11

ELEMENTE DE ANALIZĂ INSTRUMENTALĂCURSUL 8

PROF. DR. SILVIA IMRE

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN TÂRGU-MUREŞSPECIALIZAREA NUTRIŢIE ŞI

DIETETICĂ

1

22

III.5. Spectrometria de fluorescenţă

Absorbţie

Emisie de

radiaţie

fluorescentă

Radiaţie

incidentăRadiaţie

transmisă

Spectrul de emisie

Spectrul de

absorbţie - excitare

Principiul spectrometriei de fluorescenţăSemnal

λ

λ

A

3

Schimbările de energie după absorbţia de radiaţie UV-VIS cu producere de fluorescenţă

4

Lungime de undă, nm

Excitare

(Absorbţie)

Emisie

Sem

nal m

ăsurat

Spectre de excitare şi de emisie (ideal)

Lungimea de undă la care se produce absorbţia în urma căreia

apare emisia de radiaţie fluorescentă poartă numele de lungime

de undă de excitare λex, iar lungimea de undă a radiaţiei emise

poartă numele de lungime de undă de emisie λem

5

Relaţia fluorescenţă - concentraţie

If = K I0 c

unde:

If intensitatea de fluorescenţă

I0 intensitatea radiaţiei incidente

c concentraţia speciei (analitului) fluorescent

K constantă ce caracterizează analitul aflat într-o anumită

matrice.

If corespunde unei perechi de λex şi λem

6

Factori care guvernează proprietatea de fluorescenţă

� Concentraţia unui compus

fluorescent în soluţie nu

trebuie să fie foarte mare;

de regulă, în vederea

determinărilor de

fluorescenţă, concentraţiile

soluţiilor sunt de 10 – 100

ori mai mici decât cele

corespunzătoare

măsurătorilor

spectrometrice UV-VISVariaţia intensităţii

fluorescenţei cu concentraţia

7

pH-ul influenţează

fluorescenţa

substanţelor cu

caracter acido-bazic

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 5 10U

nit

ati

de

flu

ore

sc

enta

(T

%)

Variaţia fluorescenţei metoclopramidei în funcţie de pH

(λλλλex = 272 nm, λλλλem = 356 nm)

Factori care guvernează proprietatea de fluorescenţă

8

Factori care guvernează proprietatea de fluorescenţă

� Atomii grei în soluţie sting fluorescenţa prin coliziune cu moleculele excitate (de exemplu, ionii de bromură).

� Solvenţii vâscoşi favorizează fluorescenţa prin împiedicarea dezactivărilor prin ciocnire.

� Fluorescenţa este dependentă de temperatură deoarece aceasta favorizează dezexcitările prin coliziune; o moleculă care nu este fluorescentă la temperatura camerei poate deveni fluorescentă la temperaturi mai scăzute.

� Formarea complecşilor în soluţie poate modifica comportarea fluorescentă a unor compuşi. De exemplu, prezenţa cafeinei în soluţie reduce fluorescenţa riboflavinei.

9

� Aplicaţii cantitative ale spectrofluorimetriei:� Metode:

� Metoda standardului extern

� Metoda curbei de calibrare etc.

Determinări cantitative

10

Cuva cu

probă

Cuva cu

soluţia

standard

Fluorescenţa

Ip în cuva de l

cm

Fluorescenţa ISîn cuva de l cm

fI

cIc

s

sp

x =

Principiul determinării cantitative pe baza standardului extern

Unde cx şi cs sunt

concentraţia probei şi,

respectiv, a soluţiei

standard

11

Probă

Serie de

soluţii

standard

Ii

ci

<

A

c

Ax

cx

xx

x

x

x

I1c1

I2c2

I3c3

Ixcx

Principiul determinării cantitative prin metoda standardelor externe

(metoda curbei de calibrare)

I

Ix

12

Tipuri de probe şi câteva principii practice de lucru

� Tipuri de probe:� De regulă lichide şi soluţii lichide

� Concentraţiile soluţiilor analizate – vezi explicaţiile anterioare

� Solvenţii probelor lichide se aleg a.î. aceştia să nu absoarbă semnificativ la lungimea de undă maximă la care se fac măsurătorile şi să nu producă stingerea fluorescenţei

� Măsurarea probelor se face faţă de un martor – o soluţie preparată în acelaşi solvent ca proba şi care conţine aproape toţi compuşii probei, cu excepţia substanţei de analizat. Prin folosirea martorului, se scade din fluorescenţa probei, semnalul datorat celorlalţi compuşi prezenţi în probă.

� Cuvele în care se introduc probele:� Sunt confecţionate din materiale care nu absorb în UV-VIS şi au toate

feţele transparente. Ex.:� Cuarţ – domeniul UV-VIS

� Lăţimea cuvelor – de regulă, 1 cm

13

Cuvă de fluorescenţă

14

Aparatură

Schema de principiu a unui spectrometru de fluorescenţă

După http://www.chemicool.com/img1/graphics/fluor-schematic.gif