care 3 de origine mitocondrială. F1F0-ATP-aza are 2 catene polipeptidice de origine mitocondrială. Aproximativ 5-10% din proteinele mitocondriale sunt sintetizate în mitocondrie. Altele sunt codificăte de genomul nuclear şi sintetizate în citosol. Astfel, cele două genomuri, mitocondrial şi nuclear, intervin pentru biosinteza proteinelor mitocondriale active. Codul genetic utilizat de mitocondrie, în timpul traducerii, este diferit de codul genetic universal (vezi Tabelul de mai jos). Codonul de iniţiere codifică pentru N-formil metionina, ca la bacterii.

Tabel cu diferenţele dintre codul genetic universal şi codul genetic din mitocondriile mamiferelor şi plantelor

Codon Cod universal Cod mitocondrial la

mamifere Cod mitocondrial la

plante UGA Stop Trp Stop AGA Arg Stop Arg AGG Ile Met Ile AUA, CUA Leu Leu (Trp la drojdii) Leu

7.1.2 Biogeneza mitocondriilor şi transportul proteinelor în mitocondrii 

Într-o celulă, mitocondriile sunt reînnoite adesea pentru a compensa eliminarea mitocondriilor mai bătrâne de către lizozomi, fenomen cunoscut sub numele de autofagie. Noile mitocondrii derivă din mitocondriile preexistente prin diviziune. Materialul genetic este duplicat şi se sintetizează noi constituenţi (proteine şi lipide). Numai câteva proteine sunt sintetizate graţie informaţiei genetice mitocondriale. Restul sintezei proteice are loc în citosol prin expresia genelor nucleare.

Proteinele mitocondriale sintetizate în citosol sunt produse sub forma de precursori având o secvenţă peptidică adiţională, peptidă (secvenţă) semnal, situată la extremitatea N-terminală care le permite recunoaşterea şi direcţionarea către mitocondrie. Peptida semnal are 15-30 aminoacizi majoritar hidroxilaţi.

Proteinele mitocondriale sunt importate în stare nepliată. Ele recunosc receptori situaţi în membrana externă şi se integrează în compartimentul de destinaţe (membrana externă sau internă, spaţiul intermembranar sau matricea) prin transfer posttranslaţional. Cu excepţia proteinelor membranei externe, toate celelalte transporturi de proteine consumă energie. Integrarea în diferite compartimente mitocondriale se face la nivelul regiunilor de contact între membrana externă şi internă, numite situsuri de adeziune. În timpul transportului, proteinele pierd secvenţa-semnal datorită intervenţiei unei semnal peptidaze specifice.

Lipidele sunt importate din RER de către mitocondrie graţie proteinelor de transfer (proteinele de schimb fosfolipidic). În mitocondrie este sintetizat numai cardiolipidul numit difosfatidilglicerol care se obţine prin conversia precursorului său, fosfatidilglicerolul.

7.1.3. Funcțiile mitocondriei Mitocondriile au mai multe funcţii:

producerea ATP şi NADH; sinteza de hormoni steroizi; turnover-ul monoaminelor (neurotransmiţători); sechestrarea Ca2+; moartea celulară programată (apoptoză) prin eliberarea citocromului c în citoplasma; furnizarea de energie la nou născuţi.

73

7.1.4. Producerea ATP în mitocondrii  Molecula de ATP (adenozin trifosfat) este furnizorul universal de energie

Mitocondriile constituie “centrala energetică” a celulei. Le putem considera şi organitele în care energia conţinută în legăturile moleculare ale metaboliţilor proveniţi din alimentele ingerate, este convertită în ATP. Hidroliza ATP în ADP şi Pi (HPO4

2-) este necesară unui număr mare de procese celulare cum sunt: transportul activ de ioni prin membrană (ATP-aze);

deplasarea proteinelor motoare şi polimerizarea filamentelor de actină;

rol esenţial în producerea altor nucleotide şi în derularea numeroaselor procese metabolice;

intervenţia în reglarea cascadelor de semnalizare intracelulară.

Pentru a estima importanţa acestor procese se poate spune că în fiecare zi un adult utilizează (şi reciclează) o cantitate de ATP echivalentă cu 75% din greutatea sa. Se estimează că, în repaus, o treime această energie este utilizată pentru funcţionarea pompelor membranare ca Na+-K+ ATP-aza. În repaus, organele cele mai consumatoare sunt inima şi ficatul. Un procent mic din energia celulară provine din glicoliză. Pentru o molecula de glucoză, glicoliza produce 2 molecule de ATP, în citosol, în absenţa oxigenului.

În mitocondrii, în prezenţa oxigenului se obţin 36 de molecule de ATP. Energia moleculei de ATP este conţinută în legăturile macroergice dintre fosfaţi şi furnizează 7,3 kcal/mol. Într-o celulă, proteinele, glucidele şi lipidele, provenite din alimente, participă la producerea de energie în mitocondrii. În citosol, au loc primele etape ale degradării lor în unităţi glucidice, aminoacizi şi acizi graşi care stau la originea producerii unei molecule strategice numită acid piruvic. Ulterior este generat un produs comun prin transformarea tuturor monomerilor precursori în acetil coenzima A (acetil CoA), o moleculă care ocupă un rol central în producerea de energie în mitocondrie. Acetil-CoA este obţinută prin două căi majore: i) decarboxilarea acidului piruvic în prezenţa coenzimei A şi NAD+ (Niacinamid Adenin Dinucleotid oxidat) graţie, acţiunii complexului enzimatic al piruvat dehidrogenazei; ii) oxidarea acizilor graşi după un ciclu de reacţii cunoscut sub numele de ciclul Lynen.

În matricea mitocondrială, acetil-CoA suferă o serie de transformări, prin decarboxilare şi dehidrogenare enzimatică în prezenţa de coenzime oxido-reducătoare, definind ciclul acidului citric sau ciclul Krebs. Derularea completă a unui ciclu conduce la reducerea coenzimelor NAD+ (Nicotinamid-adenin-dinucleotid, forma oxidată) şi FAD+ (Flavin-adenin-dinucleotid, forma oxidată):

NAD+ + 2H+ + 2e- => NADH + H+

FAD+ + 2H+ + 2e- => FADH2 Coenzimele reduse (NADH şi FADH2) se reoxidează cedând electronii transportorilor membranei interne mitocondriale organizaţi în complexe polipeptidice şi regrupaţi sub numele de lanţul (sau catena) respirator mitocondrial. Este un ansamblu de proteine în care are loc transferul de electroni, într-o ordine precisă, cu eliberare de energie la fiecare etapă de trecere între doi transportori consecutivi (Fig. 4.15). Complexul I: NADH dehidrogenaza, conţine peste 25 de polipeptide. Situsul de legare al NADH este orientat către matrice. Acceptorul final al acestui complex este ubiquinona oxidată (UQ) care se reduce la ubiquinol după reacţia următoare:

NADH + H+ + UQ => NAD+ + UQH2

Complexul II: succinat dehidrogenaza, este constituit din cel puţin 4 polipeptide. Transferă electronii de la succinat la ubiquinonă prin intermediul FAD. Complexul III: ubiquinol-citocrom c oxidoreductaza, este compus din 10 subunităţi. Ubiquinolul produs de complexele I şi II difuzează în membrane până la complexul III căruia îi va ceda electronii pentru a ajunge în forma să oxidată. Transferul de electroni duce la reducerea citocromului c.

74

Biologie Celulara

Ultimul complex care conduce electronii până la oxigen este complexul IV: citocrom c oxidaza. El transferă electronii acceptorului final, oxigenul, care se reduce la apă.

Energia furnizată prin transferul de electroni este utilizată pentru expulzarea protonilor prin membrana internă şi creează un gradient electrochimic de protoni, numit forţã proton-motorie (PMF). Faţa matricială a membranei devine încărcată negativ, în timp ce faţa citosolică are o sarcină netă pozitivă. F1F0-ATP sintetaza (ATP-aza) sau complexul V, numit şi complexul F0F1 utilizează un gradient electrochimic de protoni pentru a cataliza reacţia de fosforilare a ADP în ATP. Conform teoriei chimiosmotice acestea sunt reacţii cuplate trecerii inverse a protonilor prin ATP sintetaza. Fosforilarea este oxidativă pentru că este cuplată cu reacţiile de oxidare ale transportorilor lanţului respirator. Energia electrochimică poate fi utilizată pentru a îndeplini alte procese celulare. Transportul fosfatului şi ADP utilizează gradientul electrochimic de protoni ca sursă de energie.

Fig. 4. 16 Localizarea şi componentele lanţului respirator mitocondrial

MatriceaH+ + NADH NAD+ + 2H+ 2H+ + ½ O2 H2O

2 e− – –I Q III IV

+ +4H+ 4H+ 2H+

Spatiul intermembranar

cit c 3H+

F1

Fo

ADP + Pi ATPMatriceaH+ + NADH NAD+ + 2H+ 2H+ + ½ O2 H2O

2 e− – –I Q III IV

+ +4H+ 4H+ 2H+

Spatiul intermembranar

cit c 3H+

F1

Fo

ADP + Pi ATP

75

7.2. Plastidele Plastidele sunt organite celulare care, la fel ca şi mitocondriile şi peroxizomii, nu aparţin sistemului

de endomembrane, având origine şi compoziţie membranară diferită. Plastidele se întâlnesc numai la organismele de tip vegetal (alge, plante verzi) şi au roluri diverse. Rolurile plastidelor se pot rezuma însă la două mai importante:

funcţie de stocare (organite de rezervă) şi

în generarea ATP şi fixarea carbonului anorganic (CO2) sub forma de molecule organice

(glucide)

Pentru că sunt extrem de diverse ca formă, compoziţie de pigmenţi şi roluri, plastidele se pot împărţi astfel: După culoarea lor, dată de diverşi pigmenţi:

- plastide incolore (albe sau leucoplaste); - plastide colorate, cu rol în asimilaţia carbonului anorgani (roşii - rodoplaste, brune – feoplaste şi

verzi - cloroplaste) sau fără rol în asimilaţie (cromoplaste).

În general, plastidele incolore (leucoplastele) pot depozita diferite substanţe:amidonul (amiloplaste), uleiuri (oleoplaste) sau proteine (proteoplaste). În continuare ne vom focaliza doar asupra cloroplastelor, plastide conţinând pigmenţi verzi, clorofilieni, şi care au funcţie energetică. 7.2.1. Structura cloroplastelor În celulele eucariote fotosintetice, energia celulară poate să provină şi din activitatea cloroplastelor. Sunt organite delimitate, ca şi mitocondriile, de două membrane (externă şi internă). În stroma (analoagă matricei mitocondriale) internă, structuri membranare în formă de saci, numiţi tilacoizi, sunt ancorate şi formează agregate (grane). Membrana tilacoidală are echipamentul enzimatic responsabil de transferul electronilor dinspre stroma către lumenul tilacoidal (Fig. 4.16). O ATP sintetază, numita C0C1 ATP-aza, este prezentă în membrană şi cuplează returul protonilor către stromă cu sinteza de ATP

GraneleGranele((teancuriteancuri

de de tilacoizitilacoizi))

GraneleGranele((teancuriteancuri

de de tilacoizitilacoizi))

MembranaMembrana externaexterna

MembranaMembrana internainterna

TilacoidTilacoidTilacoiziTilacoizi stromaticistromatici

SpatiulSpatiul intermembranarintermembranar

TilacoiziTilacoiziLumenulLumenul tilacoiduluitilacoidului

TilacoiziTilacoizi stromaticistromatici

GraneleGranele((teancuriteancuri

de de tilacoizitilacoizi))

GraneleGranele((teancuriteancuri

de de tilacoizitilacoizi))

GraneleGranele((teancuriteancuri

de de tilacoizitilacoizi))

GraneleGranele((teancuriteancuri

de de tilacoizitilacoizi))

MembranaMembrana externaexterna

MembranaMembrana internainterna

TilacoidTilacoidTilacoiziTilacoizi stromaticistromatici

SpatiulSpatiul intermembranarintermembranar

TilacoiziTilacoiziLumenulLumenul tilacoiduluitilacoidului

TilacoiziTilacoizi stromaticistromatici

Fig 4.17. Organizarea internă a unui cloroplast, a granelor şi tilacoizilor.

76

Biologie Celulara

În cursul fotosintezei au loc numeroase reacţii, clasificate în două categorii: A. Reacţii de transfer de electroni, numite şi reacţi la luminã. Energia luminoasă activează un electron al

unui fotosistem în care participă clorofila. Electronul este transmis unui lanţ transportor de electroni din membrana tilacoidală. Principiul de transfer este similar celui din lanţul respirator mitocondrial. Duce la conversia NADP+ în NADPH. Acest proces pompează protoni prin membrana tilacoidă creând un gradient electrochimic de protoni. Forţa proton-motorie formată este responsabilă de sinteza ATP, în stromă, de către C0C1 ATP sintetaza;

B. Reacţii de fixare ale carbonului, numite şi reacţii la întuneric. În cursul acestor reacţii, ATP şi NADPH,

produşi cu ocazia transferului de electroni, servesc ca sursa de energie şi agent reducător pentru a favoriza, printr-un mecanism ciclic, transformarea CO2 în glucide.

Transferul de electroni 

În cursul fotosintezei producerea ATP şi NADPH utilizează lumina solară ca energie iniţială. Când o moleculă de clorofilă este excitată de către un foton, un electron este deplasat de pe un orbital molecular pe altul cu energie mai mare. O astfel de moleculă excitată este instabilă şi va avea tendinţa să revină la starea iniţială cedând un electron cu energie mare unei alte molecule „acceptoare de electroni”. În acelaşi timp va preleva un electron cu energie scăzută de la o alta moleculă „donoare de electroni” cum este apa. Cele două fotosisteme (PSII şi PSI) funcţionează simultan pentru a produce ATP şi NADPH utilizând energie luminoasă. Fosforilarea ADP la ATP se numeşte fotofosforilare.

Fotosistemul II (PSII) preia electroni de la apă pentru a umple golurile create de lumină (fotoni)

într-o moleculă de clorofilă din centrul reactiv P680 (centru care are o moleculă de clorofilă ce absoarbe lumina la 680 nm). Electronii cu energie mare din P680 excitat sunt recuperaţi de moleculele de quinonă care îi transmit unei pompe de protoni, complexul b6f. Acest complex transportă protonii în lumenul tilacoidal şi creează un gradient electrochimic care favorizează sinteza ATP de către ATP sintetaza.

Fotosistemul I (PSI) acceptă electronul pentru a umple golul lăsat în propria moleculă de clorofilă

din centrul reactiv P700 excitat de către alţi fotoni. Fiecare electron care intră în PS I este adus la un nivel de energie foarte ridicat care îi permite să fie transmis ferredoxinei, şi apoi NADP+ pentru a produce NADPH (Fig. 4.17).

Fotofosforilarea este neciclicã când cele două fotosisteme sunt implicate în transferul unui electron de la apă la NADP+. Cloroplastele anumitor specii vegetale pot face să funcţioneze fotosistemul I în mod ciclic, fotofosforilare ciclicã. Electronii cu energie mare proveniţi din ferredoxină sunt cedaţi complexului b6f în locul NADP+ şi deci reciclaţi în fotosistemul I. Rezultatul acestui mod de funcţionare este acumularea de protoni în lumenul tilacoid şi în consecinţă disponibilitatea energiei necesare sintezei ATP. Fotofosforilarea neciclică utilizează cele două fotosisteme şi produce oxigen, ATP şi NADPH, în timp ce fotofosforilarea ciclică utilizează doar fotosistemul I şi generează ATP fără a forma nici NADPH, nici oxigen.

77

Fig. 4. 18. Localizarea şi componentele fotosistemelor şi a lanţului transportor de electroni din

membrana tilacoidala a cloroplastelor

Fotosistemul I Fotosistemul II

Moaraproduce

ATP

Foto

n

Foto

n

Fotosistemul I Fotosistemul II

Moaraproduce

ATP

Foto

n

Foto

n

Fig. 4. 19. Diagrama fotoreacţiilor care au loc în cloroplast

78

Biologie Celulara

Fixarea carbonului 

Reacţia principală de fixare a carbonului este cea dintre CO2 provenit din atmosferă, ribulozo 1,5-bifosfat şi apă cu formare a două molecule de 3-fosfoglicerat. Reacţia este catalizată în stromă de către o enzima abundentă, ribulozo bifosfat carboxilaza. Producerea de ribulozo 1,5-bifosfat necesită o serie de reacţii care consumă NADPH şi ATP. În ciclul de fixare a carbonului (ciclul Calvin-Benson), 3 molecule de ATP şi 2 molecule de NADPH sunt consumate pentru fiecare moleculă de CO2 transformată. În stromă, acest ciclu duce la formarea de gliceraldehid-3-fosfat. Acesta se va acumula în stromă sau va fi exportat în citosol pentru a fi transformat într-un dizaharid numit zaharoză, care reprezintă principala formă de transport a glucidelor în celulele vegetale.

MATERIAL S Genomul cloroEste un ADN aproximativ 20fotosistemelor mitocondria, cloProvine mereucodificăte de ge

Energie solara

Cloroplast[CH2O]zaharuri

CiclulCalvinFotoreactii

O2

H2O CO2

Energie solara

Cloroplast[CH2O]zaharuri

CiclulCalvinFotoreactii

O2

H2O CO2

Fig. 4. 20. Relaţia dintre fotoreacţiile ce au loc în tilacoizi şi ciclul Calvin care are loc în stroma cloroplastului

UPLIMENTAR

plastului circular, cu mărime de 120-200 kpb. Codifică molecule de ARNr, 30 molecule de ARNt, de proteine ribozomale cloroplastice, subunităţi ale ARN polimerazei, mai multe proteine ale I şi II, subunităţi ale ATP sintetazei şi subunitatea mare a ribulozo difosfat carboxilazei. Ca şi roplastul nu este niciodată sintetizat de novo.

din cloroplaste preexistente. Multe subunităţi proteice sunt produse în citosol (sunt proteine nomul nuclear) şi importate în diferite compartimente cloroplastice.

79

8. Peroxizomii Peroxizomii sunt structuri membranare mici, de aproximativ

0,2-1 µm diametru şi care au o localizare citosolică, unde plutesc liberi (Fig. 4.21). Ele se găsesc exclusiv în celulele eucariote de tip animal şi vegetal. Spre deosebire de mitocondrii şi plastide, peroxizomii sunt înconjuraţi de o singură membrană lipidică în care există numeroase proteine membranare importante, şi care delimitează un spaţiu (lumen) peroxizomal umplut cu enzime oxidative

Importul proteinelor peroxizomale 

Peroxizomii nu conţin ADN, ARN sau ribozomi proprii. Toate proteinele peroxizomale sunt codificăte în ADN din nucleu şi sunt sintetizate fie în ribozomii liberi din citosol, fie în cei ataşaţi de RER. Toate proteinele destinate lumenului peroxizomal prezintă două secvenţe-semnal: de tipul 1 (PTS1) sau de tipul 2, PTS2. PTS1 este, de departe, cel mai comun peptid-semnal, fiind prezent în aproximativ 95% din enzimele destinate peroxizomilor. Secvenţele-

semnal sunt recunoscute de receptori (peroxine). Peroxinele recunosc şi transportă acele proteine ce prezintă secvenţa-semnal adecvată. Odată ajunse la nivelul membranei peroxizomale, primul set de peroxine cedează încărcătura de proteine unui al doilea set de peroxine care le transportă în lumenul peroxizomal.

Fig. 4.21. Aspectul electronomicroscopic al peroxizomilor.

Rolul peroxizomilor  Peroxizomii sunt organite vitale celulelor animale deoarece participă în beta-oxidarea acizilor graşi, generând energie şi precursori pentru unele căi biosintetice. Deşi în mitocondrii au loc procese de beta-oxidare a AG, acolo sunt metabolizaţi doar AG cu lanţuri scurte (cu mai puţin de 20C). În peroxizomi sunt degradaţi AG cu lanţuri lungi şi unii AG ramificaţi utilizându-se oxigen molecular prin intermediul oxidazelor (D-aminoacid-oxidaze şi ureat-oxidaza). Din aceste procese rezultă compuşi cu moleculă mică, energie dar şi peroxid de hidrogen (H2O2). Dar peroxizomii au echipamentul enzimatic necesar (catalaze) pentru conversia peroxidului la apă şi oxigen molecular. În urma ruperii secvenţiale a unei perechi de atomi de C, din beta-oxidarea AG rezultă acetil CoA (coenzima A) care este apoi eliberată în citosol-

Peroxizomii degradează molecule toxice la compuşi netoxici. Au rol în formarea colesterolului, acizilor biliari, plasmalogenilor şi fosfolipidelor. La plante, peroxizomii realizează două funcţii esenţiale:

în germinarea seminţelor, când peroxizomi speciali numiţi glioxizomi convertesc AG şi lipide în zaharide prin intermediul ciclului acidului glioxilic. Această cale permite seminţelor să utilizeze AG (stocaţi sub forma picăturilor de ulei în plastide precum oleoplastele) ca sursă de creştere până când planta devine capabilă de fotosinteză şi asimilaţia carbonului.

în decursul fotosintezei, adăpostind reacţii biochimice în urma cărora se reciclează carbonul asimilat.

Bibliografie VOICULEŢ, N., PUIU, L., Biologia moleculară a celulei, Editura ALL, Bucureşti, 1997, p. 56-164 MIXICH, F., Biologie celulară şi moleculară, Editura Sitech, 1997, p. 232-271

80

Biologie Celulara

Capitolul 5. Citoscheletul şi motilitatea celulară itoscheletul formează o retea complexă de filamente şi tubuli care se întinde în toată citoplasma (Fig. 5.1.). Faţă de

scheletul osos care este rigid, citoscheletul este o structură foarte dinamică. El se reorganizează continuu în timpul diferitelor evenimente celulare (mişcarea celulară, diviziune, etc.). Toate elementele citoscheletului (filamente de actină, filamente intermediare şi microtubuli) sunt structuri proteice alungite care rezultă prin polimerizarea structurilor monomere.

C 200 nm200 nm

Trei tipuri principale de structuri proteice constituie citoscheletul:

1. Filamentele de actina (microfilamente), 2. Filamentele intermediare şi 3. Microtubulii.

Fig. 5.1. Aspectul

Funcţiile îndeplinite de citoschelet sunt: a) Asigură forma celulei şi forţele necesare mişcării aces

importantă mai ales pentru celula animală care nu pspecializate, elemente ale citoscheletul asigură forma premicrovililor, prelungiri ale celulele intestinale);

b) La mobilitatea organismelor unicelulare prevăzute citoscheletului alcătuind structurile de mişcare;

c) Participă la fixarea organitelor celulare în poziţii favorabd) Serveşte ca mijloc de transport pentru veziculele secret

sau şinelor de tren; e) Participă în diviziunea celulară.

În continuare prezentăm o schemă simplificată a rolurilor citoschele

CITOSCHELET (filamente de actină,

intermediare, microtubuli)

Suport Motilitatea celulară (în alcătuirea cililor şi flagelilor)

Diviziunea celulară (în alcătuirea fusului de diviziu

Cele 3 tipuri de componente ale citoscheletului sunt poziţion

în cadrul celulei. Astfel, filamentele de actină sunt localizate la (membrana plasmatică). Filamentele intermediare au localizare dubnucleului, pe faţa nucleară a anvelopei, iar o altă parte ocupă aproaaspectul unei reţele radiare cu originea într-un punct al celulei,“centrozom” (Fig. 5.2.)

electronomicroscopic al citoscheletului.

teia, constituind un suport, proprietate rezintă perete extern. În unele celule lungirilor celulare (de exemplu în cazul

cu cili sau flageli, elemente ale

ile exercitării funcţiilor lor; oare, asemănător cablurilor de funicular

tului în viaţa celulei eucariote.

pentru organitele celulare

ne)

ate diferit şi îndeplinesc funcţii diferite periferia celulei, sub învelişul celular lă, o parte sunt distribuite în interiorul pe tot volumul celular. Microtubulii au originea fiind într-un organit numit

81

C A B

Fig. 5.2. Localizarea celulară şi aspectul în microscopie de fluorescenţă al diferitelor structuri citoscheletice: filamente de actină (A), intermediare (B) şi microtubulii (C)

5.1. (Micro)filamentele de actină 5.1.1. Structura actinei 

În numeroase celule animale actina este proteina cea mai abundentă (contribuind cu cel puţin 5% la masa proteică totală). Filamentele de actină formează structuri dinamice care sunt mai mult sau mai puţin stabile prin asociere cu alte proteine. De exemplu, formele stabilizate se găsesc în microvili (Fig. 5.3) şi celulele musculare. Actina este o proteină care leagă ATP şi are două extremităţi numite poli (pozitiv şi negativ).

S-au identificat trei clase de actine: a) α-actina în celulele musculare (striate şi netede); b) β-actina (patru forme); c) γ-actina. Ultimele două clase se găsesc în celulele ne-musculare. Diversitatea moleculară dintre diferitele

tipuri de actină este foarte mică, acestea având peste 90% identitate de secvenţă. Proteinele de legatură, cu rol important în polimerizare şi stabilizarea filamentelor de actină, pot permite cuplarea filamentelor între ele şi iniţierea mişcării. 5.1.2. Polimerizarea actinei 

Actina polimerizează (în prezenta ATP) într-o elice strânsă de 5-9 nm diametru, formând un filament flexibil şi polar (Fig. 5.3.a). Microfilamentele de actină sau actina F (7 nm în diametru) rezultă din polimerizarea actinei G, cea mai abundentă dintre proteinele citoscheletice în numeroase celule eucariote. Filamentele de actină prezintă o extremitate (+) cu creştere rapidă şi o extremitate (-) stabilă.

Polimerizarea actinei pure în vitro necesită prezenţa ATP, a cationilor monovalenţi (K+) şi divalenţi (Mg2+). Filamentele de actină se constituie în trei faze (Fig. 5.3.b):

82

Biologie Celulara

1) O perioadă latentă, (de “nucleaţie”) în care actina G se agregă lent în oligomeri scurţi şi instabili. Un oligomer care a atins o anumită lungime devine centru de nucleaţie. S-a constatat că structura care acţionează ca centru de nucleaţie este un trimer de actină G.

2) În faza următoare nucleaţiei, noi monomeri se adaugă cu o rată exponenţială centrelor de nucleaţie. Filamentul de actină creşte concomitent la ambele capete. Faza de elongare este amplificată şi de clivarea întâmplătoare şi spontană a filamentelor care cresc, generând mai multe extremităţi de filamente, care se comportă la rândul lor ca centre de nucleaţie pentru elongare.

3) În ultima fază, filamentele de actină intră în starea de echilibru dinamic. Pe durata elongării, concentraţia de monomeri de actină G scade până când atinge un echilibru cu filamentele. Starea de echilibru este dinamică deoarece masa filamentului de actină nu se schimbă deorece la un capăt are loc adăugarea de monomeri iar la celălalt, monomerii se desprind. Concentraţia de echilibru a monomerilor de actină se numeşte concentraţie critică (Cc). în vitro, Cc este de 0,1 µM; peste această valoare o soluţie de actină va polimeriza, sub această valoare va avea loc depolimerizarea actinei F.

(a)

Actina GNucleaţie

Centru de nucleaţie Cen

Pol (+)

Pol (+)Pol (-)

Pol (-)

Proteinǎ de acoperire

Proteinǎ de acoperire

Actina GNucleaţie

Centru de nucleaţie Cen

Pol (+)

Pol (+)Pol (-)

Pol (-)

Proteinǎ de acoperire

Proteinǎ de acoperire

Fig. 5.3. Aspectul helicoidal al filamentului decreşterea inegală la cele

Polimerizarea actinei este favorabilă

creştere, monomerii hidrolizează lent ATP la paralel cu eliberarea ADP şi Pi din situsul polimerizare deoarece s-a constatat experimnehidrolizabil, poate polimeriza.  

Filament de actină

tru de nucleaţie

Actina F

Elongaţie Stare de echilibru

Pol ( - ) Pol ( + )

Centru de nucleaţie

Actina F

tru de nucleaţie

Actina F

Elongaţie Stare de echilibru

Pol ( - ) Pol ( + )

Centru de nucleaţie

Actina F

Elongare (b)

(c)

actină (a), principalele etape ale polimerizării actinei (b) şi două extremităţi a filamentului de actină (c)

monomerilor legaţi de ATP. Odată adăugaţi filamentului în ADP şi fosfat anorganic (Pi). Detaşarea actinei G se face în de legare. Totuşi, hidroliza ATP un este necesară pentru ental că şi monomeri legaţi la ADP sau la un analog

83

Polaritatea structurală a filamentelor de actină Aşa cum s-a menţionat anterior, filamentele de actină prezintă o extremitate (cap, pol) negativă, cu o

rată de polimerizare mult mai mică (5-10 ori) decât cea de la extremitatea pozitivă. Această diferenţă în viteza de elongare a extremităţilor opuse ale filamentelor de actină este determinată de o diferenţă între concentraţiile critice caracteristice fiecărui pol. În mod normal, în celule capetele filamentelor de actină un se găasesc în stare liberă ci sunt “blocate” de prezenţa unor proteine de acoperire (“caping proteins”). Dacă proteina de acoperire este prezentă la extremitatea (-), alungirea filamentului se face la extremitatea (+) şi invers. Dispunerea proteinelor de acoperire la cele două capete este în fun. de concentraţia critică specifică fiecărei extremităţi astfel: dacă Cc este între 0,1 şi 0,6 µM, proteina de acoperire se localizează la capătul (-) iar polimerizarea are loc la cel (+). Dacă Cc excede valoarea de 0,6 µM (sau 0,8 µM după unele surse), filamentul creşte la ambele capete. Dacă Cc este sub 0,1 µM actină G, filamentul nu mai creşte (Fig. 5.3.c).

Diferenţa între concentraţiile critice de la extremităţile filamentelor de actină conduce la un comportament dinamic cunoscut sub numele de “covor rulant” (Fig. 5.4.). Când concentraţia critică de actină G este între Cc specifică polului (+) şi cel (-), monomerii desprinşi de la capătul (-) se vor adăuga la cel (+). Apoi, monomerii adăugaţi la capătul (+) vor “străbate” filamentul pe toată lungimea lui până la extremitatea opusă unde se disociază.

Fig. 5.4. Comportamentul de covor rulant al filamentului de actină atunci când

(-) (+)

Cc (+) < concentraţia de actină G < Cc (-) În celulă, fenomenal covorului rulant este diminuta de prezenţa proteinelor de acoperire care

blochează tranzitoriu extremităţile filamentelor de actină, împiedicănd ataşarea sau disocierea actinei G.

Proteine reglatoare ale polimerizării actinei Asamblarea filamentelor de actină în celule un este un proces întâmplător. Dacă prin experimentele

în vitro, polimerizarea actinei se produce spontan în condiţii propice de concentraţie de monomeri şi compoziţie ionică, în vivo există mecanismo care controlează procesal de polimerizare a actinei, în fun. De necesităţile celulei. Aceste mecanisme sunt realizate în principal sub controlul a două proteine: timozina β4 şi profilina.

Timozina β4 este o proteină mică (5 kDa) şi formează un complex 1:1 cu actina G care devine astfel incapabilă de polimerizare. Complexul 1:1 se găseşte în echilibru cu timozina liberă, cu actina G liberă şi cu actina F. Mecanismul de sechestrare a actinei G de către timozină ar putea constă fie în blocarea situsului de legare la actina F, fie prin legarea de ADP ataşat la actină, inhibând schimbul ADP-ATP necesar asamblării monomerilor.

Profilina (15 kDa) se întâlneşte în toate celulele eucariote, în concentraţii mai mici decât timozina. Ea formează de asemenea, un complex 1:1 cu actina G, dar spre deosebire de timozină, un blochează situsul de legare a ATP. Profilina concurează timozina pentru complexarea actinei G, iar complexul profilină-actină G-ATP este favorabil polimerizării. În condiţii staţionare, o mare parte a profilinei se află în stare legată de fosfatidil inozitol trifosfat (PIP2), precursor al inozitol trifosfatului (IP3) care este un mesager secundar cu localizare membranară. Ca răspuns la un stimul extern, PIP2 este hidrolizat la IP3, eliberând profilina. Ca urmare, profilina scoate monomerii de actină G din complexele timozină-actină G şi permite polimerizarea lor.

84

Biologie Celulara

Aşadar, ca urmare a unui semnal extern, în celulă se poate declanşa formarea (polimerizarea) filamentelor de actină, a căror capete (+) se află în apropierea feţei citosolice a membranei plasmatice (Fig. 5.5).

Stimul extern

ATP ADP

-ADP -ATP

(+) (-)

Faţa citosolică a membranei plasmatice

Legendă:

IP3Monomer liber de actină G

PIP2

Timozină:actină G Profilină:actină G

Fig. 5.5. Iniţierea polimerizării actinei la nivelul membranei plasmatice, ca urmare a unui stimul extern Proteine de fragmentare şi acoperire a filamentelor de actină  Filamentele de actină pot fi clivate în fragmente mai scurte de către gelsolină. În urma fragmentării, gelsolina rămâne ataşată la extremitatea (+) a filamentului şi împiedică polimerizarea acestuia. Polul (-) rămâne liber în acest caz. Mecanismul de activare al gelsolinei şi a altor proteine de acoperire se realizează pe căile de semnalizare celulară, prin intermediul ionilor de Ca2+ şi a PIP2. S-a observat de exemplu, că depăşirea nivelelor de repaus ale calciului, activează fragmentarea şi acoperirea filamentelor de actină. Prin fragmentarea microfilamentelor, citoplasma celulelor eucariote poate trece dîntr-o stare mai vâscoasă într-una mai fluidă, cu apariţia curenţilor citoplasmatici. Rolul curenţilor citoplasmatici este acela de distribuire uniformă a organitelor celulare şi a metaboliţilor. Mai mult, lichefierea citoplasmei din apropierea membranelor permit fuziunea acestora, cu rol important, de exemplu la celulele macrofage din sistemul imunitar. Fagosomii rezultaţi prin ingerarea unui microorganism de către macrofag sunt iniţial înconjuraţi de microfilamente de actină cu rol stabilizator. Pentru ca fagosomii să fuzioneze cu lizosomii, filamentele de actină sunt fragmentate, probabil ca urmare a unor creşteri locale ale concentraţiei de Ca2+. O altă categorie de proteine nu fragmentează actina F ci blochează polimerizarea să prin ataşarea la extremitatea (+). Aceste proteine se numesc de acoperire şi funcţionează independent de concentraţia Ca2+. Proteine precum CapZ intermediază stabilizarea actinei pe membrana plasmatică a celulelor. CapZ a fost pentru prima oară identificată în celulele musculare, unde are rol de ancorare a filamentelor de actină la nivelul membranei Z a sarcomerului din muşchi. Ulterior a fost evidenţiată şi în celule nemusculare. Tropomodulina este tot o proteină ce acoperă extremitatea (-) a filamentelor de actină atât în celulele musculare cât şi reţeaua membranară a celulelor roşii sangvine. Prin proprietăţile prezentate mai sus, proteinele de acoperire au rolul de a stabiliza reţeaua de actină acolo unde este necesar ca organizarea citoscheletului să rămână neschimbată.

85

Proteine de legare a actinei: organizarea filamentelor de actină în fascicule şi rețele  Filamentele individuale de actină sunt asamblate în două tipuri de structuri numite fascicule, respectiv reţele de actină (Fig. 5.6).

Domeniu de legare a Ca2+

ABD

Monomer de fimbrină

Fig. 5.5. Asocierea actinei sexemplu,α

Pentru a forma fascicdispuse paralel (Fig. 5.5.A). Îşi sunt legate mai lax, prin lstarea de gelificare a citoplaproteine de legare a actinei proteine ale fasciculului de acprezintă domenii similare de l  (1) Dintre proteinele Fimbrina este o protdomain) apropiate, situate pefascicule dense în microvilii adeziune. α-actinina se întâlnerăspunzătoire de formarea unofilopodiilor şi lamelipodiilor, î Alte proteine care con  (2) Dintre proteinele Filamina este un dime“capsarea” împreună a două dispuse la extremităţile opusStarea de gel determinată de r

A B

ABD

C

Dimer de filamină

ABD

Domenii de dimerizare

Dimer de α-actinină

ub formă de fascicule (prin intermediul unor legături transversale datorate de - actininei) (A) sau reţele (prin intermediul filaminelor)(B)

ule, filamentele de actină sunt strâns legate prin punţi transversale proteice, n reţele, filamentele de actină sunt dispuse în zig-zag, adesea în unghiuri drepte egături proteice transversale (Fig. 5.5.B). Prezenţa reţelelor de actină induce smei. Formarea legăturilor dintre filamentele de actină este intermedată de (“actin cross-linking proteins”). Aceste proteine aparţin la două clase majore: tină şi proteine de gelificare (ale reţelei de actină). Ambele tipuri de proteine

egare la actină.  fasciculului de actină cele mai răspândite sunt fimbrina şi α‐actinina. eină de legare mică, cu două domenii de legare la actină (ABD, actin-binding acelaşi lanţ polipeptidic (fig. 5.5.C). Este răspunzătoare de formarea unor celulelor intestinale (Fig. 5.6), în stereocili (microvili specializaţi) şi plăci de

şte sub formă de dimeri, domeniile de legare la actină fiind situate opus. Este r fascicule mai laxe, cu fun. contráctil. Este abundentă în pseudopode (de tipul n fibrele de stress, plăci de adeziune. tribuie la formarea fasciculelor de actină sunt vilina, spectrina şi distrofina.  care participă la formarea rețelelor de actină amintim filamina. r proteic fexibil care promovează formarea unei citoplasme laxe, gelificate prin

filamente de actină, într-un unghi aproape drept (Fig. 5.5.B şi C). ABD sunt e domeniilor de dimerizare, molécula de filamină având forma literei “V”. eţelele de actină cu filamină este necesară extinderii membranelor celulere sub

86

Biologie Celulara

forma unor proiecţii laminare (lamelipodii). Lamelipodiile ajută la deplasarea prin târâre a celulelor pe suprafeţe solide. Pierderea de exemplu a filaminelor în unele celule canceroase (precum celulele de melanom) împiedică migrarea acestora în alte regiuni, deci un risc mai mic de metastazare.

egiuneRed

iune amorfa,

Cfi

Mp

Bl

fi

egiuneRed

iune amorfa,

Cfi

Mp

Bl

fi

Fig. 5.6. Fasciculele dense de a

Asocierea actinei cu miozinaÎn muschiul scheletic, f

familie de proteine care convealunecare în lungul filamentelo Structura miozinelor

Miozinele sunt proteine Există mai mai multe ti

şi V sunt implicate în interaccontracţia musculară. Toate mi

- domeniul capului, cunumeşte “lanţul greu” a

- gâtul, cu formă α-helcapabilă să lege calciuformează aşa-numitul “

- domeniul cozii care informa unui model α-he

Miozina I este un monom

membrană.

RgRg

0.25 µm

Microvili

Membrana plasmatica

Filamente de actina

Filamente intermediare

Figure 6.26 0.25 µm

Microvili

Membrana plasmatica

Filamente de actina

Filamente intermediare

Figure 6.26 0.25 µm

Microvili

Membrana plasmatica

Filamente de actina

Filamente intermediare

0.25 µm

Microvili

Membrana plasmatica

Filamente de actina

Filamente intermediare

Microvili

Membrana plasmatica

Filamente de actina

Filamente intermediare

Figure 6.26

amorfa, dens colorataens colorata

apatul (+) al amentului de

actinal

embranaasmatical

aI

rate de ancorareterala (miozina, calmodulina)

Legaturi din mbrina si vilina

amorfa, dens colorataens colorata

apatul (+) al amentului de

actinal

embranaasmatical

aI

rate de ancorareterala (miozina, calmodulina)

Legaturi din mbrina si vilina

ctină rigidizează microvilii, prelungiri apicale din celule intestinale, cu rol în creşterea suprafeţei de absorbţie a nutrienţilor.

: contracția musculară şi inelul contractil ilamentele de actină sunt asociate cu filamentele de miozină. Miozinele sunt o rtesc energia ATP pentru a-şi schimba conformaţia pentru a se deplasa prin r de actină.

motorii care cuplează hidroliza ATP cu deplasarea.

puri de miozine din care trei, I, II şi V sunt mai bine caracterizate. Miozinele I ţiunile dintre citoschelet şi membrană în timp ce miozina II face posibilă ozinele prezintă trei domenii diferite structural şi funcţional: situsuri de legare a ATP şi actinei, generator al forţei de mişcare, se mai l miozinei; icală, reglează activitatea capului. La nivelul ei se ataşează o altă proteină l, calmodulina şi o proteină de reglare a calmodulinei. Aceste subunităţi lanţ uşor” al miozinei. termediază ataşarea la membrană sau la alte miozine. Coada este răsucită sub lical. (Fig. 5.7).

er cu un domeniu motor (cap) unic şi un domeniu caudal scurt, de legare de

87

Miozina V se prezintă ca un dimer, la fel ca miozina II, cu două capete (lanţuri grele) dar cu un gât mai lung şi cu o regiune caudală mai scurtă decât cea a miozinei II. Domeniul cozii se termină cu o regiune globulară. Domeniul cozii gât cap

Domeniul motor al făcând miozina VI. M

(-)

Organit delimitatde membrana

(-)

Organit delimitatde membrana

Miozina II,nivelul cozilor cu aîn filamente miozin(“filamente subţiri”rezultă o structură uşi subţiri dintre doMiofibrilele sunt diformată din până la

Contracţiade actină (Fig. 5.11miozinice, ele sunt(respectiv procesul d

Miozina V

Lanturi usoare

Domeniul cozii, rasucit α -helical

Miozina I

Miozina II

Lanturi grele, domeniul motor

Lanturi usoareDomeniu motor unic

Miozina V

Lanturi usoare

Domeniul cozii, rasucit α -helical

Miozina I

Miozina II

Lanturi grele, domeniul motor

Lanturi usoareDomeniu motor unic

Fig. 5.7. Structura miozinelor II, I şi V

miozinelor se deplasează de-a lungul filamentului de actină, spre capătul plus, excepţie işcarea este dependentă de ATP.

(+)(+)

Miozinele I, V şi VI se asociază cu membranele organitelor celulare şi membrana plasmatică având un rol în transportul vezicular. Fig. 5.8. Deplasarea miozinei V de-a lungul filamentului de actină, spre polul (+) al acestuia. Domeniile globulare ale miozinei V sunt asociate cu o structură membranară, în timp ce domeniile motoare (capetele) interacţionează cu actina.

molecula prezentă în muşchi, se asociază în dimeri (Fig. 5.7) care apoi interacţionează la lţi dimeri de miozină II (Fig. 5.9). Dimerii de miozină II se grupează în celula musculară ice numite “filamente groase”. Capetele miozinice interacţionează cu filamente de actină ) fixate cu extremitatea (+) pe o structură de ancorare denumită “discul Z”. În acest fel nică, specifică celulei musculare, sarcomerul. Sarcomerul (totalitatea filamentelor groase uă discuri Z) este o unitate repetată a unei structuri numite miofibrilă (Fig. 5.10). spuse liniar şi paralel între ele, pe toată lungimea fibrei musculare. O miofibrilă poate fi 100 de mii de sarcomere şi are un diametru de 1-2 µm. este rezultatul alunecării capetelor miozinei în urma hidrolizei ATP pe filamentele subţiri şi 5. 12). Datorită faptului că actinele sunt ancorate în discul Z, prin flexia capetelor obligate să se mişte, fenomen evidenţiat de apropierea discurilor Z din miofibrile e “scurtare” a sarcomerelor).

88

Biologie Celulara

Capetele miozinei IICapetele miozinei II

Fig. 5.9. Asocierea d

A

Fig. 5.10. Organizar

Filament subtireFilament subtire

Fig. 5.11. Aspectul scasociază c

Fig. 5.12. În urma h

determ

Cozile miozinei II

Zona clarǎ

Cozile miozinei II

Zona clarǎ

imerilor de miozină II la nivelul cozilor pentru a forma “filamentele groase” ale

sarcomerului.

Sarcomer

B

ea celulei musculare cu miofibrile (A), respectiv aspectul electronomicroscopic al miofibrilei şi sarcomerelor (B).

RelaxareMiozina ActinaActina

RelaxareMiozina ActinaActinaFilament grosFilament gros

Contractie

Banda A

Banda A

Banda IBanda I

Disc ZContractie

Banda A

Banda A

Banda IBanda I

Disc Z

Disc ZDisc Z

hematic al unui sarcomer relaxat şi în contracţie: filamentele groase de miozină se u filamentele subţiri de actină care sunt ancorate la nivelul discului Z..

+) actina (−)+) actina (−)

idroinîn

((

(−) actina (+)

miozina II

(−) actina (+)

miozina II

lizei ATP, capetele miozinice tind să se deplaseze spre polul (+) al actinelor d deplasarea filamentelor de actină şi apropierea discurilor Z

89

Mai jos redăm un tabel cuprinzând o serie de proteine întâlnite în muşchii sceheltici.

Tabel.5.1. Proteinele majore din muşchiul scheletic al vertebratelor

Proteina Masa moleculară (kDa)

Funcţie

Actina 42 Componenta majoră a filamentelor groase Miozina 510 Componenta majoră a filamentelor subţiri Tropomiozina 64 Se leagă de-a lungul filamentelor subţiri Troponina 78 Poziţionată la intervale regulate de-a lungul filamentelor

subţiri; mediază reglarea contracţiei de către Ca2+

Titina 2500 Leagă filamentele groase de discul Z Nebulina 700 Leagă filamentele subţiri de discul Z Miomezina 185 Proteină legată de miozină şi prezentă la nivelul liniei M a

filamentelor groase α-actinina 190 Leagă transversal filamentele şi le ataşează de discul Z Ca2+- ATPaza 115 Proteină majoră în reticulul sarcoplasmic (RS) şi intervine

în relaxarea muşchiului prin transportul Ca2+ în lumenul RS

CapZ 68 Ataşează filamentele de actină la discul Z Tropomodulina 41 Menţine lungimea şi stabilitatea filamentelor subţiri

Rolul actinei în citocinezã 

La sfârsitul mitozei, după ce cromozomii s-au separat graţie microtubulilor (telofaza), filamentele de actină se asociază cu miozina II şi formează la periferia celulei şi perpendicular pe axul fusului mitotic un fascicul contractil numit inel contractil. Când inelul se contractă, el separă celula mamă în două celule fiice (citocineza). Funcțiile filamentelor de actină: 

- stabilizează membranele celulare (plasmatică, nucleară, etc); - realizează polarizarea celulei; - în formarea şi stabilizarea microvililor, axonilor şi altor prelungiri celulare; - în ancorarea organitelor celulare; - în transportul vezicular în asociaţie cu miozina I şi V; - în fagocitoză, endo- şi exocitoză; - în mobilitatea celulară, participând la formarea pseudopodelor; - în contracţia musculară în asociaţie cu miozina II - în diviziunea celulară, în asociaţie cu miozina II;

FA FI MicrotubuliFA FI Microtubuli

5.2. Filamentele intermediare Structura filamentelor intermediare 

Filamentele intermediare sunt polimeri proteici rezistenti şi durabili cu un diametru de 10 nm, prezenţi în citoplasma majorităţii celulelor. Se numesc intermediare pentru că diametrul lor aparent este cuprins între cel al filamentelor de actină (microfilamente) şi microtubuli (Fig. 5.13). În majoritatea celulelor, o reţea extensivă de filamente intermediare înconjoară nucleul şi se întinde până la periferia celulei. Sunt legate şi cu desmozomii şi hemidesmozomii. Fig. 5. 13. Comparaţie a

dimensiunilor celor 3 tipuri de filamente

Polimerizarea filamentelor intermediare Faţă de actină şi tubulină, care sunt proteine globulare, tipurile

proteice din constituţia filamentelor intermediare sunt molecule fibroase

90

Biologie Celulara

foarte alungite. Secvenţa lor de aminoacizi favorizează formarea dimerilor superrăsuciţi (Fig. 5.14.B). În timpul asamblării, doi dimeri foarte răsuciţi se asociază antiparalel pentru a forma o subunitate tetrameră numită protofilament (3 nm în diametru) (C). Tetramerii se alatură unui filament intermediar în curs de alungire (D) şi opt astfel de protofilamente formează filamentul intermediar cu diametrul de 10 nm (E) Componentele filamentelor intermediare se găsesc rar în stare liberă (monomeri). Procesul de asamblare sau disociere a filamentului este un proces lent care poate avea loc într-un interval de câteva minute, în timp ce actina şi tubulina necesită pentru asociere numai câteva secunde.

Doi tetrameri asamblati: filament intermediar in curs de alungire

Tetramer asamblat din doi dimeri superrasuciti

Dimer superrasucit

Regiunea α helicala a monomerului

Funcțiile filamentelor intermediare 

Fig. 5.14. Structura filamentelor intermediare

Opt tetrameri rasuciti pentru a forma un filament intermediar

Roluri importante sunt realizate de filamentele intermediare, şi anume: a) Rol în ciclul şi diviziunea celularã b) Susţinerea învelişului nuclear c) Rol structural

Reţeaua de filamente intermediare dublează faţa internă a învelisului nuclear şi formează lamina nucleara, un strat protector intern al anvelopei nucleare. Lamina susţine învelisul nuclear şi dă nucleului o formă stabilă, în general, globulară. În timpul mitozei, lamina nucleară se dezorganizează datorită fosforilării componentelor (fosforilare realizată de către un complex kinazic ciclinăB / Cdk1). Dezintegrarea să permite

91

intrarea în acţiune a unui alt tip de elemente citoscheletice, microtubulii, care participă la formarea fusului şi separarea cromozomilor.

Foarte stabile în celulă, filamentele intermediare au un rol structural şi sunt frecvent asociate cu microtubulii. Proteinele din constituţia lor sunt toate molecule fibroase cu un domeniu central cilindric. Aceste proteine formeaza homo- sau heterodimeri care se asambleaza elicoidal. Expresia genica depinde de tesut, şi de aceea aceste proteine sunt divizate în mai multe clase precum în Tabelul de mai jos :

Tabel 5.2. Principalele grupe de filamente intermediare, localizarea şi funcţiile lor

Clasa Proteina Localizare şi rol I şi II Keratine (acide, I şi

bazice, II) piele şi fanere (păr, unghii, etc.) unde este majoritară; participă la formarea desmozomilor şi hemidesmozomilor, formează o reţea flexibilă şi rezistentă furnizând suportul structural al epiteliului

III Neurofilamente (uşoare NF-L, medii, NF-M şi grele NF-H)

axonii celulelor neuronale ; rol de susţinere mecanică şi asigură calibrul axonilor din nervii periferici

Vimentine celule endoteliale ale vaselor sanguine, fibroblaste şi leucocite ; fibrele de vimentină se termină adesea pe membrana nucleară şi pe desomozomii şi hemidesomzomii membranei plasmatice (rol în ancorarea organitelor celulare)

Desmine Celule musculare; rol în legarea fibrelor musculare în fascicule şi în stabilizarea sarcomerului în timpul contracţiei musculare

IV

Filamente gliale Neuroni şi astrocite.

V Lamine (A, B şi C) Nucleu (formând lamina nucleară); cu rol în menţinerea integrităţii anvelopei nucleare în decursul ciclului celular

VI Nestina Celulele stem ale sistemului nervos central

5.3. Microtubulii Structura microtubulilor 

Microtubulii sunt bine reprezentaţi în celulele eucariote, şi mai ales în celulele nervoase unde reprezintă 10-20% din proteinele totale. Microtubulii sunt structuri extrem de dinamice, formate din molecule de tubulină, heterodimeri rezultaţi prin asocierea a două polipeptide globulare, α-tubulina şi β-tubulina.

Un microtubul este o structură cilindrică, goală în interior, constituită din 13 protofilamente. Protofilamentele sunt compuse dîntr-o alternanţă de subunităţi de α şi β-tubulină, asamblate cu

aceeaşi polaritate (Fig. 5.15.).

β α α β α β α β (-) (+)

Heterodimerul α, β tubulină Protofilament

Fig. 5.15. Structura heterodimerică a tubulinei şi asocierea în protofilamente cu capete (+) şi (-)

Subunităţile α şi β au situsuri de legare ale GTP (α) respectiv GTP şi GDP (β). Subunitatea β cu GTP legat, tinde să se ataşeze de o moleculă de α tubulină. După ataşare, are loc hidroliza GTP la GDP +Pi. GTP legat la α tubulină nu poate fi hidrolizat din cauza unor constrângeri structurale ale .α tubulinei Asamblarea microtubulilor 

Microtubulii rezultati prin asamblarea paralela a protofilamentelor sunt structuri polare cu o extremitate (+) capabilă de creştere rapidă şi o extremitate (-) care tinde să disocieze dacă nu este stabilizată. Stabilizarea extremităţilor (-) se efectuează graţie ancorării în centrozom, situat în proximitatea nucleului.

92

Biologie Celulara

Extremitatea (+) este acum liberă să se lungească prin adăugarea tubulinei (Fig. 5.16). Aceste structuri sunt extrem de labile şi într-o celulă funcţiile microtubulilor depind în parte de această stabilitate.

(-)

24 nm

(+)

-GDP

-GDP

GTP-

-GTP -GTP

-GDP

GDP

GTP

(A) (B)

Fig. 5.16. Structura (A) şi asamblarea (B) microtubulului. Microtubulul are capete (+) şi (-) şi este

format din 13 protofilamente care delimitează un spaţiu interior, gol. La capătul dinamic (+) are loc ataşarea tubulinei cu GTP în ambele subunităţi, în vreme ce la capătul (-), are loc desprinderea tubulinei

care conţine subunitatea β cu GDP, Un alcaloid de tipul colchicinei împiedică polimerizarea microtubulilor (este utilizată pentru a bloca

celulele în diviziune în metafază), în timp ce taxolul îi stabilizează. Extremitatea cu crestere rapidă (plus) este liberă, în timp ce extremitatea minus este, cel mai adesea,

prinsă într-un centru de organizare microtubulară (MTOC). Un astfel de MTOC este şi centrozomul celular. Centrozomul este un complex proteic organizat în jurul a două structuri numite centrioli (Fig. 5.17). Centriolii conţin mai multe forme de tubulină (α, β, γ, δ şi ε). Ei sunt formaţi din două structuri cilindrice, scurte, dispuse perpendicular una pe cealaltă. Fiecare cilindru este format din 9 triplete de microtubuli. În jurul centriolilor se află dispersate tubuline γ, δ şi ε, necesare nucleaţiei microtubulilor. Fiecare celulă conţine un centrozom format dîntr-o singură pereche de centrioli. La începutul diviziunii celulare, centriolii se replică rezultând două perechi de centrioli cu rol în formarea polilor fusului de diviziune şi organizarea fusului mitotic.

Tripletă de microtubuli

Fig. 5.17. Aspectul svhematic şi electronomicroscopic al centriolilor

În general, centrozomul se găseşte aproape de nucleu iar numele său provine de la faptul că reprezintă

aproximativ centrul celular. Plecând de la centrozom se adauga dimerii de tubulină (alfa şi beta) încărcaţi cu GTP (alfa la polul minus, beta la polul plus) şi se elaborează protofilamente, care se asamblează unele cu altele lateral, formând straturi. Acestea se pliază progresiv pentru a forma microtubulul, cilindric şi rigid.

93

Funcțiile microtubulilor  Microtubulii îndeplinesc 3 funcţii esenţiale:

1) Transportul organitelor ţi veziculelor membranare 2) Mişcarea cililor şi flagelilor 3) În diviziune prin formarea aparatului de diviziune În realizarea funcţiilor, microtubulii sunt însoţiţi de o serie de proteine, dintre care unele cu

proprietăţi motorii iar altele cu roluri stabilizatoare şi de intermediere a contactelor cu alţi compuşi celulari (proteine asociate cu microtubulii, MAP - microtubule associated proteins). 1. Deplasarea organitelor pe microtubuli. 

Două familii de proteine motorii (vezi, de asemenea, miozinele) interacţionează cu microtubulii : kinezinele care se deplasează spre extremitatea plus şi dineinele care se deplasează spre extremitatea minus (directia centrozomului) (Fig. 5.18.A). Fiint

Rasucire in α-helixCapete globulare Rasucire in α-helixCapete globulare

(Adin(Bde(Cco Kilanuşassucanivhidtubmelan

g. 5.18. Proteine motrice care eracţionează cu microtubulii.

Directia de miscare

Directia de miscare

Vezicula

Vezicula

Dineina

KinezinaMicrotubul

Directia de miscare

Directia de miscare

Vezicula

Vezicula

Dineina

KinezinaMicrotubul

A. Microtubul

“Piciorul” din spate se mutain fata

“Piciorul” din fata se leaga de o nouasubunitate beta-

tubulinica

Lant greu

Situs de legare a ATP

Lant usor

“Piciorul” din spate

“Piciorul” din fata

Regiuneintermediara

Regiuneintermediara

Microtubul

“Piciorul” din spate se mutain fata

“Piciorul” din fata se leaga de o nouasubunitate beta-

tubulinica

Lant greu

Situs de legare a ATP

Lant usor

“Piciorul” din spate

“Piciorul” din fata

Regiuneintermediara

Regiuneintermediara

B.

) Kinezina se deplasează anterograd iar eine, retrograd.

) Alcătuirea (a) şi modalitatea de plasare (b) a kinezinei. ) Alcătuirea dineinei citosolice şi a mplexului dinactinic

nezina este o proteină formată din 4 ţuri polipeptidice, 2 lanţuri grele şi 2

oare. Structural, kinezinele sunt emănătoare miozinelor: lanţurile grele nt răsucite în α-helix şi terminate în pete globulare (domenii motorii). La elul acestor capete se află situsul de roliză a ATP respectiv cel de legare la ulină. Asocierea cu organite sau vezicule mbranare se realizează la nivelul ţurilor uşoare (“cozile” kinezinei).

Dineina citosolicaDineina citosolica

Lanturi grele

Lanturi

intermediare

Lanturiusoare

Complex dinactinic

Spectrina

Ankrina

Dinactina

Membranacargo

Lanturi grele

Lanturi

intermediare

Lanturiusoare

Complex dinactinic

Spectrina

Ankrina

Dinactina

Membranacargo

C.

94

Biologie Celulara

Kinezina se deplasează întotdeauna în direcţia extremităţii (+) a microtubulului, fenomen denumit transport anterograd (Fig. 5.18.B).

Dineinele sunt o clasă de proteine cu localizări diverse: citosolică, axonală, flagelară şi ciliară. Dineina citosolică este activă sub forma unui complex proteic multimeric (complex dinactinic) asociată cu dinactina, o proteină înrudită cu actina (Fig. 5.18.C). Acest complex permite fixarea organitelor şi transportul lor în sens retrograd, adică spre capătul (-) al microtubulului. Dineina are activitate ATP-azică.

Dineina şi kinezina se ataşează cu ajutorul cozii la structuri celulare precum neurofilamentele, RE, aparatul Golgi, membrana plasmatică, cromozomi (kinetocori) şi veziculele de secreţie (Fig. 5.19).

Proteinmicrofil

O

microfilaplasmatiaparatul microtub

Rezultatemicrofiladatorită regiune,de transploc, pe a

Vezicule membranare

Lizozom

Lizozom

Mitocondrie

Dineine citosolice Kinezine citosolice Kinezine fusale

Vezicule membranare

Lizozom

Lizozom

Mitocondrie

Dineine citosolice Kinezine citosolice Kinezine fusale

Fig. 5.19. Rolul proteinelor motrice în transportul veziculelor membranare,

fixarea şi deplasarea organitelor celulare

ele  motorii  asociate  asigură  transportul  intracelular  de‐a  lungul  microtubulilor  sau amentelor 

veziculă membranară poate fi transportată de o proteină motorie asociată microtubulului sau unui ment de actină. În endocitoză, de exemplu, se transportă vezicule învelite în porţiuni din membrana

că, iar în procesul de secreţie celulară se transportă spre exterior vezicule care provin din RE şi Golgi. În ambele procese veziculele trebuie să traverseze regiuni ale citoplasmei sărace în uli, dar bogate în microfilamente şi invers.

experimentale sugerează că atât proteinele motorii asociate microtubulilor cât şi cele asociate mentelor se leagă la aceleaşi vezicule membranare şi cooperează pentru transportul lor. În esenţă, distribuţiei microtubulilor în miezul citoplasmei, ele intermediază transportul veziculelor în această în timp ce microfilamentele de actină, abundente la periferia (corticala) citoplasmei, preiau funcţia ort atunci când veziculele ajung în apropierea membranei plasmatice. Pentru ca transportul să aibă

ceeaşi veziculă sunt legate atât miozina cât şi dineina sau kinezina.

95

2. Mişcarea cililor şi flagelilor de la eucariote 

Cilii şi flagelii sunt prelungiri ale membranei plasmatice, constituite dintr-un miez de microtubuli. Flagelul bacteriilor este diferit de cel al eucariotelor deoarece este o prelungire de filamente proteice ale suprafeţei celulare, fără a fi delimitat de o membrană.

Cilii şi flagelii eucariotelor sunt structuri asemănătoare, fiecare cu un diametru de aproximativ 0,25 µm. Multe celule sunt acoperite de numeroşi cili care au aproximativ 10 µm lungime, dar flagelii, mult mai puţini la num. (1-4/celulă) pot atinge 200 µm. Parameciul are pe suprafaţa să mii de cili, folosiţi atât pentru locomoţie cât şi pentriu ingerarea hranei. La mamifere, un num. Mare de cili se află la nivelul epiteliilor din mucoasa nazală şi traheală. Flexia fasciculelor de microtubuli permite mişcarea cililor şi flagelilor. La suprafaţa epiteliului respirator (bronhii şi trahee), regiunile cu cili se ondulează coordonat, permiţând deplasarea unidirecţională (către exterior) a mucusului bronhic. Mişcarea este un fenomen activ, apărut dîntr-o recuperare pasivă, în care cilul revine la pozitia iniţială. Mişcarea unui cil se produce prin flexia părţii centrale, axonema.

Axonema este constituită dîntr-o armătură de microtubuli aranjaţi în nouă dublete periferice care înconjoară un dublet central (o pereche de singlete). Fiecare dublet periferic este format prin asamblarea a doi microtubuli (A şi B) care pun în comun trei protofilamente. În fiecare dublet un microtubul este asociat cu dineină. Dineina interacţionează cu dubletul adiacent pentru a determina o mişcare de alunecare a unui dublet pe altul. Dineina ciliară are un domeniu motor care hidrolizează ATP pentru a se deplasa pe microtubul către extremitatea minus (Fig. 5.9. şi 5.10).

Dubletele periferice sunt stabilizate unele faţă de altele de braţe de nexină, proteină de legare. De la dubletele periferice pornesc spre centrul axonemei alte braţe, ca nişte spiţe radiare. În mijlocul axonemei, dubleta centrală este formată din doi microtubuli care nu au în comun protofilamente (singlete de microtubuli). Cele două singlete sunt stabilizate de punţi proteice şi înconjurate de un “scut” proteic, a cărui suprafaţă intră în contact cu capetele spiţelor radiale.

Întreg ansamblul axonemal este delimitat de prelungirea membranei celulare. El este astfel organizat pentru a fi asigurată o maximă flexibilitate în condiţiile unei rezistenţe sporite.

Membranaplasmatica

Nexina Punte de conectare a singletelor centrale

Pereche centrala de singlete microtubula

Scut proteic

Spita radiala

Capul spitei

Dublet de microtubuli

Microtubul A MicrotubulB

Brat intern de dineina

Brat extern de dineina

Membranaplasmatica

Nexina Punte de conectare a singletelor centrale

Pereche centrala de singlete microtubula

Scut proteic

Spita radiala

Capul spitei

Dublet de microtubuli

Microtubul A MicrotubulB

Brat intern de dineina

Brat extern de dineina

Fig. 5.19. Structura schematică a axonemei (a), r

secţiuni transver

rere

espectiv imaginea electronomicroscopică a unei sale prin cili (b)

96

Biologie Celulara

Axonema cililor şi flagelilor se ancorează în celulă prin corpusculii bazali. Similare centriolilor, corpusculii bazali sunt structuri cilindrice ce conţin 9 triplete de microtubuli. Fiecare triplet conţine un microtubul complet cu 13 protofilamente )microtubul A) şi care fuzionează cu ceilalţi microtubuli (B şi C) incompleţi. Microtubulii A şi B se continuă în axonemă, pe când microtubulul C se termină la zona de tranziţie între corpusculul bazal şi axonemă. Perechea de microtubuli centrali este caracteristică numai axonemei şi se termină la zona de tranziţie între axonemă şi corpusculii bazali.

Fig. 5.21. Secţiune transversală printr-un corpuscul

bazal în care se observă cele 9 triplete şi absenţa dubletei centrale.

Mişcările cililor şi flagelilor de la eucariote rezultă prin alunecarea relativă a dubletelor de microtubuli externi unii printre alţii, datorită activităţii motorii a dineinei ciliare. Orientarea microtubulilor în cil este cu polul (+) spre vârf. Alunecarea braţelor dineinei de pe microtubulul A pe microtubulul B din dubletul adiacent se face spre extremitatea (-), adică spre baza acestuia. Forţa care produce alunecarea activă necesită consum de ATP. Această forţă este generată prin formarea şi ruperea succesivă a legăturilor dintre braţele dineinei şi microtubulul adiacent (B).

O schemă succintă privind declanşarea şi modul de mişcare a axonemei este prezentată în Fig. 5.20:

Dubletede microtubuli ATP

Brat de dineina

Dubletede microtubuli ATP

Brat de dineina

Intr-un cil sau flagel, două dublete adiacente nu pot aluneca prea mult deoarece sunt limitate fizic de proteine de legătură, astfel încât dubletele se îndoaie.

Energizat de ATP, braţele de dineină a unui dublet de microtubuli, trage dubletul adiacent, îl împinge în sus, se eliberează apoi se prinde din nou. Dacă cele două dublete nu ar fi ataşate la corpusculul bazal, ele ar aluneca unul faţă de celălalt.

Dubletele externe

Anorarein celula

ATP

Dubletele externe

Anorarein celula

ATP

F

Activarea sincronă, localizată, a braţelor de dineină cauzează îndoirea cilului sau flagelului începând de la bază spre vârf. Îndoirile succesive ale cilului se manifestă finalmente ca o mişcare ondulatorie a acestuia.

ig. 5.21 Diagramă reprezentând mişcarea cilului sau flagelului

97

Bibliografie: CRUCE, M., Biologie celulară şi moleculară, Ed. Aius, Craiova, 1999, p. 161-190 CRUCE, M., MIXICH, F., ZAHARIA, C., CRUCE, R., ARDELEAN, A., Citoscheletul şi motilitatea celulară, Ed. Aius, Craiova, 1998.

Capitolul 6. Ciclul celular şi diviziunea celulară  forismul lui Rudolf Virchow (patolog german, 1821-1902) “omnis cellula e cellula” („orice celulă provine dîntr-o celulă”) ilustreaza conceptul de multiplicare celulară prin diviziune. Diviziunea celulei

include diviziunea nucleului şi replicarea informaţiei genetice (mitoza) şi diviziunea citoplasmei şi a intregii celule (citochineza).

A De ce se divide o celulã? Mitoza asigura îndeplinirea mai multor fenomene:

i) dezvoltarea embrionara; ii) cresterea generala a organismelor, de la nastere pâna la stadiul adult; iii) cresterea continua a anumitor organisme si/sau organe (arborii, parul, dintii la rumegatoare,

unghiile, etc.); iv) reînnoirea celulelor moarte (celulele cutanate, hematiile, etc.); v) asigura cicatrizarea diferitelor rani; vi) conserva identitatea celulară în timpul dezvoltarii şi reînnoirii celulelor din aceleasi organe,

tesuturi, etc.; vii) apariţia dereglarilor de proliferare la nivelul celulelor somatice de tip cancer.

Ce declanşeazã mecanismul diviziunii ? Diferite ipoteze:

un factor ereditar de mărime: fiecare tip celular are o talie ereditară care, odată atinsă şi depăşită, provoacă diviziunea;

raportul nucleu/citoplasmă: nucleul nu ar putea controla eficient decât o cantitate limitată de citoplasmă; reducerea la jumătate a volumului de citoplasmă ar restabili un control eficient aducând raportul în favoarea nucleului care este întotdeauna neschimbat ca număr de cromozomi;

raportul membrană/citoplasmă: suprafaţa membranei citoplasmatice nu ar putea asigura schimburi eficace decât pentru o cantitate limitată de citoplasmă; reducerea la jumătate a citoplasmei ar aduce raportul în favoarea membranei plasmatice;

existenţa semnalelor citoplasmatice: s-a demonstrat că un nucleu care se divide normal într-un anumit tip celular, transplantat în altă citoplasmă nu se mai divide.

6.1. Fazele ciclului celular Filmarea celulelor în diviziune arată că mitoza şi citochineza reprezintă un ansamblu de modificări

continue. Ciclul celular este subdivizat în 2 faze mari: pregatitoare (interfaza) şi de diviziune (mitoza care se termina cu citochineza). Faza pregătitoare, interfaza, este o fază de repaus care reprezintă 90% din ciclul celular, este invizibilă în microscopie optică şi a cărei durată variază între 10 şi 24 de ore la mamifere; Faza de diviziune, mitoza (faza M), formata din patru etape funcţionale, vizibile la microscopul optic: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza, cu o durată de aproximativ o oră.

În timpul acesteia nucleul şi citoplasma vor fi divizate, procesele respective fiind numite cariochineză (diviziunea nucleului) şi citochineză (diviziunea citoplasmei). În esenţă, studiul mitozei este axat pe cariochineză şi în cadrul acesteia, pe modificările suferite de cromozomi.

98

Biologie Celulara

6.2. Interfaza Mult timp s-a considerat ca în celulele aflate în aceasta fază nu se întâmpla nimic. Analiza cantităţii

de ADN în celulele cu o rată de diviziune crescuta a demonstrat că acesta se dubleaza rapid înainte de fazele vizibile. Procesul este asigurat de enzima ADN polimeraza care copiază catenele parentale-matriţă şi sintetizează, pe baza de complementaritate (adenină - timină şi citozină - guanină) două catene noi omologe. La sfârşitul interfazei, nucleul, care conţine unul sau mai multi nucleoli (zone speciale din nucleu, cu functii de producere a ribonucleoproteinelor), este bine definit şi înconjurat de un învelis nuclear. Centrozomul, unic, este replicat şi microtubulii pornesc din centrozom într-o structură radiară numita aster. Analitic, interfaza se subdivide în trei perioade distincte:

faza G1 (gap = interval) care se întinde între faza M şi începutul fazei de sinteză a ADN. Durata sa variază de la câteva ore la câteva zile. Condiţionează durata ciclului celular şi constituie o perioadă critică. Celulele care nu pot trece de aceasta etapă intră în stare quiescentă, faza G0. În faza G1 are loc activarea tuturor elementelor necesare sintezei ADN, graţie unui proces susţinut de transcripţie; faza S în timpul căreia continutul ADN al unei celule trece de la 2n (2n cromozomi, fiecare cu o cromatidă pe cromozom) la 4n (2n cromozomi ramâne, fiecare cu două cromatide identice). Duplicarea cromatinei depinde de starea sa de condensare. Eucromatina, care corespunde regiunilor de ADN frecvent transcrise sub formă de ARN, este duplicată prima în timp ce heterocromatina (corespunzătoare regiunilor represate) este duplicată tardiv; faza G2, în general foarte scurtă, se caracterizează printr-o creştere mare a volumului celular. Celulele embrionare precoce posedă toate elementele necesare unei sinteze rapide de ADN şi diviziunii. În acest caz, interfaza se reduce la faza S, şi determină diminuarea dimensiunilor celulei în timpul numeroaselor diviziuni caracteristice acestui stadiu de dezvoltare (Fig. 6.1)

Celulacreste iarCelulacreste iarCelulacreste iar

6.3. Mitoza Mitoza nu s

destinate să asigure o

Ce sunt cromatide

organitelese divid

ADN se replica odataduplicarea cromozomi

cu lorCelulacreste darin acelasi timp

se pregatestesase divida

Au loc mitozasi citocineza

inte

rfaz

a

organitelese divid

ADN se replica odataduplicarea cromozomi

cu lorCelulacreste darin acelasi timp

se pregatestesase divida

Au loc mitozasi citocineza

organitelese divid

ADN se replica odataduplicarea cromozomi

cu lorCelulacreste darin acelasi timp

se pregatestesase divida

Au loc mitozasi citocineza

inte

rfaz

a

Fig. 6.1. Etapele ciclului celular cu evidentierea interfazei şi mitozei

e poate derula decât dacă cromatina se condensează în entităţi distincte (cromozomii) buna repartiţie a materialului genetic între cele două celule fiice.

le şi cromozomii ? 

99

ADN prezintă, în funcţie de stadiul în care se afla celula, mai multe nivele de condensare. Un nivel mai relaxat este cel de cromatida, în care ADN este despachetat precum sfoara desirata de pe un ghem. Cromozomii sunt cromatide condensate la maximum, intocmai ca sfoara împachetata intr-un ghem. în acest proces de condensare intervin o serie de proteine numite histone. La inceputul diviziunii cromatidele contin o singura copie a ADN (2n). în urma replicarii apare o copie identica a ADN parental şi, ca urmare, prin condensarea cromatidelor surori rezultă cromozomii duplicati (care se mai numesc 4n)

Cromatide

F R

segregar a) Profaexteriorucondensemicroscocitoplasmcentrozonucleul p

b) Metaa învelis(microtucentromeîntregimeformeazaSe stabilfusului m c) Anafsepara înîntreg, cmicrotubaltul. d)  Teloformeazăregiuni dspatiala Mitoza,

Cromozomconstituitdintr-osinguracromatida

Duplicare

surori

Cromozomduplicat

Centromer

ig. 6.2 Alcătuirea şi duplicarea unui cromozom

epartiţia informaţiei genetice duplicate se realizează în urma activarii fusului mitotic indispensabil ii şi în paralel cu condensarea cromozomilor. Succesiunea etapelor mitozei este următoarea:

za este o faza de organizare. Membrana citoplasmatică îsi modifica permeabilitatea şi schimburile cu l sunt diminuate. În nucleu, nucleolii se deplaseaza la periferie şi dispar. Fibrele de cromatina se aza în spirala. Exista trei nivele de condensare care conduc la formarea de cromozomi vizibili la pul fotonic. Fiecare cromozom duplicat are două cromatide identice reunite printr-un centromer. În a, se formeaza fusul de diviziune compus din microtubuli şi proteine care se dispun între cei doi

mi. Centrozomii se îndeparteaza unul de celalalt şi microtubulii formeaza un fus care înconjoara lecând de la o pozitie polara.

faza este un punct cheie al mitozei. Începutul sau, pro-metafaza, se caracterizeaza prîntr-o ruptura brusca ului nuclear. În acest stadiu, cromozomii devin accesibili unei clase de microtubuli ai fusului mitotic buli kinetocorici) care se leagă la cromozomi la nivelul kinetocorilor (structuri specializate de la nivelul rilor care ghideaza migrarea cromozomilor). În următoarea etapă învelisul nuclear este distrus în ; lamina nucleara este dezorganizata şi centrozomii se pozitioneaza la polii celulei. Cromozomii placa metafazicã în urma alinierii pe placa ecuatoriala, situata la distanta egala de cei doi poli ai fusului. este un echilibru între cele două cromatide ale cromozomului mentinute şi orientate către polii opusi ai itotic.

aza nu dureaza decât câteva minute şi începe când centromerul dedublat al fiecarui cromozom se două, eliberând astfel cromatidele surori. Fiecare cromatida devine din acest moment un cromozom ondus de fus către polii celulei. Cromozomii sunt atrasi către poli ca urmare a contractiei ulilor. Mitocondriile se concentreaza la nivelul placii ecuatoriale iar polii se îndeparteaza unul de

faza  marchează sfârsitul mitozei (telos = fin). Microtubulii polari alungesc celula şi la poli se noii nuclei. Cele două noi învelisuri nucleare se constituie din învelisul nuclear al celulei mamă şi in membrana reticulului endoplasmatic. Reapar nucleolii, fiecare cromozom îsi pierde organizarea

compacta şi reia forma cromatinei initiale. Mitocondriile, ca şi celelalte organite sunt redistribuite. adica diviziunea unui nucleu în două nuclee identice genetic, s-a terminat. Citochineza (diviziunea

100

Biologie Celulara

citoplasmei) este deja bine conturată deoarece cele două celule fiice se vor individualiza la puţin timp dupa mitoza.

Sfarsitul citochinezei

Telofaza + citochineza

Metafaza Anafaza

Interfaza Profaza timpurie Profaza tarzie

101

e) Citochineza începe la sfârsitul anafazei cu formarea unei linii de diviziune prin invaginarea membranei la ecuatorul membranei celulare, perpendicular pe axul longitudinal al fusului mitotic. Diviziunea în două celule fiice se realizează gratie elaborarii unui inel contractil, compus dintr-un fascicul de filamente de actina şi miozina, asociate pe fata internă a membranei plasmatice. O data cu invaginarea liniei, are loc o pierdere progresiva a filamentelor la nivelul inelului contractil pâna se ajunge la un punct strâns între cele două celule fiice. Procesul se încheie cu ruperea acestui punct când celula pare să sufere o întindere centripeta care separa complet celule fiice. În celulele vegetale, care au un perete celulozic, citochineza apare ca un mecanism centrifug. O structura dubla, numita placa celulară se constituie în timpul telofazei la ecuatorul celulei mama, plecând de la centru şi fuzionând cu peretele celulei-mama astfel încât cele două celule vegetale noi sunt formate. Diviziunea celulară este rezultanta cariochinezei (diviziunea mitotică a nucleului) dirijată de fusul mitotic şi citochinezei (diviziunea citoplasmei) cauzată de formarea şi restrângerea inelului contractil. Aceste două entităţi, fusul mitotic şi inelul contractil apar prin rearanjarea citoscheletului care conferă celulei interfazice arhitectura să internă.

6.4. Formarea fusului mitotic ` In cea mai mare parte a celulelor, asterii se organizeaza în jurul centrozomilor, care constau într-o pereche de centrioli şi materialul pericentriolar asociat acestora. Fiecare aster acţionează ca un veritabil centru organizator de microtubuli sau MTOC (pentru Microtubule Organizing Center) Înainte de sfârsitul profazei, fusul mitotic este constituit din doi asteri legati prin câtiva microtubuli interpolari.

In profaza tardiva, timpul de înjumatatire al unui microtubul scade brusc de la 5 minute la 15 secunde, iar numărul de microtubuli ce pornesc din centrozom creste considerabil. Astfel se explica de ce începutul fazei M este marcat de trecerea rapida a microtubulilor interfazici relativ lungi şi puţin numerosi la un număr mare de microtubuli mici care înconjoara fiecare centrozom şi participa la elaborarea fusului mitotic.

Pentru a discuta asamblarea fusului mitotic este necesară descrierea organizarii sale. Fusul mitotic metafazic matur este o structura cu simetrie bilaterala în centrul căreia sunt localizati cromozomii flancati de aranjamente formate din microtubuli care iradiaza spre poli. Structura fusului este determinata prin acţiunea a aproximativ sapte tipuri deferite de kinezine şi a dineinei citoplasmatice. Adesea, aceste proteine motrice au functii diferite.

Deci, fusul este o structura foarte dinamica a carui morfologie se modifica permanent. Fusul mitotic este constituit din trei clase de microtubuli:

I. microtubuli polari care interacţionează între ei la centrul fusului şi asigura apoi îndepartarea polilor la fiecare extremitate a fusului;

II. microtubuli kinetocorici, purtători ai cromozomilor; III. microtubuli interpolari sau astrali situati la exteriorul fusului şi a caror raspândire din centrozom

mentine organizarea intracelulară în mitoza şi orienteaza fortele necesare separarii polilor.

Placa metafazica, structura tipica aparent imobila, rezultă dintr-un proces de asamblare complex a carui stabilitate este asigurata printr-un schimb continuu de subunităţi de tubulina cu tubulina libera din celula. Legaturile între microtubulii polari şi celelalte structuri cum sunt kinetocorii şi centrozomii se realizează prin intermediul proteinelor motrice microtubulare.

Cu toate ca lungimea medie a microtubulilor kinetocorici este aproximativ constanta în cursul metafazei, microtubulii se modifica continuu prin trei modalitati:

i) adaugare constanta de noi subunităţi de tubulina (aproximativ 10 unitati pe secunda) la nivelul extremitatii plus prin care sunt atasati de kinetocori;

ii) un număr echivalent de subunităţi de tubulina se disociaza lent la extremitatea minus de la nivelul polilor fusului. Deci, subunităţile de tubulina migreaza permanent de-a lungul microtubulilor kinetocorici, de la kinbetocori la poli.

102

Biologie Celulara

iii) toti microtubulii atasati la fiecare kinetocor îsi modifica lungimea în mod coordonat în urma oscilatiilor cromozomiale.

Segregarea cromozomilor între cele două celule fiice este un proces foarte precis. Pentru a atinge acest nivel de precizie, majoritatea celulelor întârzie intrarea lor în anafaza pâna când toti cromozomii au o orientare bipolara. Acesta reprezintă punctul de control al metafazei la nivelul caruia se detecteaza daca alinierea cromozomilor şi asamblarea fusului au fost corect realizate în timpul metafazei. Remodelarea microtubulilor în anafazã 

Începutul anafazei care corespunde separarii cromatidelor surori este unul dintre evenimentele cele mai impresionante din întreg ciclul celular. Cromatidele surori se orienteaza către polii fusului (anafaza A) şi apoi polii se separa (anafaza B). De asemenea, anafaza este faza în care fusul mitotic activeaza regiunea periferica a celulei pentru prepararea citochinezei. Deci, anafaza este dominata de miscarea ordonata a cromatidelor surori către polii opusi ai fusului, care rezultă din acţiunea combinata a proteinelor motoare şi din modificările de lungime ale microtubulilor.

Miscarea cromozomilor către polii opusi rezultă din două mecanisme independente. Primul se desfasoara în anafaza A, şi îsi are originea în micsorarea microtubulilor kinetocorici a caror depolimerizare la nivelul kinetocorilor se efectueaza cu viteza mare.

Al doilea mecanism se observa în anafaza B şi corespunde separarii polilor prin cresterea distantei de separare. Are loc o polimerizare la nivelul extremitatilor distale ale microtubulilor polari, şi o alunecare către poli ajutata de proteinele motrice din familia kinezinei.

Microtubulii astrali se alungesc în toate directiile plecând de la poli în timpul anafazei B. În asocierea cu proteinele motrice, ca dineina, genereaza o forta care permite separarea polilor fusului.

6

c

Fig. 6.3. Remodelarea microtubulilor in

anafaza.

.5. Mecanisme biochimice de control al ciclului celular Procesele moleculare care reglează cele două evenimente cheie ale ciclului celular, replicarea

romozomilor şi segregarea celulară sunt fundamental similare în toate celulele eucariote. Tehnicile de

103

biochimie, genetica şi biologie moleculara au scos în evidenta ca replicarea celulară este primordial controlata de realizarea corecta a replicarii ADN şi mitozei. Controlul suprem al acestor evenimente îl au mai multe protein kinaze heterodimere mici care sunt compuse dîntr-o subunitate reglatoare (ciclina) şi o subunitate catalitica (CDK, kinaza dependenta de ciclina). Aceste kinaze reglează activitatile mai multor proteine implicate în replicarea ADN şi în mitoza asigurând fosforilarea la nivelul unor situsuri specifice. Procesul are drept rezultat activarea unor proteine şi inhibarea altora astfel încât să se realizeze coordonarea activitatilor.

Ciclul celular se articuleaza în jurul a patru faze cu durata inegala (Fig. 6.1). În cea mai mare parte a timpului, celula se afla în faza G1; în cursul fazei S se realizează replicarea ADN; se trece apoi în faza G2 şi apoi se realizează mitoza. Faza G1 este cea mai lunga şi o putem defini ca o faza control în care celula se asigura ca mediul sau îi permite să se divida. Aceasta etapă este extrem de controlata. Un anumit control se manifesta şi în faza G2 unde celula se asigura ca replicarea ADN s-a realizat corect. Concentraţiile ciclinelor, subunităţile reglatoare ale protein kinazelor heterodimere care controleaza evenimentele ciclului celular, cresc şi descresc pe durata derularii acestuia. Subunităţile catalitice (kinazele ciclin dependente) nu prezintă activitate kinazica daca nu sunt asociate cu diferite cicline. Ciclinele asociate determina care dintre proteine vor fi fosforilate de către un anumit complex ciclina- CDK. Când celulele sunt stimulate să se replice, complexele cicline-CDK din faza G1 sunt primele exprimate. Acestea pregatesc celula pentru faza S prin activarea factorilor de transcriptie care promoveaza transcriptia genelor care codifică enzimele necesare sintezei ADN şi genelor care codifică ciclinele şi kinazele ciclin dependente din faza S. Activitatea complexelor cicline-CDK din faza S este initial controlata de inhibitori. Mai târziu, în faza G1, complexele cicline-CDK ale fazei G1 induc degradarea inhibitorilor din faza S prin fosforilarea acestora şi prin stimularea cuplarii lor cu ubicuitina determinata de către un complex multiproteic.

Complexele cicline-CDK mitotice sunt sintetizate în timpul fazelor S şi G2, dar activitatile lor sunt tinute sub control prin fosforilare la nivelul situsurilor inhibitoare pâna ce sinteza ADN este completa. Odata activate prin defosforilarea situsurilor inhibitoare, complexele cicline-CDK mitotice fosforileaza mai multe proteine care promoveaza condensarea cromozomilor, retragerea anvelopei nucleare, asamblarea aparatului fusului mitotic şi alinierea cromozomilor condensati la nivelul placii metafazice. În timpul mitozei, complexul de promovare a anafazei APC, (în engleza Anaphase Promoting Complex), care contine multe subunităţi de ubicuitin ligaza, poliubicuitineaza proteinele reglatoare cheie marcându-le pentru degradarea proteozomala. Un substrat important al APC este securina, o proteina care inhiba degradarea proteinelor care asigura legarea cromatidelor surori.

104

Biologie Celulara

MCb

6

cAA

sb

Fig. 6.4. Reglarea ciclului celular

ATERIAL SUPLIMENTAR iclinele - contin cel puţin două domenii functionale. Primul, întâlnit la toate clasele de cicline, este „cyclin ox”, regiune conservata de 100 aminoacizi care asigura două functii: recunoaste şi favorizeaza legarea ciclinei la kinaza CDK corespunzatoare; variatiile de secvenţa în aceasta

regiune responsabila de recunoasterea unei cicline particulare, permite clasificarea ciclinelor în sub-familii;

activeaza domeniul catalitic (kinazic) al proteinei CDK. Al doilea domeniu prezent doar la ciclinele de tip A şi B, localizat în regiunea N terminala a proteinei, corespunde unei regiuni numita „destruction box”. Aceasta regiune contine un motiv din aminoacizi bine conservati (secvenţa consens RALGDIGN) urmat de o regiune bogata în lizina cu un situs de recunoastere pentru legarea mai multor molecule de ubiquitina (proteina mica termostabila de 76 aminoacizi). Astfel modificata, ciclina va fi degradata de un complex multienzimatic, numit proteazom.

.6. Punctele de control - Mecanisme de supraveghere a ciclului celular

Mecanismele specifice de supraveghere detecteaza erorile şi induc blocarea ciclului celular la puncte heie de tranzitie. Astfel, în celulele de mamifere, arestarea ciclului în faza G1 consecutiva unei alterari a DN este controlata de genele ATM şi p53 (gena supresoare tumorală esenţiala în controlul integritatii DN). Debutul anafazei este întârziat daca în celula cromozomii nu sunt toti perfect aliniati pe fusul mitotic.

Punctele de control ale ciclului celular au fost considerate etape în care toate evenimentele pecifice ale fazei precedente trebuiesc îndeplinite. Aceste puncte de control pot fi şi puncte de oprire, locând tranzitia către faza următoare. Intrarea în mitoza depinde de starea de fosforilare a complexului MPF

105

(eng. Maturation Promoting Factor sau Mitosis Promoting Factor). Fosfatazele şi kinazele care controleaza procesul sunt şi ele supuse unei reglari care funcţionează dupa acelasi principiu.

Factorii de crestere sunt necesari pentru stimularea proliferării. Legarea unui factor de crestere la receptorul sau membranar initiaza o cascada de evenimente (transducerea semnalului) care stimuleaza celula să îndeplineasca faza G1 şi să se angajeze în faza S. Factorii de crestere induc transcriptia a numeroase gene, dintre care cele precoce codifică factori de transcriere. Astfel, o familie de factori, numiti E2F, este necesară pentru transcrierea unor gene care codifică numeroase proteine implicate în sinteza deoxiribonucleotidelor şi ADN în timpul tranzitiei G2/S.

fdfcgr

6 mgfc

g(n

Fig. 6.5. Punctele de control ale

ciclului celular

Diferitele tranzitii G1/S, S/G2, G2/M depind de protein kinaze, asociate cu ciclinele lor si/sau osfataze. Etapele cheie ale ciclului celular evita „catastrofe genetice” care ar putea surveni daca celula epaseste inopinat un punct de control. De exemplu, daca anafaza începe înainte ca toti cromozomii să se ixeze la microtubulii kinetocorici, vor fi celule fiice în care anumiti cromozomi vor lipsi si/sau cu romozomi supranumerari. Când acest proces, numit non-disjunctie, se produce în timpul diviziunilor care enereaza gameti femeli şi masculi, pot aparea trisomii care au drept consecinte anomalii de dezvoltare şi etardare mentala.

Punctele de control permit evitarea numeroaselor erori ca:

Replicarea partiala a ADN înainte de intrarea în mitoza; Defecte de asamblare a fusului mitotic care antreneaza o distributie incorecta a cromozomilor; Anomalii la nivelul structurii ADN care ar putea genera mutanti care scapa de controlul proliferării (carcinogeneza).

.7. Diviziunea celulelor sexuate (meioza) Celulele somatice (soma-gr=corp), care constituie corpul plantelor şi animalelor, se multiplică prin

ecanismul descris anterior, prin mitoză. Informaţia genetică (ADN condensat în cromatide şi cromozomi) se ăseşte sub formă de perechi de cromozomi (cromozomi 2n sau celule diploide), căte unul provenit de la iecare părinte. Prin mitoză, o celulă somatică, diploidă, dă naştere la două celule fiice identice, fiecare onţinând o copie a ADN parental, ele fiind diploide (2n) la rândul lor.

Exista însă şi o altă categorie de celule, implicate în înmulţirea sexuată a organismelor, şi anume ameţii sau celulele sexuale. La om aceste celule sunt ovulele (celule sexuale de tip femel) şi spermatiile celule sexuale de tip mascul). Fenomenul prin care are loc fuziunea unui gamet femel cu unul mascul se umeşte fecundatie sau fertilizare, iar rezultatul este un zigot (Fig. 6.6.).

106

Biologie Celulara

Celulele sexuale conţin doar o singură replică a informaţiei genetice (celule haploide, n) iar acestea se combină prin fertilizare, rezultând zigotulo cu garnitură dublă de cromozomi, 2n, caracteristica celulelor somatice (diploide). Astfel putem spune că zigotul este prima celulă somatică apărută în urma fecundaţiei.

Din zigot, prin mitoză, procese de crestere şi diferentiere celulară vor lua naştere toate celelalte tipuri

celulare ţi în final întregul organism uman aşa cum îl vedem la naştere.

Fig. 6.6. Ro

Datorită situaţiei pa

zone specializate din organmultiplicarea celulelor somnumeste MEIOZĂ. Spre ddescendenţi haploizi. Reducnucleară şi celulară (numite

Meioza I  

Începe, ca şi mitozamoment fiecare cromozom în mitoză, în profaza I meiose dispun ulterior în placa mcu planul plăcii metafazice spre fiecare pol al celulei vaI este formarea a două celul În timpul profazei Ide pe cromozomii perechrecombinaţi. Procesele deesenţiale în asigurarea vari 

lul mitozei şi meiozei în viaţa organismelor multicelulare sexuate.

rticulare a gameţilor, diviziunea şi multiplicarea acestor celule (care au loc în ele reproductive, ex. în ovare, respectiv în testicule) este oarecum diferită de atice (de ex. celulele din piele). Fenomenul de diviziune a celulelor sexuate se eosebire de mitoză, meioza are ca rezultat divizarea unei cellule diploide în erea numărului de cromozomi de la 2n la n are loc în două etape de diviziune meioza I şi meioza II), care urmează după o singură replicare a ADN.

, imediat ce faza S a luat sfârşit, când cantitatea de ADN este dublată. În acest este format din două cromatide surori. Spre deosebire de aranjarea cromozomilor tică, cromozomii omologi se asociază sub formă de perechi formând tetrade care etafazică. În metafaza I meiotică aceste tetrade sunt orientate cu braţele paralel şi cu câte un cromozom spre un pol al celulei. În anafaza şi telofaza I meiotică, migra câte un cromozom având cele două cromatide surori. Rezultatul meiozei

e fiice cu un număr de cromozomi redus la jumătate (n cromozomi) (Fig. 6.7).

meiotice, datorită apropierii spaţiale şi omologiei structurale, secvenţe de ADN e vor fi schimbate prin procesul de crossing-over, rezultând cromozomii schimb de secvenţe de gene omoloage din timpul profazei I meiotice sunt abilităţii genetice a descendenţilor.  

107

Meioza I 

centrioliFusul de diviziune

aster

Tetrada(perechi omoloagede cromozomi)

centrioliFusul de diviziune

aster

centrioliFusul de diviziune

aster

Tetrada(perechi omoloagede cromozomi)

Profaza I

Placa metafazicaPlaca metafazicaPlaca metafazica

sau

Placa metafazica

sau

Metafaza I

Anafaza I

Telofaza I

Citochineza I

Fig. 6.7. Derularea meiozei I, cu formarea a două celule fiice haploide, conîinând cromozomi recombinaţi cu

cromatide surori.    

108

Biologie Celulara

 Meioza II 

Urmează meiozei I şi se derulează similar unei mitoze. La începutul profazei II meiotice nucleele se destramă iar cromatina nucleară se condensează în cromozomi.. În metafaza II meiotică, cromozomii cu cromatidele surori se dispun în planul ecuatorial al celulei, în placa metafazică. La începutul anafazei II meiotice, cromozomii se scindează în câte o cromatidă iar în telofaza II meiotică, la fiecare pol al celulei va migra câte un cromozom monocromatidic. Rezultatul mitozei II va fi formarea de cellule fiice cu n cromozomi (haploide).

Bilanţul meiozei va fi formarea a 4 celule fiice haploide: celulele sexuale.

Meioza II 

Profaza II

Placa metafazicaPlaca metafazica Placa metafazicaPlaca metafazica

Metafaza II Anafaza II

Telofaza II

Citochineza II

Fig. 6.8. Desfăşurarea meiozei II, cu formarea a patru celule fiice haploide, celulele sexuale conţinând

cromozomi recombinaţi monocromatidici.

109

Principalele asemănări şi deosebiri dintre mitoză şi meioză  Caracteristicile comune şi diferentele dintre cele două tipuri de diviziune celulară sunt rezumate în tabelul de mai jos.

Tabel 6.1. Tabel comparativ între mitoză şi meiză Asemănări între mitoză şi meioză Deosebiri dintre mitoză şi meioză Ambele sunt precedate de o duplicare a informaţiei genetice, adică de formare unei perechi de cromatide surori în fiecare cromozom pe durata interfazei

Cu plecare de la 2n cromozomi, meioza are ca finalitate formarea unui număr n de cromozomi, în timp ce din mitoza rezultă tot 2n cromozomi

Cu alte cuvinte: rezultatul meiozei este formarea a 4 celule fiice cu ½ din numărul total de cromozomi. La sfârşitul mitozei apar 2 celule fiice cu acelasi număr 2n de cromozomi.

Meioza II este practic o mitoza, profaza II, metafaza II, anafaza II şi telofaza II fiind identice în desfăşurare cu o mitoza obisnuita.

Meioza este formată din două diviziuni succesive: meioza I şi meioza II

In metafaza I, perechile de cromozomi parentali se dispun în tetrade în placa metafazică. În mitoza în placa metafazică câte un singur cromozom este aliniat în planul plăcii.

In anafaza I meiotică, spre polii fusului sunt direcţionaţi câte una din perechile de cromozomi, fiecare cu 2 cromatide surori. In mitoză, spre polii fusului se deplasează cate una din cele două cromatide surori.

Telofazele I şi II meiotice se termina cu o citochineză asemănătoare cu cea existentă în mitoză.

Rezultatul telofazei I este obtinerea unor celule fiice cu jumătate din numărul iniţial de cromozomi.

Dupa apariţia celor 2 celule fiice în urma meiozei I, acestea intră într-o nouă diviziune după tiparul mitozei.

6.8. Proliferarea, diferențierea şi moartea celulară programată  Creşterea corpului la organismele eucariote pluricelulare este consecinţa proliferării şi diferenţierii celulelor pronind de la stadiul de zigot şi parcurgând fazele embrionare, apoi de organism tânăr până la atingerea maturităţii. La acest stadiu, proliferarea celulelor se diminuează, un număr de celule oprindu-şi multiplicarea, stagnând în faza G0. Alte celule însă păstrează capacitatea de proliferare având rol în înlocuirea celulelor moarte sau distruse. Proliferarea celulelor în organismele adulte este contrabalansată de moartea fiziologică (programată) a altor celule.

Proliferarea celulară Celulele adulte au capacităţi proliferante diferite, în funcţie de gradul lor de diferenţiere (specializare).

(1) Celule neproliferante Astfel o serie de celule diferenţiate precum celulele cristalinului, cele din muşchiul cardiace sau

celulele nervoase, odată ce au dobândit funcţia lor specifică, îşi pierd capacitatea proliferativă. Teoretic, pe tot parcursul vieţii un individ trebuie să trăiască cu aceleaşi celule diferenţiate iar distrugerea lor nu mai poate fi compensată (de aici şi creşterea riscului de infarct miocardic pe măsura înaintării în vârstă). (2) Celule slab-proliferante

A doua categorie de celule sunt cele care intră în faza G0 şi din care fac parte majoritatea celulelor adulte. Ele re-intră în diviziune atunci când este nevoie de înlocuirea altor celule moarte sau lezate. Aşa sunt, de exemplu, celulele din epiteliile şi endoteliile organelor interne, celulele fibrelor musculare netede, hepatocitele, etc.

(3) Celule care proliferează continuu O serie de celule, cum sunt celulele epiteliului pielii sau ale tractului digestiv, trebuie înlocuite foarte

des. Celulele adulte diferenţiate nu se pot divide, această funcţie revenind celulelor stem, nediferenţiate. Celulele stem se divid şi produc celule care se diferenţiază ulterior. O parte din celulele fiice ale celulelor stem, rămân la rândul lor celule stem, constituind un rezervor de noi celule. Un exemplu edificatory de

110

Biologie Celulara

proliferare a celulelor stem pe toată durata vieţii unui individ este cel al celulelor stem pentru ceulele sangvine. Eritrocitele (care transportă O2 şi CO2), granulocitele şi macrofacele (care participă la fagocitoza intruşilor bacterieni sau a celulelor moarte), trombocitele (care intervin în coagulare) şi limfocitele (care induc răspunsul imun) au o durată de viaţă scurtă. (zile-luni). Ele sunt produse prin diviziunea repetată a unei celule stem comune, celula stem-pluripotentă, din măduva osoasă. Descendenţii celulei stem pluripotente urmează diferite căi de diferenţiere. Capacitatea de proliferare a descendenţilor scade pe măsură ce devin tot mai specializate.

Diferențierea celulară  Imensa majoritate a vieţuitoarelor pluricelulare au în componenţa lor tipuri variate de celule, grupate în ţesuturi, respectiv organe şi sisteme de organe. Heterogenitatea unui organism adult este vizibilă la nivel de organe (inimă, ficat, creier) constituite din tipuri celulare extrem de diverse (celule musculare, hepatocite, neuroni, etc). Aşa cum s-a amintit deja, întreaga diversitate şi complexitate a unui organism adult provine prin diviziunea repetată a unei singure celule iniţiale (zigot). Procesul de constituire a unor tipuri celulare diverse, specializate, pornind de la o singură celulă – celula ou, se numeşte diferenţiere celulară.

Diferenţierea celulară este ireversibilă şi are la bază o serie de mecanisme, în principal genetice. Din punct de vedere genetic, zigotul şi primele celule descendente sunt pluripotente (sau multipotente) deorece întreg setul lor de gene din nucleu este derepresat. În acest stadiu, toate genele lor sunt active iar ele pot urma orice traseu evolutiv de diferenţiere celulară. Ulterior, în cursul dezvoltării embrionare (embriogenezei), sub acţiunea unor semnale interne şi externe, exprimarea unor gene este represată (inhibată), celulele fiind silite să urmeze un anumit traseu de diferenţiere. Celulele care au suferit această transformare se numesc celule determinate.

Caracteristicile celulelor diferențiate: 

1. Funcţie specifică (specializare). Celulele diferenţiate sunt strict specializate funcţional;

2. Cooperare (joncţionare). Între celulele diferenţiate se stabilesc interrelaţii şi intercomunicare ca urmare a formării joncţiunilor celulare;

3. Structură specifică. Celulele specializate au formă şi structură caracteristice, necesare îndeplinirii funcţiei specifice (de exemplu, celulele destinate secreţiei de enzime digestive, au un RER bine dezvoltat, celulele musculare prezintă miofibrile, etc);

4. Compoziţie chimică specifică, dată de acumularea unor seturi de proteine (structurale şi enzime) specifice;

5. Adezivitate de substrat. Pe această proprietate se bazează formarea ţesuturilor şi organelor prin suprapunerea straturilor celulare caracteristice ţesutului sau organului respectiv;

6. Inhibiţia capacităţii de diviziune (sau de proliferare). Celulele diferenţiate au un ritm variat de diviziune, aşa cum a fost discutat anterior (vezi „Proliferarea celulară”);

7. Inhibiţia de contact, proprietate strâns asociată joncţionării şi adezivităţii de substrat. Atunci când densitatea celulelor dintr-un ţesut atinge un anumit nivel, celulele se opresc din diviziune. De exemplu, în urma lezării unui epiteliu, regenerarea lui are loc dinspre cele două laturi ale plăgii, până în momentul în care celulele ajung în contact. Înhibişia de contact lipseşte celulelor tumorale (vezi „6.9. Dereglarea ciclului celular: Cancerul”) din cauza unor modificări metabolice particulare.

Moartea celulară programată  Moartea celulară programată sau “sinuciderea celulară”, este un process fiziologic normal prin care sunt eliminate celulele în decursul dezvoltării embrionare şi pentru menţinerea dimensiunilor şi funcţiilor normale ale ţesuturilor. La organismul adult, apoptoza echilibrează proliferarea celulară menţinând un număr constant de celule în ţesuturile cu un ritm rapid de înlocuire a celulelor. În decursul dezvoltării organismului numeroase celule moştenite din stadiile tinere de viaţă sunt eliminate prin moarte celulară programată. Astfel circa 50% din celulele neuronale apărute în timpul

111

maturizării organismului sunt eliminate, rămânând doar cele mai specializate, apte pentru îndeplinirea funcţiilor nervoase complexe.

Moartea celulară programată este un proces prin care sunt eliminate nu numai celule normale ci şi celule lezate sau celule în care există anomalii de expresie genică şi de metabolism. De exemplu, celulele infectate cu virusuri intră în moarte celulară pentru a se împiedica propagarea virusului. Totalitatea modificărilor morfologice care însoţesc moartea celulară programată se numeşte apoptoză. Ea se deosebeşte de moartea neprogramată (accidentală) care se manifestă ca o necroză celulară. Pe durata apoptozei ADN cromozomial este fragmentat ca urmare a clivajului între nucleozomi. Cromatina se condensează iar anvelopa nucleară se dezintegrează în fragmente mici. În final celula se micşorează şi se fragmentează în corpusculi înveliţi în membrană, numiţi corpi apoptotici. Corpii apoptotici sunt recunoscuţi de macrofage şi fagocitate. În necroză, celulele urmează o altă cale, se umflă , “plesnesc” şi îşi eliberează conţinutul în spaţiul extracelular determinând inflamaţia.

Tabel 6.2. Tabel comparativ între apoptoză şi necroză

Apoptoza Necroza Fiziologică şi patologică Patologică Dependentă de energie Independentă de energie Fragmentarea celulei Umflarea celulei Integritatea membranei menţinută Integritatea membranei nu este menţinută Fără scurgerea enzimelor lizozomale Are loc scurgerea enzimelor lizozomale în citosol Activarea unor protease specifice Fără participarea proteazelor Clivajul ADN Nu are loc clivajul ADN Modificări nucleare caracteristice Dezintegrarea completă a nucleului Participarea mitocondriilor şi citocromilor c Fără participarea mitocondriilor şi citocromilor c Corpi apoptotici Corpi necrotici (fragmente celulare) Conservat din puct de vedere evolutiv Neconservat Celulele moarte sunt ingerate de celulele vecine Celulele moarte sunt ingerate de neutrofile şi macrofage

6.9. Dereglarea ciclului celular: cancerul Originea cuvântului “cancer” este latina, el insemnand “crab” sau “rac” şi a fost atribuita acestei clase

de maladii datorita aspectului multiramificat şi modului de propagare multidirectional al celulelor şi tesuturilor canceroase.

Cancerul apare ca urmare a dereglarii ciclului celular, în urma căreia celulele sunt “arestate” în faza de diviziune, continua să se multiplice şi nu mai devin celule specializate pentru o anumita funcţie. . Dereglarea ciclului celular cauzatoare de cancer apare în urma unor mutatii genetice. Ca rezultat al acestei multiplicari scapate de sub control, apar aglomerari de celule canceroase numite tumori sau neoplazii.

6.9.1. Ce sunt şi cum se formeaza tumorile (neoplaziile) ? In funcţie de aspectul anatomic şi consecintele asupra starii organismului, tumorile pot fi: A. Benigne

1. Sunt tumori localizate şi contin celule care provin din aceeasi celula initiala, celule care la rândul lor sunt foarte asemanatoare cu celulele tesutului din care au aparut. Ex: negii 2. Pot fi relativ usor indepartate chirurgical deoarece sunt izolate de tesutul în care se formeaza. 3. Devin o problema atunci când masa tumorală interfereaza cu functionarea normala a corpului.

B. Maligne 1. Celulele se divid extraordinar de repede, cu mult mai rapid decat celulele tesutului inconjurator. 2. Celulele isi pierd “identitatea” şi devin nediferentiate, pastrand doar o parte din proteinele existente în tesutul de origine.

112

Biologie Celulara

Pentru a se putea afla originea metastazei, în laboratoarele clinice se identifica filamentele intermediare din celulele metastazice, filamente care raman neschimbate ca structura şi care sunt de mai multe tipuri, caracteristice fiecarui tesut.

Cancerele se clasifica în funcţie de tesutul în care apar şi de tipul de celula din care deriva, astfel :

a. adenoame –tumori provenite din epitelii glandulare b. carcinoame – tumori provenite din epitelii (tesuturi care acopera suprafetele - internă şi externă -a organelor) b. sarcoame - tumori derivate din tesuturi de lagatura sau musculare. c. leucemii – tumori care afecteaza celulele sangvine. [Circa 90% din totalul cancerelor umane sunt carcinoame, iar cele mai fecvente sunt afectiunile plamanilor, stomacului, sanilor, colonului/rectului şi a cervixului uterin]

3. în urma unor mutatii genetice suplimentare, care permit desprinderea lor de tesutul de origine, unele celule canceroase pot invada tesuturile invecinate şi chiar cele indepartate, unde se fixeaza pentru a produce noi tumori (numite secundare sau metastaze) a. Pentru a metastaza, celulele canceroase trebuie să “evadeze” din adeziunea cu celulele tesutului de origine. Este un proces “neobisnuit” care necesita alterari ale proteinelor implicate în adeziunea dintre celule. Celulele metastatice au suprimata expresia unor molecule proteice (de ex. E-cadherinele) implicate în adeziunea celulelor

b) Pe de alta parte celulele metastatice au supraexprimate proteine (integrine) cu rol în legarea de lamina bazala (structura care impiedica desprinderea celulelor de tesut) şi a enzimelor colagenaza IV şi plasmina cu rol în digestia laminei bazale (bogate în colagen, care confera suport şi rezistenta tesutului). Odata penetrata lamina bazala, celulele tumorale ajung în circulatia sangvina şi limfatica de unde se raspandesc, invadeaza şi colonizeaza noi tesuturi. 4. Cresterea tumorilor necesita formarea unor noi vase de sange care să alimenteze continuu celulele ce se multiplica.

a. în lipsa unui supliment de sange, metastazele pot creste doar foarte puţin până când celulele din interiroul lor incep să moara.

b. Majoritatea tumorilor pot induce formarea unor noi vase de sange, adica stimuleaza procesul numit angiogeneza. Stimularea angiogenezei de către tumori este posibila datorita secreţiei de factori de crestere angiogenica (precum bFGF) şi a factorilor de crestere endoteliala (VEGF).

Posibilitatea de a incetini cresterea tumorilor prin inhibarea angiogenezei este un o directie noua de cercetare a cancerului. în diverse faze de testare (de laborator sau clinice) se afla o serie de agenti antiangiogenici capabili de reducerea angiogenezei prin legarea şi blocarea factorilor proangiogenici (legarea VEGF de către endostatina) sau prin inhibarea secreţiei lor ca urmare a acţiunii la nivel genomic sau prin blocarea receptorilor celulari pentru factorii proangiogenici (hormoni corticosteroizi)

5. Celulele tumorale trebuie să evite moartea celulară programata (apoptoza) şi atacul celulelor din sistemul imunitar. Aceste piedici sunt contracarate prin activarea unor oncogene- gene ale caror expresie suprima genele implicate în apoptoza celulelor tumorale (gena p53), stimuleaza formarea şi diferentierea vaselor de sange tumorale, sunt responsabile pentru exprimarea unor molecule de recunoastere (citokine) pentru a nu fi recunoscute ca celule straine, “pacalind” astfel celulele sistemului imun (macrofage)

6.9.2. Care sunt cauzele apariției cancerului? 

113

Declansarea cancerului (dereglarii ciclului celular) se produce în urma mutatiilor genetice. O singura mutaţie a unei gene este o condiţie necesară dar nu suficienta pentru a converti o celula sanatoasa în una canceroasa. Este nevoie de producerea simultana sau în timp a catorva mutatii rare. Procesul inducerii starii de cancer se numeste oncogeneza.

Mutatiile genetice se produc regulat (spontan) în celule la o rata de 10-6 per gena per diviziune celulară. [Prezenta agentilor mutageni (raze UV, diversi compuşi chimici) cresc rata mutatiilor genetice!]. Odata cu inaintarea în varsta creste riscul de apariţie a cancerelor din cauza acumularii mutatiilor genetice.

A. în laborator, ADN izolat dîntr-o celula tumorală, când este introdus într-o celula normala poate cauza transformarea acesteia . Celulele transformate prezintă alterari ale ratei de crestere şi ale morfologiei (aspectului). Spre deosebire de celulele normale care cresc până când epuizeaza nutrientii din mediu sau se ating unele pe altele (conflueaza), celulele transformate isi pierd inhibitia de contact, cresc exagerat şi incep să se aglomereze unele peste altele. B. Transformarea celulelor în laborator este o tehnica folosita pentru a izola şi identifica genele implicate în oncogeneza.

• In celule izolate de soarece se introduc fragmente mici de ADN (cu 1-2 gene), izolat din tumori umane. • Celulele de soarece care prezintă o crestere neobisnuita sunt apoi izolate iar ADN-ul celulelor transformate

este extras. • In continuare este izolat un fragment şi mai mic de ADN şi transformarea este repetata pentru a restrange aria

de cautare în ADN. • ADN care produce cea de-a două transformare este clonat apoi intr-un bacteriofag (virus bacterian) care este

utilizat pentru a infecta bacterii. • Bacteriile transformate cu ADN uman cauzator de cancer sunt cultivate pentru a obtine o biomasa suficienta

pentru izolarea unei cantitati detectabile de ADN bacteriofagic. • In final ADN-ul este izolat şi secventiat pentru identificarea genei umane.

Prin metoda descrisa mai sus s-au izolat cateva gene precum cea pentru proteina Ras. S-a constatat ca

aceasta gena avea o mutaţie în urma căreia proteina Ras anormala rămânea blocata într-o stare legata de GTP. în aceasta stare proteina Ras rămâne activata fiind un permanent semnalizator pentru cresterea celulară, chiar şi în absenta semnalelor reale date de factorii de crestere. în această situaţie celula devine canceroasa deoarece nu se mai opreste din multiplicat. Proteina Ras mutanta este intalnita în circa 30% din cazurile de cancer şi mai ales în cancerul pancreatic şi cel de vezica urinara .

Genele care codifică factori de declansare a cancerului se numesc oncogene. Ele sunt prezente în

genom ca proto-oncogene exprimand proteine normale, implicate în desfăşurarea functiilor celulare. Proto-oncogenele în urma unor mutatii, pot declansa anomalii ale ciclului celular.

C. Cancerul progreseaza într-o maniera multifazica. Ipoteza multifazica a declansarii cancerului susţine ca:

I. într-o primă etapă o mutaţie conferă unei celule un uşor avantaj în creştere, rezultând o clonă de celule

II. in a două etapă, una din celulele acestei aglomerări suferă o a două mutaţie care ii permite o creştere şi mai puţin controlată formând tumoarea benignă

III. a. treia mutaţie care apare într-una din celulele tumorii benigne ii permite să depăşească rata de creştere a celorlalte celule atingându-se stadiul de tumoare pre-canceroasă

IV. a patra etapă constă într-o mutaţie a unei celule din tumoarea pre-canceroasă care ii permite evadarea din ţesut, pătrunderea în circulaţia sangvină şi limfatică şi metastazarea.

În timp, odata cu acumularea mutatiilor, o tumoare benigna poate deveni maligna.

114

Biologie Celulara

O dovadă experimentală în sprijinul ipotezei multifazice este obsevaţia că şoarecii care supraexprimă proto-oncogena myc prezintă un risc usor crescut de e dezvolta cancer în timp. Prin încrucişarea a doi şoareci transgenici, unul cu proto-oncogena myc supraexprimată iar celălalt cu proto-oncogena ras mutantă, descendenţii dezvoltă cancer în 100% din cazuri.

Exista două tipuri de gene implicate în apariţia stării de cancer: proto-oncogenele (de care am amintit anterior) şi genele de supresie tumorală). Spre deosebire de oncogene a căror exprimare este cauzată de o mutaţie, genele de supresie tumorală induc starea de cancer atunci când expresia lor este inhibată ca urmare a mutaţiei.

Proto-oncogenele care sufera mutatii devin oncogene şi supraexprima proteine mutante cauzatoare de cancer. Genele de supresie tumorală care sufera mutatii, sunt inhibate iar factorii supresori ai tumorii nu mai sunt exprimati, permitand dereglarea ciclului celular. In afara mutatiilor spontane care pot aparea la un moment dat în proto-oncogene, apariţia oncogenelor poate fi cauzata de aducerea ei de către un virus (oncogene virale). Astfel unii retroviruşi şi adenoviruşi contin material genetic care includ şi oncogene. De exemplu virusul sarcomului Rous este un retrovirus care infecteaza puii. El contine o oncogena numita v-Src, altfel inutila pentru multiplicarea virusului. în genomul puilor exista însă o proto-oncogena c-Src ce codifică un receptor tirozin-kinazic. Oncogena v-Src, fiind foarte apropiaţa (omoloaga) ca structura de c-Src¸se incorporeaza usor în genomul cazda şi acţionează ca oncogenă, declanşând boala.

In cazul cancerelor umane se cunosc atât adenovirusuri (papilomavirusul uman responsabil de cancerul de col uterin, virusul hepatitei B, virusul herpetic Epstein-Barr) cat şi ribovirusuri (virusul hepatitei C, virusul leucemiei limfocitelor T).

Genele de supresie tumorală codifică proteine care funcţionează pentru a stopa proliferarea celulară. Pierderea funcţiei acestora contribuie la declanşarea cancerului prin eliminarea activităţii de frânare a proliferării. în multe cazuri genele surpesoare de tumori codifică proteine de control al ciclului celular (vezi Capitolul 6. Ciclul şi diviziunea celulară). proteinele de supresie tumorală pot fi:

a) proteina care inhiba sau reglează progresia ciclului celular; b) receptori pentru proteine de secreţie care inhiba proliferarea celulară (ex TGF-beta); c) proteine implicate în adeziunea celulară (ex: cadherinele) [90% din carcinoamele umane prezentand

o descrestere a expresiei E-cadherinelor]; d) Proteine de control care aresteaza ciclul celular în cazul în care ADN este replicat incorect sau

cromozomii nu se formeaza normal (ex: proteina p53); e) Proteine care declanseaza moartea celulară programata (apoptoza); f) Enzime implicate în repararea ADN.

O singura copie a genei (care se afla în dublu exemplar) este suficienta pentru exprimarea proteinei ce controleaza ciclul celular. Dereglarea ciclului celular are loc numai daca ambele gene (alele) de supresie tumorală sunt inhibate.

Cancerul de san ereditar este o boala mostenita în care descendentii manifesta o predispotitie marita pentru  cancer mamar.  El  apare  datorita  unei mutatii  a  genei  de  supresie  tumorală  BRCA1.  femeile  care mostenesc o singura copie mutanta a genei BRCA1 au 60% probabilitate de a dezvolta cancer mamar până la varsta de 50 de ani. O singura mutație în gena alela BRCA1   poate suprima în totalitate expresia proteinei codificăte. Femeile care mostenesc două gene normale BRCA1 au doar 2% probabilitate de a dezvolta cancer.  

 Alte  forme  de  cancer  cu  posibile  cauze  ereditare  este  cancerul  uman  colorectal  şi  polipoza 

adenomatoasa familiala (FAP) cu frecventa de până la 1/7000 în S.U.A. Cauza acestei forme de cancer este o mutație  în gena de  supresie  tumorală APC. Gena APC mutanta poate  fi  transmisa urmasilor. Gena APC codifică o proteina care inhiba factorul de transcriptie Beta‐catenina. Beta‐catenina se leagă şi stimuleaza la 

115

rândul ei diversi factori declansatori ai mitozei. în absenta proteinei codificăte de APC, mitoza se desfasoara necontrolat. Ca urmare a proliferării celulare apar polipii  (tumori pre‐canceroase). O mutație ulterioara  (a unei proto‐oncogene ras) determina transformarea polipilor  în adenom de clasa II. Daca una dintre celulele adenomului  format  sufera  o  noua mutație  (la  nivelul  unor  gene  codificătoare  de  proteine  de  adeziune), descendentii acestei celule vor pierde  inhibitia de contact  formand un adenom de clasa III (inca benign). O noua mutație care afecteaza gena de supresie tumorală p53 determina apariția tumorii maligne (carcinom). Mutatia imediat următoare poate declansa metastaza.  

Cancerul de colon poate fi prevenit prin verificari regulate şi indepartarea chirurgicala a polipilor.

6.9.3. Depistarea şi tratarea cancerului 

Identificarea timpurie a predispozitiei la cancer Metodele moderne de identificare şi depistare precoce a riscului de cancer constau în principal în

descoperirea markerilor de boala. Unul dintre acesti markeri este integritatea genei pentru proteina p53. S-a constatat ca un marker (compus al cărei prezenta sau absenta indica o anumita stare patologica a celulei) frecvent intalnit în celulele canceroase este proteina p53. p53 este un reglator al ciclului celular, monitorizand trecerea de la faza G1 la S şi contribuind la procesele reparatorii ale ADN. De asemenea p53 este implicat în cascada de evenimente ce precede moartea celulară programata.

Mutatia ambelor gene alele (omoloage) pentru p53 este observata în numeroase cazuri de cancer. O forma de observare a predispozitiei pentru cancer este prelevarea de celule de la pacient şi secventierea genei p53 pentru urmarirea mutaţiei. Daca o copie a genei p53 este mutanta atunci riscul pacientului testat de a dezvolta diferite forme de cancer (cancer mamar, pulmonar, al ochilor etc) este mare.

Cancerul colului uterin este puternic asociat cu papilomavirusul uman (HPV). 90% din cazurile de cancer de  col uterin  sunt provocate de acest virus. Celulele  infectate  cu acest virus manifestă o proliferare sporită  şi  invadează  suprafața  internă  a uterului  (fenomen numit displazie). Ele  se  inserează  intre  celulele dermice, bogate  în keratină  şi bine diferențiate. Ulterior aceste  celule anormale  se grupează  formând polipi (tumori pre‐canceroase).  

Testul  de  laborator  Papanicolaou  (sau  PAP)  constă  în  prelevarea  de  celule  de  pe  suprafața cervixului uterin, colorarea şi analiza lor sub microscop. Punctul de interes pentru investigator este aspectul matur  sau  imatur  al  celulelor  precum  şi  dimensiunea  nucleului.  Celulele  normale  sunt  diferențiate,  au dimensiuni mari şi nuclei mici, foarte condesați. În schimb celulele tumorale prezintă un aspect imatur, sunt nedezvoltate, au citoplasma puțină şi nucleu foarte mare, pregătit pentru diviziune. În acest stadiu displazia (arii  cu  celule  tumorale)  poate  rămâne  localizată  sau  poate  regresa.  Uneori  însă  displazia  poate  evolua periculos  spre  carcinom  in  situ  în  acest  caz  întregul  epiteliu  al  cervixului  uterin  este  acoperit  de  celule neoplazice.  Indepartarea chirurgicală a polipilor  şi a uterului  este  recomandată pentru  scăderea  riscului de metastază.  Tratamentul cancerului 

In unele cazuri, indepartarea chirurgicala a tumorilor maligne nu este suficienta pentru inlaturarea completa a riscului de metastaza. în funcţie de gravitatea cazurilor se recomanda aplicarea de tratamente combinate (radioterapie - raze UV scurte, chimioterapie – medicamente care tintesc diverse componente celulare, molecule implicate în caile de declansare a proliferării celulare etc).

Radioterapia cu radiatii ionizante (UV scurte, X, gamma) are ca efect denaturarea ADN din celulele proliferante. în aceste condiţii celulele tumorale a caror ADN este mai susceptibil la distrugere sunt stopate în proliferarea lor. Dezavantajul este ca nu numai celulele neoplazice sunt distruse ci şi celulele normale care prolifereaza.

Chimioterapia constă în utilizarea unor medicamente capabile de : - stoparea formării fusului mitotic (citostatice precum: taxolul, colchicina etc);

116

Biologie Celulara

[Dezavantajul utilizării acestor medicamente este apariţia rezistentei primare şi secundare la medicamente datoritat activităţii pompelor de tip ABC, a caror structura a fost discutata în Capitolul 3] - stimularea celulelor sistemului imunitar (limfocite) care ataca celulele tumorale (ex. citokine

precum interleukina IL-12) - inhibarea angiogenezei (ex.hormoni corticosteroizi, interferoni) - inhibarea factorilor de crestere - inhibarea pompelor de eflux de tip ABC (MDR) (ex. Verapamil, diferiti analogi ai ciclosporinei) - inducerea apoptozei celulelor tumorale ( interleukina IL-13) Terapia cu anticorpi monoclonali constă în utilizarea unor anticorpi specifici anti-antigene asociate membranelor celulelor tumorale (ex anticorp anti-gangliozid GD3 asociat cu suprafaţa celulelor de melanom). Terapia genică constă în transferul de material genetic în celule cu scopul de a transforma fenotipul celular canceros în fenotip celular normal sau de a suprima funcţia oncogenelor. Materialul genetic este introdus fie prin diferite sisteme de transport de natura virală (capsulă virală sau virusuri atenuate) sau de natură non-virală (diferiţi polimeri, liposomi).

Aspirina are acţiune inhibitoare asupra ciclooxigenazei, enzimă implicată în calea sintezei

prostaglandinelor, compuşi lipidici care intervin în multiple evenimente celulare (mitoza, adeziune celulară, apoptoza). Ciclooxigenaza are concentraţii ridicate în tumorile colorectale astfel că inhibarea ei de către aspirina este asociaţa cu scaderea de până la 50% a riscului de cancer metastazat de colon. Bibliografie CRĂCIUN, C., Citologie Generală, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2005, p. 161-163 MIXICH, F., Biologie celulară şi moleculară, Editura Aius, Craiova, 1999, p. 253-275, 277-300

7. Semnalizarea celulară oate celulele, indiferent dacă aparţin unor organisme unicelulare sau trăiesc într-un sistem pluricelular, sunt permanent bombardate de o multitudine de semnale. Una dintre proprietăţile esenţiale ale viului este

de a detecta şi de a răspunde semnalelor din mediu, cu consecinţe cruciale pentru supravieţuire. Principiile şi componentele de bază ale semnalizării celulare sunt similare în tot spectrul de organisme: bacterii, fungi, plante sau animale.

T Semnalizarea celulară nu este importantă doar pentru înţelegerea funcţionării unei celule normale ci

şi pentru înţelegerea creşterii şi activităţii unei celule aberante sau a supuse unor factori perturbatori. Principiile de bază ale semnalizării celulare  Evenimentul declanşator al mecanismului de semnalizare celulară este sosirea la nivelul celulei a unui stimul care obligă celula să răspundă. Acest stimul poate fi un foton ca în cazul celulelor din retina ochiului. Stimulul poate avea şi o natură chimică, un compus eliberat fie de un alt organism, fie de o altă celulă aflată în acelaşi organism. Cele mai multe semnale sau stimuli sunt percepuţi la nivelul membranei plasmatice, după un scenariu prezentat în Fig. 7.1.

117

CITOPLASMĂ

NUCLEU

MEM

BRAN

A

PLAS

MAT

ICĂ

Metabolism (contracţia musculară, etc)

Proteine noi Traducerea semnalului

Expresie genică

Fig. 7.1. Principalul eveniment în semnalizarea celulară, sosirea semnalului la suprafaţa celulei, este urmată de o cascadă de evenimente în urma cărora “mesajul” este purtat la destinaţia finală, fie în nucleu, fie în citoplasmă.

Stimul primar

Sosirea semnalului este succedată de următoarele evenimente:

• recepţia semnalului, de obicei realizată de către proteine denumite receptori;

• transmiterea semnalului de către receptor în interiorul celulei; • traducerea “mesajului” prin intermediul unor componenţi ai semnalizării celulare, de regulă grupaţi

în “cascada de semnalizare celulară” sau în “traducerea semnalului” (Fig. 7.1); • sosirea mesajului la destinaţia finală în celulă; • răspunsul celulei, o acţiune realizată în concordanţă cu semnalul recepţionat. În figura de mai sus,

un semnal iniţial declanşează modificări ale activităţilor metabolice din citoplasmă respectiv ale expresiei genice din nucleu.

Câteva aspecte generale privind semnalizarea şi răspunsul celular sunt de reţinut. (1) Un stimul unic poate declanşa mai multe răspunsuri simultan, datorate activării mai multor cascade de

semnalizare. Aceste cascade de semnalizare pot avea componente comune cu a altor cascade. De exemplu, hormonii care declanşează activarea fosfolipazei C iniţiază atât cascada inozitol trifostaului cât şi cascada kinazică

(2) O cantitate redusă de stimul poate sensibiliza celula pentru a declanşa un răspuns consistent. De exemplu, răspunsul la un număr mic de molecule de hormoni ajunse la suprafaţa celulei necesită activarea unui mare număr de enzime şi de aceea prezenţa unor elemente de “amplificare” este necesară în sistem.

(3) Celulele trebuie să fie selective cu stimulii, fiind în permanenţă asaltate de mii de astfel de semnale chimice. Celulele nu-şi permit luxul de a accepta toate semnalele în acelaşi timp. Ele nu răspund tuturor semnalelor prezente în mediu ci mai degrabă unui număr limitat. Anumite semnale sunt percepute doar de un anumit tip de celule, în timp ce celulele învecinate pot rămâne pasive. De exemplu, doar celulele sistemului imun la mamifere răspund unui atac al germenilor patogeni, iar nu toate celulele corpului.

Caracteristicile unui stimul  În natură existo o varietate enormă de stimuli, de la molecule proteice de diverse dimensiuni, la compuşi gazoşi. O proprietate esenţială a unui stimul este specificitatea sa. Celula care detectează stimulul trebuie să fie capabilă să primească şi să răspundă la mesajul corect purtat de acel stimul.

118

Biologie Celulara

Pentru a fi efectiv, semnalul trebuie să aibă dimensiuni mici, capabil de a circula cu uşurinţă de la locul de sinteză la locul de destinaţie. Semnalele extracelulare sunt purtate, de exemplu, cu ajutorul sistemului vascular. Semnalele intracelulare însă trebuie să fie suficient de mici pentru a difuza (pe cale simplă sau facilitată) prin membranele care înconjoară diversele organite celulare. Unele semnale de mari dimensiuni (proteine mari, lipide) nu sunt capabile de a circula pe distanţe lungi. Semnalele, fie extra- sau intracelulare trebuie să fie rapid şi uşor de produs, mobilizat şi degradat, astfel încât răspunsul celular să fie pornit sau oprit cu rapiditate.

Există două căi majore de producere rapidă a unui semnal: (a) pe cale enzimatică un semnal poate fi sintetizat de regulă dintr-un substrat larg răspândit, uşor accesibil (de exemplu din ATP); (b) cu pornire de la o moleculă precursoare (pre-semnal) care este produsă permanent şi depozitată în anumite structuri de unde este eliberată la nevoie.

sau

(a) (b)

Fig. 7.2. Căile majore de sinteză rapidă a semnalelor. (a) calea enzimatică, din substrate accesibile (de exemplu sinteza cAMP din ATP), respectiv (b) sinteza sau sechestrarea unor pre-semnale ce vor fi eliberate sub formă de semnale atunci când situaţia o cere (de exemplu, eliberarea ionilor de Ca2+ din RE în citosol)

În general, prima cale de sinteză a semnalelor este des întâlnită în cazul semnalizării intracelulare iar cea de a doua, în cazul semnalizării extracelulare. La fel de importantă precum sinteza este şi degradarea sau sechestrarea semnalului. În celulă există un echipament enzimatic capabil de activarea-inactivarea semnalelor, iar în general enzimele implicate în aceste procese fac parte din grupa fosfatazelor şi kinazelor. Alte aspecte ale opririi răspunsului celular pot implica diminuarea sintezei receptorilor şi inhibarea expresiei genelor ce declanşează răspunsul.  Căile de semnalizare celulară  În funcţie de distanţa dintre celula generatoare de semnal şi ţintă există mai multe clase de semnalizare aşa cum sunt prezentate în tabelul de mai jos. Tabel 7.1. Tipurile de semnalizare ce au loc într-un organism şi distanţele la care semnalele pot fi efective

Clasa de semnalizare Intervalul de semnalizare

într-un organism Observaţii

Electrică Distanţă lungă Propagarea unui potenţial electric de-a lungul unei celule (ex. celula nervoasă)

Endocrină Distanţă lungă Eliberarea şi recepţia hormonilor Paracrină Distanţă scurtă Eliberarea şi recepţia semnalelor extracelulare Contact celulă-celulă Celule învecinate Fie prin semnalizare mediată de receptori fie

prin joncţiuni de comunicare (animale) sau plasmodesme (plante)

Autocrină Aceeaşi celulă Utilizarea semnalelor difuzibile

119

Semnalizarea electrică sau sinaptică Este o modalitate rapidă şi eficientă de semnalizare pe distanţe lungi. Ea are loc prin modificarea

potenţialului electric transmembranar şi este utilizată de celulele neuronale din sistemul nervos. Celulele neuronale prezintă prelungiri (axoni şi dendrite) care sunt în contact cu prelungirile altor celule neuronale prin intermediul sinapselor. Transmiterea electrică are loc de-a lungul suprafeţei prelungirilor neuronale, până la nivelul sinapselor. Aici transmiterea semnalului se face fie pe cale electrică fi pe cale paracrină (vezi mai jos). Semnalizarea endocrină

Se bazează pe sinteza de molecule-semnal de către celule specializate, transportul moleculelor pe distanţe lungi şi recepţia semnalelor de către celule-ţintă. Este o modalitate de control la distanţă a activităţii unor ţesuturi şi organe de către ţesuturi specializate (de ex. glande hormonale). Deoarece circulaţia prin sistemul vascular (sânge, la animale sau sevă, la plante) este relativ lentă şi nespecifică, semnalizarea endocrină realizează un control de durată, determinând răspunsuri întârziate şi prelungite. Reglajul hormonal la plante si animale are la bază semnalizarea endocrină. Semnalizarea paracrină În acest caz semnalele elaborate de anumite celule sunt detectate de celule-ţintă apropiate. Transportul moleculelor-semnal în semnalizarea paracrină este puternic limitat de degradări enzimatice, de imobilizarea sau preluarea lor de alte celule învecinate. Transmiterea semnalelor la nivelul sinapselor (unde o celulă nervoasă eliberează molecule numite neurotransmiăţtori, preluate rapid de celula neuronală adiacentă) şi răspunsul imun (în care o varietate de celule sangvine albe eliberează citokine şi chemokine care modulează activitatea altor celule albe şi a unor celule locale) sunt două exemple de semnalizare paracrină. Semnalizarea autocrină Este asemănătoare celei paracrine dar în acest caz, celula producătoare de semnal este celulă-ţintă în acelaşi timp. Comportamentul autocrin este întâlnit la celulele în curs de creştere şi diferenţiere care produc hormoni sau factori de creştere. Odată ce a fost stabilită direcţia de specializare, un sistem autocrin este declanşat iar celula se autostimulează pentru a urma acea direcţie. Semnalizarea autocrină este, de asemenea, întâlnită şi la celulele tumorale care produc hormoni de creştere ce stimulează creşterea şi proliferarea necontrolată. Semnalizarea directă celulă-celulă Este prezentă la celulele care se găsesc în contact fizic şi se realizează fie prin sinteza de molecule de recunoaştere cu localizare pe suprafaţa celulei (markeri moleculari), fie prin comunicarea directă prin arii specializate (cum ar fi joncţiunile de comunicare, la animale, respectiv plasmodesmele, la plante). Amplificarea cascadei de semnalizare  Mecanismul traducerii semnalului de la o celulă la alta şi apoi în interiorul celulei-ţintă necesită formarea unui lanţ de molecule semnal, fiecare trecând mesajul următoarei molecule din lanţ. Un semnal extracelular (numit mesager primar) recepţionat de o celulă, conduce la apariţia temporară a unor molecule mai mici în interiorul celulei, numite mesageri secundari. Mesagerii intracelulari activează sau alterează activitatea următorului component al căii de traducere, de exemplu, o kinază.

Mesageri secundari bine studiaţi sunt cAMP (AMP ciclic), IP3 (inozitol trifosfat), DAG (diacilglicerol) şi ionii de Ca2+.

O caracteristică importantă a cascadei de semnalizare este capacitatea de amplificare a semnalului original, astfel încât rezultatul final este un răspuns eficient al celulei-ţintă.

120

Biologie Celulara

Cu alte cuvinte, legarea unei molecule de hormon (ligand) de un receptor membranar va duce la activarea unui mare număr de molecule enzimatice (Fig. 7.3) declanşând o cascadă de semnalizare amplificată. Astfel este cazul concret al activării proteinelor G de către hormonii hidrofili. În continuare proteinele G vor activa câteva adenilil-ciclaze. Fiecare enzimă ciclazică va cataliza formarea a numeroase molecule de cAMP (mesager secundar) cu pornire de la ATP. cAMP la rândul lor vor activa mai multe kinaze care vor fosforila un mare număr de proteine, cauzând amplificarea în continuare a semnalului. Astfel, legarea unei singure molecule hormonale de suprafaţa celulară poate activa sute sau chiar mii de enzime de molecule enzimatice care, fiecare, pot cataliza mai multe reacţii.

Ligand

AmplificareEnzimă

Mesager secundar Mesager secundarMesager secundar

Kinază KinazăKinază

Amplificare

Amplificare

Rec

epto

r

Fosforilare FosforilareFosforilare

Amplificare Cascadele de semnalizare celulară nu formează, de regulă, căi izolate, cu rute definite, mergând de la un stimul la un singur rezultat final. Cele mai multe molecule semnal au efect asupra mai multor cascade de semnalizare, stimularea unui alement dintr-un lanţ de traducere poate activa elementele uneia sau mai multor cascade de semnalizare (Fig. 7.4).

Enzimă activată care produce multe

molecule

Enzimă activată care produce multe

molecule Enzimă activată

care produce multe molecule

Amplificare

Efect Efect

Receptori

Fig. 7.3. Exemplificarea modului în care are loc amplificarea în cascada de traducere a semnalului

Efect Fig. 7.4. Reţeaua cascadelor de semnalizare Semnalele extracelulare Comunicarea dintre celule aflate la o distanţă oarecare se realizează prin intermediul unor semnale de natură chimică. Din această categorie fac parte hormonii (prezenţi atât la animale cât şi în plante), citokinele, factorii de creştere, neurotransmiţătorii, etc. Natura şi proprietăţile lor fizico-chimice le obligă să urmeze anumite căi de transmitere şi semnalizare celulară (endocrină, paracrină sau autocrină). Adeseori, disfunţiile datorate absenţei sau excesului de semnale extracelulare sau deficitului de receptori pot declanşa stări patologice în organism. Hormonii

Hormonii animalelor au fost primele molecule-semnal extracelulare studiate şi, totodată sunt cele mai bine cunoscute. Hormonii sunt produşi în permanenţă de anumite organe specializate (glande), pătrund în

121

sistemul circulator şi inundă practic întreg organismul, ajungând până la cele mai îndepărtate celule (semnalizare endocrină). Chiar dacă aproape toate celulele vin în contact cu hormonii, doar cele care posedă receptori specializaţi pot traduce mesajul purtat de hormon şi pot emite un răspuns adecvat semnalului.

În funcţie de natura chimică şi localizarea receptorilor, hormonii pot fi împărţiţi în câteva clase: - hormoni mici hidrosolubili; - hormoni peptidici; - hormoni lipidici cu receptori pe suprafaţa celulară şi - hormoni lipidici cu receptori intracelulari Din categoria hormonilor mici hidrosolubili fac parte histamina şi epinefrina (adrenalina) şi ei nu

pot străbate membrana plasmatică datorită încărcăturii lor electrice la pH-ul fiziologic. Hormonii peptidici sunt hidrosolubili. De obicei eliberarea lor este rapidă deoarece în celulă sunt depozitaţi în interiorul vacuolelor de unde, la nevoie, sunt externalizaţi prin exocitoză. Un exemplu cunoscut de hormon peptidic este insulina. Hormonii de natură lipidică pot fi recunoscuţi de receptori aflaţi la suprafaţa celulei (ca în cazul hormonilor hidrosolubili) sau pătrund prin bistratul lipidic pentru a ajunge la receptorii intracelulari specializaţi. Principalul grup de hormoni lipofilici cu receptori extracelulari sunt prostaglandinele iar hormonii cu receptori intracelulari fac parte din clasa hormonilor steroidici (estrogeni, progesteron, androgeni, glucocorticoizi, cortizol şi vitamina D), tiroidieni (tiroxina) şi precursorilor retinoidici (vitamina A sau retinolul). Hormonii plantelor (fitohormonii sau factorii de creştere ai plantelor) Denumirea de “hormoni” în cazul plantelor este relativă deoarece diversitatea chimică a compuşilor implicaţi în creşterea, fototropismul (mişcarea în funcţie de direcţia luminii) şi răspunsul la stress al plantelor este foarte mare. Din această categorie amintim auxina (având un nucleu indolic), citokininele (cu nucleu adenilic), giberelinele, acidul abscisic şi etilena (compus gazos). Citokinele şi chemokinele Sunt un grup extrem de divers de molecule peptidice cu masă moleculară mică (6-60 kDa) şi cu efecte dintre cele mai variate şi profunde. Citokinele şi chemokinele sunt produse de un mare număr de celule şi au efect doar asupra celulelor învecinate sau a celor care le sintetizează (semnalizare paracrină şi autocrină). Dintre citokinele mai cunoscute amintim interleukinele, interferonii, factorii de necroză tumorală. Chemokinele sunt o superfamilie de peptide grupate pe baza unui caracter chimic comun: prezenţa unei secvenţe conservate conţinânt patru resturi de cisteină. Factorii de creştere Sunt compuşi care au funcţie specifică în reglarea creşterii şi diferenţierii celulare. Peste 50 de proteine sunt cunoscute ca având proprietăţile unui factor de creştere (de exemplu, PDGF, factorul de creştere derivat din plachete, EGF – factorul de creştere epidermal, FGF – factorul de creştere al fibroblastelor). Neurotransmiăţtorii Sunt compuşi specifici terminaţiilor neuronale unde exercită o funcţie paracrină. Acest grup include acetilcolina, acidul gamma-aminobutiric (GABA) şi dopamina.

Alte molecule –semnal extracelulare sunt: - feromonii , molecule secretate de un individ şi având efect asupra unui alt individ din aceeaşi

specie; feromonii sunt semnale folosite în comunicarea dintre bacterii, mucegaiuri, nevertebrate şi vertebrate. Structura chimică a feromonilor este diversă, incluzând derivaţi ai aminoacizilor, peptide, proteine şi acizi graşi.

- ATP este produs în principal prin procesul de fosforilare oxidativă în mitocondrii. Prezenţa sa în mediul extracelular este accidentală, rezultând în urma lezării sau morţii celulelor. Apariţia ATP în fluidele extracelulare este percepută de o serie de celule cu receptori de suprafaţă specializaţi (purinoceptori), aşa cum sunt trombocitele (plachetele sangvine), neutrofilele, fibroblastele (celule stem ) celule musculare netdede şi celulele din pancreas.

Detecția semnalelor extracelulare: rolul receptorilor 

122

Biologie Celulara

Detecţia unei molecule-semnal la suprafaţa sau în interiorul celulei poate fi realizată de un receptor (moleculă proteică, de regulă cu localizare membranară) caz în care molecula-semnal joacă rolul de ligand.

Concentraţia moleculelor-semnal în mediul extracelular este în general foarte mică (10-8 M). Celulele trebuie să fie capabile să detecteze şi să răspundă unor astfel de concentraţii reduse. În plus, suprafaţa celulară este permanent şi simultan asaltată de o multitudine de semnale dintre care numai o parte prezintă interes pentru celulă. Abilitatea de discriminare şi legare a moleculelor-semnal importante pentru viaţa celulei se realizează prin exprimarea receptorilor specializaţi, atât pe suprafaţa celulei cât şi în mediul intracelular (citoplasmă şi nucleu).

Pentru a fi eficienţi, receptorii îndeplinesc trei criterii cruciale: - specificitate, - afinitate de legare ajustată în asemenea măsură încât să detecteze molecula-semnal la

concentraţia cea mai probabilă să existe în preajma celulei; - capacitate de transmitere a mesajului pentru care semnalul este desemnat, de regulă prin

modularea unor componente care intră în cascada de semnalizare.  Tipuri de receptori  În discordanţă cu diversitatea semnalelor extracelulare, majoritatea receptorilor celulari se grupează în cinci clase:

- receptori legaţi de proteine G; - receptori legaţi de canale ionice; - receptori cu activitate enzimatică intrinsecă; - receptori legaţi de tirozin-kinaze şi - receptori intracelulari.

Primele patru clase sunt receptori cu localizare pe faţa externă a membranei plasmatice (receptori extracelulari).

Având în vedere diversitatea de molecule-semnal, a căilor de transmitere a semnalelor, natura şi localizarea receptorilor, există numeroase modalităţi de semnalizare celulară. Dacă anterior am amintit în principal aspectele comune semnalizării celulare la diferite organisme, în cele ce urmează vom prezenta procesul de semnalizare celulară în câteva exemple concrete.

1. Cascade de semnalizare mediate de nucleotide ciclice (AMPc şi GMPc)

În 1971, premiul Nobel pentru medicină a fost atribuit lui E.Sutherland pentru identificarea AMP

ciclic (AMPc) ca mesager secundar în semnalizarea hormonilor hidrofilici (peptidici şi catecolaminici). Hormonul însuşi constituie mesagerul primar într-un proces în care legarea sa de un receptor membranar declanşează o cascadă de semnalizare amplificată. S-a constatat experimental că legarea unui hormon hidrofilic de un receptor membranar este urmată în scurt timp de creşterea concentraţiei de AMPc şi un răspuns celular constând, de exemplu, în accelerarea glicogenolizei. Etapele cascadei de semnalizare celulară amplificate cu participarea AMPc ca mesager secundar pot fi rezumate astfel:

a) Un complex proteic cu activitate GTPazică (guanozin trifosfat hidrolazică), numit “proteina G” este activată ca urmare a legării hormonului de receptorul membranar. În stare inactivă, proteina G este un trimer constituit din trei subunităţi, α, β şi γ, în care subunitatea

cu acţiune catalitică, α, este legată de GDP. Proteina G inactivă este areceptorului membranar. Forma activă a proteinei G este reprezentată de monomerul α legat de GTP.

taşată pe faţa citoplasmică a

123

AMPc

b) Proteina G activată va determina activarea adenilat-ciclazei, o enzimă cu localizare pe faţa citosolică a membranei plasmatice.

c) Adenilat-ciclaza utilizează ca substrat ATP pentru a genera molecule de AMPc.

d) Odată generat, AMPc funcţionează ca un mesager secundar, transmiţând “informaţia” hormonului unei cascade de semnalizare celulare. AMPc activează la rândul ei o serie de protein kinaze dependente de AMPc. Un exemplu cunoscut de protein kinaze este protein kinaza A.

e) Protein kinaza A poate declanşa răspunsuri la nivel citosolic sau nuclear. Citosolic, protein kinaza A (PKA) intervine de exemplu în reglarea metabolismului glicogenului

(forma de stocare a glucozei). PKA activă fosforilează simultan două enzime cheie: glicogen fosforilaza şi glicogen-sintetaza. Fosforilarea glicogen-fosforilazei duce la degradarea glicogenului la glucozo-1 fosfat în timp ce fosforilarea glicogen-sintetazei determină inhibarea acesteia, deci incetarea sintezei glicogenului.

O schemă a cascadei de semnalizare cu implicarea AMPc este redată în Fig. 7.5..

α

β γ

GDP

Protein kincu 2 subunită

2 cata

n Exteriorul celulei Recepto

F

La nivel nfosforila un factorgene numită elemejoacă roluri import

AMPc are

enzimă citosolică, Un mesag

guanilat-ciclaze derăspunsuri celulare

2. Cascade

Una din cmesagerilor secundhormoni şi factori

Hormo

α

GTP

Adenilat- ciclaza

ATP PPi

AMPc

C

C

R

R

R

R

C

Caza A inactivă ţi reglatoare (R) şi litice (C)

Protein kinaza A activă

Proteină

ATP

ADP

Proteină –(P)

Citosol

r

R , ĂSPUNS CELULAR (de ex.activarea glicogenolizei)

ig. 7.5. Mecanismul de acţiune al unui hormon activator al adenilat-ciclazei

uclear, o parte a PKA active (subunităţi catalitice desprinse de pe cele reglatoare) pot de transcripţie numit CREB. Această proteină se va lega la o secvenţă reglatoare a unei nt de răspuns la AMPc sau CRE influenţând expresia mai multor gene specifice. CREB ante în creşterea şi proliferarea celulară, în învăţare şi memorare, etc.

o viaţă scurtă în celulă iar transformarea ei în AMP prin deciclizare este catalizată de o fosfodiesteraza AMPc. er secundar asemănător AMPc este GMPc, produs de guanilat-ciclaze. Stimularea acestor către semnale precum NO (oxid nitric) sau liganzoi peptidici poate declanşa diverse .

de semnalizare mediate de fosfolipide şi Ca2+ ăile de semnalizare cele mai răspândite în celulele animale se bazează pe utilizarea ari proveniţi din fosfolipidul membranar fosfatidil inozitol 4,5 difosfatul (PIP2). Numeroşi de creştere stimulează hidroliza PIP2 de către fosfolipaza C, o reacţie din care rezultă doi

124

Biologie Celulara

mesageri secundari: diacilglicerol (DAG) respecitiv inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3). DAG şi IP3 stimulează căi de semnalizare diferite determinând activarea proteinkinazei C respecttiv mobnilizarea Ca2+ din RE.

Hidroliza PIP2 este iniţiată: a) fie prin activarea fosfolipazei C β (PLCβ) ca urmare a legării hormonilor de receptori cuplaţi cu

proteine G, b) fie prin activarea unei alte PLC (PLCγ) de către receptori cu activitate tirozin-kinazică specifică.

Diacilglicerolul (DAG) rezultat în urma hidrolizei PIP2, rămâne ataşat de membrana plasmatică şi activează kinaze serin/treonin specifice numite protein kinaze C (PKC). PKC au roluri în răspunurile imune, în creşterea şi diferenţierea celulară, etc. Unele PKC activează o cascadă de proteine kinazice numite MAP kinaze, care prin fosforilarea factorilor de transcripţie produc schimbări în expresia genelor şi stimularea proliferării celulare. Calea MAP kinazică este o cascadă de semnalizare comună tuturor celulelor eucariote.

Clivajul fosfolipazei C

(fosfatidil inozitol 4,5-bifosfat)

PIP2

Inozitol 1,4,5-trifosfat

Diacilglicerol

α γ

Hormon

αGTP

Fosfolipaza C

PIP2

Exteriorul celulei

Protein kinaze C

IP3Proteină Proteină-(P)

ATP ADP

Reticul endoplasmatic

Ca2+

RĂSPUNS CELULAR (ex, contracţia musculară)

RĂSPUNS CELULAR (ex, răspuns imun)

DAGGDP

β

125

Fig. 7.6. Mecanismul de acţiune al unui hormon activator al fosfolipazei C Celălalt mesager secundar, inozitol trifosfatul (IP3), va fi eliberat în citosol. IP3 stimulează eliberarea

Ca2+ din RE prin legarea sa la receptori din membrana RE, care sunt în acelaşi timp şi canale de Ca2+. Ca urmare, nivelurile Ca2+ citosolic cresc foarte mult influenţând activităţile protein kinazelor şi fosfatazelor. Unele protein kinaze necesită pentru activare atât prezenţa DAG cât şi cea a Ca2+, astfel că aceste protein kinaze sunt reglate în comun pe ambele ramificaţii ale căii. Multe din efectele Ca2+ sunt mediate de calmodulină, o proteină care devine activă prin legarea acestui ion. Complexul Ca2+/calmodulină se leagă de o protein kinază care realizează fosforilarea unuia din lanţurile uşoare ale miozinei, iniţiind contracţia actină-miozină. Alte protein kinaze activate de complexul Ca2+/calmodulină fosforilează enzime metabolice, canale ionice şi factori de transcripţie.

Una din modalităţile de semnalizare, prin care se realizează controlul creşterii şi polarizării celulare a fost deja discutată la capitolul despre citoschelet (rolul PIP2 în medierea dinamicii microfilamentelor de actină).

O schemă comună privind mecanismul de semnalizare prin intermediul fosfolipidelor este prezentată în Fig. 7.6.

Căile de semnalizare amintite până acum sunt tipice moleculelor-semnal care se leagă de un receptor membranar, urmată de traducerea mesajului în interiorul celulei. Mai jos vom reda câteva informaţii privitoare la semnalele recepţionate în citosol.

3. Alte căi de semnalizare În general hormonii hidrofobi sunt transportaţi prin plasma sangvină de către proteine specifice de

care se disociază la nivelul membranei celulei-ţintă. Unii hormoni liposolubili au receptori membranari ca în cazul prostaglandinelor şi a factorului de activare plachetar (PAF). Alţi hormoni lipidici au receptorii situaţi în citosol sau în nucleu, ca în cazul hormonilor steroidici, a tiroxinei şi acidului retinoic.

Fiind lipofili hormonii steroidici şi tiroxina sunt solubili în membranele lipidice, difuzând cu uşurinţă în interiorul celulelor ţintă unde interacţionează cu receptorii lor. Receptorii hormonilor tiroidieni au localizare nucleară iar cei ai hormonilor steroidici, localizare citosolică.

Receptorii citosolici ai hormonilor steroidici se găsesc în stare inactivă, fiind legaţi de o proteină inhibitoare. În prezenţa hormonilor steroidici, receptorii citosolici se disociază de proteina inhibitoare şi se leagă de molecula-semnal. Complexul hormon-receptor este activat şi pătrunde în nucleu unde îşi exercită acţiunea similar unui factor de transcripţie. Legarea complexului ligand-receptor la intensificator conduce la activarea genei promotoare pe care se fixează ARN polimeraza iniţiind transcripţia.

Bibliografie: CRUCE, M., Biologie Celulară şi Moleculară, Editura Aius, Craiova, 1999, p. 225-240, 241-243; HANCOCK, J. T., Cell Signalling, 2nd Edition, Oxford University Press, 2005, p. 1-15, 37-58, 61-73; PETRESCU, I., Biochimie, vol. I, Editura Presa Universitară Clujeană, Cluj-Napoca, 1998, p. 147-157

126