Home > Documents > Cristina_Toteanu Genetica umana

Cristina_Toteanu Genetica umana

Date post: 24-Nov-2015
Category:
Author: toteanu-cristina
View: 50 times
Download: 8 times
Share this document with a friend
Description:
Cristina_Toteanu Genetica umana
Embed Size (px)
of 78 /78
CAPITOLUL 6 VARIABILITATEA GENETICĂ Genetica este ştiinţa eredităţii şi a variabilităţii. Dacă ereditatea determină conservarea informaţiei genetice şi deci a similitudinii biologice dintre părinţi şi copii, variabilitatea creează deosebirile dintre generaţii. Dar diferenţele fenotipice dintre indivizi pot fi produse fie de modificări ale materialului genetic, fie de factori din mediul înconjurător. Prin variabilitate genetică se înţelege ansamblul de fenomene care produc diferenţele genetice între indivizii unei populaţii precum şi între populaţii diferite. Datorită acestor diferenţe se creează diversitatea, premisă esenţială a evoluţiei. Consecinţele fenotipice ale diferenţelor ce pot apărea în secvenţa ADN la diferiţi indivizi au un spectru larg: unele nu au efect fenotipic sau acesta este minim, altele pot produce direct o stare de boală; între aceste două extreme se plasează variaţile fenotipice normale determinate genetic ale morfologiei şi fiziologiei organismului, ale comportamentului şi personalităţii individului, ale răspunsului său la factorii externi (de la alimente, la agenţi cauzatori de boală sau medicamente). Deci bolile genetice sunt numai partea cea mai evidentă, extremă, a variabilităţii genetice. A.SURSELE DE VARIABILITATE Variabilitatea genetică este produsă prin mutaţii, recombinări şi migraţii. Aceste trei fenomene sunt interconectate: mutaţiile determină modificări în structura materialului genetic al unui individ şi creează fondul genetic caracteristic unei populaţii; migraţiile unor persoane dintr-o populaţie în altă populaţie aduc un potenţial genic nou iar recombinările din gametogeneză şi fecundare produc un „amestec” al zestrei genetice parentale într-o combinaţie nouă, specifică descendentului. Cert este că genomul uman nu este o entitate statică, fixă. 1
Transcript

VARIABILITATEA GENETIC

PAGE 4

CAPITOLUL 6

VARIABILITATEA GENETIC

Genetica este tiina ereditii i a variabilitii. Dac ereditatea determin conservarea informaiei genetice i deci a similitudinii biologice dintre prini i copii, variabilitatea creeaz deosebirile dintre generaii. Dar diferenele fenotipice dintre indivizi pot fi produse fie de modificri ale materialului genetic, fie de factori din mediul nconjurtor. Prin variabilitate genetic se nelege ansamblul de fenomene care produc diferenele genetice ntre indivizii unei populaii precum i ntre populaii diferite. Datorit acestor diferene se creeaz diversitatea, premis esenial a evoluiei.

Consecinele fenotipice ale diferenelor ce pot aprea n secvena ADN la diferii indivizi au un spectru larg: unele nu au efect fenotipic sau acesta este minim, altele pot produce direct o stare de boal; ntre aceste dou extreme se plaseaz variaile fenotipice normale determinate genetic ale morfologiei i fiziologiei organismului, ale comportamentului i personalitii individului, ale rspunsului su la factorii externi (de la alimente, la ageni cauzatori de boal sau medicamente). Deci bolile genetice sunt numai partea cea mai evident, extrem, a variabilitii genetice.A. SURSELE DE VARIABILITATE

Variabilitatea genetic este produs prin mutaii, recombinri i migraii. Aceste trei fenomene sunt interconectate: mutaiile determin modificri n structura materialului genetic al unui individ i creeaz fondul genetic caracteristic unei populaii; migraiile unor persoane dintr-o populaie n alt populaie aduc un potenial genic nou iar recombinrile din gametogenez i fecundare produc un amestec al zestrei genetice parentale ntr-o combinaie nou, specific descendentului. Cert este c genomul uman nu este o entitate static, fix.1. MUTAIILE Termenul de mutaie a fost folosit pentru prima oar n genetic de ctre Hugo de Vries, n 1901. Prin mutaie se nelege orice modificare n secvena sau aranjarea nucleotidelor din ADN. Aceste modificri sunt nenaturale (accidentale), permanente i ereditare. Dac intereseaz ADN genic, ele pot produce o schimbare detectabil a fenotipului (dar acest lucru nu este obligatoriu). Celula sau organismul ce prezint o astfel de modificare se numete mutant.n funcie de mrimea materialului genetic interesat gen, cromosom, genom - mutaiile se pot clasifica n trei mari categorii:

(1) Mutaii genice, care afecteaz secvena nucleotidelor unei gene; ele pot interesa ntreaga gen sau o parte a ei (rearanjri intragenice) sau numai o pereche sau cteva perechi de nucleotide (mutaii punctiforme), formnd o variant alelic a genei normale (de tip slbatic); frecvena mutaiilor genice este apreciat la 10-5 10-6 /locus/generaie.(2) Mutaii cromosomice, care produc schimbri n structura cromosomilor i deci n ordinea liniar a genelor n cromosomi (remanieri cromosomice: pierderea, ctigul sau rearanjarea unor segmente); mutaiile cromosomice se produc cu o frecven de 10-4 /diviziune celular.(3) Mutaii genomice (de ploidie), care afecteaz cantitatea de material genetic i se traduc printr-o modificare a numrului diploid de cromosomi ntregi; ele afecteaz fie 1-2 perechi de cromosomi (aneuploidie), fie toi cromosomii, prin adugarea a 1-2 seturi haploide (poliploidie). Mutaiile genomice sunt cele mai frecvente mutaii la om, 10-2 /diviziune celular.Ultimele dou tipuri de mutaii sunt reunite ntr-un singur grup numit anomalii cromosomice.

O alt clasificare a mutaiilor se bazeaz pe tipul de celule afectate: germinale (ce vor forma, n gonade, celule sexuale) sau somatice. n cazul, mutaiilor germinale, se pot produce gamei anormali care (n cazul n care individul este fertil), dup fecundare, transmit mutaia la generaia urmtoare, rezultnd un individ ale crui celule vor fi toate mutante; mutaiile germinale sunt deci ereditare. n al doilea caz, cel al mutaiilor somatice, descendenii unei celule mutante vor forma o clon celular anormal, prezent n anumite esuturi, rezultnd un mozaicism somatic; mutaiile somatice nu pot fi transmise generaiilor viitoare. n funcie de cauz, mutaiile pot fi clasificate n spontane i induse. Mutaiile spontane sunt cele mai numeroase i se produc prin erori de copiere n cursul replicrii ADN. Dei funcia de autocorecie a ADN polimerazelor reduce semnificativ numrul de erori, mrimea enorm a genomului uman face ca la orice replicare a celor 3 miliarde de nucleotide s apar erori (10-10). Mutaiile induse sunt determinate de agresiunea unor substane chimice exogene, a radiaiilor ionizante sau a metaboliilor reactivi. Urmrile acestor atacuri genotoxice sunt reduse prin intervenia unor sisteme eficace de supraveghere, alarm i reparare; dovada nedorit a eficacitii lor este adus de mutaiile genelor implicate n aceste procese ce cresc semnificativ rata mutaiilor, producnd - cel mai - adesea cancere.Consecinele fenotipice ale mutaiilor formeaz un spectru foarte larg. Cele mai multe mutaii germinale (produse n regiunile necodante ale ADN) nu au un efect fenotipic, sunt mutaii neutre. Ele genereaz variantele alelice ce alctuiesc polimorfismul ADN, dac un locus are mai mult de o variant (alel) ce se ntlnete n populaie cu o frecven mai mare de 1% (ce face ca producerea ei ntmpltoare s fie improbabil). Heterozigoia medie a ADN genomic la om a fost apreciat la 0,001 0,004 (adic 1:250 1:1000 pb difer prin secvenele alelice). De notat c unele gene, i n special genele HLA, au un polimorfism nalt. Uneori mutaiile noi pot avea efecte benefice, producnd o mai bun adaptare la mediu i/sau o rezisten mai mare la agresiunile ecologice sau o cretere a aptitudinilor reproductive (fitness). Avantajul selectiv al heterozigoilor (Na), purttori ai unei gene mutante, se poate nscrie n aceast categorie (vezi capitolul 7). Cert este c mutaiile reprezint combustibilul brut care conduce evoluia. Deseori mutatiile pot fi patogene, producnd o modificare fenotipic evident (letal, subletal, morbid) sau crescnd susceptibilitatea la boal. Pn acum ne-am referit la mutaiile germinale, care sunt ereditare. Dei mutaiile somatice nu se transmit la descendeni, nu nseamn c medical nu sunt importante. Evoluia de la zigot la adult necesit circa 1015 diviziuni celulare; la o frecven medie de 10-10 erori de replicare per diviziune se produc n genomul fiecrei celule somatice mii de mutaii. Efectul lor va depinde de natura mutaiei, localizarea i esutul implicat; ele vor produce clonele anormale implicate n cancer, afectri degenerative sau mbtrnire precoce. Consecinele patogene ale mutatiilor, germinale i somatice, ne permit s afirmm c mutaiile sunt cauza principal de boal la om.2. RECOMBINRILE GENETICEPrin reombinare genetic nelegem producerea unor combinaii genetice noi (recombinani), prin rearanjarea (reasortarea, redistribuia) materialului genetic cuprins n dou uniti genetice diferite.

Recombinarea genetic este un proces natural i reprezint una din cheile mecanismelor prin care se formeaz noi indivizi ce vor fi apoi testai, prin selecie natural, n marea schem a evoluiei biologice (Wetzel, 1980).

Procesul de recombinare necesit o asociere intim i apoi o interaciune ntre dou uniti genetice diferite; aceast condiie permite, ntre altele, diferenierea dintre recombinrile genetice i mutaii. n funcie de mrimea unitilor implicate n replicare genom, cromosom, gen se pot deosebi mai multe tipuri de recombinare.2.1 RECOMBINAREA GENOMIC.

Recombinarea genomic se realizeaz n cadrul procesului sexual, prin asortarea genomurilor din gameii care unesc, pentru a forma zigotul. Reproducerea sexuat asigur nu numai continuitatea i pstrarea genelor i caracterelor de la prini la copii, dar i creterea variabilitii urmailor. Cnd se unesc doi gamei provenii de la indivizi nenrudii, diferii genetic, descendenii vor prezenta o vitalitate sporit, caliti noi, o adaptabilitate mai bun i o fertilitate crescut. Aceast vigoare hibrid sau heterozis este consecina heterozigotismului care se creeaz la descendeni. n cazul ncrucirii ntre indivizi apropiai sau nrudii (consanguinitate), gradul de heterogenitate se reduce i crete fenomenul de omogenizare genetic (vezi capitolul 5.D.3). Deci recombinarea genomic este o important surs de varibilitate, cu condiia ca genomurile care se combin s fie ct mai diferite.2.2 RECOMBINAREA CROMOSOMICRecombinarea cromosomic se produce n cursul gametogenezei ntre cromosomii omologi (cu origine diferit) prin fenomenele specifice meiozei I (vezi capitolul 5.C.1.c). Ea poate avea loc ntre cromosomi ntregi (recombinare intercromosomic) sau ntre pri din cromosomi (recombinare intracromosomic).

a. Recombinarea intercromosomic Recombinarea intercromosomic se produce n cursul anafazei I, atunci cnd cromosomii ce formeaz o pereche de omologi se separ i apoi se dirijeaz spre celulele fiice independent de alte perechi de omologi. Prin aceast asortare independent se formeaz 223 tipuri de gamei, deci peste 8,4 milioane de gamei diferii, la fiecare din cele dou sexe. (aceast cifr este valabil pentru situaia n care cromosomii se deosebesc printr-o singur gen). Dup fecundare pot rezulta teoretic 246 combinaii, valoare ce depete de opt mii de ori populaia actual a globului pmntesc. S nu uitm ns c fiecare cromosom are mai multe gene; de aceea se poate afirma c fiecare persoan are o structur genetic unic i nerepetabil. Asortarea independent a cromosomilor omologi explic a doua lege a lui Mendel, referitoare la combinarea liber a "factorilor ereditari" (genelor) i distribuia diferit a unor caractere, normale sau anormale, la descendeni (vezi capitolul 5.D.1).b. Recombinarea intracromosomic (omolog)Variaiile genotipice individuale produse prin recombinarea intercromosomic sunt amplificate prin schimbul reciproc i egal de gene dintre cromosomii omologi care se produce prin crossing-over, n profaza I (vezi capitolele 3.A.2; 5.C.1 i caseta 6.1). Prin aceast recombinare intracromosomic sau omolog cromosomii omologi, care iniial erau diferii ca origine, sufer o recombinare a genelor parentale. 2.3 RECOMBINAREA INTRAGENICRecombinarea intragenic se produce printr-un crossing-over egal ntre dou gene alele i produce o gen hibrid sau o fuziune genic, ce conine un fragment terminal dintr-o alel i restul de secven din cealalt alel (figura 6.1). Recombinarea intragenic poate produce i fenomenul de conversie genic, la care ne vom referi ulterior. CASETA 6.1 Mecanismul recombinrii intracromosomice

Procesul de recombinarea intracromosomic, o surs major de diversitate genetic, are loc printr-un mecanism molecular care este doar parial neles, dar asemntor cu cel al recombinrii omologe responsabile de repararea rupturilor ADN bicatenare (vezi figura 6.23).

nainte de iniierea procesului de crossing-over este necesar mperecherea cromosomilor omologi. Acest mecanism, care aduce n imediata vecinatate secvenele ADN ce vor fi schimbate n cadrul crossing-over, pare a fi reglat independent de recombinarea propriu-zis. Procesul de recombinarea este iniiat prin producerea n profaza meiozei a unor rupturi ADN bicatenare n cteva puncte de-a lungul fiecaruia din cele patru cromatide de ctre endonucleaza SPO11, proteina nrudit cu topoizomerazele II. SPO11 formeaz o legtura fosfodiester ntre un aminoacid tirozina i nucleotidul din poziia 5' de la nivelul punctului de ruptur. Aceste puncte de ruptur par a nu apare ntmpltor de-a lungul cromosomilor ci mai frecvent n regiunile promotor ale genelor i preferential n regiunile cromosomice bogate n perechi de baze GC. Consecinele defectelor SPO11 au fost evideniate pe modele animale i constau n alterarea formrii chiasmatelor i aneuplodie masiv cu imposibiliatea formrii unor gamei funcionali.

Ulterior are loc ndeprtarea SPO11 i procesarea capetelor rupte sub aciunea 5' 3' exonucleazic a unui complex proteic format cel puin din proteinele RAD50 si MRE11. Aceasta conduce la formarea unor capate protruzive 3', monocatenare, situate de fiecare parte a unei rupturi. Unul dintre aceste capete protruzive 3' va invada apoi o cromatida a cromosomului omolog i acelai proces va fi realizat de ctre capatul protruziv 3' opus pentru cealalt cromatid a cromosomului omolog. Aceste proces este controlat de ctre proteinele DMC1 si RAD51. Urmeaz un proces de reparare a dublei jonciuni tip Holliday formate cu participarea unor ADN polimeraze si ADN ligaze.

Etapa final a acestui proces este rezoluia jonciunilor Holliday care este esenial pentru separarea cromosomilor patern i matern i evidenierea recombinanilor. Aceasta etap presupune intervenia unor rezolvaze nc neidentificate.

3. MIGRAIILEPrin migraii se nelege transferul de gene prin deplasarea unui grup de indivizi dintr-o populaie n alt populaie genetic diferit. Prin imigrare se produce astfel o introducere a unor gene noi n populaia gazd. Asupra acestui mecanism ne vom referi pe larg n capitolul urmtor, Genetica populaiilor, dar vom preciza aici c migraiile au reprezentat i n specia uman o surs important de variaii ereditare.B. MUTAIILE GENICE

Mutaiile sunt definite ca modificri permanente i ereditare n secvena nucleotidelor sau aranjarea ADN. Prin aceste modificri se produc variante alelice ale secvenei de ADN (gen sau secven extragenic). Unele dintre aceste variante nu au efect fenotipic sau acesta este mi nim; alte variante alelice, produse prin mutaie, pot fi implicate direct n etiologia unor boli.

Introducerea metodelor de analiz a ADN a permis, n ultimii 20 de ani, realizarea unor progrese remarcabile n identificarea i studiul mutaiilor rspunztoare de producerea unor boli monogenice. S-a putut defini astfel spectrul mutaiilor pentru aceste boli, att calitativ (tipurile i poziiile mutaiilor, precum i efectul lor asupra funciei genei) ct i cantitativ (analiza frecvenei mutaiilor n diferite populaii sau epidemiologia molecular). Consecinele au fost multiple i pot fi grupate n trei categorii:

Cunoaterea teoretic mai precis a diversitii mecanismelor mutaionale ce opereaz la om i descoperirea unor mecanisme noi (transpoziii, inversii, expansiuni de repetiii trinucleotidice);

nelegerea mai precis a mecanismelor patogenice ale unor boli (pierderea total sau parial a funciei proteinelor, modificarea sau achiziia unor proprieti noi ale proteinelor codificate de genele mutante);

Ameliorarea calitii i eficienei diagnosticului n numeroase boli monogenice, precum i a sfatului genetic i diagnosticului prenatal.1. TIPURI I MECANISME DE PRODUCERE ALE MUTAIILOR GENICE

Mutaiile care afecteaz regiuni mici din genom pot fi mprite n dou mari clase:

modificri ale unei secvene unice de ADN sau mutaii simple; acestea sunt de obicei microleziuni, interesnd unul sau cteva nucleotide; modificri ce implic schimburi ntre dou secvene alelice/nealelice de ADN sau recombinri genice aberante; ele genereaz macroleziuni (mari deleii, inserii, duplicaii, inversii mari, fuziuni de gene) interesnd o parte din gen sau chiar ntreaga genn funcie de modificarea produs n secvena de nucleotide a ADN se pot deosebi trei mari categorii de mutaii (figura 6.2): substituii nucleotidice ce implic de regul nlocuirea unei singure perechi de baze; mai rar pot fi nlocuite simultan mai multe nucleotide grupate, rezultnd o form de conversie genic;

deleii eliminarea (pierderea) unuia sau mai multor nucleotide din secvena genei, mai rar pri din gen (exoni) sau ntreaga gen; inserii introducerea (adiia) unuia sau mai multor nucleotide n structura genei; rar se pot produce inserii largi (prin transpoziie), amplificarea (expansiunea) unor secvene repetitive trinucleotidice sau duplicaia genei.Majoritatea mutaiilor sunt modificri stabile/fixe ale secvenei ADN. Recent s-a descris o clas nou de mutaii numit mutaii instabile sau dinamice n care anumite repetiii trinucleotidice sufer modificri (de obicei expansiuni) atunci cnd sunt transmise n succesiunea generaiilor.n funcie de tipul secvenelor din structura genei care sunt afectate, mutaiile pot interesa secvenele codante (exonii) sau necodante (intronii, secvenele reglatoare), cu efecte variate asupra expresiei informaiei ereditare i implicit asupra sintezei de proteine (alterarea structurii sau cantitii).Descrierea diferitelor tipuri de mutaii se bazeaz pe o nomenclatur specific, stabilit de grupuri de experi, prezentat n caseta 6.2..CASETA 6.2Nomenclatura mutaiilor

Nomenclatura mutaiilor a fost stabilit de ctre Genome Database Nomenclature Commitee i poate fi accesat la adresa http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/ Mutaiile pot fi descrise n dou modaliti: prin efectul lor sau prin descrierea secvenei modificrii.

Nomenclatura pe baza efectului alelei mutante este folosit mai ales la organismele de laborator. O alel nul sau amorf nu produce nici-un efect; o alel hipomorf produce o cantitate sau o activitate redus a produsului genei; o alel hipermorf determin o cantitate sau activitate crescut de produs; o alel neomorf este o alel cu activitate sau produs nou; o alel antimorf este o alel a crei activitate sau produs antagonizeaz activitatea produsului normal.

Nomenclatura pentru descrierea mutaiei este ampl (vezi Antonarakis et al.,1998). Vom prezenta aici cteva repere.

Substituiile de amino acizi. Reziduurile de aminoacizi (desemnai prin codul de trei litere sau cel cu o singur liter; vezi tabelul 4.2) sunt numrate ncepnd cu metionina (corespunztoare codonului iniiator) considerat numrul 1. Astfel mutaia cu sens greit n codonul 6 al genei pentru -globin i substituia acidului glutamic cu valina ce produce sicklemia se scrie: Glu6Val sau E6V. O mutaie non sens ce nlocuiete glutamina din poziia 39 a -globinei cu un codon stop, producnd o form trunchiat a -globinei i determinnd o-talasemia, se scrie Gln39X sau Q39X

Substituiile nucleotidice. n descriere se va scrie mai nti baza original, numrul nucleotidului cu aceast baz, simbolul mai mare (>) i apoi noul nucleotid din poziia respectiv. Numrul nucleotidului se calculeaz de la primul nucleotid A din codonul iniiator (start) ATG care este +1 (nucleotidul precedent este -1; nu exist nucleotid 0). Dac este necesar se va folosi g. i c. pentru a indica o secven de ADN genomic sau ADN complementar.

De exemplu, o mutaie cu sens greit se poate scrie G1444>A (uneori se mai scrie 1444G>A)

Pentru modificri n introni, se va specifica numrul intronului (desemnat cu iniialele IVS de la intervening sequence), numrul nucleotidului (+1, +2) ncepnd cu situl donor 5 sau invers (-1, -2) de la situsul 3acceptor. D ex., IVS33+2T>A reprezint o mutaie n intronul 33 n situsul donor, n care T este nlocuit cu A.

Deleiile i inseriile. Deleiile mici sunt indicate prin termenul del scris dup numerele nucleotidelor deletate; de ex., 1524-1527del sau 1524-1527delAGTA deleia a 4 nucleotide (AGTA). Pentru a preciza modificarea aminoacizilor atunci se scrie mai nti simbolul lor. De ex., F508del semnific deleia fenilalaninei n poziia 508 (aceast modificare frecvent n mucoviscidoz s-a scris iniial F508, semnul delta semnificnd deleie). Inseriile mici sunt desemnate similar cu termenul ins dup cele dou nucleotide ntre care se produce inseria, urmat de nucleotidele inserate. De ex., 1277-1278insTATC denot inseria a patru baze ntre nucleotidele 1277 i 1278, o cauz comun a bolii Tay-Sachs

1.1 SUBSTITUIA UNUI NUCLEOTID

nlocuirea unui singur nucleotid (i deci a unei perechi de baze n ADN bicatenar) este o mutaie punctiform i reprezint cel mai frecvent tip de mutaie ntlnit la om. Astfel, din circa 130 de variante anormale ale hemoglobinei umane, 120 sunt produse prin substituii.

a). Tranziii i transversii.Se deosebesc dou tipuri de substituii: tranziiile care reprezint nlocuirea unei baze pirimidinice (T sau C) sau purinice (A sau G) cu o baz de acelai tip i transversiile n care o baz pirimidinic (T sau C) este nlocuit de o baz purinic (A sau G) i vice versa. Teoretic, presupunnd c substituia se face la ntmplare, transversiile ar trebui s fie de dou ori mai frecvente dect tranziiile, deoarece orice baz poate suferi dou transversii dar numai o singur tranziie (figura 6.3) . n realitate, tranziiile sunt mai frecvente ca transversiile; excesul de tranziii este determinat probabil de aciunea combinat a ADN polimerazei (ce poate ncorpora eronat n procesul de replicare mai frecvent o baz de acelai tip) i aciunii sistemelor de corecie (care recunosc mai uor o ncorporare de tipul transversiei, ce antreneaz o modificare mai important a diametrului moleculei de ADN, dect tranziia).Printre tranziii, cele ce intereseaz dinucleotidul CpG (sau 5-CG-3) sunt mai frecvente dect celelalte dinucleotide (TpG sau CpA), reprezentnd cam o treime din toate substituiile. Acest dinucleotid CpG se gsete mai ales n regiunile reglatoare ale transcripiei (promotor), sub forma unor insule CpG, iar C situat n poziia 5 fa de G este frecvent metilat. n plus, citozina sufer deseori o dezaminare spontan transformndu-se n uracil, un component anormal al ADN care este uor recunoscut i ndeprtat prin mecanismele de corecie. Dac dezaminarea intereseaz metil-citozina, aceasta este transformat n timin, o baz normal din structura ADN; n acest caz eroarea nu va fi uor de recunoscut i corectat, producnd o tranziie CT sau GA n funcie de catena ADN implicat (figura 6.4). Dinucleotidul CpG constituie deci un punct fierbinte de producere a mutaiilor n genomul uman; ntr-adevr tranziiile n acest dinucleotid au fost gsite, n diferite boli, de 10-20 ori mai frecvent comparativ cu alte dinucleotide i circa 30% din toate substituiile unui singur nucleotid sunt de acest tip.b). Efectele substituiei asupra informaiei genetice.Efectele substituiei unui nucleotid depind de localizarea intragenic a mutaiei: secvene codante, secvene intragenice necodante i secvene reglatoare (vezi capitolul 3.B.1).n regiunile codante (exoni) substituia se poate face ntr-un codon sens sau nonsens i modific codonul respectiv, putnd s-i schimbe semnificaia (figura 6.5).(1) Substituia ntr-un codon sens poate produce: Un codon sens sinonim, care semnific acelai aminoacid; mutaia este fr efect asupra polipeptidului codificat de gen (care va rmne nemodificat), este neutr din punct de vedere fenotipic i evolutiv, i se numete mutaie silenioas (mut) sau mutaie sinonim; Un alt codon sens care semnific un aminoacid diferit; acest tip de mutaii nesinonime, care altereaz sensul unui codon, se numesc mutaii cu sens greit (missens). Ele se mpart n dou grupe:

substituii conservative, cnd este nlocuit un aminoacid cu altul care este chimic i funcional similar, (face parte din aceeai grup; de ex., lizina i arginina sunt aminoacizi bazici); adesea, efectul acestei substituii asupra funciei proteinei este minim (ambii aminoacizi au funcii similare); substituii neconservative, cnd este nlocuit un aminoacid cu altul care este chimic i funcional diferit; acest tip de mutaii este frecvent (50%) n patologia genetic la om. Un codon nonsens sau stop prematur, care nu semnific nici-un aminoacid; se formeaz un ARNm mai scurt i, dac acesta este stabil, o protein trunchiat (de obicei instabil i degradabil); mutaiile nonsens constituie aproximativ 12% din toate mutaiile ce produc boli la om.(2) Substituia ntr-un codon nonsens poate produce: Un codon sens care semnific un aminoacid; deci codonul stop este anulat, transcripia continu pn la urmtorul codon stop i se formeaz un ARNm mai lung, care va codifica o protein anormal de lung. Rareori rezult un alt codon stop (UAAUAG) i mutaia este fr efect asupra proteinei.c). Consecinele substituiei n raport cu localizarea intragenic

Efectele substituiei unui nucleotid depind de localizarea intragenic a mutaiei: secvene codante, secvene intragenice necodante i secvene reglatoare (figura 6.6).

(1) Secvenele codante sunt afectate n marea majoritate a mutaiilor patogene. Predomin substituiile nucleotidice nesinonime, n special mutaiile cu sens greit, care modific: - stabilitatea proteinei, localizarea intracelular, maturarea proteinei, asamblarea ei n structuri multimerice, - interaciunile cu liganzii sau alte proteine, - situsul funcional pentru activitatea enzimatic etc). Totui, foarte rar, o substituie sinonim (de obicei neutr) poate cauza un efect patogen prin activarea unui situs criptic de decupare/matisare (asemntor celor din introni) care va determina excluderea unei pri a exonului din ARNm. Remarcm, de asemenea, c unii exoni pot avea n zonele cu dinucleotide CpG o rat mare de mutaii.

(2) Secvenele necodante intragenice, i n special intronii, pot fi sediul unor mutaii (n circa 10-15% din mutaiile patogenice). Astfel, alterarea (prin substituie) a situsurilor de decupare a intronilor (n englez - splice site mutations) situsul donor (5-GT) sau acceptor (AG-3) face ca excizia s se produc la urmtorul exon i, ca atare, n ARNm matur se va ncorpora o parte sau ntregul intron sau va lipsi un exon (n englez - exon skipping), n funcie de situsul afectat. Ambele situaii au consecine importante asupra expresiei genei (ARNm instabil; polipeptid nefuncional). Ocazional au fost descrise mutaii patogenice i n secvenele 5UTR (hemofilia B Leyden) sau 3UTR, transcrise dar netranslate, din primul i ultimul exon; ele pot modifica rata sintezei proteice.

(3) Secvenele reglatoare pot suferi mutaii care, evident, modific rata transcripiei (dac afecteaz elementele promotorului i interaciunea lor cu factorii de transcripie) sau stabilitatea moleculei de ARNm formate (cnd afecteaz situsul de poliadenilare din regiunea 3) i deci cantitatea de protein sintetizat; astfel de mutaii se ntlnesc n talasemii.

d). Mecanismele posibile de producere a substituiilor

Substituiile nucleotidice pot fi produse fie spontan, prin erori n procesul normal de replicare a ADN, fie prin leziuni provocate n ADN de factori mutageni (chimici sau fizici). Erorile de replicare ale ADN apar prin mperecherea greit a nucleotidelor (vezi 5.A.3.6). Ele sunt ndeprtate rapid prin procesul de corecie fie de ctre ADN polimeraza , fie prin alte mecanisme de reparare; n final, rmn puine erori de replicare, aproximativ o mutaie nou la fiecare diviziune celular. Mutaiile pot aprea i prin procese chimice spontane de depurinare, dezaminare, demetilare sau dup expunerea la mutageni chimici sau fizici (radiaii ionizante sau ultraviolete).1.2 DELEII I INSERII MICIUn al doilea tip major de mutaii este reprezentat de ctre deleiile sau inseriile a unul sau mai multe nucleotide; ele reprezint circa un sfert din toate mutaiile responsabile de producerea bolilor genetice la om. Dac deleiile sau inseriile sunt un multiplu de trei nucleotide se produce lipsa sau adiia unor aminoacizi n protein. Un exemplu interesant este cel al mutaiei F508 (sau F508 del, dup nomenclatura actual), ce produce aproape 70% din cazurile de fibroz chistic la Europeni; prin deleia a trei perechi de nucleotide din gena CF rezult pierderea fenilalaninei (F) din poziia 508 a proteinei CFTR (vezi capitolul 11.B.4). Atunci cnd numrul nucleotidelor deletate sau inserate nu este un multiplu de trei se produce o decalare (defazare) a cadrului de lectur al genei, de la locul n care s-a produs deleia sau inseria (figura 6.7); s ne reamintim c citirea informaiei genetice se face continuu, n grupe de trei nucleotide sau codoni adiaceni, formai prin simpla grupare cte trei (vezi 4.B.3.a). Acest tip de mutaii (n englez frameshift mutations), produc frecvent un codon stop n aval de locul deleiei/inseriei, rezultnd o protein trunchiat.Deleiile i inseriile ctorva nucleotide survin cel mai adesea la nivelul unor secvene scurte repetate n tandem, printr-un mecanism de glisare sau derapare replicativ (n englez slipped strand mispairing), determinat de mperecherea decalat a acestor secvene repetate. Aa cum se observ n figura 6.8, secvenele repetate din catena nou sintetizat (de ex., CAG CAG...), se pot alinia greit (gliseaz nainte sau napoi) fa de secvenele repetitive complementare corespunztoare ale catenei ADN matri (de ex., GTC GTC...). n funcie de direcia de glisare se produc n catena nou sintetizat inserii (prin glisarea spre napoi) sau deleii (prin glisare spre nainte). Acest fenomen de glisare replicativ se produce frecvent n cazul microsateliilor sau minisateliilor determinnd polimorfismul cunoscut al acestor secvene repetate n tandem de un numr variabil de ori (VNTR). El ar putea fi la originea expansiunii repetiiilor trinucleotidice (vezi seciunea 1.4). Unele gene implicate n etiologia unor boli (gena CF - pentru CFTR implicat n fibroza chistic; gena FIX - pentru factorul IX implicat n hemofilia B; gena APC - pentru polipomatoza adenomatoas de colon, .a) posed n secvena codant o serie de repetiii n tandem ale unui numr mic de nucleotide (figura 6.9), ce pot fi implicate n fenomenul deraprii replicativ, producnd deleia sau inseria unitii repetitive, fapt ce va genera decalarea cadrului de lectur (o mutaie frameshift). 1.3. REMANIERI GENICE ABERANTERemanierile genice aberante se realizeaz prin schimburi ntre secvene de ADN identice sau cvasi-identice, alelice sau nealelice i genereaz deleii i inserii mari, duplicaii, inversiuni i conversii genice. Comparativ cu alte tipuri de mutaii descrise mai nainte, remanierile genice sunt mai rar ntlnite n etiopatogenia bolilor genetice dar relativ frecvente n anumite boli. De ex., 90% din cazurile de amiotrofii spinale infantile i 60% din cazurile de miopatie Duchenne sunt produse prin deleii genice importante.

a). Recombinri genice prin recombinare omolog nealelic (inegal sau ectopic).Mecanismul principal al remanierilor genice este recombinarea omolog nealelic (RON)(sau ectopic) ntre secvene identice sau cvasi-identice situate (n cteva exemplare) n amplasri diferite ale cromosomilor (figura 6.10). Ea se produce de obicei n profaza meiozei I atunci cnd cei doi cromosomi omologi se mperecheaz greit (prin secvenele lor identice) RON meiotic (intercromosomic) - sau, mai rar, n mitoz, prin schimb fie ntre cromosomii omologi, fie ntre cromatidele surori RON somatic (intracromosomic sau intracromatidian). Aceast recombinare (intermolecular) poate duce fie la un schimb reciproc (CO) inegal (figura 6.11) prin care se modific ambele cromatide (deleie sau duplicaie n oglind; inversie), fie la o conversie genic care este un transfer unidirecional de informaie i se modific numai una dintre cromatide. Poate exista i o recombinare intracromatidian, ntre secvene omologe situate pe aceeai cromatid. Aceste situaii sunt ilustrate prin mai multe exemple.

Regiunea ce cuprinde gena int este duplicat n tandem. Astfel, genele 1 i 2 ce codific lanurile de alfa-globin ale hemoglobinei sunt produse printr-o duplicaie recent; mperecherea greit 1-2 (figura 6.12) va genera, prin CO inegal, deleia sau duplicaia unei gene Aceeai situaie se ntlnete i pentru gena SMN (de la survival motor neuron), duplicat n regiunea 5q11.2-13.3; prin CO inegal se produce deleia exonilor 7 i/sau 8 a genei, ceea ce genereaz amiotrofia spinal infantil. Conversia genic este produs prin schimburi nereciproce (unidirecionale), de mrime variabil (de la cteva pb la cteva kb) ntre gene vecine, foarte asemntoare dar neidentice. Ele se pot mperechea greit i atunci una din gene - donor (desori o pseudogen, inactivat prin mutaii) - ramne neschimbat iar cealalt acceptor - este modificat primind o parte din secvenele donorului (figura 6.13). Exemplul cel mai tipic privete genele codante pentru 21-hidroxilaz, CYP21A i CYP21B, situate pe braul scurt al cromosomului 6 n regiune HLA (vezi figura 3.3.c); numai gena CYP21B este funcional, cealalt gen - CYP21A - este o pseudogen care a acumulat numeroase mutaii inactivatoare. Circa 75% din cazurile de hiperplazie congenital de suprarenal prin deficien de 21-hidroxilaz sunt consecina mutaiilor ce apar n gena CYP21B ca urmare a conversiei genice ntre pseudogena CYP21A i gena funcional CYP21B; restul cazurilor sunt produse prin deleia genei CYP21B prin CO inegal (figura 6.14). Mecanismul de conversie genic pare implicat n generarea polimorfismului extrem al genelor complexului HLA. Regiunea ce cuprinde gena int este flancat/ ncadrat de secvene repetitive scurte, identice, care prin mperechere greit i CO inegal vor genera deleia sau duplicaia genei (figura 6.15). De ex., gena pentru proteina mielinei, PMP22, se afl ntr-o regiune de 1,5Mb flancat de secvene identice de circa 30Kb (vezi figura 5.18 i capitolul 5.C.1.3). Dup CO inegal se produce duplicaia i deleia genei PMP22 care va genera dou neuropatii ereditare diferite: boala Charcot-Marie-Tooth 1A i, respectiv neuropatia ereditar cu pareze induse de presiune (HNPP). Repetiiile dispersate nealelice (de tip Alu) predispun la aliniere greit, CO inegal i producerea de deleii/duplicaii; acest mecanism a fost identificat n gena receptorului pentru LDL, gena NF1, gena factorului IX al coagulrii i altele .

Pe acelai cromosom, n interiorul sau vecintatea genei int se gsesc secvene identice; prin recombinare intracromosomic (deci intramolecular) ntre dou copii se poate produce deleie sau inversii a unei mari pri din gen. De ex., n intronul 22 al genei pentru factorul VIII al coagulrii (Xp28) se afl o mic secven nucleotidic care se mai gsete repetat, dar cu orientare opus, de cel puin dou ori la extremitatea telomeric a genei (figura 6.16); prin recombinare ntre secvena intronic i una din secvenele omologe se produce o inversie a primilor 22 de exoni ai genei FVIII; aceast mutaie recurent produce circa 50% din cazurile severe de hemofilie A. Acelai fenomen se ntlnete n boala Hunter, o mucopolizaharidoz legat de X.

Toate cazurile descrise mai sus fac parte din bolile genomice care sunt produse prin recombinarea omolog nealelic ntre regiuni specifice din genom, cu duplicaii sau cu un numr mic de repetiii identice sau foarte asemntoare. Aceasta pare s fie un mecanism frecvent (10-4) i important de producere a unui nou tip de boli, numit boli genomice (Lupski, 1998) (vezi Caseta 6.3); ele sunt determinate de arhitectura specific a genomului uman i prin aceasta se deosebesc de bolile monogenice convenionale, produse prin mutaii specifice ntr-o gen (de obicei consecina unor erori de replicare i/sau reparare). In funcie de mrimea segmentului genomic implicat i de numrul de gene localizate n segmentul remaniat deleia i/sau duplicaia rezultat prin recombinare aberant (intercromosomic, intracromosomic sau intracromatidian; (figura 6.17)- poate produce: o boal mendelian (tabelul 6.1), un sindrom al genelor contigue sau o aberaie cromosomic a unui bra ntreg. Tabelul 6.1. Bolile genomice Mendeleene

(adaptat dup Stankiewicz i Lupski, 2002)

BoalCod

OMIMMod de trans-miterePoziie cromo-somicGenTip de rearanja-ment

Sindrom Bartter tip III601 678AD1p36CLCNKA/Bdeleie

Boal Gaucher230 800AR1q21GBAdeleie

Nefronoftizie juvenil familial256 100AR2q13NPHP1deleie

Distrofie muscular facio-scapulo-humeral158 900AD4q35FRG1?deleie

Atrofia muscular spinal253 300AR5q13.2SMNinversie/

duplicaie

Hiperplazia corticosuprarenal congenital

tip III (prin deficit de 21 hidroxilaz)201 910AR6q21.3CYP21deleie

Aldosteronism cu rspuns la tratament cu glucocorticoizi (GRA)103 900AD8q21CYP11B1/2duplicaie

(-talasemie141 900AR11p15.5(-globindeleie

(-talasemie141 800AR16p13.3(-globindeleie

Boala polichistic renal tip 1 (ADPKD)601 313AD16p13.3PKD1

Boala Charcot-Marie-Tooth (CMTA1)118 220AD17p12PMP22duplicaie

Neuropatia ereditar cu sensibilitate la pareze presionale (HNPP)162 500AD17p12PMP22deleie

Neurofibromatoza tip 1 (NF1)162 200AD17q11.2NF1deleie

Nanism hipofizar262 400AR17q23.3GH1deleie

Deficit farmacogenetic al CYP2D6124 030AR22q13.1CYP2D6deleie/ duplicaie

Ihtioz308 100LXXp22.32STSdeleie

Dicromatopsie pentru vederea colorat rou/verde303 800LXXq28RCP i GCPdeleie

Incontinentia pigmenti308 300LXXq28NEMOdeleie

Hemofilia306 700LXXq28F8inversie

Distrofia muscular Emery-Dreifuss (EMD)310 300LXXq28Emerin i FLN1deleie/ duplicaie/ inversie

Sindromul Hunter (mucopolizaharidoza tip III)309 900LXXq28IDSinversie/ deleie

b). Remanieri genice prin recombinare neomolog sau nelegitim

Remanierile genice se pot produce i prin evenimente de recombinare neomolog sau nelegitim ntre secvene care nu prezint sau au o foarte mic omologie de secven. Este cazul celor mai multe deleii ale genei ce codific distrofina. Nu se cunosc precis mecanismele moleculare ale recombinrii nelegitime. Se crede c anumite elemente din structura genelor ar putea fi puncte fierbini pentru aceste recombinri: secvenele alternante de purine-pirimidine, regiunile MAR (de la matrix-associated region) bogate n nucleotide A/T, situsurile de clivare ale topoisomerazelor, secvenele n palindrom etc.

Caseta 6.3Boli genomice

Bolile genomice sunt afeciuni care rezult prin rearanjarea ADN din genomul uman, datorit recombinrii dintre regiuni distincte omologe dar nealele (paraloge) (Lubski, 1998); aceste rearanjamente determin pierderea sau duplicaia unei gene (sau unor gene). Bolile genomice sunt deci consecina arhitecturii speciale a unor regiuni din cromosom (sau cromosomi) spre deosebire de bolile monogenice convenionale, produse prin mutaii specifice ntr-o gen (datorit erorilor de replicare i/sau reparare).

Rearanjrile se produc prin recombinare omolog nealelic ntre regiuni specifice, de ~10-400 Kb, cu secvene identice sau asemntoare. Acestea sunt frecvent duplicaii segmentare (dupliconi) sau secvene cu un numr mic de repetiii identice, localizate preferenial n anumite segmente ale cromosomilor, frecvent la centromer sau telomere (estimri recente arat c ~5-10% din genomul uman este duplicat). Datorit omologiei lor, secvenele respective se mperecheaz greit i determin prin recombinare omolog meiotic (intercromosomic) sau mitotic (intracromosomic: schimb ntre cromatidele surori sau intracromatidian) (figura 6.10) rearanjri cromosomice sau cromatidiene (deleii, duplicaii, inversii, disrupii genice).

Recombinarea omolog nealelic mediat de secvene repetitive mici este un fenomen frecvent (10-4) i un mecanism major de producere a bolilor genetice. n funcie de mrimea segmentului implicat (figura 6.17) i de numrul de gene localizate n segmentul remaniat se pot produce: boli mendeliene (numeroase cazuri de: neurofibromatoza 1, nefronoftizia juvenil familial, incontinentia pigmenti s.a.) (tabelul 6.1); sindroame cu microdeleii (sdr. Williams, sdr. DiGeorge/Velocardiofacial etc); aberaii cromosomice mari (inversii, isocromosomi X de bra lung , cromosomi supranumerari bisatelitici etc).

Folosirea unor metode noi de analiz (hibridizarea genomic comparativ CGH - de nalt rezoluie, microcipuri cu BAC de genom uman) va duce probabil la descoperirea unor noi boli prin rearnjamente genomice submicroscopice.1.4. EXPANSIUNEA INSTABIL A REPETIIILOR TRINUCLEOTIDICEDup anul 1991 s-au descoperit peste 10 boli genetice produse prin mutaii instabile sau dinamice ale unor repetiii trinucleotidice; trei dintre acestea sunt relativ frecvente: retardul mintal cu X fragil (FRAXA), distrofia miotonic (sau boala Steinert) i boala (coreea) Huntington (tabel 6.2). Aceste afeciuni se caracterizeaz prin expansiunea instabil a unui segment de ADN ce conine o repetiie de trei nucleotide (CAG, CTG, CGG sau GAA), dispuse n tandem (deci adiacente); aceste repetiii se pot gsi n exoni, la capetele 5 sau 3 ale genei, sau n introni. Pe msur ce gena trece de la o generaie la alta, numrul de repetiii trinucleotidice crete progresiv, sufer o expansiune, i cnd depete un anumit prag critic produce anomalii n expresia genei sau funcia proteinei codificat de gen.Tabelul 6.2. Exemple reprezentative de boli prin repetiii trinucleotidiceBoalaLocalizarea

geneiMod de

transmisieRepetiieLocalizarea repetiieiNumr de repetiiiEfect parental

Alela

normalPre-mutaieMutaie

complet

Sindromul X fragil (FRAXA)

(1:4000)Xq27.3DLX (anticipaie)CGG5UT< 6060-200> 200matern

Distrofia miotonic

(1:8000)19q13.3 AD

(anticipaie)CTG3UT< 3050-80> 80matern

Ataxia Friedreich

(1:50.000)9q13 ARGAAIntron 1< 2536 -100> 100matern

Boala Huntington

(1:12.000)4p16.3AD (anticipaie)CAGRegiune codant< 36?> 35patern

Identificarea acestui mecanism mutaional nou a fost o surpriz deoarece:

se deosebete fundamental de restul mutaiilor, permanente i stabile care, o dat produse, acestea se transmit nemodificate n succesiunea generaiilor i sunt prezente la toi bolnavii dintr-o familie;

iniial se credea c acest tip de mutaii dinamice nu se gsesc dect la om; ulterior au fost identificate i la alte specii, dar mult mai rar;Genomul uman conine numeroase secvene repetitive care ocup poziii cromosomiale fixe (loci) i a cror complexitate variaz de la gene integrale (de ex., genele pentru ARN ribosomal) la tracturi formate prin repetarea unuia sau ctorva nucleotide (microsatelii). Printre cele mai simple i mai frecvente sunt repetiiile unor mononucleotide SNP (de la single nucleotid polimorfism), repetiiile dinucleotidelor AC, repetiiile unor trinucleotide sau, mai rar, a unor secvene mai lungi repetate succesiv, n tandem. Funciile repetiiilor simple sunt nc neelucidate dar foarte probabil ele nu sunt inerte funcional; Numrul de repetiii variaz de la un individ la altul, ceea ce face ca secvena respectiv s fie polimorfic n populaie. Aceste secvene repetate sunt n general stabile, fiind transmise identic la generaiile urmtoare i putnd servi atunci ca marker genetic.

n unele cazuri, o repetiie trinucleotidic moderat amplificat (probabil prin CO inegal) poate produce boal dar repetiia este perfect stabil i se transmite fr modificri de mrime n mai multe generaii; de ex. o expansiune trinucleotidic stabil n gena HOXD13 produce o polisindactilie.

n alte cazuri, numrul de repetiii trinucleotidice al secvenei poate s creasc n succesiunea generaiilor, realiznd o expansiune progresiv sau brutal a secvenei repetate, care este numit instabil. n aceste cazuri, dac secvena se gsete n interiorul sau vecintatea unei gene, se produce o alterare a expresiei genei ce conine secvena i deci o stare de boal.

n afara expansiunii repetiiilor trinucleotidice instabile exist foarte probabil si expansiuni ale altor tipuri de repetiii. Astfel, o expansiune a unei repetiii de 12 nucleotide n gena cistatin B produce epilepsia mioclonic progresiv.

La bolile prin repetiii trinucleotidice ne vom referi n detaliu n capitolul 11.D dar aici vom preciza c modul lor de transmitere prezint dou caracteristici neobinuite: exist o cretere a riscului de apariie a bolii sau a severitii i precocitii manifestrilor clinice n succesiunea generaiilor (anticipaie); formele cele mai severe se transmit de preferin printr-unul din prini (efect parental).

Expansiunea instabil a repetiiilor trinucleotidice este un mecanism nou i neateptat, care ridic n discuie trei ntrebri majore:

cum se produce boala prin aceste expansiuni?

care este mecansimul instabilitii i expansiunii?

cum au aprut aceste mutaii n populaiile umane i, mai ales, cum au putut s se menin la un nivel att de ridicat?

a. Mecanismul de producere a bolii prin expansiuni trinucleotidice.

Caracteristica definitorie a mutaiilor dinamice o constituie instabilitatea lor, exprimat cel mai adesea prin creterea numrului de copii trinucleotidice. Instabilitatea devine manifest cu ocazia diviziunilor pe care le realizeaz celula purttoare, fie n timpul transmiterii de la prini la descendeni (instabilitate intergeneraional sau instabilitate meiotic), fie prin mitoz, producnd variaii de mrime n esuturile unui individ afectat (mozaicism somatic sau instabilitate mitotic). Instabilitatea se exprim clinic sub form de boal cnd este depit un anumit prag critic de repetri. Sub pragul critic variaiile numrului de repetiii trinucleotidice genereaz polimorfisme ADN benigne. O nou traversare a meiozei, de aceast dat n gonadele bolnavilor, se soldeaz cel mai frecvent cu expansiuni adiionale care, n generaia urmtoare, vor imprima o simptomatologie mai sever i vor precipita debutul clinic, la o vrst mai precoce. Acest fenomen, denumit anticipaie, caracterizeaz aproape toate bolile prin repetiii trinucleotidice descrise pn n prezent, dar se manifest i n alte afeciuni cu mecanism patogenic neclar. Intensitatea de manifestare a bolii la descendeni este proporional cu dimensiunile secvenei amplificate i depinde uneori de sexul printelui prin care se face transmiterea: n sindromul X fragil i distrofia miotonic boala este mai grav dac transmiterea se face de ctre mam, n timp ce n boala Huntington gravitatea formei clinice este mai mare cnd boala este transmis de ctre tat. Mecanismul acestui efect parental este necunoscut.

Genele ce conin expansiuni trinucleotidice instabile se mpart n dou clase majore:

(1).Gene care prezint expansiuni foarte mari ale unor repetiii (CGG, CCG, CTG, GAA), localizate n secvenele necodante ale genei n promotor, regiunile 5 i 3 transcrise dar netranslate sau n introni (tabelul 6.2, primele trei exemple). Expansiunea lor masiv blocheaz transcripia genei i produce pierdera funciei genei. Alelele normale i stabile au de obicei 5-50 repetiii; alelele cu mrime intermediar - ntre 25-200 repetiii - sunt nepatogene (atenie: pragul critic este destul de mare) dar foarte instabile. Creterea treptat a numrului de repetiii accentueaz instabilitatea i realizeaz, n apropierea pragului critic, o premutaie. Purttorii de premutaii sunt fenotipic normali dar vor avea descendeni afectai deoarece n celulele lor germinale se produce o expansiune brusc a premutaiei care, prin depirea pragului critic de repetiii, devine mutaie complet.(2). Gene ce prezint o expansiune moderat a tripletului CAG (ce codific glutamina) n secvenele codante (tabelul 6.2, exemplul patru); aceast expansiune nu modific transcripia i translaia dar altereaz structura i funcia proteinei codificate (genernd o secven poliglutaminic anormal). Alelele normale i stabile au 10-30 repetiii, ele devin (ocazional) patogene la un prag critic foarte ngust i determin o alterare specific a anumitor neuroni. Cu ct repetiia este mai mare cu att boala debuteaz la o vrst mai precoce. Acest mod de aciune - dup cum se vede diferit de primul grup - rmne enigmatic. Prezena unui mecanism unic de mutaie (sau predominant) face ca identificarea mutaiei prin analiza ADN s fie cel mai bun mijloc de diagnostic exact a fiecreia dintre bolile prin expansiunea repetiiilor trinucleotidice. b. Mecanismul expansiunii repetiiilor trinucleotidice.Mecanismul expansiunii nu se cunoate exact dar probabil este identic la toate tipurile de repetiii trinucleotidice. Cel mai probabil expansiunea se produce prin fenomenul de glisare sau derapare replicativ (descris mai sus; figura 6.8), determinat de alinierea greit i mperecherea decalat a repetiiilor trinucleotidice. O dovad: repetiiile ntrerupte prin introducerea unui triplet diferit (de ex., CAT n repetiia CAG) sunt stabile comparativ cu repetiiile omogene. S-a sugerat c regiunile cu repetiii trinucleotidice pot forma, dincolo de un anumit prag de lungime, structuri spaiale anormale ale ADN (n ac de pr sau triplu helix) care perturb replicarea i favorizeaz derapajul replicativ.

Exist o serie de dovezi care susin rolul fragmentelor Okazaki n expansiunea repetiiilor trinucleotidice. Unele repetiii trinucleotidice (precum CCG n sindromul X fragil sau CAG n distrofia miotonic) prezint o distribuie bimodal a instabilitii, cu o grani ntre modificrile minore i cele majore ale numrului repetiiilor trinucleotidice care este aproximativ egal cu dimensiunea unui fragment Okazaki. De asemeni, structurile secundare CAG/CTG i repetiiile CGG pot inhiba activitatea endonucleazei FEN1 implicat n procesarea fragmentelor Okazaki. Drojdiile mutante pentru Rad27 (echivalentul FEN1) prezint tendina spre instabilitatea numrului secvenelor repetitive.

Mecanismul de glisare replicativ ar trebui s produc i contracii prin deleii - alturi de expansiuni (vezi figura 6.8) dar acest fenomen este rar i deloc instabil; nu se tie nc de ce se produc cu predilecie mai ales expansiuni. De asemenea nu se tie dac modificrile repetiiilor trinucleotidice la transmiterea intergeneraii se produc n gametogenez, la fecundarea sau n primele diviziuni din embriogenez. n sfrit, trebuie spus c glisarea replicativ a fost implicat i n fenoemnul de instabilitate a microsateliilor din anumite cancere dar bolile prin repetiii trinucleotidice nu se asociaz cu un defect din repararea ADN i nici cu o inciden crescut a neoplaziilor.

Exist i date care contrazic rolul replicrii ADN n expansiunea repetiiilor trinucleotidice. Astfel, au fost identificate modele animale pentru boala Huntington la care se constat o cretere marcat a numrului repetiiilor CAG la nivelul neuronilor din striatum. Aceti neuroni nu mai sufer diviziuni celulare, ceea ce arat c expansiunea repetiiilor trinucleotidice a aparut independent de replicare.

c. Originea mutaiilor prin expansiunea repetiiilor trinucleotidice.Se pune firesc ntrebarea: cum s-au putut menine la un nivel de frecven populaional ridicat dou dintre bolile prin repetiii trinucleotidice sindromul X fragil (transmitere legat de X) i distrofia miotonic (DM) (transmitere autosomal dominant) care reduc firesc eficacitatea reproductiv (fitness)? Un rspuns imediat ar fi: o producie foarte mare de mutaii noi. Dar, neateptat, s-a descoperit c n cele dou boli exist un dezechilibru de nlnuire ntre markeri polimorfici apropiai de gen, sugernd astfel un efect de fondator! Analiza locusului DM relev c 10% din populaie are o alel normal lung (cu 20-30 CTG) ce constituie rezervorul mutaiilor recurente, evolund n mai multe generaii spre lungimea patologic. Aceste alele lungi normale au aprut printr-un eveniment ancestral unic, fapt ce explic dezechilibrul de nlnuire observat pentru alelele patologice. Date asemntoare se cunosc i despre coreea Huntington: alelele patologice provin de la un tat sntos, purttor al unei alele lungi normale (30-35 repetiii)

1.5 MECANISME RARE Genomul uman conine un numr mare de secvene repetate dispersate, n special secvene scurte (300 pb) de tip Alu, din familia Sine, sau secvene mai lungi (3-7 kb) din familia Line, derivate din retrotransposoni (vezi capitolul 2.C.2.2). Unele secvene pot fi active i sunt capabile de transpoziie prin ARN intermediar, inserndu-se aleatoriu n genom; dac inseria se face n exoni, atunci se ntrerupe secvena ce codific o protein; dac inseria se face n introni poate fi afectat matisarea lor. Astfel, s-au descris cazuri de hemofilie A, distrofie muscular Duchenne, polipoz de colon produse prin inseria unei repetiii LINE 1 sau de neurofibromatoz 1 cauzate de inseria unui element transpozabil activ Alu. Mecanismul de mutagenez inserional pare, din fericire, puin activ la om. Rearanjrile cromosomice, de tipul translocaiilor reciproce echilibrate, care au punctul de ruptur n interiorul unei gene, pot produce inactivarea ei. Acest mecanism este foarte rar dar important pentru localizarea foarte precis i apoi clonarea genei implicate.2. CONSECINELE GENOTIPICE I FENOTIPICE ALE MUTAIILOR GENICE

Consecinele mutaiilor genice asupra genotipului i expresiei sale fenotipice sunt complexe i dependente de factori multipli. Analiza este dificil, datorit volumului mare de informaii, iar prezentarea lor nu poate fi dect sintetic i schematic.

2.1. MUTAII N GENOMUL NUCLEAR I MITOCONDRIAL

Cele mai multe mutaii genice afecteaz genomul nuclear i, din acesta, ADN extragenic, care reprezint imensa majoritate a genomului. Se produce astfel un foarte amplu polimorfism al ADN, care ns nu are consecine fenotipice. n felul acesta marea majoritate a mutaiilor nu au consecine asupra individului i se poate spune c soluia imensitii ADN extragenic, necodant este benefic pentru evoluie. Din fericire, aceasta nu este unica soluie de protecie din natur: s ne amintim de existena ADN necodant din structura genelor, precum i de mutaiile sinonime (silenioase) sau de cele conservative (vezi seciunea B.1.1). Practic, numai anumite alterri n structura i expresia genic vor fi implicate n producerea unor boli, dar despre acestea vom discuta n seciunea urmtoare.

Genomul mitocondrial reprezint doar circa 1/200.000 din mrimea genomului nuclear. ADNmt se gsete n mii de copii n fiecarea celul somatic; dac se produce o mutaie ntr-o singur molecul de ADNmt se poate presupune c ansa fixrii ei va fi foarte mic i deci rata mutaiilor mitocondriale cu efect patogen va fi foarte joas. Totui, frecvena bolilor mitocondriale este suficient de mare pentru a considera genomul mitocondrial ca o int preferat (un punct fierbinte) a mutaiilor. Acest paradox se poate explica prin:

procentajul foarte mare al regiunilor codante din ADNmt (93% vs 3% n genomul nuclear);

rata foarte nalt a mutaiilor la nivelul ADNmt, supus unui bombardament continuu de ctre speciile reactive de oxigen (produse de catena respiratorie din mitocondrii) i neprotejat de ctre histone; ADNmt sufer mai multe runde de replicare dect ADN cromosomic iar sistemele de reparare a leziunilor ADNmt sunt reduse i puin eficace;

rata foarte mare de fixare a mutaiilor n ADNmt

Deci rata mutaiilor n ADNmt este foarte mare datorit combinaiei dintre instabilitatea crescut a ADNmt i rata nalt de fixare a mutaiilor.

2.2 CONSECINELE MUTAIILOR ASUPRA INFORMAIEI I EXPRESIEI GENICE.

Consecinele genotipice ale mutaiilor genice depind n principal de tipul i localizarea mutaiilor n structura genei.

a). Efectul tipului de mutaie.Efectul tipului de mutaie microleziuni (substituii, deleii i inserii nucleotidice mici) sau macroleziuni / remanieri genice (deleii, duplicaii, inserii, inversii etc) asupra informaiei genice a fost discutat n seciunea anterioar. Fr a reveni, vom reaminti c substituiile se produc cel mai frecvent n secvenele codante determinnd, prin mutaii nesinonime, modificri ale secvenei de aminoacizi ale proteinelor iar deleiile i inseriile mici (non-multiplu de trei) produc decalarea cadrului de lectur i o protein complet anormal. Remanierile genice importante determin o perturbare a expresiei genice afectnd transcripia, procesarea ARNm, translaia sau stabilitatea proteinelor.

b). Efectul localizrii intragenice a mutaiei.

Orice component din structura genei (vezi 3.B.1) poate fi afectat de mutaii (figura 6.6). n funcie de localizarea intragenic vom deosebi trei categorii principale de mutaii:

mutaii n regiunile codante determin sinteza unei proteine cu o structur anormal a crei funcie va fi de obicei redus sau abolit, mai rar crescut sau modificat, diferit de funcia iniial;

mutaii care afecteaz matisarea ARNm precursor sau stabilitatea ARNm matur produc, n funcie de mecanism, fie o protein anormal, fie o modificare a cantitii de protein normal sintetizat;

mutaii care afecteaz dozajul genic (deleii, duplicaii) sau reglarea procesului de transcripie determin scderea sau creterea sintezei proteice, mai rar o expresie inadecvat ca timp i spaiu.

n esen, mutaiile n diferite regiuni din structura genei produc fie o modificare a structurii proteinei, fie o perturbare a diferitelor etape ale expresiei genice (la nivelul transcripiei, procesrii i maturrii ARNm precursor, al translaiei sau stabilitii proteinei).

(1). Transcripia. Mutaiile pot afecta transcripia alternd elemente diferite necesare reglrii acestui proces.

Secvenele regiunii promotor (de ex. a genei codante pentru -globin) pot fi modificate de mutaii diverse care vor altera legarea factorilor de transcripie; n acest context vom sublinia c exist i mutaii ale genelor ce codific factori de transcripie, deseori letale sau producnd anomalii de dezvoltare;

Secvenele 5UTR sau 3UTR, transcrise dar netranslate, din primul i ultimul exon al genei, pot suferi mutaii ce modific rata sintezei proteice. Au fost descrise mutaii ale secvenei 5UTR n gena pentru factorul IX ce produce hemofilia B Leyden i n gena FMR1 care determin sindromul X-fragil sau ale secvenei 3UTR n gena DM ce produce boala Steinert.

(2). Maturarea ARN premesager n ARNm. Mutaiile pot afecta matisarea i poliadenilarea ARNm precursor (vezi capitolul 4.B.2.b).

Alterarea (prin substituie) a situsurilor de decupare a intronilor situsul donor (5-GT) sau acceptor (AG-3) face ca excizia s se produc la urmtorul exon i astfel se va ncorpora n ARNm matur o parte sau ntregul intron sau va lipsi un exon (n funcie de situsul afectat). Ambele situaii au consecine importante asupra expresiei genei (ARNm instabil; polipeptid nefuncional).

Activarea, prin mutaie, a unui situs criptic de decupare (dintr-un exon sau intron) va antrena o competiie cu situsurile normale n cursul procesului de maturare a ARNm; aceste mutaii pot produce o protein trunchiat cu activitate funcional nul sau foarte redus (n funcie de exonul afectat) sau vor bloca transcripia (cnd se produc n introni)

(3). Translaia ARNm n protein. Mutaiile codonului iniiator, mutaiile cu decalarea cadrului de lectur (frameshift) sau mutaiile non-sens determin de regul absena formrii proteinei codificat de gena ce a fost modificat sau producerea unei proteine trunchiate.

Mutaiile cu sens greit modific semnificaia unui codon i consecinele lor sunt variabile dup natura schimbrii i amplasarea n protein a aminoacidului modificat. Mutaiile nesinonime pot afecta stabilitatea proteinei, localizarea intracelular, maturarea proteinei, asamblarea ei n structuri multimerice, interaciunile cu liganzii sau alte proteine, situsul funcional pentru activitatea enzimatic etc). Mutaiile sinonime (sau neutre) sunt ns fr efect (exceptnd situaiile de activare a unui situs criptic de matisare).

Mutaiile n codonul terminator vor duce la ncorporarea adiional de aminoacizi n protein, care va deveni instabil.

2.3. EFECTUL FENOTIPIC AL MUTAIILOR PATOGENE

Alternd funcia unei proteine, mutaiile pot avea consecine patologice majore, fiind astzi unanim recunoscute ca o cauz important de boal sau predispoziie la mbolnvire.

Efectul fenotipic al mutaiilor patogene depinde de mai muli factori:

efectul mutaiilor asupra funciei proteinei; n esen este vorba de pierderea i ctigul de funcie, dar aceste aspecte sunt mai complexe i vor fi nuanate i detaliate mai jos; tipul i funcia proteinei: enzim, protein structural, receptor membranar, canal ionic etc;

gradul n care fenotipul anormal va fi exprimat la heterozigoi; n bolile recesive prezena unei alele normale la heterozigoii N/a poate fi suficient pentru meninerea unei stri normale; n unele boli dominante heterozigoii A/n au un fenotip mai puin modificat comparativ cu homozigoii A/A;

gradul n care expresia genei mutante va fi influenat de alte gene modificatoare care genereaz un fond genetic diferit la persoane diferite;

natura celulelor (germinale sau somatice) i proporia de celule (n mozaicurile somatice) care au gena mutant; mutaiile motenite de la prini, prin gamei, sunt prezente n toate celulele unui individ; mutaiile somatice vor avea efecte dependente de momentul ontogenetic n care se produc i, n consecin, de proporia celulelor ce formeaz clona anormal;

originea parental a mutaiilor, n cazul genelor cu amprentare parental.Asupra unora din aceti factori, ce influeneaz n esen ereditatea monogenic, ne-am referit n capitolul anterior i vom reveni cu detalii i exemple n capitolul 11.A. Considerm totui utile pentru nelegerea efectelor mutaiilor cteva precizri sintetice despre efectul mutaiilor asupra funciei proteinei.

Mutaiile patogene, cauzatoare de boal, pot avea n funcie de tipul i mecanismul de aciune patru tipuri de efecte asupra funciei proteinei codificat de gena care a suferit mutaia.

(1) Pierderea funciei. Numeroase tipuri de mutaii pot produce o pierdere total sau parial a activitii normale a genei i deci a expresiei proteinei. Aceste mutaii sunt la originea majoritii bolilor cu transmitere recesiv, care se manifest la homozigoi sau heterozigoi compui (ambele gene alele sunt modificate); ele se pot gsi i n unele boli cu transmitere dominant prin haploinsuficien, cum ar fi hipercolesterolemia familial, n care formele heterozigote sunt mult mai puin severe dect cele homozigote; totui pierdera a 50% din activitatea genei este suficient pentru producerea bolii.(2) Ctigul de funcie. Mutaiile asociate cu un ctig de funcie a proteinei sunt mult mai rare; ele pot aciona fie prin creterea nivelului de expresie a proteinei (de exemplu, prin creterea dozajului genic), fie prin creterea abilitii proteinei de a-i efectua funcia normal proteinei (de exemplu, activarea permanent a unui receptor, n absena ligandului).

(3) Achiziia unor proprieti noi de ctre proteina mutant, prin mecanisme diverse:

modificarea proprietilor structurale ale proteinei ce tinde s polimerizeze sau s se agrege (mutaii ale genei -globinei n sicklemie sau mutaii ale genelor asociate cu amiloidoza);

achiziia unei funcii noi (varianta 1-antitripsin Pittsburg nu mai acioneaz ca o anti-elastaz ci ca un puternic inhibitor al factorilor de coagulare);

producia unei proteine toxice (gena ce codific precursorul peptidului pentru -amiloid i produce forme precoce de boal Alzheimer);

participarea polipeptidului mutant la formarea unor complexe multimerice, alturi de proteine normale, face ca ntregul complex s fie anormal sau nefuncional; acest efect a fost numit dominant negativ (de exemplu, genele COL1A1 sau COL1A2 ale colagenului).

(4) Expresia inadecvat a genei fie ca timp (expresie heterocronic), fie ca loc (expresie ectopic), fie ambele. n aceast categorie se ncadreaz persistena ereditar a hemoglobinei fetale sau expresia inadecvat a oncogenelor, n celule n care aceste gene nu sunt normal exprimate.2.4. CORELAII DINTRE GENOTIP I FENOTIP

Studiul mutaiilor patogenice, cauzatoare de boal, a dus la o mai bun nelegere a relaiilor dintre genotip i fenotip n bolile genetice. Desigur, relaia clasic o gen un caracter (boal) ce st la baza ereditii monogenice ramne valabil pentru multe boli dar aceasta nu este singura corelaie posibil ntre genotip i fenotip. Cu riscul de a reveni asupra unor aspecte discutate, dar pentru a asigura o nelegere complet a problemei, vom preciza aceste posibile corelaii.O gen o boal. Multe afeciuni monogenice sunt produse de mutaia unei anumite gene. Totul pare simplu i clar. n realitate, posibilitile actuale de analiz a genei i, implicit, de identificare a mutaiilor au artat c lucrurile nu sunt simple iar problema corelaiei genotip-fenotip este destul de complex. n unele boli (sicklemie, acondroplazie, boala Huntington, .a) mutaia este unic, deoarece produce maladia printr-o modificare funcional foarte precis a proteinei sau a expresiei genei. n alte afeciuni o anumit mutaie este preponderent, datorit unui punct fierbinte din structura genei ce determin recurena mutaiei (inversia n hemofilia A, deleia n amiotrofia spinal, expansiunea trinucleotidic n sindromul X-fragil etc). n numeroasele boli produse prin pierderea funciei unei proteine heterogenitatea mutaiilor din gen este aproape regula (de exemplu, mai mult de 130 de mutaii n -talasemie i peste 600 n fibroza chistic). Spectrul mutaiilor reflect sensibilitatea genei la diferite mecanisme mutaionale iar corelaia dintre anumite mutaii i anumite manifestri clinice ramne a fi definit n viitor. O gen mai multe boli. Exist numeroase exemple care demonstraez c mutaii produse ntr-o singur gen determin boli distincte, diferite. Dup un studiu a lui Pearson (1996) pe 750 de gene indexate n OMIM, 100 produceau prin mutaii mai multe boli (2-7) diferite (n total 248). Citm cteva exemple:

mutaiile genei pentru beta-globin (pe cromosomul 11pter) produc sicklemia (AR), -talasemia (AR), methemoglobinopatia (AD) i o hemoglobina instabil (AD);

mutaii n gena RET (11q12) (ce codific un receptor tirozinkinazic, implicat n migrarea celulelor din creasta neural) produc boala Hirschprung i trei forme de cancer ereditar al glandelor tiroid i suprarenal (neoplaziile endocrine multiple MEN2A i MEN2B precum i cancer medular tiroidian); un al treilea grup de mutaii n gena RET produc ambele boli la acelai individ; gena LICAM (pe cromosomul Xq28) prezint mutaii n hidrocefalia prin stenoza apeductului Sylvius, sindromul MASA (mental retardation, aphasia, shuffing gait, adducted thumbs = retard mintal, afazie, mers "trit" - spastic i adducia policelor) i paraplegia spastic 1;

gena COL1A2 este implicat n patru forme diferite clinic de osteogenesis imperfecta i sindromul Ehlers-Danlos tipul VII B;

mutaiile genei FGFR2 (receptorul factorului de cretere fibroblastic 2) produc trei sindroame diferite cu craniostenoz, numite Crouzon, Pfeiffer i Jackson-Wiess.

Mai multe gene o boal. Este vorba de heterogenitatea nonalelic, de locus, n care mutaii n gene diferite se manifest fenotipic identic sau foarte asemntor; n capitolul 4.A.5 i tabelul 4.1 am discutat mai multe exemple, precum i importana practic a acestui fenomen relativ frecvent.

Vom mai aduga un exemplu ilustrativ: boala Hirschprung (megacolonul congenital) caracterizat prin dezvoltare insuficient a ganglionilor colonici, care produce secundar hipomotilitatea i distensia colonului, constipaie sever cronic se poate prezenta fie ca o form izolat, fie ca o component a unor sindroame plurimalformative (sindromul Down, sindromul Waardenburg). Formele izolate au fost considerate mult timp ca fiind un exemplu de ereditate multifactorial. Studii recente au artat c cel puin jumtate din cazurile familiale i 20% din cazurile sporadice de boal Hirschprung sunt determinate de o mutaie ntr-una din urmtoarele cinci gene diferite: gena RET (Rearranged during Transfection), care codific un receptor pentru tirozin-kinaze, ligandul su GDNF, gena pentru receptorul B al endotelinelor (EDNRB), gena pentru endotelina 3 (EDN3) i gena pentru enzima de conversie a endotelinei (ECE1). Vom mai aduga faptul c n sindromul Waardenburg (pete hipopigmentate ale pielii sau me alb frontal, surditate neurosensorial, megacolon congenital) intervine o gen ce codific factorul de transcripie SOX10.Ereditatea digenic: dou gene pentru un fenotip. Boala apare prin mutaii concomitente n dou gene nealele; de exemplu, o form de retinit pigmentar este produs numai dac se produc concomitent mutaii n gena RDS (pe cromosomul 6p)i n gena ROM (pe cromosomul 11q).

O mutaie nu determin totdeauna acelai fenotip. Fenotipul produs de o mutaie poate fi influenat de aciunea altor gene (de exemplu o aceiai mutaie C342R n gena FGFR2 poate produce sindromul Crouzon sau sindromul Pfeiffer) sau de factori de mediu (de exemplu, mutaia n gena PAH poate produce prin deficiena fenilalanin hidroxilazei fenilcetonuria cu retard mintal sever, sau ramne fr efect dac bolnavii sunt depistai la natere i primesc o diet fr fenilalanin).

Mutaii n aceeai gen forme dominante sau recesive ale bolii. Deficiena n factorul von Willebrand este o tulburare a coagulrii sngelui relativ frecvent (vezi capitolul 11.E) Unele mutaii (deleii, nonsens, frameshift) n gena VWF (pe cromosomul 12p) produc o form de boal cu transmitere recesiv autosomal iar alte mutaii (mai ales substituii cu sens greit) determin forme dominante

3. CAUZELE I FRECVENA MUTAIILOR GENICE

Mutaiile genice se pot produce spontan, natural, cel mai frecvent prin erori accidentale n cursul replicrii, sau pot fi induse de ageni exogeni sau endogeni, numii mutageni. Aceste cauze spontane sau induse genereaz multiple i frecvente leziuni ale ADN, care au un potenial nociv major asupra informaiei ereditare.

O clasificare simpl a diverselor tipuri de leziuni ale ADN permite gruparea lor n trei mari categorii:

Alterri ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminri spontane, metilri, adiii variate, substituii sau pierderea lor i crearea de situsuri abazice ;

Formarea de puni intra- sau intercatenare (prin ageni intercalani);

Rupturi simple, monocatenare, i bicatenare

Din fericire exist n organism mecanisme de reparare eficace care reduc substanial efectul defavorabil al mutaiilor.

3.1. MUTAII SPONTANE

Schematic, se pot deosebi dou mecanisme de generare a mutaiilor spontane

(1). Cea mai important surs de leziuni ADN o reprezint nsui procesul de replicare. n cursul replicrii semiconservative (vezi 5.A.3.2) fiecare caten a ADN parental servete ca matri pentru sinteza unei noi catene; acest proces, efectuat de polimeraze, implic recunoaterea unei baze din catena matri i adugarea complementar a unui nucleotid la captul 3 al catenei ce se sintetizeaz. ADN polimeraza catalizeaz mperecherea corect a A cu T u G cu C, fcnd rareori erori. i totui, datorit unui fenomen de tautomerie (ce implic deplasarea unui atom de hidrogen din nucleotid), acestea pot forma structuri alternative care fac ca bazele s se mperecheze greit (mismatch). ADN polimerazele corecteaz n mare msur aceste erori. Acestea sunt mai rare n cazul ADN polimerazei delta, principala polimeraza implicat n replicarea ADN, dar relativ frecvente n cazul altor polimeraze. Pe ansamblu, erorile care rezult n urma procesului de replicare au o frecven de aproximativ 50.000/genom/zi. Dar organismul uman posed alte sisteme de reparare care determin ca rata erorilor de mperechere aprute n cursul unei runde de replicare s fie extrem de redus, de circa o ncorporare greit la 109 1010 nucleotide.(2). Exist leziuni care pot s apar spontan, n condiii fiziologice, n absena replicrii. De exemplu, hidroliza reziduurilor nucleotidice poate s conduc la situsuri abazice; apariia lor poate fi favorizat de temperaturi crescute i acidifierea mediului celular. Dezaminarea spontan a citozinei, adeninei, guaninei sau 5-metilcitozinei poate conduce la formarea uracilului, hipoxantinei, xantinei i, respectiv, timinei.

3.2. MUTAIILE INDUSE

Mutaiile induse sunt determinate de ageni mutageni externi sau interni, fizici sau chimici.

(1). Factorii de mediu extern precum radiaiile ultraviolete (UV) component a radiaiei solare, radiaiile ionizante i numeroi ageni chimici genotoxici pot cauza diverse alterri n structura ADN (tabelul 6.3) care, lsate nereparate, pot conduce la apariia mutaiilor. Pe primul loc ca frecven n aceast categorie se afl radiaiile ultraviolete, ce produc dimeri pirimidinici. Din punctul de vedere al consecinelor, fumul de igar este ns cel mai important agent mutagen exogen, acesta fiind responsabil de producerea mai multor decese prin cancer dect orice alt agent exogen cunoscut. Hidrocarburi policiclice se gsesc ns i n produii de combustie; lor li se adaug ageni alchilani/metilani ce polueaz atmosfera, gudroanele de ulei, medicamente antitumorale, diverse minerale sau metale. Radiaiile ionizante (X, gama) induc n special rupturi mono- sau bicatenare ale ADN. La om, radiaiile ionizante - din surse naturale, profesionale, medicale sau accidentale - au probabil consecine genetice mici (caseta 6.4) (datorit eficacitii mecanismelor de reparare a leziunilor) reprezentate cel mai adesea sub form de mutaii recesive, care se vor manifesta numai dac se ntlnesc doi heterozigoi cu o mutaie identic. Organismele internaionale au definit o limit arbitrar de siguran - mai mic dect cea care ar produce un efect semnificativ asupra frecvenei mutaiilor duntoare din populaie - recomandnd ca expunerea profesional s nu depeasc 50 mSv pe an .

CASETA 6.4

Radiaiile ionizante

Radiaiile ionizante includ unde electromagnetice cu lungime de und foarte mic (razele gama i razele-X) precum i particule cu energie nalt (particule alfa, beta i neutroni). Razele-X, razele gama i neutronii au mare putere de ptrundere comparativ cu particulele alfa i beta (numai civa milimetri). Cantitatea de radiaii primit pe esut iradiat se numete doz de radiaii i este msurat n doz absorbit de radiaii sau rad (radiation absorbed dose). Oamenii pot fi expui la un amestec de radiaii i atunci se folosete o unitate convenional rem (roentgen equivalent for man) pentru a msura orice radiaie n termeni de raze-X. Un rem de radiaie este acea doz absorbit care produce ntr-un esut dat acelai efect biologic ca 1 rad de raze-X. Un milirem (mmrem) este a mia parte dintr-un rem.100 rem este echivalent cu 1 sievert (Sv) iar 100 razi este echivalent cu 1 gray (Gy); pentru practic, sievert i gray sunt aproximativ egale.

Potrivit unei concepii mai vechi, bazat pe studii experimental, orice iradiere produce mutaii (nu exist prag sub care iradierea s nu aibe efect), numrul de mutaii produse de radiaii crete proporional cu doza, efectele genetice sunt cumulative. Studii recente par s infirme conceptul lipsei de prag, relevnd c dozele mici stimuleaz activitatea mecanismelor reparrii ADN.Sursele de radiaii la care este expus omul sunt naturale (radiaii cosmice, materiale radioactive) i artificiale (radiologie diagnostic sau terapeutic, expunere profesional, expunere accidental) iar doza medie de radiaii primit pe gonade, din diferite surse, este apreciat (Clarke i Southwood, 1989) la 2,4 mSv pe an i 72 mSv pentru 30 de ani (perioada reproductiv).

La om efectele genetice ale radiaiilor sunt greu de studiat deoarece ele nu sunt manifeste la generaia expus ci numai la generaiile urmtoare i aceasta n funcie de tipul de mutaie: dominant, recesiv sau legat de X. Studiile ample efectuate de ctre Neel i Schull la supravieuitorii bombardamentelor atomice din Japonia au artat c nu exist diferene semnificative ale nou-nscuilor mori, malformaiilor congenitale, deceselor neonatale, sex ratio (pentru mutaii letale legate de X), cancere niante de vrsta de 20 de ani - la urmaii prinilor expui (la o doz de 30-60 remi) comparativ cu descendenii unui lot martor neexpus la radiaii atomice. Rezultate similare au fost obinute i prin analiza efectelor iradierii medicale. n ceea ce privete iradierea profesional, mai ales n centralele nucleare, s-a descris o cretere semnificativ a numrului de copii cu leucemie din tai ce lucreaz n aceste uniti, posibil prin inducerea de mutaii n celulele lor germinale. Alte cercetri nu au reuit, totui, s ateste efectele leucemogene ale iradierii paterne. i datele privind iradierea accidental sunt contradictorii. Un studiu al persoanelor expuse la radiaii dup accidentul de la centrala nuclear de la Cernobl indic o cretere de dou ori a ratei mutaiilor germinale. Dar este dificil s se compare aceste date cu rezultatele studiilor Japoneze deoarece tipul de radiaii este oarecum diferit, lotul de la Cernobl este mic (79 de familii) iar grupul martor era din populaia britanic. n concluzie, ncercrile de a demonstra c radiaiile produc alterri genetice la om nu au fost foarte convingtoare. Aceasta nu nseamn c radiaiile ionizante nu au consecine genetice ci numai ca acestea sunt probabil mici (mecanismele de reparare a leziunilor sunt destul de eficace) si cel mai adesea sub form de mutaii recesive, care se vor manifesta numai dac se ntlnesc doi heterozigoi cu o mutaie identic.

Organismele internaionale au definit o doz permisiv de radiaii. Aceasta este o limit arbitrar de siguran i este foarte probabil mai mic dect cea care ar produce un efect semnificativ asupra frecvenei mutaiilor duntoare din populaie. S-a recomandat ca expunerea profesional s nu depeasc 50 mSv pe an, dar unele ri au sczut aceast doz la 15 mSv. Pentru a avea o imagine clar asupra acestei doze (prin comparaie cu iradierea medical sau cosmic) trebuie spus c 1 mSv este echivalentul dozei primite la 50 de radiografii toracice i n 100 de zboruri de la Bucureti la Paris. Cu toate acestea, este obligatoriu s se evite orice expunere nenecesar la radiaii, n special pe gonade sau asupra ftului, i s se asigure obligatoriu o protecie maxim.

(2). Alte leziuni sunt produse de ctre diferite agresiuni endogene cum ar fi speciile reactive de oxigen (2-20.000 leziuni/genom/zi), o serie de molecule reactive mici (precum S-adenozil metionina: 600 leziuni/genom/zi) i mai ales produii de peroxidare ai lipidelor (malondialdehida, acroleina i crotonaldehida care sunt metabolizate rapid ctre epoxizi i pot genera apoi alterri ale bazelor ADN). Organismul poseda un sistem antioxidant (superoxid dismutaza, catalaza, glutation peroxidaza etc.) care ncearc s minimizeze aceste efecte. Atunci cnd capacitatea acestui sistem este depasit, aceti ageni induc modificri ale bazelor ADN i rupturi monocatenare prin alterarea deoxiribozelor.

Tabelul 6.3 Tipuri de leziuni ADN i agenii etiologici ai acestora

Tipul de leziune ADNAgentul etiologic

Erori de mperechereErori ale replicrii

Situsuri abaziceErori ale replicrii, spontan

DeaminriSpontan

AlchilriAgeni metilani (S-adenozil metionina)

Baze oxidate sau hidroxilateUV-A, radicali ai oxigenului, radiaii X, produi ai peroxidrii lipidelor

Dimeri pirimidiniciUV-B (> 320 nm)

Adiia unor radicali chimiciCarcinogeni (atmosferici, alimentari, fum de igar), citostatice

Legturi ncruciate intracatenare sau cu proteineleCarcinogeni, citostatice

Legturi ncruciate intercatenareMitomicina C, cisplatinul

Rupturi monocatenareRadiaii X, inhibitori ai topoizomerazei I, radicali ai oxigenului

Rupturi bicatenareRadiaii gama, inhibitori ai topoizomerazei II

3.3. frecvena mutaiilor genice.

Rata mutaiilor unei gene se exprim de obicei ca numr de mutaii noi per locus per generaie i se evalueaz prin determinarea incidenei unor cazuri sporadice, noi, a unor boli autosomal dominante (cu penetran complet) sau recesive legate de X, care au o expresie clinic uor de recunoscut (de exemplu, acondroplazia, aniridia, hemofilia, distrofia muscular Duchenne .a). Determinrile pentru diferite afeciuni au dat valori ale ratelor mutaiilor germinale cuprinse ntre 10-4 i 10-7 mutaii per locus / per generaie, cu o frecven medie de 1x10-6. Aceasta nseamn c cel puin una din 20 de persoane a primit de la unul din prini o gen mutant nou.

Mutaiile noi se pot produce n spermatogenez sau ovogenez, n cursul diviziunilor mitotice sau meiotice ale celulelor germinale. Exist ns diferene importante ntre cele dou sexe privind timpul de producere i numrul de diviziuni celulare pe care le sufer celulele sexuale.

n ovogenez, fiecare gamet este rezultatul a 22 de diviziuni mitotice i unei diviziuni meiotice (23 de diviziuni) ce se produc n cursul vieii fetale; dup cum tim deja (vezi capitolul 5.C.2) meioza I se oprete nainte de natere, rmne astfel suspendat un timp ndelungat i este reluat numai dup ovulaie. Cu ct ovocitele rmn mai mult vreme n meioza I (i deci vrsta reproductiv matern este mai mare) cu att mai mult crete riscul nedisjunciei meiotice. n spermatogenez, producia de gamei se face pn la vrste avansate i fiecare spermatozoid rezult, n medie, dup 200 de diviziuni iar acest numr crete cu vrsta. Explicaie: spermatogoniile su se formeaz pn la pubertate, prin circa 30 de mitoze; apoi sunt necesare 5 diviziuni pentru fiecare ciclu de spermiogenez, care dureaz 16 zile (deci 23 cicluri pe an); numrul de diviziuni pentru formarea unui spermatozoid se calculeaz dup formula urmtoare: 30+23n+5, n care n= vrsta n ani15 (vrsta pubertii). La o frecven de 1010 erori de replicare per genom per diviziune fiecare spermatozoid al adultului va conine cteva sute de mutaii noi produse prin acest mecanism. Dei marea lor majoritate nu vor avea efecte fenotipice aparente se estimeaz c o mic proporie de spermatozoizi (circa 1 din 10) vor avea o mutaie patogen.Rezult, logic, c frecvena neomutaiilor paterne produse prin erori de replicare a ADN ar trebui s fie mai mare dect a neomutaiilor materne i s creasc odat cu vrsta tatlui, fapt observat n anumite boli, ca neurofibromatoza, acondroplazia sau hemofilia B (la bunicul matern al bolnavului). Acest fenomen este amplificat de faptul c metilarea citozinei n dimerul CpG este mai frecvent n celulele germinale masculine, determinnd transversiile de tip CT sau GA.

Astfel, mutaiile FGFR2 (receptorul factorului de cretere fibroblastic de tip 2) responsabile de sindromul Apert (o craniostenoz asociat cu polisindactilie) sunt toate de origine patern. Mai mult, unele remanieri genice (inversia genei ce codific factorul VII al coagulrii sau deleia/duplicaia genei PMP22, discutate mai sus) se produc, din motive necunoscute, exclusiv n celulele germinale masculine.

Diferenele de sex n producerea unor mutaii se observ pregnant i n unele boli prin expansiunea repetiiilor trinucleotidice. Astfel, expansiunea ampl a repetiiei CAG, ce produce formele juvenile de boal Huntingon, este n general de origine patern. Dar expansiunea masiv a repetiiei CGG n sindromul X fragil se produce aproape ntotdeauna n timpul gametogenezei feminine. Aceste diferene pot exprima nu numai diferenele fundamentale dintre ovogenz i spermatogenez ci i o selecie contra gameilor ce poart expansiunea repetiiei.

Multe mutaii se produc, firesc, i n celulele somatice care efectueaz un numr mare de replicri i diviziuni. Un organism uman adult are circa 1014 celule derivate din zigot prin 1015 diviziuni celulare; la o frecven de 1010 erori de replicare per genom i per diviziune rezult mii de mutaii noi n genomul fiecrei celule. Dar consecinele lor fenotipice depind de natura mutaiei, gena alterat i esutul implicat. Ele se ntlnesc frecvent n procesul de cancerogenez i constituie, foarte probabil, una din cauzele heterogenitii expresiei clinic a unor boli ereditare. Mozaicurile somatice ar putea produce boli genetice numai dac se produc precoce, n cursul dezvoltrii embrionare. Cert este c mutaiile somatice (non germinale) nu se transmit generaiilor viitoare.

4. MECANISMELE REPARRII LEZIUNILOR ADN.Genomul uman sufer numeroase i variate leziuni spontane sau induse de ageni externi sau interni. Totui rata mutaiilor este meninut la un nivel sczut prin intervenia unor sisteme de recunoatere a leziunilor ADN i reparare enzimatic, care realizeaz fie o restituie fidel a structurii iniiale fie o reparare parial, cu defect. Aciunea acestor sisteme este corelat cu mecanismele care coordoneaz progresia prin ciclul celular, tolerarea unor leziuni sau apoptoza. Nici unul dintre mecanismele de reparare ale ADN nu are o eficien absolut dar, n general, performana lor este ridicat. Existena unor boli umane asociate cu defecte n repararea ADN, multe din ele avnd o cretere a susceptibilitii la cancer, demonstreaz importana acestui proces de control al calitii ADN.4.1. MECANISMELE DE REPARARE ALE ADN NUCLEAR .

a). Repararea erorilor de mperechere din cursul replicrii ADN.n momentul n care cele dou catene ADN sunt separate, nucleotidele activate se aranjeaz "spontan" i pe baz de complementaritate pe ntreaga poriune a matriei de ADN astfel expus. Stoichiometria reaciei de poziionare pe baz de complementaritate permite mperecheri greite (n special G-T) cu o probabilitate de 1 la 10.000. n plus, replicarea secvenelor repetitive ale ADN se nsoete relativ frecvent de fenomenul de alunecare (glisare) (slippage) a ADN-polimerazei, ceea ce conduce la formarea unor bucle de ctre una din catene cu alungirea (inserie) sau scurtarea (deleia) secvenei repetitive (vezi figura 6.8). Rata mutaiilor este, ns, mult mai mic datorit interveniei unor mecanisme care asigur fidelitatea replicrii i pstrarea informaiei ereditare.

Un prim mecanism implic ADN polimerazele care nu catalizeaz ncorporarea pasiv a oricrui nucleotid care este deja legat prin puni de hidrogen la catena matri, ci discrimineaz activ mpotriva unor mperecheri greite, acestea producnd distorsiuni a dublului-helix ADN. Distorsiunile acioneaz ca semnal pentru ndeprtare bazei inserate greit. Mecansimul crete acurateea replicrii de aproximativ 100 de ori, reducnd rata ateptat a erorilor de la 10-4 la aproximativ 10-6.

Un alt mecanism major rspunztor pentru acurateea replicrii ADN este activitatea de autocorecie (sau editare de la proofreading) a ADN polimerazelor. Ca un veritabil "editor", ADN polimerazele verific dac ultimul nucleotid plasat la captul 3'OH al catenei de ADN este "scris corect", deci dac nu exist o greeal de mperechere. In cazul unei astfel de erori ele pot s-l excizeze (datorit capacitii exonucleazice 3' 5' pe care o posed) i s-l nlocuiasc cu nucleotidul corespunztor. O astfel de activitate, demonstrat pentru ADN polimerazele delta si epsilon, permite creterea acurateei replicrii ADN de circa 100-1000 ori.

n sfrit, puinele erori de mperechere care apar totui n ciuda interveniei mecanismelor mai sus amintite vor fi inta unor mecanisme de reparare a erorilor de mperechere (MMR de la mismatch repair) ce intervin dup replicare.

Sistemul MMR a fost descris iniial la E.coli cu fenotipul mutator (mut), ce determin o cretere a ratei mutaiilor spontane pentru toi locii din genomul bacteriei. Sistemul implic intervenia unor proteine speciale (proteine mutator): Mut S, Mut L i Mut H ce formeaz aa numitul sistem de reparare direcionat metil. Denumirea deriv de la mecanismul de identificarea a catenei care conine nucleotidul mperecheat greit. Aceast funcie pare a fi asigurat de diferena n statusul de metilare care exist ntre catena nou sintetizat (nemetilat) i catena matri (metilat). n esen, mperecherea greit produce o distorsiune a catenei nou sintetizate, nemetilat, recunoscut de proteina Mut S care se fixeaz la caten i recruteaz proteinele Mut L (care stabilizeaz complexul), Mut H (cu aciune endonucleazic) i o helicaz (Mut U, care desface duplexul ADN). Mut H va cliva catena de ADN i fragmentul de circa 100 pb va fi ndeprtat de o exonucleaz. Golul rezultat va fi reparat de ctre ADN polimeraza, folosind secvena de baze a matriei. Pasul final este realizarea legturii fosfodiester de ctre ADN ligaz.

La om au fost identificate genele care codific proteinele MSH 2, MSH3 i GTBP (sau MSH6) omologe cu Mut S precum i proteinele MLH1, PMS1 i PMS2 omologe cu Mut L. Nucleotidele mperecheate greit sunt identificate prin intermediul a dou complexe: MSH2/MSH6 (GTBP) care recunosc n special erorile de mperechere i MSH2/MSH3 care recunosc preferenial micile inserii/deleii. Dup recunoaterea erorii de mperechere, intervin complexele heterodimerice MLH1/PMS2 i MLH1/PMS1 ce interacioneaz cu complexele legate anterior (figura 6.18). n continuare, procesul de reparare presupune secionarea i degradarea exonucleazic a unui fragment ADN cu o lungime de peste 1-2 kb (ce conine erorile de replicare), urmat de refacerea secvenei normale. Pentru aceste aciuni, mecanismul de reparare utilizeaz o serie de factori comuni altor sisteme de reparare (ADN-polimeraza , RPA, PCNA, factorul de replicare C (RFC), exonucleaza 1, FEN1 i exonucleazele asociate ADN-polimerazelor i ).

Mutaiile genelor implicate n calea MMR au drept consecin o boal genetic, relativ frecvent, numit cancerul colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC), responsabil de apariia a circa 5% din toate cazurile de cancer colorectal; boala se asociaz un risc relativ crescut pentru dezvoltarea unor neoplazii maligne cu alte localizri. Exist cteva caracteristici ale neoplasmelor colorectale care apar n cadrul HNPCC: 70% sunt localizate proximal de flexura splenic, exist un exces de cancere mucinoase sau cu infiltraie limfocitar iar evoluia pare a fi mai bun. Markerul principal al celulelor cu HNPCC este instabilitatea microsateliilor (secvene di-, tri- sau tetranucleotidice nalt repetitive, dispersate n genom). Circa 60-70% din cazurile de HNPCC sunt determinate de mutaii ale genelor MLH1 i MSH2; un numr redus de cazuri sunt asociate cu mutaii ale genelor PMS1, PMS2 i MSH6.

b). Repararea bazelor modificate sau alterate dup replicare

n afara erorilor ce se produc n timpul replicrii, o alt surs de mutaii este modificarea chimic sau alterarea bazelor azotate dup replicare. Leziunile ADN produse de ageni endogeni sunt ndeprtate de obicei prin mecanismul de excizie a bazelor (BER) modificate i mai rar prin reparare direct monoenzimatic (MGMT). Agenii mutageni exogeni care produc distorsiunea dublului helix prin legturi ncruciate intra- sau intercatenare; aceste alterri sunt ndeprtate prin excizia nucleotidelor (NER).

Mecanismele BER, NER i chiar a MMR sunt variante ale unui mecanism general de reparare prin excizie-resintez, ce difer prin inta lor, modul de recunoatere a leziunii i moleculele efectoare. Acest mecanism se realizeaz n mai multe etape (figura 6.19): recunoaterea situsului lezat (baz sau nucleotid), prin aciunea unor enzime specifice; desfacerea dublului helix, de ctre o helicaz;

excizia fragmentului de ADN alterat i a unui segment nvecinat leziunii, prin intervenia unor endonucleaze;

ndeprtarea i degradarea fragmnetului, de ctre exonucleaze;

resinteza componentelor breei/lacunei (folosind ca matri catena de ADN complementar) prin aciunea unor ADN polimeraze;

realizarea, de ctre o ADN ligaz, a legturii fosfodiester ntre fragmentul de ADN neosintetizat i capetele libere ale catenei de ADN.

(1). Repararea prin excizia bazei (base excision repair- BER). O baz modificat chimic (frecvent prin dezaminare spontan) este ndeprtat prin intermediul unor ADN-glicozilaze care cliveaz legtura glicozil dintre baza azotat i deoxiriboz. Se creeaz astfel un situs abazic care este recunoscut de ctre endonucleaza APE1 (apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1), enzim cu rol cheie n calea de reparare BER la om; aceast enzim cliveaz catena ADN pe flancul 5 al situsului abazic. Apoi intervine polimeraza (figura 6.20) care ndeprteaz reziduul 5-deoxiribozo-fosfat (dRp), inser nucleotidul corespunztor catenei matri i recruteaz complexul ligaz 3 XRCC


Recommended