CURS 4

CRESTEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIANA

Dr. Anda Baicus

Creşterea bacteriană

proces rapid, intenscresterea volumului bacterian

sinteza noi produsiacumulare apa

Multiplicarea bacteriană

• diviziune• raportul suprafaţă volum subunitar•creşterea numărului de bacterii pe un substrat nutritiv corespunzător

Diviziunea bacteriană (sciziparitatea) •directă :

• ADN- autoreplicare semiconservativă•cei 2 cromozomi se deplasează spre polii celulei,• septul transversal în mijlocul celulei • pentru un timp cele 2 celule rămân unite

Dispunerea spaţială a celulelor (grămezi, lanţuri, in diplo) depinde de orientarea în spaţiu a planurilor succesive de diviziune

Timpul de generaţie (ritmul de diviziune)• medie de 20 minute ( Escherichia coli) pentru majoritatea

tulpinilor bacteriene virulente

• bacilul Koch la care acest timp este mai mare de 24 de ore.Bacteria vizibila numai la microscop

Multiplicarea bacteriană

Colonia bacteriană (clonă bacteriană) - unitatea macroscopică rezultată prin multiplicarea unei grup de bacterii cu aceleaşi caractere genotipice şi fenotipice

Cultivarea bacteriilor

• substraturi nutritive favorabile ce asigură multiplicarea bacteriană

• factori fizico-chimici favorabili (ex, temperatură 37C, timp 18-24 ore, pH, presiune osmotica, etc.)

• in vitro pe medii de cultură artificiale

• cultivarea pe substraturi vii, culturi celulare, ou embrionat de găină, animale de laborator (Chlamydii, Rickettsii)

Insămânţare = cultivarea bacteriilor pe medii artificiale

Inoculare = cultivarea pe medii celulare

Organismul uman poate deveni un mediu de cultură pentru bacteriile patogene

Repicare - mobilizarea bacteriilor dintr-o singură colonie cu ajutorul ansei bacteriologice pe un nou mediu de cultură

Insamantare/Inoculare

Cultura bacteriană- totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un sau pe un mediu de cultură

pura mixta

• consistenţă – medii lichide, solide, semisolide• compoziţie – medii simple , complexe : selectiv, electiv, de

îmbogăţire, diferenţiale• scopul urmărit prin utilizarea lor - medii de transport, de izolare,

de conservare • necesitaţile metabolice - medii pentru germeni strict anaerobi• după conţinutul în apă : medii cu umiditate obişnuită (normale),

medii uscate (deshidratate)•  

Medii de cultura

Prepararea mediilor de cultura

• Clasificarea mediilor de cultura ( artificiale) :• dupa starea de agregare: lichide (bulion), solide(geloza), semisolide(gelatina)• dupa complexitatea ingredientelor : medii naturale(lapte, bila)• : medii artificiale(geloza, bulion)• : medii mixte(geloza-sange)• dupa sursa ingredientelor : medii cu proteine animale(bulion sange)• : medii cu proteine vegetale(cartof, soia)• : medii sintetice si semisintetice( Lodder)• dupa complexitatea ingredientelor: medii complexe- electiv(Loeffler)• - selectiv(Loewenstein)• - de imbogatire(Muller- Kauffman)• - diferential(AABTL)• dupa scopul urmarit prin utilizarea lor: medii de transport(Carry- Blair)• : medii de izolare(electiv, selectiv, de diferentiere)• : medii de identificare(TSI, MIU)• : medii de conservare(Loewenstein)• dupa continutul in apa: umiditate obisnuita(normale)• : uscate(deshidratate) in scopul conservarii•  

MEDII DE CULTURA

bulion geloza

MediulElectiv:Ex.: m. Loeffler(contine ser coagulat de bou si bulion glucozat) pentru bacilul difteric permite cresterea in 8-12 ore a acestuia (celelalte bacterii cresc dupa 18-24 ore de incubare.

• Mediul Selectiv: contine substante bacteriostatice ce inhiba dezvoltarea unei populatii microbiene favorizand dezvoltarea unei anumite specii m.Loewenstein (BK) prin verdele malachit inhiba flora de asociatie, favorizand izolarea BK.

• Mediul diferential Mediu solid ce contine unele substraturi (sange, zaharuri, indicatori de pH,) -degradate enzimatic

• Ex.:AABTL(agar, albastru de brom timol ,lactoza) • : geloza-sange(elaborarea de hemolizine) 

•Mediul de imbogatire: functioneaza concomitent si ca mediu selectiv si ca mediu electiv.(Chapman pentru Stafilococ)

geloza-sange(elaborarea de hemolizine) 

Mediul diferential

MEDIU DE TRANSPORT STUART

EMB SSCH A

MHinton Manitol salt agar

Agar

Mac Conkey

Simmon’s agar

TSI UREEA AGAR

STUDIUL CARACTERELOR DE CULTURĂ BACTERIENE

Aspectul macroscopic al culturilor bacteriene variaza

funcţie de:-starea de agregare a mediului de cultură-caracterul virulent sau avirulent bacterian

-factori care tin de gazdă (eventual tratament antibiotic realizat anterior recoltării produsului patologic)

CRESTEREA BACTERIANA IN MEDII LICHIDE Turbiditate a mediului după 18-20 ore de incubare la termostat (37C)

- omogen creştere de tip S (smooth) -tulpinile tinere, virulente ce dispersează rapid şi uniform ( Staphylococcus)

-tip R (rough) -mediul rămâne limpede cu depozit grunjos pe pereţi sau la fundul eprubetei, - tulpini avirulente, îmbătrânite, degradate antigenic

-in anumite situaţii apare şi o membrană groasă plisată la suprafaţa mediului care rămâne limpede dar acestă creştere este caracteristică unei tulpini virulente ( b. Koch)

CRESTEREA BACTERIENA PE MEDII SOLIDE

Bacteriile anaerobe • colonii pufoase (Clostridium tetani)

Clostridium perfringens

colonii lenticulare

DINAMICA MULTIPLICĂRII BACTERIILOR ÎN CULTURI

• Culturile bacteriene sunt :• discontinue când sunt limitate de un anumit volum de mediu

care nu este reînnoit

• continue când mediul de cultură este permanent reîînoit (dispozitul poartă numele de chemostat)

• În microbiologia clinică culturile discontinue sunt cel mai frecvent utilizate

• Chemostatul este un dispozitiv care menţine cultura bacteriană în faza de creştere exponenţială sau la o concentraţie specifică şi se bazează pe principiul că produşii toxici şi celulele sunt îndepărtate cu aceeaşi frecvenţă cu care nutrienţii proaspeţi sunt adăugaţi şi se resintetizează noi celule

Creşterea bacteriană poate fi determinată prin:• măsurarea concentraţiei celulare (turbiditate sau numararea celulelor)• densitatea biomasei ( greutate uscată sau determinare proteică)Concentraţia de celule poate fi determinată prin:• numărarea celulelor viabile lucru realizabil cu ajutorul diluţiilor seriate ale eşantionului •urmat de determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii de pe suprafaţa unei plăci cu geloză•Această concentraţie de celule mai poate fi determinată măsurarea densităţii turbidimetrice (care include atăt celulel vii cât şi cele moarte).

CURBA DE CREŞTERE BACTERIANĂ 1• În realitate dinamicia creşterii bacteriene are altă evoluţie decât cea exponenţială

(susţinută teoretic). Aceasta este evidenţiată printr-o curbă în care se disting 4 faze:• Faza de lag variază de la câteva minute la 2 ore.• activitatea metabolică intensă,nu apare diviziunea celulară• bacteriile se adaptează la noile condiţii de mediu

• Faza de multiplicare exponenţială (logaritmică) -2-3 ore. • multiplicarea bacteriană rapidă, cu evoluţia exponenţială a curbei până când una

dintre substanţele nutritive din mediu este consumată sau se acumulează metaboliţi toxici

• factorul limitant pentru bacteriile aerobe este oxigenul• bacteriile au cea mai mare virulenţă dar şi susceptibilitate la acţiunea antibioticelor.

Faza staţionară durează 2-3 zile•depleţia substratului nutritiv sau acumularea de metaboliţi toxici determină încetinirea creşterii• numărul bacteriilor rămâne constant (numărul bacteriilor care se divid = numărul bacteriilor care mor)•coloniile sunt individualizate , se pot identifica speciile bacteriene

Faza de declin durează 2-3 luni•distrugerea progresivă a bacteriilor datorită acumulării masive de produşi toxici• rămân câteva celule vii dar care au un timp de generaţie de câteva zile.• in condiţii proprii (un nou mediu de cultură) ciclul se repetă• in această fază apare procesul de sporogeneză pentru bacteriile care pot prezenta formă de rezistenţă (Bacillus, Clostridium).