Cristina CĂRĂBUȘ (căs. APETREI) - old.unitbv.roold.unitbv.ro/Portals/31/Sustineri de...

Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013

Axa prioritară 1 „Educaţie şi formare profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”

Domeniul major de intervenţie 1.5. „Programe doctorale şi post-doctorale în sprijinul cercetării”

Titlul proiectului: Burse doctorale si postdoctorale pentru cercetare de excelenta

Numărul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/134378

Beneficiar: Universitatea Transilvania din Braşov

Partener:

UNIVERSITATEA „TRANSILVANIA” BRAŞOV

Școala Doctorală Interdisciplinară

Departament: Silvicultură

Ing. Mihaela-Cristina CĂRĂBUȘ (căs. APETREI)

Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și

cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.) în populații din România:

evaluări cu markeri ADN

Genetic diversity of hornbeam (Carpinus betulus L.) and oriental

hornbeam (Carpinus orientalis Mill.) in Romanian populations:

evaluations using DNA markers

Rezumatul tezei de doctorat

Summary of the PhD Thesis

Conducător ştiinţific

Prof.univ.dr.ing. Neculae ŞOFLETEA

BRAŞOV, 2017

MINISTERUL EDUCAŢIEI NAŢIONALE

UNIVERSITATEA TRANSILVANIA DIN BRAŞOV

BRAŞOV, B-DUL EROILOR NR. 29, 500036, TEL. 0040-268-413000, FAX

0040-268-410525

RECTORAT

D-lui (D-nei) ...............................................................................................

COMPONENŢA

Comisiei de doctorat

Numită prin ordinul Rectorului Universităţii „Transilvania” din Braşov

Nr. 8521 din 15.03.2017

PREŞEDINTE: Prof.univ.dr.ing. Ovidiu IONESCU

PRODECAN: Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere,

Universitatea Transilvania din Brașov

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof.univ.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA


REFERENŢI: Conf.dr.ing. Liviu FĂRTĂIŞ

Universitatea ,,Ştefan cel Mare” Suceava

Cercet.st.gr. I – Dr. Ing. Flaviu-Eugen POPESCU

Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare în Silvicultură

,,Marin Dracea”

Prof.dr.ing. Alexandru Lucian CURTU


Data, ora şi locul susţinerii publice a tezei de doctorat: 28.04.2017, 11.00, sala SP4,

Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere

Eventualele aprecieri sau observaţii asupra conţinutului lucrării vă rugăm să le transmiteţi

în timp util, pe adresa Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere, Brașov, Șirul Beethoven,

nr. 1, 500123, la numărul de fax: 0268.475705 sau la adresa de e-mail

[email protected].

Totodată vă invităm să luaţi parte la şedinţa publică de susţinere a tezei de doctorat.

Vă mulţumim.

mailto:[email protected]

Diversitatea genetică a carpenului (Carpinus betulus L.) și cărpiniței (Carpinus orientalis Mill.)

în populații din România: evaluări cu markeri ADN

3

Mulțumiri

Următoarea teză este o lucrare personală, dar nu ar fi fost posibilă fără sprijinul,

îndrumarea și eforturile depuse de numeroase persoane. În acești ani s-au legat relații frumoase

cu mulți oameni generoși de la care am primit îndrumări ştiinţifice de calitate realizate cu

profesionalism şi exigenţă. Prin intermediul acestei lucrări, profit de această oportunitate de a-

mi exprima recunoștința sinceră tuturor care m-au ajutat pe tot parcursul proiectului meu.

În primul rând îmi exprim recunoștința profundă și sinceră conducătorului de doctorat,

domnului Prof.univ.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA care m-a sprijin și îndrumat necondiționat din

primele zile până la sfârșitul studiului. Dumnealui mi-a oferit încurajări, sfaturi bune, comentarii

prețioase și sugestii clare. Ca rezultat, acestea m-au ajutat să dezvolt și să îmbunătățeasc

abilitățile mele, să termin această teză, iar viața de cercetare a devenit ușoară și plină de

satisfacție pentru mine. Fără ajutorul dumneavoastră visele mele şi lucrarea mea nu ar fi fost

materializate.

,,Vă spun de la început ca nu va fi o temă ușoară. Carpenul este poliploid în cea mai mare

parte și de aici o interpretare mai dificilă a electroforegramelor”

Sunt afirmațiile domnului Decan Alexandru Lucian CURTU care mi-a dat șansa de a

începe studiul, de a finaliza cercetarea și nu în ultimul rând pentru a îmbunătăți cunoștințele

geneticii moleculare o dată cu deplasarea la Gottingen. Vă mulțumesc pentru încrederea avută în

potențialul meu și susținere încă din perioada ciclului de liciență, dar nu în ultimul rând de

răbdarea de care ați dat dovadă.

Îi mulțumesc în continuare domnului Rector Ioan Vasile ABRUDAN care a avut un rol

important în cadrul desfășurării analizelor de laborator. Acestea nu s-ar fi realizat la timp dacă

nu ar fi aprobat suplimentarea fondului de cercetare.

Doresc să mulțumesc membrilor comisiilor de susținere a referatelor științifice pentru

sugestiile valoroase, discuțiile constructive și pentru citirea manuscrisul cu mare atenție și grijă.

În mod deosebit aș dori să mulțumesc profesorilor care mi-au călăuzit sinuosul drum spre

tainele ştiinţei, pentru sprijinul lor în timpul studiului meu dar și în timpul facultății. Sunt profund

recunoscătoare pentru contribuțiile lor critice și abile acestei teze.

Adresez mulțumiri personalului de la INCDS “Marin Dracea”, în special domnului dr.ing.

Flaviu POPESCU și domnului dr.ing. Dragoș POSTOLACHE, pentru colaborarea și dicuțiile

științifice valoroase pe care le am avut privind analiza ADN-ului cloroplastic.



4

Mulțumiri aderesez domnișoarei dr.ing. Elena Ciocîrlan pentru asistența ei, pentru

îndrumarea în analiza datelor și pentru sfaturile cu privire la modul de a rezolva problemele pe

care le-am confruntat în laborator asupra analizelor genetice.

Sunt deosebit de recunoscătoare colegilor și prietenilor mei pentru consultanță științifică,

asistență tehnică, schimbul de idei și nu în ultimul rând de sprijinul puternic și minunat. Le

mulțumesc pentru prietenia lor și multe discuții academice și non-academice interesante.

Aş dori să îmi extind recunoştinţa mea sinceră faţă de socrii mei (Ioan și Elena) pentru

înțelegerea și suportul moral acordat, precum și cumnatei mele (Laura) și viitorului ei soț (Ionuț)

pentru încurajare și încredere.

Sunt profund recunoscătoare și nu aș putea să le mulțumesc îndeajuns părințiilor mei

(Gheorghe și Meluzina), pentru dragostea neclintită şi de neegalat, pentru sprijinul necondiționat

și încurajarea lor pe tot parcursul studiului meu. Doresc să-i mulțumesc surioarei mele Adelina-

Nicoleta pentru încurajările primite din partea ei și nu în ultimul rând de faptul că de fiecare dată

m-a făcut să zâmbesc în momentele grele. Le mulțumesc în continuare bunicilor mei (Elena,

Gheorghe și Stela), cei care m-au vegheat în perioada copilăriei și care mi-au modelat spiritul.

Voi sunteți simbolul copilăriei mele fericite.

Mulțumiri speciale și adevărate doresc să le exprim soțului meu, Ionuț, pentru dragostea

lui, pentru sprijinul și încurajările fără sfârșit, pentru răbdarea și stresul pe care i l-am provocat

și care a sacrificat timpul și resursele lui pentru a-mi permite să fac această lucrare. El merită

fiecare succes și reușită a mea, pentru că fără el nu ar fi existat această teză.

Vă mulțumesc și vă dedic această lucrare...



5

CUPRINS

Pg.

teza

Pg.

rezumat

INTRODUCERE………………………………………………………………………9………..9

Capitolul I. ANALIZA STADIULUI ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR……..……..10……...10

1.1 Consideraţii generale privind genul Carpinus…………………………….10...…….10

1.2 Originea şi evoluţia genului Carpinus.........................................................12............11

1.3 Diversitatea genetică a carpenului și cărpiniței (studii de ADN)…………..22..….…12

1.3.1 Date privind ADN-ul extranuclear………………………………….22.…..…12

1.3.2 Date privind ADN-ul nuclear.............................................................26...........13

Capitolul II. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR....................................30...........14

2.1 Scopul cercetărilor........................................................................................30...........14

2.2 Obiectivele cercetărilor................................................................................30...........14

Capitolul III. MATERIAL ȘI METODE DE CERCETARE………………………….31....…...15

3.1 Localizarea studiului și materialul de cercetare……………………………31……...15

3.2 Metode de cercetare………………………………………………………..35...…....17

3.2.1 Analiza ADN-ului nuclear cu markeri de tipul SSRs…………….....35.......…17

3.2.1.1 Pregătirea probelor și izolarea ADN-ului…………………...35...……17

3.2.1.2 Testarea calității și concentrației ADN-lui izolat...................36...........17

3.2.1.3 Reacția de polimerizare în lanț (PCR)....................................38...........18

3.2.1.4 Electroforeza capilară.............................................................40..........19

3.2.2 Analiza ADN-ului cloroplastic cu markeri de tipul SSRs…………..43..…....19

3.3 Programe și metode statistice utilizate în analiza datelor..............................44...........20

3.3.1 Analiza ADN-ului nuclear..................................................................44...........20

3.3.1.1 Determinarea erorilor de citire a electroforegramelor.….......44...........20

3.3.1.2 Calculul indicilor de diversitate genetică...............................46...........21

3.3.1.3 Analiza structurilor genetice spațiale ....................................47...........21

3.3.1.4 Testul ,,bottleneck’’................................................................49..........23

3.3.2 Analiza ADN-ului cloroplastic............................................................50..........23

Capitolul IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII......................................................................52..........25

4.1 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului nuclear...........52..........25

4.1.1 Stabilirea protocolului de interpretare a electroforegramelor pentru specia

octoploidă C. betulus........................................................................52..........25

4.1.2 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus betulus..................56..........29

4.1.2.1 Structura alelică......................................................................56.........29



6

4.1.2.2 Indicii de diversitate genetică.................................................59.........31

4.1.2.3 Diferențierea genetică.............................................................61.........33

4.1.2.4 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale...........62.........33

4.1.2.5 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale...........66.........35

4.1.3 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus orientalis...............71.........39

4.1.3.1 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg, a dezechilibrului linkage și

identificarea alelelor nule...................................................................71.........31

4.1.3.2 Structura alelică......................................................................73.........41

4.1.3.3 Indicii de diversitate genetică..................................................75.........42

4.1.3.4 Diferențierea genetică.............................................................79.........44

4.1.3.5 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale...........80.........45

4.1.3.6 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale...........83.........46

4.1.3.7 Testarea efectului de ,,bottleneck” în populațiile de cărpiniță.88.........49

4.2 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului cloroplastic.....89.........50

4.2.1 Haplotipurile identificate și frecvențele relative ale acestora în populații.89......50

4.2.2 Distribuția geografică a haplotipurilor...................................................91.........51

4.2.3 Diversitatea genetică intra și interpopulațională....................................93.........54

4.2.4 Relațiile filogenetice între haplotipuri...................................................96.........56

Capitolul V. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. DISEMINAREA

REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE.......................................98.........59

5.1 Concluzii finale................................................................................................98........59

5.1.1 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici nucleari..................98........59

5.1.2 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici cloroplastici..........100........61

5.2 Contribuții originale.......................................................................................100........61

5.3 Diseminarea rezultatelor.................................................................................101........62

5.4 Direcții viitoare de cercetare...........................................................................102........63

BIBLIOGRAFIE..............................................................................................................103........64

REZUMAT......................................................................................................................147........71

CURRICULUM VITAE..................................................................................................148........72



7

CONTENT

Summary Thesis

INTRODUCTION...................................................................................................................9......9

Chapter I. ANALYSIS OF THE CURRENT STATE OF KNOWLEDGE...........................10.....10

1.1 General description of genus Carpinus...............................................................10.....10

1.2 Origin and evolution of genus Carpinus.............................................................12.....11

1.3 Genetic diversity of hornbeam and oriental hornbeam (DNA studies)...............22.....12

1.3.1 Extranuclear DNA data.............................................................................22.....12

1.3.2 Nuclear DNA data.....................................................................................26.....13

Chapter II. AIM AND RESEARCH OBJECTIVES.............................................................30.....14

2.1 Aim of the study...................................................................................................30.....14

2.2 Objectives............................................................................................................30.....14

Chapter III. MATERIAL AND METHODS.........................................................................31.....15

3.1 Location of study and research material...............................................................31.....15

3.2 Research methods................................................................................................35.....17

3.2.1 Nuclear DNA analysis with SSRs markers................................................35.....17

3.2.1.1 Sample preparation and DNA isolation.........................................35.....17

3.2.1.2 Testing the quality and the concentration of DNA........................36.....17

3.2.1.3 Polymerase chain reaction (PCR)..................................................38.....18

3.2.1.4 Capillary electrophoresis..............................................................40.....19

3.2.2 Chloroplast DNA analysis with SSRs markers..........................................43.....19

3.3 Programs and statistical methods used in dataset analysis...................................44.....20

3.3.1 Nuclear DNA analysis...............................................................................44.....20

3.3.1.1 Determination the reading errors of electropherograms................44.....20

3.3.1.2 Genetic diversity indices...............................................................46.....21

3.3.1.3 Spatial genetic structure................................................................47.....21

3.3.1.4 ,,Bottleneck” test...........................................................................49.....23

3.3.2 Chloroplast DNA analysis.........................................................................50.....23

Chapter IV. RESULTS AND DISCUSSION........................................................................52.....25

4.1 Allelic structure and genetic diversity at the nuclear DNA level..........................52.....25

4.1.1 Establishment of the protocol for electropherograms interpretation of the C.

betulus octoploid species.......................................................................................................52.....25

4.1.2 Genetic diversity in the Carpinus betulus populations...............................56.....29

4.1.2.1 Allelic structure.............................................................................56.....29




8

4.1.2.3 Genetic differentiation..................................................................61.....33

4.1.2.4 Spatial genetic structure between populations...............................62.....33

4.1.2.5 Spatial genetic structure within populations..................................66.....35

4.1.3 Genetic diversity in the Carpinus orientalis populations...........................71.....39

4.1.3.1 Testing the Hardy-Weinberg equilibrium, linkage disequilibrium and

null allele identification.........................................................................................................73.....39

4.1.3.2 Allelic structure.............................................................................73.....41


4.1.3.4 Genetic differentiation..................................................................79.....44

4.1.3.5 Spatial genetic structure between populations...............................80.....45

4.1.3.6 Spatial genetic structure within populations.................................83.....46

4.1.3.7 Testing of the ,,bottleneck” effect in the oriental hornbeam

populations............................................................................................................................88.....49

4.2 Allelic structure and genetic diversity at the chloroplast DNA level....................89.....50

4.2.1 Identified haplotypes and their relative frequency in the population.........89.....50

4.2.2 Geographical distribution of the haplotypes..............................................91.....51

4.2.3 Genetic diversity between and within populations.....................................93.....54

4.2.4 Phylogenetic relationships between haplotypes.........................................96.....56

Chapter V. FINAL CONCLUSIONS. ORIGINAL CONTRIBUTIONS. DISSEMINATION OF

RESULTS. FUTURE RESEARCH DIRECTIONS..............................................................98.....59

5.1 Final Conclusions................................................................................................98.....59

5.1.1 Conclusions resulted of the nuclear genetic markers analysis....................98.....59

5.1.2 Conclusions resulted of the chloroplast genetic markers analysis............100.....61

5.2 Original contributions........................................................................................100.....61

5.3 Dissemination of results....................................................................................101.....62

5.4 Future research directions..................................................................................102.....63

REFERENCES...................................................................................................................103.....64

ABSTRACT........................................................................................................................147.....71

CURRICULUM VITAE.....................................................................................................148.....72



9

INTRODUCERE

Variația genetică în interiorul speciilor de arbori este o componentă importantă a

biodiversității pădurilor (Kramer et al. 2016). Arborii s-au confruntat de-a lungul istoriei lor

evolutive cu schimbările globale de mediu, însă cei mai mulți dintre ei au supraviețuit (Hamrick,

2004). În acest context, capacitatea de replicare a variației genetice cu ajutorul genelor care

controlează trăsăturile adaptative este deosebit de importantă, deoarece permit supraviețuirea

populațiilor de arbori în condițiile schimbărilor de mediu.

Carpinus betulus și C. orientalis ar putea avea un rol important în menținerea vegetației

forestiere în arborete marginale: carpenul (specie octoploidă) mai ales ca urmare a capacității sale

foarte mari de concurență cu alte specii (Șofletea și Curtu, 2007; Paridari et al. 2013; Purina et al.

2015) și a puținilor factori biotici și abiotici care l-au afectat până în prezent (Zhu et al. 2012;

Şulea et al. 2013), respectiv cărpinița (specie diploidă) datorită adaptabilității de excepție dovedite

pentru zonele cu climat arid din silvostepă.

Nivelul de poliploidie a fost asociat cu creșterea toleranței față de factorii ecologici

limitativi (McIntyre, 2007; Leitch și Leitch, 2008), o dovadă binecunoscută în acest sens fiind

creșterea frecvenței poliploizilor la altitudini mari sau în arealele nordice (Ramsey, 2011).

Capacitatea speciilor diploide și poliploide de-a reacționa în moduri diferite față de încălzirea

climatului și alte modificări ale habitatului prezintă implicații potențiale pentru estimarea

distribuției viitoare a speciilor de arbori, așa cum s-a afirmat că speciile poliploide ocupă nișe

distincte și mai largi în raport cu speciile diploide (McIntyre, 2012). Poliploidia ar putea explica

de ce unele specii prezintă un succes mai ridicat decât altele, prin urmare, crește potențialul lor de-

a fi invazive (te Beest et al. 2012).

Relațiile filogenetice joacă un rol important asupra biologiei evolutive a structurii speciilor

și a populațiilor (Xu et al. 2015). Barierele montane influențează istoria evolutivă a populaților

prin izolarea lor (Bănărescu și Boşcaiu, 1973; Ortiz-Ramírez et al. 2016). Izolarea pe termen lung

în refugiile glaciare și procesul migrațional au jucat, de asemenea, un rol important în modelarea

diversității genetice a multor specii.

Această lucrare a plecat de la premisa că nu există nicio informație completă cu privire la

modelele de variație genetică, prin prisma markerilor SSRs nucleari și cloroplastici, pentru cele

două specii de Carpinus cu niveluri diferite de poliploidie. Mai mult decât atât, lipsesc în

continuare informații cu privire la diversitatea genetică și structura spațială a acestor specii, atât

la nivel regional cât și în arealul general al acestora. În contextul schimbărilor climatice

preconizate, obținerea din timp a acestor cunoștințe noi de genetică moleculară, chiar și pentru

specii care au în prezent o valoare economică redusă, prezintă utilitate pentru managementul

riscurilor în silvicultura viitorului.



10

CAPITOLUL I. ANALIZA STADIULUI ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR

1.1 Consideraţii generale privind genul Carpinus

Genul Carpinus a fost definit de Linnaeus (1737) și în clasificarea actuală aparţine familiei

Betulaceae, inclusă în mod tradiţional în cadrul ordinului Fagales (Thorne, 1973; Cronquist,

1981; Tutin et al. 1993; EuroMed Plant Database), deşi unii autori, cum ar fi Hickey și Wolfe

(1975), l-au considerat un ordin separat. Studiile taxonomice mai vechi (Winkler, 1904) sau mai

recente (care se ocupă exclusiv cu analiza organelor de reproducere; Crane, 1989) susţin divizarea

familiei Betulaceae în șase genuri care sunt distribuite în două triburi: Betuleae şi Coryleae (Crane

et al. 1990; Crane, 1998). Primul trib include genurile Alnus Mill. (29-35 specii) şi Betula L. (42-

50 specii), iar cel de al doilea trib Carpinus L. (26-35 specii), Corylus L. (16 specii), Ostrya Scop.

(5-9 specii) şi Ostryopsis Decne. (3 specii) (Hall, 1952; Crane et al. 1990; Grimm și Renner,

2013). Totodată, unii autori au inclus genurile Carpinus şi Ostrya într-un al treilea trib, Carpineae,

pe baza caracterelor morfologice florale (Abbe, 1935; Furlow, 1990).

Genurile Carpinus L. Ostrya Scop. şi Ostryopsis Decne. cuprind circa 47 de specii de

arbori şi arbuşti răspândite în regiunile temperate nordice (Winkler, 1904; Crane, 1989).

Aproximativ 35 de specii de arbori şi arbuşti cuprinde genul Carpinus, cu o distribuţie largă în

America de Nord (C. caroliniana şi C. tropicalis), Europa de Sud-Est şi Centrală (C. betulus L.

şi C. orientalis Mill.) şi în Asia (aproximativ 31 de specii) (Rehder, 1960; Heywood, 1993; Chen,

1994; Sun, et al. 2011).

Involucrul fructifer este un descriptor folosit pentru a diferenția cele două specii: la carpen

acesta este de 3-5 cm, trilobat, frunzos, cu marginea întreagă şi lobul median de 2-3 ori mai lung

decât cei laterali, în timp ce la cărpiniță are doar 1-2 cm, este nelobat şi neregulat serat pe margine

(Săvulescu, 1952; Șofletea și Curtu, 2007; Savill, 2013). Inflorescența în stadiul de fructificaţie

atinge în ansamblu 6-12 cm în cazul carpenului și respectiv doar 3-6 cm la cărpiniţă (Șofletea și

Curtu, 2007).

Carpenul este o valoroasă specie de amestec în arboretele de foioase, mai ales în pădurile

dominate de specii de cvercinee, manifestând o mare capacitate de competiție față de acestea în

stadiul juvenil (Petre et al. 2012). În ceea ce privește cărpinița, aceasta se remarcă mai ales prin

capacitatea de-a vegeta în zone aride (Șofletea și Curtu, 2007; Bergmeier și Dimopoulos, 2008;

Čarni et al. 2009; Lachashvili et al. 2016), fiind o specie promițătoare pentru menținerea

vegetației lemnoase în zone care ar putea fi afectate în viitor de modificările climatice preconizate.

Dealtfel, cărpinița este o specie caracteristică pentru unități de vegetație termofilă (Doniță et al.

2005; Chifu et al. 2006; Chifu și Irimia, 2014; Coldea et al. 2015).



11

1.2 Originea şi evoluţia genului Carpinus

Din punct de vedere etimologic, numele genului provine din latinescul ,,carpinus” (Nelson

și Deam, 1919) ce este compus din cuvintele celtice ,,karr” care înseamnă ,,lemn” şi ,,pen”, cu

semnificația ,,cap”, adică ,,juguri de lemn” (Mauric, 2000), referindu-se la faptul că lemnul său

extrem de tare, asemănător ca un corn (engl. horn = corn) (San-Miguel-Ayanz et al. 2016), a fost

folosit de romani pentru carele lor, mai exact la realizarea jugurilor boilor (Heath, 2012).

Carpenul a recolonizat Europa foarte târziu, în timpul Holocenului, deși cercetările

palinologice indică existența acestuia, uneori chiar abundentă, încă din perioada interglaciară

(Pop, 1932; Fărcaș și Tanțău, 1999). Istoria mai recentă a speciei şi unele procese biologice şi

ecologice caracteristice acesteia ar putea fi explică prin diseminarea relativ limitată a semințelor.

Genul Carpinus a fost detectat pentru prima dată în timpul Paleocenului, în Europa

Centrală, din granule de polen care au fost integrat în genul Carpinuspollenites Krutzsch (Muller,

1981). Resturi de frunze și fructe au fost găsite în Eocen în Kursk (Rusia), Siberia, Manciuria,

Japonia, Alaska, Oregon și Idaho (Jentys-Szaferowa, 1958). Polenul de tip Ostrya (care include

date pentru două specii: Carpinus orientalis şi Ostrya carpinifolia) apare de la perioada Terţiară

încoace, având însă o abundenţă scăzută (Tzedakis, 1994).

Din datele palinologice reiese atestări ale carpenului în sudul Spaniei acum cca. 17 500

de ani, iar în nord-vestul ei, de cca. 11 500 de ani, ca în prezent să fie aproape inexistent în

Peninsula Iberică (Grivet și Petit, 2003). Involucrul cărpiniţei este prezent în mai multe depozite

neogene din Europa de Vest (Fărcaş et al. 2006).

În Bulgaria există semnalări ale carpenului în Tardiglaciar (Alleröd), în Munţii Rila şi

Pirin (Bozilova, 1975), autoarea include specia chiar într-un sistem de etajare a vegetaţiei.

Carpenul a fost atestat acum ± 8 500 ani lângă litoralul Mării Negre, la Durankulak (Bozilova şi

Tonkov, 1985; Bozilova şi Atanassova, 1989). Momentul expansiunii carpenului s-a înregistrat

acum ± 7 000 de ani, iar faza de maximă răspândire a sa a fost semnalată acum ± 5 800 de ani,

deci în ultima parte a Atlanticului (Bozilova, 1996; Fărcaş et al. 2006).

Polenul bradului şi al cărpiniţei (nu şi cel al carpenului) apar în spectrele polinice

tardiglaciare în Ungaria (Willis et al. 1995, 1997; Willis, 1997).

În România, primele atestări ale carpenului, în spectre polinice, sunt cele de la Peşteana

(Munţii Poiana Ruscă), de acum ± 12 800 ani şi Luci (Munţii Harghitei), de acum 12 350 ani, ce

sunt considerate „infecţii”, deoarece sunt apariţii izolate ale carpenului în spectrele polinice,

urmate de o lungă pauză, înaintea altor atestări (Fărcaş et al. 2006).

Începând cu 5 000 de ani B.P., are loc expansiunea și optimul de Carpinus, ca mai apoi

fagul să disloce și apoi să elimine acest etaj al cărpinetelor, alcătuind cele mai recente asociații



12

silvestre postglaciare (făgetele) (Fărcaş et al. 2006). Cercetările de paleobotanică relevă o fază a

carpenului în Carpații românești în timpul Subborealului, astfel încât etajul cărpinetelor a fost cu

mult mai extins pe altitudine (Diaconeasa și Fărcaș, 1998b).

1.4 Diversitatea genetică a carpenului și cărpiniței (studii de ADN)

1.4.1 Date privind ADN-ul extranuclear

Materialul genetic extranuclear este constituit din ADN-ul cloroplastic (întâlnit la plante)

și ADN-ul mitocondrial (întâlnit la plante și animale). Pe baza datelor din literatură a rezultat că,

până în prezent, cele două specii de Carpinus au fost studiate doar la nivelul ADN-ului

cloroplastic, nu și al celui mitocondrial.

Prin analiza ADNcp cu markeri ADN s-au putut identifica rutele de migrare postglaciară

ale mai multor specii forestiere şi centrele de refugii în timpul glaciațiunilor cuaternare (Petit et

al. 2002a; Bassil et al. 2012; Papageorgiou et al. 2014).

Majoritatea laboratoarelor au analizat două tipuri de fragmente cloroplastice: fragmente

mari (1,5-4 kilobaze), în care polimorfismul este detectat prin utilizarea unei enzime de restricție

(RFLP), și fragmente mai mici (100-200 bp), denumite microsateliți (SSRs), care conțin diferite

repetiții ale mononucleotidelor (Grivet, 2002).

Petit et al. 2003 au analizat 18 populații din arealul carpenului unde au fost identificate 4

haplotipuri. Indicele de diferențiere genetică a atins valoarea de GST = 1,00, de unde se poate

deduce că populațiile de carpen s-au conformat cel mai bine la modelul global de divergență.

În cadrul studiului la nivel european efectuat de Grivet şi Petit (2003) asupra carpenului

(C. betulus) şi cărpiniţei (C. orientalis) s-au analizat 36 de populaţii de carpen şi 5 de cărpiniţă din

12 ţări. Din România s-au analizat probe de ADNcp pe de o parte, prin procedura PCR-RFLP,

utilizând două fragmente: K1K2 (restricţionat cu enzima HinfI) şi CD (restricţionat cu enzima

TaqI). Separarea fragmentelor restricţionate s-a făcut pe geluri de poliacrilamidă, care în urma

interpretării au condus la identificarea a trei haplotipuri. Pe de altă parte, prin procedura SSRs s-

au utilizat trei perechi de primeri (ccmp4, ccmp7 şi ccmp10), în urma cărora au rezultat şapte

haplotipuri. Cele două tehnici (PCR-RFLP şi SSRs) au condus la determinarea a opt combinaţii

de haplotipuri cloroplastice, dintre care două sunt prezente numai în populaţiile de cărpiniţă din

Italia, Grecia şi Ungaria. La carpen au fost detectate 6 haplotipuri specifice, dintre care haplotipul

1se întâlnește în toate populaţiile din nordul şi vestul Europei. Celelalte 5 au fost întâlnite în estul

Europei (trei haplotipuri identificate numai în România) şi sudul Italiei. Două haplotipuri specifice

au fost detectate și la C. orientalis, haplotipul 7 respectiv haplotipul 8, sugerând absența fluxului

genetic între cele două specii. Centrele de refugiu ale celor două specii au fost în Peninsula Italică



13

(haplotipul 8) şi în Peninsula Balcanică. Diversitatea genetică haplotipică totală a carpenului la

nivel european a fost hT = 0,683, iar indicele de diferențiere între populații a avut valoarea GST =

0,972, ceea ce indică o pondere mare a diversității la nivel interpopulațional.

Fărcaş et al. (2006) au evaluat diversitatea genetică a 15 populaţii de carpen din România,

la nivelul ADN-ului cloroplastic, prin procedura PCR-RFLP, amplificând un fragment de

ADNcp (CD) restricționat cu ajutorul enzimei TaqI. În urma studiului au rezultat trei haplotipuri

şi anume: haplotipul 5 (57,3%) întâlnit în 8 populaţii pure și una în amestec cu haplotipurile 2 și

3; haplotipul 3 întâlnit în 6 populaţii pure și una în amestec cu haplotipurile 2 și 5; haplotipul 2

întâlnit într-o singură populație, împreună cu haplotipurile 3 și 5. Toate cele trei haplotipuri sunt

de origine balcanică. Variabilitatea genetică ridicată din Carpaţii de Curbură, poate sugera

existenţa unui refugiu glaciar pe teritoriul României sau apropiat de acesta.

Sintetizând datele din literatură (Grivet și Petit, 2003; Fărcaș et al. 2006), până în prezent

au fost descrise un număr de șase haplotipuri cloroplastice la carpen, trei haplotipuri bazându-se

pe variaţia ADNcp, iar celelalte trei haplotipuri pe variaţia SSRs cloroplastici.

Interpretarea datelor polen-analitice și corelarea cu cele obținute prin cercetări de genetică

moleculară au indicat două posibile refugii glaciare, unul în Peninsula Italică și respectiv altul în

Peninsula Balcanică, de unde în postglaciar ar fi migrat spre nordul și vestul Europei.

1.5.2 Date privind ADN-ul nuclear

Recent, au fost investigați SSRs nucleari din genul Carpinus și utilizați pentru genotipare

și evaluarea diversității genetice (Prinz și Finkeldey, 2015; Cărăbuș et al. 2015). Nu au existat

informații detaliate asupra markerilor codominanți (SSRs nucleari) pentru Carpinus, singurele

informații referindu-se doar studiile realizate de Barbará et al. (2007) și Gürcan și Mehlenbacher

(2010) cu privire la caracterizarea markerilor polimorfi din familia Betulaceae, în general.

Coart et al. (2005) au realizat un studiu bazat pe markeri AFLP pentru a caracteriza

structura genetică a populaţilor de C. betulus în Europa şi de-a formula câteva recomandări pentru

utilizarea acestei specii în plantaţiile din Flandra (Belgia). S-au luat în studiu 18 populații de

carpen (379 exemplare) din Flandra, iar din Europa 19 populații de carpen (196 exemplare) și 5

de cărpiniță (41 exemplare). Aceste populații au fost analizate cu trei combinații de primeri pentru

studiul diversității genetice: EcoRI-AAC + MseI-CAC, EcoRI-ACA + MseI-CAG și EcoRI-ACG

+ MseI-CAC. Cei trei markeri au reliefat existenţa a 118 alele, iar valoarea heterozigoţiei

aşteptate (He) a fost de 0,33 la nivel european și 0,30 în Flandra pentru C. betulus și 0,27 pentru

populațiile de C. orientalis.



14

CAPITOLUL II. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

2.1 Scopul cercetărilor

Cercetările întreprinse au avut ca scop evaluarea diversității genetice a carpenului

(Carpinus betulus) şi cărpiniței (Carpinus orientalis) cu ajutorul markerilor genetici de tipul

microsateliţilor nucleari şi cloroplastici în populațiile autohtone. Această evaluare a urmărit

cuantificarea diversităţii genetice intra/interpopulaţionale a celor două specii în vederea

caracterizării structurii lor genetice şi a identificării particularităţilor existente în diferite zone din

arealul lor natural în România. Analizele de ADN cloroplastic urmăresc în principal decelarea

haplotipurilor specifice existente în zona cercetată, pe baza cărora pot fi descrise căile de migrație

postglaciară din refugiile existente pentru cele două specii analizate.

2.2. Obiectivele cercetărilor

Pentru atingerea scopului propus s-au stabilit următoarele obiective de cercetare:

Stabilirea protocolului de interpretare a electroforegramelor pentru specia octoploidă C.

betulus.

Evaluarea diversității genetice a carpenului (Carpinus betulus) şi cărpiniţei (Carpinus

orientalis) din România cu ajutorul microsateliților, la nivelul ADN-ului nuclear.

Analiza haplotipurilor existente la nivelul ADN-ului cloroplastic și verificarea ipotezelor

referitoare la rutele de migrare postglaciară a celor două specii.

Având în vedere folosirea pentru prima dată la carpen/cărpiniță a markerilor nucleari și

cloroplastici de tipul SSR, cercetările au un caracter exploratoriu. Pe de altă parte, datele astfel

obținute vor putea fi comparate cu cele din cercetări anterioare având la bază alte tipuri de markeri

genetici.



15

Capitolul III. MATERIAL ȘI METODE DE CERCETARE

3.1. Localizarea studiului și materialul de cercetare

Cercetările s-au efectuat pe material biologic recoltat din populații reprezentative pentru

arealul celor două specii în România. O condiție avută în vedere a fost includerea în eșantionaj a

zonelor în care apar ambele specii, în vederea comparării structurii genetice haplotipice ale

acestora. Materialul de studiu pentru analiza ADN-ului nuclear (Tabelul 3.1) a fost recoltat din

14 populații (8 populații de carpen și 6 populații de cărpiniță), iar pentru analiza ADN-ului

cloroplastic (Tabelul 3.1) a fost recoltat din 24 de populații (18 populații de carpen și 6 populații

de cărpiniță). Aceste populații se află atât la limita arealului de distribuție, cât și în centrul

acestuia, inclusiv în zone în care cercetările anterioare nu au furnizat informații despre diversitatea

genetică, lipsind mai ales datele despre ADN-ul nuclear. La alegerea populațiilor de studiu s-a

avut în vedere, de asemenea, ca prin determinările ce vor fi efectuate să se obțină date care să fie

relevante pentru caracterizarea de ansamblu a genofondurilor existente pentru cele două specii în

România.



16

Tabelul 3.1 Localizarea geografică a populațiilor analizate

Table 3.1 Location of the analyzed populations

Nr. Denumirea

populației-Abreviere

Zona geografică Latitudine Longitudine Altitudinea

medie

Nr. de probe

(ADNn/ADNcp)

Specia

1 Apa Sărată (MM) Depresiunea Maramureș 47040’ 23029’ 265 m 50/5

C. b

etulu

s

2 Teaca (BN) Depresiunea Colinară a Transilvaniei-

Subcarpații Transilvaniei

46052’ 24032’ 465 m 50/5

3 Roșcani (IS) Podișul Moldovei - Câmpia Moldovei 47026’ 27024’ 146 m 50/5

4 Panciu (VN) Subcarpații de Curbură - Subcarpații Vrancei 46004’ 27001’ 303 m 50/5

5 Babadag (TL) Podișul Dobrogei - Podișul Babadag 44051’ 28041’ 110 m 50/5

6 Măcin (TL) Podișul Dobrogei - Munții Măcin 45014’ 28011’ 160 m 0/5

7 Warthe (BV) Carpații de Curbură - Munții Postăvarul 45039’ 25034’ 615 m 0/5

8 Tâmpa (BV) Carpații de Curbură - Munții Postăvarul 45038’ 25035’ 660 m 0/5

9 Gura Teghii (BZ) Subcarpții de Curbură - Subcarpații Buzăului 45032’ 26028’ 665 m 0/8

10 Măgura (BZ) Subcarpții de Curbură - Subcarpații Buzăului 45016’ 26033’ 255 m 0/8

11 Colți (BZ) Subcarpții de Curbură - Subcarpații Buzăului 45022’ 26023’ 452 m 0/5

12 Lotrișor (VL) Carpații Meridionali - Munții Lotrului 45017’ 24012’ 995 m 50/7

13 Leamna (DJ) Câmpia Română - Câmpia Olteniei 44018’ 23042’ 119 m 50/5

14 Baia de Aramă (MH) Podișul Mehedinți 44057’ 22045’ 482 m 50/5

15 Stârmina MH) Câmpia Română-Câmpia Olteniei 44030’ 22046’ 112 m 0/3

16 Lugoj (TM) Câmpia de Vest-Câmpia Banatului 45042’ 21058’ 230m 0/5

17 Săvârșin (AR) Depresiunea Mureșului 46000’ 22013’ 150 m 0/5

18 Huedin (CJ) Carpații Occidentali - Munții Apuseni 46056’ 22049’ 485 m 0/5

Total 400/96

1 Roșcani (IS) Podișul Moldovei - Câmpia Moldovei 47026’ 27024’ 162 m 50/6

C.o

rien

tali

s 2 Murfatlar (CT) Podișul Dobrogei - Podișul Dobrogei de Sud 44009’ 28023’ 55 m 50/6

3 Cândești (BZ) Subcarpații de Curbură - Subcarpații Buzăului 45016’ 26040’ 212 m 50/5

4 Leamna (DJ) Câmpia Română - Câmpia Olteniei 44017’ 23043’ 155 m 50/5

5 Baia de Aramă (MHA) Podișul Mehedinți 44057’ 22045’ 491 m 50/5

6 Stârmina (MHS) Câmpia Română - Câmpia Olteniei 44029’ 22045’ 200 m 50/5

Total 300/32

ADNn – ADN-ul nuclear; ADNcp – ADN-ul cloroplastic.



17

Probele de analiză (lujeri cu muguri sau frunze) au fost recoltate din 754 de arbori maturi

(454 de C. betulus și 300 de C. orientalis). Pentru analizele de ADN nuclear s-au recoltat câte 50

probe din fiecare populație, iar pentru cele de ADN cloroplastic s-au efectuat determinări la câte

5-8 arbori/populație. De altfel, literatura de specialitate (Pons și Petit, 1995) consideră că sunt

suficienți 5 arbori/populație pentru a caracteriza structura genetică haplotipică, eșantionaje

similare fiind utilizate în multe studii efectuate la cvercinee (Slade et al. 2008; Pliura et al. 2009).

În cazul de față nu s-a pus condiția ca distanța între exemplare să fie de cel puțin 50 m

(condiție care urmărește evitarea sau diminuarea probelor ca exemplarele să fie înrudite),

deoarece un obiectiv secundar al cercetărilor efectuate a avut în vedere efectuarea de analize

genetice spațiale intrapopulaționale. Poziția în teren a fiecărui arbore a fost înregistrată cu GPS-

ul. Conservarea materialului vegetal s-a realizat prin depozitarea într-un freezer (-600C), în pungi

etichetate, până în momentul extragerii ADN-ului.

3.2 Metode de cercetare

3.2.1 Analiza ADN-ului nuclear cu markeri de tipul SSR

3.2.1.1 Pregătirea probelor și izolarea ADN-ului

Pregătirea probelor în vederea izolării ADN-ului presupune secționarea a 5-6 muguri (se

înlătură solzi), respectiv tăierea cât mai mărunt a unei frunze din care se va recolta materialul

necesar analizei (aproximativ 50 mg pentru fiecare arbore).

Pentru extragerea ADN-ului din țesutul mugurelui/frunzei s-a utilizat protocolul CTAB

(Doyle și Doyle, 1987), care presupune o succesiune de pași: încărcarea materialului vegetal în

tuburile furnizate, adăugarea bilelor de wolfram (la Byozime tuburile sunt încărcate cu bile mai

mici de cuarţ), măcinarea la o moară electronică la frecvenţe mari, centrifugarea, adăugarea de

soluţii specifice pe bază de etanol (furnizate în kit), extragerea supernatantului, spălarea ADN cu

diferite substanţe pe bază de etanol, păstrarea ADN-ului (substanţele folosite sunt pe bază de apă

deoarece astfel ADN-ul devine solubil).

3.2.1.2 Testarea calității și concentrației ADN-ului izolat

Testarea ADN-ului pe gel de agaroză

Determinarea calității și cantității ADN-ului s-a realizat cu ajutorul electroforezei

orizontale într-un gel de agaroză de 100 ml soluție TAE (tris-acetat-EDTA 1%) și 1,5 g agaroză,

la o tensiune de 100 V, timp de 45 de minute, în tampon de migrare TAE1x. Ulterior, gelul a fost

colorat într-o soluţie de Gel Red (1%) timp de 20 de minute. În final, cantitatea de ADN a fost

estimată în lumina ultravioletă a transiluminatorului UVP, cu ajutorul scării prestabilite.

a) a)



18

Măsurarea cantității de ADN cu spectrofotometrul NanoDrop8000

A doua metodă de testare a calității și concentrației ADN-ului s-a realizat cu ajutorul

spectrofotometrului NanoDrop 8000 (Thermo Scientific; USA). Acest dispozitiv măsoară până la

96 de probe într-un interval de timp scurt și nu necesită o cantitate mare de ADN (1 µl).

3.2.1.3 Reacția de polimerizare în lanț (PCR)

Toate reacțiile de polimerizare în lanț s-au efectuat pe mașina termocycler ,,Corbett Palm-

Cycler CG1-96”, aptă să scadă și să ridice temperatura din tuburile de reacție după un protocol

prestabilit. ADN-ul nuclear s-a analizat cu ajutorul a șapte markeri moleculari la carpen, respectiv

cinci la cărpiniță, pentru o bună diferențiere a speciilor (Tabelul 3.2). Acești markeri genomici

(SSRs) au fost dezvoltați pentru Carpinus spp. într-un singur studiu european de către Prinz și

Finkeldey (2015).

Procedura de lucru adoptată a presupus gruparea SSRs nucleari în două kituri multiplex la

cărpiniță și patru kituri multiplex la carpen (din kitul K.2.2 a făcut parte și markerul Cb_12b, dar

în urma citirii electroforegramelor acesta a fost exclus). Volumul unei reacții a fost de 10 µl, dintre

care: 2,00 µl ADN, 1,50 µl PCR Puffer, 1,50 µl MgCl2, 1,00 dNTPs µl, 0,10 µl Promega Taq

Polymerase, 0,90 µl H2O şi fiecare primer la diferite concentrații (Tabelul 3.2).

Tabelul 3.2 Gruparea microsateliților în multiplexe PCR

Table 3.2 The grouping of markers in PCR multiplexes

Kitul Marker Concentrația

primerilor (µl)

Temperatura

de legare

Specia

K1.1 Cb_17 0.7 61 °C

C

. b

etulu

s

Cb_33 0.8

K1.2 Cb_29 0.8 61 °C

Cb_48a 0.7

K2.1 Cb_15b 0.8 60 °C

Cb_49a 0.7

K2.2 Cb_37a 0.8 61 °C

K1 Cb_37a 0.7 60 °C

C.

ori

enta

lis Cb_49a 0.7

K2 Cb_29 0.7

61 °C Cb_33 0.7

Cb_48a 0.8

Reacţia de polimerizare în lanţ este precedată de diluţia ADN-ului, care constă în

adăugarea unei anumite cantităţi de apă bidistilată peste soluţia obţinută (1:30, adică la 2 μl de

ADN s-au adăugat 58 μl de apă nucleară pură).

După terminarea procesului, produsul PCR a fost testat prin electroforeză orizontală în

1,5% gel de agaroză, la tensiunea de 100 V, timp de 25 minute. Scopul acestui test este de a selecta

a)



19

markerii cei mai buni care arată amplificare de succes și pentru a identifica intensitatea produselor

PCR pentru scanarea secvențelor genomului analizat.

3.2.1.4 Electroforeza capilară

Protocolul de laborator pentru determinarea genotipurilor prevede reactivi ce sunt compuși

din: 2 µl produs PCR diluat (1:20), 37,6 µl Sample Loading Solution (SLS400) și 0,32 µl Size

Standard, pentru o singură probă. Markerii sunt vizualizați sub formă de semnale florescente pe

electroforegrame, utilizând metoda FRAG-3, pe secvențiatorul Beckman Coulter GeXP.

Preluarea datelor se face vizual deoarece interpretarea electroforegramelor este una

dificilă, asfel încât lecturarea manuală a putut evita erorile care pot apărea dacă această operație

s-ar fi realizat automat. Carpenul este o specie octoploidă și, ca atare, poate prezenta până la opt

variante alelice pentru orice marker dat, ceea ce face ca interpretarea electroforegramelor să fie

una laborioasă. Genotipurile au variat de la o singură alelă până la opt alele diferite. Cărpinița

fiind o specie diploidă, prezintă două alele pentru fiecare genotip.

Datele obținute în urma citirii electroforegramelor se introduc într-un fișier Microsoft

Excel, în scopul rounjiri lungimii alelelor la numere întregi, deoarece aceeași alelă poate varia de

la 0,1-1 pb în cadrul unui locus genic. În acest mod se realizează structura genotipică a fiecărui

arbore pentru fiecare marker luat în studiu.

3.2.2 Analiza ADN-ului cloroplastic cu markeri de tipul SSRs

În cadrul acestei metode s-a utilizat ADN-ul total obținut tot prin metoda CTAB (Doyle

și Doyle, 1987) de izolare. Din fiecare populație s-au analizat probe de la câte 5-8 arbori.

Analizele s-au efectuat pentru trei primeri cloroplastici universali și anume: ccmp4, ccmp7

și ccmp10 dezvoltați de Weising și Gardner (1999).

În continuare s-a procedat în mare parte la fel ca la analizele de ADN nuclear, singurele

diferențe s-au înregistrat, în primul rând, la protocolul PCR, iar în al doilea rând, diferă modul de

citire, interpretare și prelucrare a datelor obținute. Analiza SSRs cloroplastici diferă de analiza

SSRs nucleari, deoarece cloroplastele sunt haploide și moștenite uniparental. Prin urmare, SSRs

din același organism sunt descriși ca un ,,haplotip” care devine unitatea de analiză (spre deosebire

de alelele din cadrul SSRs nucleari) (Ebert și Peakall, 2009).

Genotiparea s-a realizat tot cu ajutorul secvenţiatorului Beckman-Coulter, iar semnale

fluorescente care redau valorile specifice perechilor de baze se introduc într-un fișier Microsoft

Excel. Baza de date astfel rezultată se va exporta, astfel încât să fie utilizată ca input pentru diferite

soft-uri cu care se va lucra mai departe.

a)



20

3.3 Programe și metode statistice utilizate în analiza datelor

3.3.1 Analiza ADN-ului nuclear

3.3.1.1 Determinarea erorilor de citire a electroforegramelor

Testarea markerilor genetici pentru echilibrul Hardy-Weinberg (abv. HWE) a devenit o

rutină în aproape toate studiile genetice, deoarece reprezintă un instrument important pentru

detectarea erorilor genotipului, astfel încât abaterile de la acest echilibru pot indica

consangvinizarea, stratificarea populației și chiar probleme în genotipare (Wigginton et al. 2005;

Graffelman și Weir, 2016). Pentru a vedea dacă există abateri de la acest echilibru, ca o urmare a

excesului/deficitului de heterozigoți, s-a folosit programul GENEPOP ver. 4.2.1 (Rousset, 2008).

Dezechilibrul linkage (engl. linkage desequilibrum, abv. LD) reprezintă asocierea non-

aleatoare a alelelor la unu sau mai mulți loci (Mackay și Powell, 2007; Slatkin, 2008) și este la

rândul său afectat de mai mulți factori genetici și non-genetici, inclusiv: recombinarea, driftul

genetic randomizat, selecția, fluxul de gene (Gaut și Long, 2003), chiar și temporar. S-a calculat

cu ajutorul testului Fisher, bazat pe analiza ,,Markov chain” (10 000 randomizări, 100 loturi și 5

000 iterații/lot), tot în programul GENEPOP ver. 4.2.1 (Rousset, 2008). Inițial s-a realizat un fișier

input cu ajutorul programului GeneAlEx 6.5 (Peakall și Smouse, 2012), după care a fost importat

în programul GENEPOP ver. 4.2.1. (Rousset, 2008).

O altă analiză genetică preliminară a constat în identificarea alelelor nule. O alelă este

considerată nulă atunci când nu reușește să se amplifice în reacția PCR datorită prezenței unor

mutații într-o secvență de legare a primerilor la locusul respectiv sau care nu se observă din cauza

eșantionării incomplete (Chapuis și Estoup, 2007). Pentru a determina frecvența alelelor nule în

cadrul populațiilor de cărpiniță s-a utilizat programul MICROCHECKER 2.2.3 (Van Oosterhout

et al. 2004). Programul MICROCHECKER a utilizat teste ce au presupus 1 000 de randomizări

ale alelelor la fiecare locus din oricare populație, cu un interval de încredere de 95%.

Codificarea genotipurilor la speciile poliploide este sensibilă la prezența alelelor nule. Nu

avem însă niciun program care să testeze prezența alelelor nule la aceste specii comparativ cu cele

diploide (Dufresne et al. 2014). În cazul nostru ne bazăm pe ipoteza că acești markeri au fost

dezvoltați special pentru carpen deoarece, de obicei, frecvența alelelor nule crește rapid atunci

când SSR sunt transferați la alte specii (Li et al. 2003). În cazul dat al carpenului, presupunem că

alelele nule ar fi minime și cu o influență redusă asupra indicilor de diversitate genetică. Aceste

erori de citire s-au efectuat doar pentru cărpiniță, pentru că majoritatea metodelor și programelor

statistice au fost dezvoltate inițial pentru speciile diploide, astfel încât speciile poliploide prezintă

niște goluri din acest punct de vedere.



21

3.3.1.2 Calculul indicilor de diversitate genetică

Cu ajutorul programului GenAlEx 6.5 (Peakall şi Smouse, 2012) s-au calculat următorii

indici de diversitate genetică pentru carpen: Ne (numărul efectiv de alele pe locus), Na (numărul

mediu de alele pe locus), He (heterozigoția așteptată; diversitatea genetică); PPL (proporția locilor

polimorfi), precum și numărul de alele private pentru fiecare populație; respectiv pentru cărpiniță:

Ne (numărul efectiv de alele pe locus), Na (numărul mediu de alele pe locus), Ho (heterozigoția

observată), He (heterozigoția așteptată; diversitatea genetică), F (indicele de fixare), PPL

(proporția locilor polimorfi). Compararea valorilor indicilor de diversitate genetică între cele două

specii nu este concludentă deoarece baza de date este una diferită (codominant - cărpiniță,

dominant - carpen). S-a testat semnificația statistică între valorile indicilor de diversitate estimați

pe baza SSRs cu ajutorul testului parametric t Student.

Diferențierea genetică (GST) a fost calculată pentru carpen folosind programul POPGEN

version 1.32 (Yeh et al. 1997), iar pentru cărpiniță (FST) utilizând programul ARLEQUIN 3.5

(Excoffier și Lischer, 2010).

Diversitatea genetică între și în interiorul populațiilor a fost examinată prin analiza

varianței moleculare (AMOVA), luând în considerare toate speciile simultan, diferite perechi de

grupuri de specii/populații. Testul AMOVA s-a realizat pe baza matricelor datelor binare, pentru

a măsura diferențierea populațiilor (Excoffier, 1992) dar și pentru a calcula valorile de

semnificație, utilizând programul GenAlEx 6.5 (Peakall şi Smouse, 2012). Aceaste valori de

semnificație au fost estimate prin măsurarea parametrului PhiPT, un analog al indicelui FST

calculat ca parte a procedurii AMOVA. Valuarea lui p pentru estimarea indicilor de diferențiere

a fost obținută după 9 999 de permutări (Excoffier,1992).

3.1.1.3 Analiza structurii genetice spațiale

Structura genetică spațială intrapopulațională a fost determinată cu ajutorul programului

GenAlEx 6.5 (Peakall și Smouse, 2012) pentru toți indivizii luați în studiu, pe populații. S-a

calculat coeficientul de autocorelație r, pentru fiecare clasă de distanță, dintre matricea distanțelor

genetice și matricea distanțelor geografice. Distanțele geografice au fost determinate cu ajutorul

coordonatelor spațiale (latitudine și longitudine) luate cu GPS-ul pentru fiecare individ și

transformate în coordonate Stereografice 70. Distanțele genetice atât pentru datele dominante

(carpen) cât și pentru datele codominante (cărpiniță) au fost calculate pe baza metodei propuse de

Peakall și Smouse (2012).

Coeficientul de autocorelație oferă o măsură de asemănare dintre perechile de indivizi a

cărei separare geografică se încadrează în clasa de distanță specificată. O abatere semnificativă



22

de la ipoteza nulă (r = 0) este obținută atunci când valoarea lui r este pozitivă ori negativă și

depășește intervalul de încredere de 95%. Când valorile lui r nu depășesc intervalul de încredere

de 95% rezultă absența structurii genetice spațiale. O valoare apropiată de 0 arată lipsa unei

corelații între distanțele genetice și distanțele geografice, adică o distribuție genetică randomizată.

Valorile negative sugerează un model spațial dispersat. Pe baza informațiilor redate de Degen et

al. (2001), unde fiecare clasă de distanțe să cuprindă cel puțin 30 de perechi de arbori, astfel încât

s-a stabilit mărimea intervalului de distanță la 25 m pentru 10 clase de mărime, oferind o evaluare

între 0 și 250 m. Testul neparametric de eterogenitate a lui Smouse et al. (2008) s-a determinat

folosind 999 de permutări aleatorii și 1 000 de estimări bootstrap.

Structura genetică spațială interpopulațională pentru carpen și cărpiniță a fost estimată

utilizând programul STRUCTURE (Pritchard, et al. 2000), care are la bază metoda Bayesiană.

Structura genetică pentru fiecare populație a fost analizată în mod independent, folosind 100 000

de pași pentru burn-in, urmată de 200 000 repetări Markov Chain Monte Carlo (MCMC) pentru K

= 1-9 la carpen și K = 1-7 la cărpiniță, fiecare cu 10 serii independente, utilizând opțiunea frecvența

alelelor corelate (Allele Frequencies Correlated) și un model mixt (Admixture Model; la carpen

fără opțiunea LOCPRIOR, iar la cărpiniță cu opțiunea LOCPRIOR - ceea ce presupus includerea

în model a localizării geografice a indivizilor eșantionați). S-a utilizat atât probabilitatea

posterioară a datelor pentru valoarea dată de K (Ln Pr (X/K)), cât și rata de schimbare (ΔK).

Numărul adecvat de grupuri omogene din punct de vedere genetic (K) s-a determinat

utilizând tot programul STRUCTURE (Pritchard, et al. 2000). În secțiunea ,,simulation summary”

programul afișează valorile medii ale logaritmului probabilității de estimare Ln Pr(X/K), astfel

încât mai multe studii evocă faptul că numărul de clustere corespunde acelei valori K pentru care

valoarea parametrului Ln Pr(X/K) este maximă (Ciofi et al. 2002).

O metoda mai precisă a fost cea descrisă de Evanno et al. (2005). Metoda a fost

implementată în programul ce este disponibil online, STRUCTURE HARVESTER V.0.6 (Earl și

VonHoldt, 2012) și calculează parametrul ΔK, care indică cel mai probabil număr de clustere.

Analiza cluster pentru cele două specii s-a realizat cu ajutorul programului PAST

(Hammer et al. 2001) având la bază și un suport statistic al clusterelor (1 000 bootstrap). Matricea

distanțelor genetice Nei a fost calculată în programul GenAlEx 6.5 (Peakall și Smouse, 2012) și

exportată în programul amintit mai sus. Populațiile cercetate au fost grupate prin metoda

,,aglomerativă” UPGMA (engl. Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average).

Testul Mantel (Mantel, 1967) a fost utilizat pentru a estima corelația între distanțele

genetice și distanțele geografice între populațiile eșantionate folosind programul GenAlEx ver.

6.5 (Peakall și Smouse, 2012).



23

3.3.1.4 Testul ,,bottleneck”

Programul BOTTLENECK (Piry et al. 1999) calculează pentru fiecare populație/locus,

distribuția heterozigoției așteptate și numărul de alele observate în ipoteza echilibrului dintre

mutație și deriva genetică (generate de rata de mutație și numărul efectiv de alele). Trebuie să se

țină cont de relația dintre excesul heterozigoției și numărul de alele observate în funcție de timpul

scurs de la începutul blocajului (Cornuet și Luikart, 1996). Este determinată valoarea lui ,,p”

(p<0,05) pentru heterozigoția observată și distribuția frecvenței alelelor pentru a detecta dacă a

existat o schimbare provocată de blocajele recente (Cornuet și Luikark, 1996).

Programul cuprinde trei modele diferite de analiză utilizate pentru a compara excesul

heterozigoției observate și heterozigoția așteptată: modelul IAM (engl. Infinite Allele Model),

modelul SMM (engl. Stepwise Mutation Model) și modelul TPM (engl. Two Phase Model).

S-a ales testul simplu de semnificație (engl. sing test) pentru a evalua dacă s-a produs sau

nu un blocaj genetic recent la nivelul populațiilor. Acest test măsoară excesul temporar de

heterozigoți care rezultă dintr-o populație redusă (Luikart et al. 1998). O valoare pozitivă a

testului de semnificație (He-Heq) indică un exces de heterozigoție. În cazul în care numărul de

markeri cu exces de heterozigoție este semnificativ mai mare decât jumătate, sugerează că

populația a trecut recent printr-un blocaj genetic.

Testele utilizate în detectarea blocajului genetic pot duce la concluzii eronate cu privire la

pierderea diversității genetice în populațiile care au supraviețuit mai multor generații, chiar dacă

condițiile de testare sunt îndeplinite (Peery et al. 2012).

Testul ,,bottleneck” s-a aplicat doar pentru populațiile de cărpiniță, pentru că arealul

acestei specii este fragmentat, cu populații mici și izolate. Neaplicarea testului în populațiile de

carpen luate în studiu a fost determinat atât din faptul că acestea prezintă un număr mare de

exemplare, cât și ca urmare a conectivității lor cu arealul reprezentativ al speciei în România.

3.3.2 Analiza ADN-ului cloroplastic

Pentru analiza haplotipurilor s-au analizat probe de la 96 arbori de carpen și 32 arbori de

cărpiniță. Haplotipurile au fost definite ca o combinație de alele (secvențe ADN) găsite la fiecare

locus pe un cromozom, care sunt moștenite împreună de la un singur părinte (Lloyd et al. 2015).

Programul PERMUT & CpSSR (Pons și Petit, 1996) a fost utilizat pentru a calcula indicii

de diversitate genetică (hs = diversitate intrapopulațională, ht = diversitatea totală și GST =

diferențierea genetică pentru toate populațiile). Nivelurile de diferențiere în genomul cloroplastic

pentru alelele neordonate (GST) și alele ordonate (RST) au fost calculate folosind același program.

O analiză ierarhică a varianței moleculare (AMOVA) a fost realizată pentru a estima distribuția



24

variației genetice între și în interiorul populațiilor, folosind programul GenAlEx 6.5 (Peakall și

Smouse, 2012). Distanța genetică a fost calculată cu HAPLOTYPE ANALYSIS© ver. 1.05

(Eliades and Eliades, 2009).

Pentru a determina relațiile filogenetice dintre populații, s-a utilizat metoda

,,aglomerativă” UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average), din cadrul

programului PAST (Hammer et al. 2001), având la bază și un suport statistic al clusterelor (1 000

bootstrap). Pentru a detecta relațiile intraspecifice ale ADN-ului din haplotipurile cloroplastice a

fost construită o rețea de haplotipuri MJ (engl. Median Joining) utilizând programul NETWORK

versiunea 4.6 (Bandelt et al. 1999) (disponibil la adresa: http://www. fluxus

engineering.com/sharenet_rn.htm).

Analiza corelației dintre matricele v distanțelor genetice (Nei) și distanțele geografice

(GGD) s-a analizat cu ajutorul testului Mantel (Mantel, 1967), utilizând software-ul GenAlEx 6.5

(Peakall și Smouse, 2012).



25

Capitolul IV. REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului nuclear

4.1.1 Stabilirea protocolului de interpretare a electroforegramelor pentru specia

octoploidă Carpinus betulus

Utilizarea microsateliților la speciile poliploide nu este, în general, atât de simplă ca în

cazul speciilor diploide. În trecut, această metodă de a determina numărul de copii de alele SSR

la speciile poliploide a fost descrisă ca fiind în cea mai mare parte fără succes (Falque et. al. 1998).

În prezent, se fac numeroase studii pentru a obține informații utile despre distanțele genetice sau

identificarea cultivarelor (Esselink et al.2004), precum și despre genetica populației și analize de

paternitate. În concluzie, genotipurile nu pot fi determinate cu certitudine, folosind astfel de

metode, în timp ce indicii de diversitate genetică populaționali pot fi estimați.

Interpretarea variației dimensiunilor fragmentelor este mai laborioasă la speciile poliploide

față de speciile diploide. Speciile octoploide prezintă mai puțin de opt variante alelice, sau chiar

opt alele, pentru orice locus dat (Ashley et al. 2003), însă acest număr uneori este chiar mai mare

în cazurile în care duplicările genelor oferă un număr mai mare de loci. La carpen (specie

octoploidă) pot să apară homozigoți (o alelă; fig. 4.1a) sau heterozigoți compleți (opt alele; fig.

4.1b), dar pentru cei parțial heterozigoți (fig.4.1c ) numărul de copii ale alelelor este imposibil de

determinat cu certitudine. Esselink et al. (2004) au propus o metodă pentru a estima numărul de

copii, folosind dimensiunea vârfurilor microsateliților. Această metodă este mai greu de aplicat

atunci când crește poliploidia. La speciile diploide există maximum două alele/locus (când cele

două alele sunt diferite individul este heterozigot la locusul respectiv, iar când cele două alele sunt

identice individul este homozigot).

a) b)



26

c)

Figura nr. 4.1 Exemple de electroforegrame pentru un individ homozigot (a), heterozigot total

(b) și heterozigoți parțiali (c)

Figure nr. 4.1 Examples of electroforegrame for a homozygous individual (a), total

heterozygous (b) and partial heterozygous (c)

Metoda abordată în această lucrare a fost cea a citirii manuale a electroforegramelor, astfel

încât s-a luat ca alelă adevărată cea care a înregistrat o intensitate mai mare, precum și alelele cu

o intensitate mai scazută. Această metodă a fost utilizată, de exemplu, într-un studiu realizat de

Esselink et al. (2004). De obicei, alelele mai lungi pot fi omise atunci când citirea se realizează

automat cu ajutorul programului, ca urmare a amplificării mai slabe a ADN-ului (fig. 4.2). De

asemenea, prezența unor alele care diferă doar printr-o singură pereche de baze (engl. stuttering)

poate fi neglijată.

Figura 4.2 Exemplu de electroforegramă unde alelele mai lungi prezintă intensitate scăzută

Figure 4.2 Exemple of electrophoregrame where longer alleles have low intensity

https://www.google.ro/search?biw=1366&bih=662&q=electroforegrame&spell=1&sa=X&ved=0ahUKEwi107SjzM7QAhWBpCwKHcUSAjQQvwUIGigA



27

Interpretarea manuală a electroforegramelor a avut drept scop reducerea acestor erori de

citire generate de preluarea automată a datelor. În cazul în care dimensiunea alelei este întâlnită

între mai multe perechi de baze, interpretarea devine dificilă, astfel încât trebuie să se facă

distincția între ,,benzi false” (engl, ,,sttuter band”) și alela adevărată (Flores-Rentería și Krohn,

2013). Pentru a reduce aceste erori de interpretare, citirea electroforegramelor s-a realizat de trei

ori, în mod independent.

Microsateliții sunt considerați markeri codominanți la speciile diploide (Bai, 2014), având

un avantaj diferit cu privire la identificarea exactă a genotipurilor. Pentru a evalua diversitatea

genetică la speciile poliploide cu acești markeri, datele microsateliților codominanți au fost tratate

ca date binare dominante (în cazul în care o alela a fost prezentă, aceasta s-a marcat cu valoarea 1,

iar când este absentă i s-a atribuit valoarea 0), ceea ce reduce conținutul de informații și se opune

unei analize care să ia în considerare heterozigoții direct observabili sau distribuția frecvențelor

alelelor (Dufresne et al. 2014; Clark și Schreier, 2015). În acest mod s-au generat genotipuri binare

pentru toți indivizii luați în studiu. O justificare suplimentară pentru utilizarea acestui tip de analiză

pentru markeri codominanți utilizați la speciile poliploide a decurs din modalitățile similare de

interpretare găsite în studiile realizate de: Sampson și Byrne (2012), Clark și Schreier (2015) etc.

Deoarece benzile de stutter apar de obicei înainte de vârfurile principale (Prinz și Finkeldey, 2015),

vârfurile microsateliților au fost citite în ordine descrescătoare. Datorită profilelor SSR mult mai

diverse, în multe studii la speciile popliploide genotiparea s-a realizat cu mai puțini markeri

(Esselink et al. 2004; Andreakis et al. 2009). Acest tip de analiză permite determinarea indicilor

de diversitate genetică, a structurii și diferențierii genetice.

Cu alte cuvinte, majoritatea instrumentelor, tehnicilor de lucru și a programelor statistice

pentru evaluarea diversității genetice populaționale, care au fost dezvoltate pentru speciile

diploide, de cele mai multe ori nu dau randament și pentru speciile poliploide.

O primă problemă pe care o întâlnim pentru utilizarea SSR la speciile poliploide o

reprezintă alelele nule. Testele pentru alelele nule (engl. null alleles) și alte artefacte (engl. artifact)

rezultate în urma reacției PCR nu pot fi utilizate pe aceste specii, deoarece necesită calcularea

frecvențelor alelelor exacte (Dufresne et al. 2014). Determinarea alelelor ,,stuttering” (cauzate de

alunecarea de replicare din timpul reacției PCR) la microsateliții care prezintă mai multe alele este

mai dificilă și de mare importanță pentru evaluarea calității amprentelor (Pfeiffer et al. 2011).

Narayan et al. (2015) au prezentat o tehnică pentru identificarea alelelor nule, însă aceasta

presupune utilizarea mai multor tipuri de țesuturi pentru un singur arbore. Acest protocol în

vederea analizei de genotipare este unul robust, însă costisitor. Pe de altă parte, frecvența alelelor

nule crește rapid atunci când markerii SSR sunt transferați la alte specii. În cazul nostru ne bazăm

pe faptul că acești markeri au fost dezvoltați special pentru carpen, ceea ce ar presupune ca alelele



28

nule să nu aibă incidență sporită. De aceea, presupunem că alelele nule ar fi minime și cu o

influență redusă asupra indicilor de diversitate genetică.

O altă problemă o reprezintă determinarea frecvenței alelelor, care au un rol important în

analiza geneticii populaționale. În primul rând, frecvențele alelelor prezintă o mare importanță în

studierea factorilor care influențează structura demografică a populației (migrația, creșterea

populației, bottleneck) (Dufresne et al. 2014), iar în al doilea rând ajută la calcularea indicilor de

diversitate genetică și la estimarea diferențierii genetice a populațiilor și a structurii acestora. În

cazul speciilor poliploide, lucrurile nu stau la fel de bine comparativ cu cele diploide, deoarece

calculul frecvenței alelelor rar poate fi efectuat. Cu ajutorul programului SPAGEDI (Hardy și

Vekemans, 2002) s-a putut estima frecvența alelelor în cazul poliploizilor, astfel încât se consideră

că fiecare dintre alelele din heterozigoții parțiali are o probabilitate egală de a fi prezentă în mai

mult de o copie (Dufresne et al. 2014). Însă dezavantajul este că rezultatul duce la o minimalizare

a frecvențelor alelelor comune și o supraestimare a frecvențelor alelelor rare (Clark și Jasieniuk

2011). Cu alte programe (ATETRA, Van Puyvelde et al. 2010; STAMPP, Pembleton et al. 2013)

s-au calculat frecvențele alelelor și nivelurile de heterozigoție numai pe baza genotipurilor lipsite

de precizie și ignorând genotipurile cu date lipsă. Acest lucru poate duce la o frecvență subiectivă

a alelelor, deoarece heterozigoții parțiali sunt ignorați (Dufresne et al. 2014). Pentru a omite aceste

erori, s-a creat o matrice binară (1-prezența alelelor; 0-absența alelelor) și s-au aplicat programele

utilizate pentru markerii dominanți, determinând astfel frecvența alelelor.

Structura și diferențierea genetică se află printre obiectivele principale ale analizei genetice

populaționale. Aceste obiective au la bază principiul că populația trebuie să fie în echilibru Hardy

Weinberg, dar devierea de la acesta să fie minimă (Pritchard, et al. 2000). S-au făcut numeroase

studii la diferite specii poliploide unde s-a aplicat analiza Bayesiană (Sampson și Byrne, 2012;

Thomson et al. 2015; Samah et al. 2016) și au avut rezultate concludente. Programul cel mai

utilizat în literatura de specialitate (STRUCTURE, Pritchard et al. 2000) are la bază un algoritm

care determină genotipuri complete pentru fiecare individ pe baza genotipurilor parțiale ale

acestora, dar poate prezenta lipsă de claritate datorită prezenței heterozigoților parțiali (Falush et

al. 2007). În cadrul studiului nostru, s-a utilizat programul STRUCTURE, folosind opțiunea

alelelor recesive, care reprezintă genotipurile ambigue ale poliploizilor. În acest capitol cu obiectiv

metodologic s-a trecut nu numai date bibliografice, precum și metodele și analizele efectuate în

laborator. Acestea din urmă sunt necesare în elaborarea și stabilirea modalităților de interpretare a

electroforegramelor, în scopul reducerii erorilor de citire.



29

4.1.2 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus betulus

4.1.2.1 Structura alelică

Alegerea unui anumit marker devine o problemă complexă, astfel încât poate avea un rol

important în determinarea structurii și a diferențierii genetice a populațiilor. Testarea markerilor

pe un număr mare de exemplare ar putea avea o influență remarcată asupra reducerii costurilor

precum și o semnificație evolutivă asupra rezultatelor.

La nivelul întregului eșantion (400 arbori), la cei șapte markeri analizați s-au observat 162

de alele, dintre care 151 (93,2%) sunt comune celor opt populații. Intervalele de variație a alelelor

la markerii analizați se încadrează sau chiar depășesc intervalele raportate de Prinz și Finkeldey

(2015) - cercetări efectuate, de asemenea, la carpen. Media de alele identificate pe marker a fost

aproximativ de 23 alele. Într-un studiu realizat pe un eșantion de 100 arbori de carpen, Cărăbuș et

al. (2016) au comunicat 148 de alele, ceea ce corespunde tendinței logice ca numărul de alele să

fie influențat de marimea eșantionajului. Secvențierea repetitivă a fost în general de 2 pb și nu sunt

alele care să se abată de la acestă unitate de repetare (excepție fac câteva alele care nu respectă

pasul secvenței repetitive, care determină o distanță între alele de o pereche de baze). Există câteva

zone din interval unde nu s-au identificat alele în nicio populație cercetată. Alelele au variat de la

1 la 8 pe arbore (Tabelul 4.1). Trei până la opt alele pe marker au fost observate cel mai frecvent

pentru fiecare arbore.

Numărul de alele per populație a variat între 11, pentru markerul Cb_17 în populația

Babadag, până la 25 de alele pentru markerul Cb_37 în populația Leamna (Tabelul 4.2). Cel mai

mare număr de alele (28 alele) s-a recenzat la markerul 37_Cb. Numărul de alele observate pentru

fiecare marker a variat cu 1-7 alele/marker față de cele raportate de către Prinz și Finkeldey (2015).

Cărăbuș et al. (2015) au relatat un număr relativ scăzut de alele/marker, pentru un eșantion de 98

de arbori genotipați la 4 markeri.

Alelele private au fost detectate în șase din cele opt populații analizate așa cum se poate

observa în tabelul 4.2. Aceste alele au avut o frecvență foarte scăzută (<2%), încadrându-se în

categoria alelelor considerate rare. Markerul Cb_48a s-a semnalat cel mai mare număr de alele

specifice doar într-o populație din cele opt (două alele). Acestea au avut o frecvență destul de

redusă (<2%), motiv pentru care considerarea lor ca alele private este discutabilă. Populațiile Apa

Sărată și Panciu nu a prezentat nicio alelă privată. Estimarea frecvenței alelelor nu a fost posibilă

la carpen, datorită nivelului ridicat de poliploidie.



30

Tabelul 4.1 Variația numărului de alele observate pe individ

Table. 4.1 Variation of number alleles observed per sample

Marker Numărul de alele pe individ

Apa Sărată Teaca Roșcani Babadag Panciu Lotrișor Leamna Baia de Aramă

Cb_17 1-5 1-6 2-8 1-7 1-6 1-8 1-8 1-7

Cb_33 2-8 2-7 1-8 1-8 1-8 1-8 3-8 1-8

Cb_29 3-8 2-8 3-7 2-8 2-8 2-8 2-8 2-8

Cb_48a 2-8 1-8 3-8 2-8 3-8 2-8 3-8 3-8

Cb_15b 4-8 3-8 3-8 1-8 3-8 3-8 2-8 2-8

Cb_49a 3-8 3-8 3-8 2-8 3-8 4-8 3-8 2-8

Cb_37a 2-8 3-8 3-8 3-8 3-8 4-8 3-8 1-8

Tabelul 4.2 Numărul de alele observate în cele opt populații de carpen

Table 4.2 Alleles scored in the eight hornbeam populations

Marker Lungimea

perechilor de baze

Numărul de alele pe populație Numărul

total de alele Apa Sărată Teaca Roșcani Babadag Panciu Lotrișor Leamna Baia de Aramă

Cb_17 56-97 17 14 15 11 18 19 15 18 22

Cb_33 121-182 15 17 20 17 17 18 19 19 22

Cb_29 55-99 20 20 21 17 17 16 20 21 24

Cb_48a 126-188 13 18 17 16 17 18 17 17 20

Cb_15b 67-123 20 19 22 20 20 22 19 23 26

Cb_49a 147-185 18 18 20 19 18 19 16 16 20

Cb_37a 74-132 20 23 24 24 23 22 25 21 28

Numărul de alele private 0 2 2 1 0 2 3 1 11



31

4.1.2.2 Indicii de diversitate genetică

După cum se poate observa în tabelul 4.3, în cele opt populații luate în studiu, valorile au

fost ușor diferite pentru numărul mediu de alele pe locus (Na) și asemănătoare pentru numărul

efectiv de alele (Ne). Valorile maxime ale primului indice de diversitate genetică (Na) s-au

înregistrat în populația Roșcani (Na = 1,716), iar valoarea minimă pentru populația Apa Sărată (Na

= 1,531). Interesant este faptul că acestea sunt cele mai nordice populații analizate, însă prima este

în nord-estul României, respectiv cea de-a doua este din zona de nord, nord-vest, la circa 400 km

față de prima. Comparativ cu numărul mediu de alele pe locus, la numărul efectiv de alele se

observă o altă clasificare a populațiilor: valoarea maximă s-a obținut pentru populația Leamna (Ne

= 1,292) iar cea minimă pentru populația Teaca (Ne = 1,274), însă amplitudinea de variație de

0,018 a fost mult mai mică decât pentru Na (0,185).

Heterozigoția așteptată, cunoscută și sub denumirea de diversitatea genetică, este indicele

cel mai utilizat pentru caracterizarea variaţiei genetice intrapopulaţionale. Valoarea maximă a

diversității genetice se înregistrează în populația Leamna (He = 1,88), iar valoarea minimă în

populația Teaca (He = 1,75). Diversitatea genetică prezintă valori aproximativ similare în toate

populațiile, ceea ce face ca diferențele între valorile obținute pentru cele opt populații de carpen

să nu fie semnificative din punct de vedere statistic. Valoarea medie a diversității genetice obținută

în acest studiu (He = 0,181) este mai scăzută comparativ cu analizele efectuate cu ajutorul

markerilor AFLP în populația Săvârșin, situată în sud-vestul României (He = 0,3197; Coart et al.

2005). Aceste diferențe ar putea fi rezultatul determinării cu markeri diferiți, dar nu este exclusă

nici influența eșantionului redus de arbori evaluați în populația Săvârșin (doar 11 arbori, față de

50/populație în studiul de față). De altfel, se recomandă ca atunci când diversitatea genetică este

evaluată cu ajutorul markerilor SSR nucleari să se preleveze probe din cel puțin 20-30 de indivizi,

mai ales atunci când se efectuează evaluări într-o populație care are un nivel necunoscut de

diversitate (Pruett și Winker, 2008). Totuși, comparativ cu datele studiului de față, valori mai

ridicate ale diversității genetice s-au observat și pentru trei populații de carpen din România

analizate cu doar 4 markeri SSRn (He = 0,309; Cărăbuș et al. 2015).

Proporția locilor polimorfi a variat de la 76,54% în populația Apa Sărată, până la 85,80%

în populația Roșcani.

La nivelul indicilor de diversitate genetică analizați, populația Leamna înregistrează valori

puțin mai ridicate decât celelalte populații analizate, cu excepția numărului mediu de alele pe locus

(Na) și a proporției locilor polimorfi.



32

Tabelul 4.3 Valori ale indicilor de diversitate genetică în populațiile de carpen

Table 4.3 Values of genetic diversity indices in hornbeam populations

Populația Na Ne I He PPL (%)

Apa Sărată

Media 1,531 1,282 0,284 0,178 76,54

Eroarea standard 0,067 0,025 0,019 0,013

Teaca Media 1,593 1,274 0,281 0,175 79,63


Roșcani Media 1,716 1,284 0,296 0,183 85,80


Babadag Media 1,543 1,277 0,289 0,179 77,16


Panciu Media 1,617 1,278 0,284 0,177 80,86


Lotrișor Media 1,654 1,278 0,293 0,180 82,72


Leamna Media 1,630 1,292 0,303 0,188 81,48


Baia de Aramă Media 1,667 1,284 0,296 0,184 83,33


Total Media 1,619 1,281 0,291 0,181 80,94


Na - numărul mediu de alele pe locus; Ne - numărul efectiv de alele pe locus; I - Indicele Shannon;

He – Heterozigoția așteptată (diversitatea genetică); PPL – proporția locilor polimorfi.

Speciile poliploide sunt mai puțin sensibile la eroziunea genetică datorită capacității lor de

a acumula o mare diversitate genetică în seturi de cromozomi și sensibilitate mai mică la efectele

alelelor dăunătoare (Comai, 2005; Palop-Esteban et al. 2011). Analiza indicilor de diversitate

moleculară nu a relevat diferențe semnificative statistic între populațiile luate în studiu. Valorile

consemnate pentru întregul set de indici ai diversității genetice indică o relativă uniformitate a

populațiilor de carpen din România, aspect care ar putea decurge din posibilitatea realizării cu

intensitate destul de mare a fluxului de gene interpopulațional care s-ar fi putut derula de-a lungul

centurii subcarpatice, dar și prin trecătorile/pasurile care traversează Carpații Meridionali sau cei

Orientali.



33

4.1.2.3 Diferențierea genetică

Distribuția diversității genetice în interiorul și între populații este determinată de procesele

genetice cum ar fi: selecția, deriva genetică și fluxul de gene, precum și de caracteristicile

ecologice, demografice și istorice ale plantelor (Duminil et al. 2009).

Indicele de diferențiere genetică (GST) indică o valoare scăzută (0,033), ceea ce sugerează

un flux de gene ridicat la nivelul ADN-ului nuclear, care poate fi consecința arealului

cvasicontinuu al speciei în zonele subcarpatice. Această valoare scăzută denotă că cea mai mare

parte a variabilității genetice se regăsește la nivelul intrapopulațional.

Aplicarea testului AMOVA (GenAlEx 6.5; Peakall și Smouse, 2012) relevă un aport de

4% a variației genetice între populații, iar cea mai mare parte a acesteia este deținută în interiorul

populațiilor (96%). Valoarea lui PhiPT a fost foarte semnificativă (PhiPT = 0,043; P = 0,0001).

Această diferențiere genetică scăzută între populații ar putea fi explicată de un flux de gene activ,

datorită lipsei unor bariere.

Sunt puține studii care descriu diversitatea genetică în interiorul și între populații speciilor

poliploide. Într-un studiu realizat la Juniperus thurifera a rezultat că diversitatea genetică în

interiorul populațiilor a fost de 90%, între populații de 4% iar între regiuni de 6% (Teixeira et al.

2014). În cazul poliploizilor este de așteptat să se mențină un nivel ridicat al diversității genetice

din cauza multiplicării genomului. La carpen, specie octoploidă, variabilitatea genetică ridicată la

nivel intrapopulațional poate fi explicată, într-o anumită măsură, și prin faptul că rezultă

combinații între mai mult de două alele la un marker genic.

4.1.2.4 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale

Valori ale acestui coeficient au fost observate în afara intervalelor de încredere de 95% (U

- sus și L - jos) ale ipotezei nule pentru șase din cele opt populații analizate (fig. 4.4. a-f). Cu

excepția populațiilor Roșcani și Panciu, valori semnificative atât pozitive cât și negative, s-au

întâlnit în toate populațiile. În cinci populații, valorile coeficientului de autocorelație au fost

semnificative în prima clasă de distanțe (25 m), cu cea mai mare valoare negativă a lui r = -0,109

în populația Teaca, respectiv pozitivă (r = 0,043), în populația Baia de Aramă. Structurile genetice

spațiale sunt dependente și de densitatea populației, deoarece în cazurile de densitate mică crește

distanța de dispersie a polenului, și invers (Vekemans și Hardy, 2004; Curtu et al. 2015). Ori, în

populațiile Teaca și Baia de Aramă, proporția de participare a carpenului este foarte mare, iar

arboretele au consistență ridicată (peste 0,8), ceea ce ar putea avea repercusiuni asupra valorii

ridicate a lui r la prima clasă de distanță. Totuși, acestea sunt doar prezumții, deoarece considerăm



34

că în cazul carpenului s-ar impune cercetări de amănunt care să cuantifice structurile spațiale atât

în funcție de participarea speciei în compoziția arboretelor, cât și în funcție de consistența acestora.

În urma testului statistic de eterogenitate, care presupune compararea SGS între perechile

de indivizi, pentru fiecare clasă de distanțe a rezultat că în patru din cele opt populații analizate

valorile sunt semnificative (p˂0,01) din acest punct de vedere (Roșcani, Babadag, Leamna și Baia

de Aramă).

-0.060

-0.040

-0.020

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Apa Sărată

a)

-0.150

-0.100

-0.050

0.000

0.050

0.100

0.150

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (n)

r

U

L

Teaca

b)

-0.060-0.040-0.0200.0000.0200.0400.0600.0800.100

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Babadag

c)

-0.060

-0.040

-0.020

0.000

0.020

0.040

0.060

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Lotrișor

d)



35

Figura 4.4 Structura genetică spațială pentru fiecare populație de carpen analizată. Cele două linii

cu roșu reprezintă intervalul de încredere de 95% în jurul unei ipoteze nule (sus - U și jos - L)

Figure 4.4 Spatial genetic structure for each hornbeam population analyzed. The two red

lines represent 95% confidence interval around a null hypothesis (up - U and down - L)

4.1.2.5 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale

Structura genetică a populațiilor reflectă interacțiunile diverșilor factori, inclusiv evoluția

istoriei pe termen lung a speciei (fragmentarea habitatului, modificarea arealului și izolarea

populației), drift genetic, fluxul de gene și selecția (Schaal et al. 1998).

Programul STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) a fost utilizat pentru a analiza structura

genetică a populațiilor și de-a efectua un test de grupare asupra indivizilor analizați. Această

analiză a fost realizată cu ajutorul metodei de grupare Bayesiene, care are la bază un model ce

presupune că fiecare individ a moștenit o anumită proporție de la strămoșii săi din fiecare dintre

cele K populații (Pritchard et al. 2000).

Valoarea optimă a lui K a fost determinată atât în funcție de probabilitatea logaritmică de

estimare (L(K)(±SD)) cât și prin determinarea valorilor lui ΔK (Evanno et al. 2005). Determinarea

prin prima metodă (L(K)(±SD) a celui mai probabil număr de grupuri omogene este 5 (K = 5; fig.

4.5.a). Cea de a doua metodă, de a identifica valorile lui ΔK, relevă un număr de grupuri omogene

pentru K = 2 (fig. 4.5.b). De asemenea se poate constata în fig. 4.5.b și o probabilitate ușor ridicată

pentru K = 5.

-0.060

-0.040

-0.020

0.000

0.020

0.040

0.060

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Leamna

e)

-0.060

-0.040

-0.020

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Baia de

Aramă

f)



36

a) b)

Figura 4.5 Determinarea numărului cel mai probabil de clustere genetice prin procedeul bazat pe:

a) valoarea medie L(K)(±SD); b) valoarea obținută pentru ΔK

Figure 4.5 Determination of the number most probably of genetic clusters by the process based

on: a) mean of estimated of L(K)(±SD); b) the value obtained for ΔK

În urma rulării programului STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) a rezultat histograma

pentru K = 2 (fig. 4.6), ce denotă o bună grupare a genotipurilor multilocus pe populații și de

asemenea arată o structură genetică bine diferențiată între acestea. Acest rezultat, corelat cu cel

din testul AMOVA, care indică o diferență de 4% a variației genetice între cele două populații

statistice (clustere) astfel constituite, relevă, totuși, existența unor particularități genetice suficient

de mari ale acestora, cu probabilitate mare de a fi fixate genetic. Fiecare individ în graficul de mai

jos este reprezentat de o linie verticală unică, ce este împărțită în segmente de K culori, cu

lungimile proporționale fiecăreia dintre cele două clustere identificate. Fiecare culoare reprezintă

gradul de apartenență a individului la clusterul aferent culorii respective (%).

Din graficul pentru K = 2, considerat a fi cel mai potrivit pentru gruparea arborilor analizați,

se poate observa că populațiile din sud-vestul României (Baia de Aramă, Leamna și Lotrișor)

relevă o structură genetică foarte bine diferențiată față de restul populațiilor luate în studiu.

Populațiile de carpen analizate sunt grupate în concordanță cu divizarea lor în locații geografice

de prelevare a probelor. În populația Roșcani, proporția coeficientului de apartenență (Q) din cele

două clustere este aproximativ egală la toți arborii luați în studiu. Cea mai bine conturată ca entitate

genetică în raport cu genotipurile multilocus este populația Baia de Aramă, în care doar doi arbori

prezintă valori ale coeficientului de apartenență (Q) specifice celuilalt cluster (Q = 0,858 și

respectiv 0,935). Analiza efectuată permite reliefarea proporției de apartenență a fiecărui exemplar

la genotipurile multilocus astfel generate.



37

Figura. 4.6. Rezultatele grupării pe populații pentru K=2, fără opțiunea LOCPRIOR

Figure 4.6 The results of the population assignment for K = 2, without the option LOCPRIOR

Gradul de apartenență la clusterul genetic corespunzător unei populații este dat de ponderea

culorii (roșu = Cluster 1; verde = Cluster 2). Cu ajutorul acestor valori ale coeficientului

(probabilității) de apartenență s-a putut realiza distribuția spațială a clusterelor pentru populațiile

analizate de pe teritoriul țării (fig. 4.7).

Figura 4.7 Distribuția geografică a clusterelor genetice (K = 2), fără opțiunea LOCPRIOR

Figure 4.7 Geographical distribution of genetic custer (K = 2), without the option LOCPRIOR

În fig. 4.8 este redată histograma pentru K = 5, unde se poate observa și de data aceasta o

corespondență bună între clustere și localizarea geografică. Primul grup este alcătuit din

populațiile Apa Sărată și Teaca, aflate în zona de nord a României. Al doilea grup este format din

populațiile Roșcani și Panciu, situate în nord-estul și respectiv estul României. Un alt model pentru

genotipurile multilocus este caracteristic populației Babadag, din sud-estul României. Populațiile

Lotrișor și Baia de Aramă constituie grupul 4 iar populația Leamna formează singură grupul 5.

Figura 4.8 Rezultatele grupării pe populații pentru K=5, fără opțiunea LOCPRIOR

Figure 4.8 The results of the population assignment for K = 5, without the option LOCPRIOR



38

În urma analizei Baiesyene s-au identificat și genotipuri intermediare, care ar putea fi o

consecință a fluxului de gene determinat de migrarea polenului. Parametrul ∆K ne-a determinat să

constatăm că cea mai bună diviziune a celor 400 de arbori luați în studiu corespunde la două

grupuri omogene (K = 2). Acest rezultat a indicat că au existat diferite grade de introgresie în

populațiile cercetate, detectate ca diferențe de frecvențe ale alelelor în rândul populațiilor. Premoli,

et al. (2001) au constatat că nivelul de eterogenitate genetică între populații este mai mare la specii

cu răspândire geografică disjunctă decât la specii cu răspândire continuă.

O altă modalitate de analiză a structurilor genetice spațiale s-a efectuat prin clasificarea

ierarhică ,,aglomerativă”, bazată pe algortimul UPGMA și distanțele genetice Nei dintre perechile

populațiilor analizate. Rezultatele acestei analize confirmă pe cele identificate în urma analizei

Bayesiene (fig. 4.9). Se observă în mod evident apartenența indivizilor la două grupuri, care

corespund cu localizarea geografică a populațiilor. Primul grup este constituit din populațiile din

sud-vestul țării (Baia de Aramă, Leamna și Lotrișor), iar cel de al doilea grup este format din

celelalte populații de carpen luate în studiu. Un suport statistic destul de scăzut se poate observa

între populațiile Roșcani și Panciu (bootstrap = 21). Cealaltă extremă a suportului statistic este

întâlnită între populațiile Apa Sărată și Teaca (bootstrap = 76), dar suficient de mare și pentru

încadrarea populațiilor Leamna și Baia de Aramă în același subcluster.

Figura 4.9 Dendrograma UPGMA pe baza distanțelor genetice Nei

Figure 4.9 UPGMA dendrogram constructed based on genetic distances Nei



39

În schimb, testul Mantel a relevat o corelație nesemnificativă între distanța genetică și

distanța geografică a populațiilor (R = 0,233, P = 0,38). Prin urmare, uneori se speculează că

structura genetică a populațiilor de carpen poate fi afectată de distanța geografică, dar diferențierea

sporită ar putea rezulta și din barierele geografice (Munții Carpați) și/sau evenimentele istorice.

4.1.3 Diversitatea genetică în populațiile de Carpinus orientalis

4.1.3.1 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg, a dezechilibrului linkage și

identificarea alelelor nule

În urma testării echilibrului Hardy-Weinberg s-a semnalat un deficit de heterozigoți la

markerul Cb_33 (p<0,05) doar în trei populații (Leamna, Stârmina și Baia de Aramă) din cele șase

luate în studiu (Tabelul 4.4). Aceste populații care prezintă deviații de la starea de echilibru

genetic, nu sunt în concordanță cu criteriile unei ,,populații ideale” (panmictică, lipsa mutațiilor,

migrației, derivei și a selecției; Selkoe și Toonen, 2006).

Cu toate acestea, la niciun marker nu s-au observat abateri de la această stare de echilibru

din cauza excesului de heterozigoți, ceea ce denotă că numărul de homozigoți nu a fost mai mic

decât se aștepta.

Tabelul. 4.4 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg

Table 4.4 Testing for Hardy Weinberg equilibrium

Marker Roșcani Murfatlar Cândești Leamna Stârmina Baia de Aramă

Deficit de heterozigoți

Cb_37a 0,3572 0,2693 0,2017 0,7613 0,4105 0,4755

Cb_49a 0,0680 0,8937 0,7826 0,0772 0,4019 0,1197

Cb_29 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000

Cb_33 0,0887 0,258 0,1221 0,0016 0,0044 0,0004

Cb_48a 0,7798 0,7491 0,5003 0,1300 0,0827 0,2610

Exces de heterozigoți Cb_37a 0,8301 0,8822 0,9226 0,4930 0,8025 0,7576

Cb_49a 0,9441 0,1066 0,2218 0,9259 0,5981 0,8843

Cb_29 0,8454 0,7928 0,6054 0,3503 0,9374 0,7885

Cb_33 0,9261 0,9743 0,8799 0,9984 0,9956 0,9994

Cb_48a 0,2303 0,2578 0,5016 0,8700 0,9184 0,7398

-deficit de heterozigoți; ns = nesemnificativ, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001

Dezechilibrul linkage a fost testat pentru cei cinci markeri luați în studiu, în cadrul fiecărei

populații (Tabelul 4.5). Din cele 60 de situații posibile între perechile de markeri, s-au identificat

10 cazuri pentru care există o probabilitate semnificativă (p<0,05), ca acest dezechilibru linkage să

existe. Un puternic dezechilibru s-a observat la nivelul grupului de markeri Cb_33 - Cb_48a, având



40

o probabilitate extrem de semnificativă. Acest lucru se poate datora cel mai probabil

polimorfismului ridicat la ambii markeri.

Tabelul 4.5 Testarea dezechilibrului linkage

Table 4.5 Testing of linkage disequilibrium

Nr. critic Marker 1 Marker 2 Semnificație

1 Cb_37 Cb_49a

Diferențe nesemnificative

(p<0,05)

2 Cb_37 Cb_29

3 Cb_49a Cb_29

4 Cb_37a Cb_33

5 Cb_49a Cb_33

6 Cb_29 Cb_33

7 Cb_37a Cb_48a

8 Cb_49a Cb_48a

9 Cb_29 Cb_48a

10 Cb_33 Cb_48a Diferențe foarte semnificative (p<0,001)

Alelele nule (neamplificate) sunt o caracteristică comună în genotiparea indivizilor cu

ajutorul microsateliților și pot duce la estimări eronate ale frecvențelor alelelor și genotipurilor,

astfel pot stopa analizele genetice ale populațiilor (Van Oosterhout et al. 2006). La genotiparea

exemplarelor pot să apară erori cauzate atât de apariția alelelor nule, cât și de prezența unei

concentrații reduse a ADN-ului, o amplificare ridicată în favoarea alelelor scurte, precum și erori

de citire datorită omiterii unor alele de lungime mare (engl. large allele drop-out) sau erori

rezultate în urma alelelor care diferă print-o singură pereche de baze (engl. stuttering) (Van

Oosterhout et al. 2004). La cărpiniță, aceste erori au fost evaluate cu ajutorul programului

MICROCHECKER (Van Oosterhout et al. 2004), care a confirmat atât absența alelelor nule, cât

și a erorilor de citire (engl. large allele drop-out și engl. stuttering) (Tabelul 4.6). Acest rezultat

conferă datelor experimentale un nivel adecvat de acuratețe și poate fi datorat și nivelului scăzut

de polimorfism al markerilor SSRs.

Tabelul 4.6 Identificarea alelelor nule cu programul Microchecker

Table 4.6 Identification of null alleles with Microchecker program

Marker Dovezi pentru

alelele nule

Dovezi pentru ,,large

allele drop-out’’

Dovezi pentru

,,scoring error

due to stuttering’’

Chakraborty Brookfield

Cb_37a Nu Nu Nu 0,04 0,027

Cb_49a Nu Nu Nu 0,08 0,061

Cb_29 Nu Nu Nu -0,03 -0,007

Cb_33 Nu Nu Nu 0,07 0,056

Cb_48a Nu Nu Nu -0,04 -0,032



41

4.1.3.2 Structura alelică

În cele șase populații de cărpiniță (300 de arbori) s-au identificat 18 alele, la nivelul celor

cinci markeri. Dintre acestea, 16 sunt comune celor șase populații analizate. Media de alele

observate pe marker a fost de aproximativ 4 alele. În graficul de mai jos (fig. 4.10) sunt redate

frecvențele relative ale alelelor pentru fiecare marker genic.

Figura 4.10 Frecvența relativă a alelelor pentru cei cinci markeri analizați

Figure 4.10 Relative frequency of the alleles for the five markers analyzed

Analizând structura alelică a celor șase populații de cărpiniță, pe baza celor cinci markeri

SSRs se observă faptul că numai markerul Cb_33 prezintă alele private.

Alelele identificate de noi la cei 300 de arbori de cărpiniță, nu le putem compara cu studiul

realizat de Prinz și Finkeldey (2015) pentru că genotiparea în studiul amintit s-a realizat doar pe

un singur exemplar de cărpiniță.

Numărul redus de variante alelice la markeri luați în studiu se poate datora ratei mutațiilor

ușor scăzute. O altă ipoteză ar fi că acești markeri au fost dezvoltați inițial pentru carpen, specie

cu un nivel diferit de poliploidie, comparativ cu cărpinița care este o specie diploidă. Gürcan și

Mehlenbacher, (2010) a realizat un studiu pe câteva specii din familia Betulaceae, transferând

perechi de markeri între specii cu polimorfism mai ridicat decât în studiul nostru. Numărul mic de

fragmente repetitive în genomul cărpiniței sau structura secvențelor repetitive ar putea fi o altă

ipoteză care să explice diferențele față de carpen. Variații importante ale numărului de alele pot fi

determinate de fenomene precum: deriva genetică, efectul ,,gâtului de sticlăˮ (engl. bottleneck),

precum și „efectul de fondator” (engl. founder effect). Mai mult decât atât, este de așteptat ca

polimorfismul să fie mai mare la speciile poliploide, dar diferențe de polimorfism pot fi generate

și din cauza efectivelor populaționale, care sunt evident mai mari la carpen decât la cărpiniță,

supoziție care are în vedere amploarea recombinărilor la împerechere dependentă de dimensiunea

populației.

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

74 80 159 169 171 61 63 142 144 146 148 150 154 156 144 146 148 150

Cb_37a Cb_49a Cb_29 Cb_33 Cb_48a

Fre

cven

ța

Marker

Frecvența alelelorRoșcani-IS

Murfatlar-CT

Cândești-BZ

Leamna-DJ

Stârmina-MH

Baia de Aramă-MH



42

4.1.3.3 Indicii de diversitate genetică

Valorile principalilor indici de diversitate genetică estimaţi pentru cele 6 populaţii de

cărpiniță sunt prezentate în tabelul 4.7. Aceste valori sunt discutate și comparate cu alte studii din

literatura de specialitate.

Tabelul 4.7 Diversitatea genetică în populații de cărpiniță din România

Table 4.7 Genetic diversity of C. orientalis for each population from Romania

Na - numărul mediu de alele pe locus; Ne - numărul efectiv de alele pe locus; I - Indicele Shannon;

Ho – Heterozigoția observată; He – Heterozigoția așteptată (diversitatea genetică); F – indicele de fixare.

Populația Marker Na Ne I Ho He F

Roșcani

Cb_37a 2,00 1,99 0,69 0,46 0,50 0,08

Cb_49a 3,00 2,98 1,09 0,56 0,66 0,15

Cb_29 2,00 1,13 0,23 0,13 0,12 -0,07

Cb_33 4,00 2,98 1,13 0,57 0,67 0,14

Cb_48a 4,00 2,51 1,07 0,65 0,60 -0,09

Media 3,00 2,32 0,84 0,47 0,509 0,045

Eroarea standard 0,45 0,35 0,17 0,09 0,10 0,05

Murfatlar

Cb_37a 2,00 1,99 0,69 0,44 0,50 -0,14

Cb_49a 3,00 2,83 1,07 0,74 0,65 -0,08

Cb_29 2,00 1,15 0,26 0,14 0,13 0,08

Cb_33 4,00 3,45 1,30 0,65 0,71 -0,13

Cb_48a 4,00 3,40 1,29 0,80 0,71 -0,14

Media 3,00 2,57 0,92 0,55 0,539 -0,030


Cândești

Cb_37a 2,00 1,89 0,66 0,40 0,47 0,15

Cb_49a 3,00 2,67 1,03 0,68 0,63 -0,09

Cb_29 2,00 1,22 0,33 0,20 0,18 -0,11

Cb_33 5,00 3,48 1,34 0,61 0,71 0,15

Cb_48a 4,00 3,29 1,28 0,74 0,69 -0,06

Media 3,20 2,51 0,93 0,53 0,538 0,008


Leamna

Cb_37a 2,00 1,75 0,62 0,46 0,43 -0,07

Cb_49a 3,00 2,67 1,04 0,54 0,63 0,13

Cb_29 2,00 1,32 0,41 0,28 0,24 -0,16

Cb_33 5,00 3,56 1,39 0,63 0,72 0,13

Cb_48a 4,00 3,13 1,22 0,70 0,68 -0,03

Media 3,20 2,48 0,94 0,52 0,539 0,001


Stârmina

Cb_37a 2,00 1,85 0,65 0,43 0,46 0,07

Cb_49a 3,00 2,61 1,01 0,67 0,62 -0,09

Cb_29 2,00 1,09 0,17 0,08 0,08 -0,04

Cb_33 6,00 4,11 1,59 0,65 0,76 0,15

Cb_48a 4,00 3,47 1,30 0,67 0,71 0,06

Media 3,40 2,62 0,95 0,50 0,525 0,028


Baia de Aramă

Cb_37a 2,00 1,81 0,64 0,43 0,45 0,04

Cb_49a 3,00 2,77 1,06 0,57 0,64 0,11

Cb_29 2,00 1,16 0,26 0,15 0,14 -0,08

Cb_33 5,00 4,10 1,50 0,65 0,76 0,15

Cb_48a 4,00 3,55 1,33 0,69 0,72 0,04

Media 3,20 2,68 0,96 0,50 0,539 0,051


MEDIA GENERALĂ 3,17 2,53 0,92 0,51 0,531 0,017




43

Din analiza diversității genetice cu ajutorul celor cinci markeri moleculari s-a constatat că

populațiile analizate prezintă un grad scăzut de polimorfism, fapt dovedit de numărul mic de alele

identificate la fiecare marker. Numărul mediu de alele pe locus (Na) este în medie de 3,17, iar

numărul efectiv de alele pe locus (Ne) este de 2,53. Cel mai polimorfic marker este Cb_33, la care

s-au observat 7 alele, dintre care două alele sunt private pentru populațiile Baia de Aramă (156 pb)

și Stârmina (154 pb). Numai două alele pe locus au înregistrat markerii Cb_37a și Cb_29. Cele

mai mari valori ale numărului efectiv de alele s-au observat tot la markerul Cb_33, urmat de

Cb_48a și Cb_49a.

La nivel de populație atât indicele de diversitate genetică Na cât și Ne prezintă o valoare

aproximativ constantă pentru întregul eșantion luat în studiu, neprezentând diferențe semnificative

între populații, rezultând din această perspectivă o relativă uniformitate a speciei.

Heterozigoția observată este un indice de diversitate genetică care corespunde valorii

proporției heterozigoților din populațiile analizate. La nivelul markerilor, heterozigoția observată

a variat destul de mult, de la 0,164 la markerul Cb_29, la 0,706 la markerul Cb_48a. Valorile

extreme se găsesc la acești doi markeri și în toate populațiile luate în studiu. Cea mai mare valoare

a heterozigoției se înregistrează în populația Murfatlar (Ho = 0,554), iar cea mai scăzută în

populația Roșcani (Ho = 0,474).

Heterozigoția așteptată, cunoscută și sub denumirea de diversitatea genetică, a înregistrat

valoarea medie 0,53, care este ușor mai mare decât heterozigoția observată. Așa cum era de

așteptat, datorită nivelului ridicat de polimorfism, valoarea cea mai mare a diversității genetice

poate fi observată la markerul Cb_33a (He = 0,720). Markerul Cb_29 a atins valoarea cea mai

scăzută a diversității genetice dintre cei 5 markeri analizați (He = 0,148). De la acest marker se

așteaptă puțini heterozigoți în cele 6 populații analizate, în primul rând din cauza nivelului scăzut

al polimorfismului, iar în al doilea rând datorită valorii scăzute a heterozigoției observate.

În ceea ce privește analiza acestui indice de diversitate genetică la nivel de populație, putem

constata faptul că valoarea maximă se înregistrează în populațiile Murfatlar, Leamna și Baia de

Aramă (He = 0,539), iar valoarea minimă în populația Roșcani (He = 0,509). Valoarea mai scăzută

a diversității genetice se poate datora și faptului că populația Roșcani este situată la limita nordică

a arealului din Europa, fiind totodată și o populație izolată. O reducere a dimensiunii populației și

absența fluxului de gene poate duce la reducerea diversității genetice, ceea ce ar putea genera o

capacitate limitată de a se adapta la schimbările climatice preconizate, culminând cu creșterea

riscului de dispariție. Valori mici ale diversității genetice se găsesc și la fag, în cadrul populațiilor

marginale izolate (He = 0,538 în populația Tălășmani din estul României) (Ciocîrlan, 2014). Pe

ansamblu întregului eșantion de populații cercetate, care acoperă și reflectă arealul speciei în



44

România, nivelul diversității genetice a fost relativ ridicat și nu au existat diferențe semnificative

între populațiile analizate, valorile pentru He varind între 0,509 și 0,539.

Analiza indicilor de diversitate moleculară nu a relevat diferențe semnificative statistic

între populațiile luate în studiu.

Indicele de fixare - F (Hartl și Clark, 1997) redă măsura în care o populație se abate de la

starea de echilibru Hardy-Weinberg. Atunci când F = 0 semnifică absența consangvinizării (Keller

și Waller, 2002). Din tabelul 4.7 se constată că la patru din cei cinci markeri valorile acestui indice

sunt apropiate de 0, ceea ce înseamnă că încrucișările s-au realizat cel mai probabil în mod

aleatoriu. La markerul Cb_33 se observă că valorile indicelui de fixare sunt cu puțin peste 0,1,

ceea ce sugerează că încrucișările nu au fost întâmplătoare. Valoarea medie a indicelui de fixare

tinde spre 0 (F = 0,017), ceea ce evidențiază că populațiile analizate sunt apropiate de starea de

echilibru genetic Hardy-Weinberg. Ca atare, în populațiile cercetate fenomenul de consangvinizare

nu joacă un rol important, având o incidență infimă, în schimb cel mai probabil se regăsește

acțiunea factorilor evolutivi (selecția). Pe ansamblul markerilor analizați, în populațiile Baia de

Aramă (F = 0,051), Roșcani (F = 0,045) și Stârmina (F = 0,028) a rezultat un ușor exces de

homozigoţi. La cealaltă extremă se întâlnește populația Murfatlar cu un exces de heterozigoți (F

= -0,030). Faptul că populația Roșcani nu prezintă un dezechilibru Hardy-Weinberg de

homozigotare la markerii analizați indică viabilitatea acesteia, care trebuie să fie în legătură cu

mărimea sa suficient de mare, care nu a favorizat consangvinizarea.

4.1.3.4 Diferențierea genetică

Indicele de diferențiere (FST) redă diferența dintre populații sau specii (Wright, 1951).

Pentru populațiile luate în studiu, indicele de diferențere calculat ca medie pentru cei cinci markeri

redă o diferență genetică scăzută pentru probabilitatea de 95% (FST = 0,030; P < 0,05) (Tabelul

4.8). Această valoare nu poate fi însă atribuită lipsei barierelor dintre populații, deoarece arealul

speciei este, așa cum bine se cunoaște, puternic fragmentat. Mai degrabă valoarea scăzută a

indicelui de diferențiere poate fi interpretată prin prisma conservatorismului ereditar general al

speciei, inclusiv în condiții de izolare a populațiilor sale. Coeficientul FST prezintă o valoare

maximă la markerul Cb_37a (0,067) urmat de markerul Cb_48a (0,040). Acești doi markeri se

diferențiază cel mai bine între cele șase populații analizate. Într-un studiu efectuat pe stejarul

pedunculat și stejarul brumăriu, Toader (2011) a comunicat valori scăzute pentru ambele specii

(FST-Q.robur = 0,018 și FST-Q.pedunculiflora = 0,016), ceea ce denotă un nivel scăzut de departajare

interpopulațională. Valori tot scăzute ale indicelui de diferențiere s-au înregistrat și la Alnus

glutinosa (FST = 0,014; Mingeot et al. 2016), Fagus sylvatica (FST = 0,017; Pluess et al. 2016).



45

Tabelul 4.8 Valorile indicelui de diferențiere FST pentru fiecare marker genic

Table 4.8 FST differentiation index values for each genic marker

Marker Cb_37a Cb_49a Cb_29 Cb_33 Cb_48a Media Eroarea standard

FST 0,067 0,008 0,006 0,018 0,040 0,030 0,010

După cum se poate observa în tabelul de mai jos (Tabelul 4.9), o diferențiere genetică

moderată s-a semnalat între populațiile Leamna și Roșcani (FST = 0,067), aflate totuși la o distanță

geografică mare, de peste 400 km, dar și între populații mai apropiate din sud-vestul României:

Baia de Aramă și Leamna (FST = 0,059), respectiv Stârmina și Leamna (FST = 0,058). În aceste

populații fie izolate (Roșcani) sau fie cu un număr mic de exemplare (Stârmina), deriva genetică

și fluxul de gene ar putea juca un rol important, observându-se o ușoară pierdere a diversității

genetice. Cea mai scăzută diferențiere s-a observat între populațiile Baia de Aramă și Murfatlar

(FST = 0,007), Baia de Aramă și Stârmina (FST = 0,007), urmate de populațiile Stârmina și

Murfatlar (FST = 0,008), respectiv Cândești și Roșcani (FST = 0,009). Valoarea scăzută a indicelui

de diferențiere poate indica o oarecare similitudine a variației genetice.

Tabelul 4.9 Valorile indicelui de diferențiere FST între populațiile analizate

Table 4.9 FST differentiation index values between the analyzed populations

Populația Roșcani Murfatlar Cândești Leamna Stârmina Baia de Aramă

Roșcani 0,000

Murfatlar 0,023 0,000

Cândești 0,009 0,012 0,000

Leamna 0,067 0,026 0,037 0,000

Stârmina 0,039 0,008 0,031 0,058 0,000

Baia de Aramă 0,033 0,007 0,031 0,059 0,007 0,000

- populațiile în care diferențierea genetică este înalt semnificativă (p<0,01); - populațiile la care diferențierea

genetică este semnificativă (p<0,05); - populațiile în care diferențierea genetică este nesemnificativă (p>0,05).

4.1.3.5 Analiza structurii genetice spațiale intrapopulaționale

Autocorelația spațială permite măsurarea structurii genetice a întregului eșantion luat în

studiu cu datele rezultate în urma analizei cu markerii SSRs. Această analiză s-a realizat la 10 clase

de distanțe egale, pe o distanță totală de 250 m (fig. 4.11. a-b). Corelația dintre matricea distanțelor

genetice și matricea distanțelor geografice a fost semnificativă, cu valoare pozitivă pentru

populația Cândești și cu valoare negativă pentru populația Baia de Aramă (fig. 4.11. a-b). Testul

de eterogenitate arată valori semnificative tot pentru cele două populații (p ˂0,01). Pentru celelalte

patru populații coeficientul de corelație nu se abate de la ipoteza nulă a distribuției randomizate a

genotipurilor în orice clasă de distanțe.



46

Figura 4.11 Corelogramele pentru cele șase populații de cărpiniță.Liniile roșii punctate delimitează

intervalul de încredere a ipotezei nule pentru probabilitatea de 95%. Liniile negre din jurul valorii

coeficientului r reprezintă intervalele de încredere pentru 95%, generate prin bootstrapping

Figure 4.11 The correlograms for the six oriental hornbeam populations. The dashed red

lines represent confidence intervals for the probability of 95%. Black lines around coefficient r

represent 95% confidence intervals generated by bootstrapping.

Prezența unei structuri genetice spațiale în două din cele șase populații luate în studiu ar

putea fi explicată de răspândirea limitată a semințelor. Cu cât este mai slabă SGS, cu atât este mai

intens fluxul de gene intrapopulațional. Rezultatele noastre au arătat că la scară mică SGS este

sensibilă la fragmentare și poate fi utilă ca un indicator timpuriu al consecințelor negative ale

fragmentării populațiilor de plante.

4.1.3.6 Analiza structurii genetice spațiale interpopulaționale

Pentru determinarea structurii genetice s-a folosit analiza Bayesiană disponibilă în

software-ul STRUCTURE (Pritchard et al. 2000), așa cum s-a menționat în capitolul anterior.

Numărul de grupuri omogene din punct de vedere genetic (K) a fost determinat prin cea

mai mare valoare a probabilității posterioare Ln (P(D)) (fig. 4.12.a), dar și prin metoda bazată pe

cea mai mare valoare a lui ΔK (fig. 4.12.b), evocată de Evanno et al. (2005).

Numărul optim de clustere (K = 3), s-a stabilit prin cea de-a doua metodă, dar același număr

optim de clustere a fost comfirmat și de prima metodă.

-0.150-0.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.2000.250

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Cândești

a)

-0.300

-0.200

-0.100

0.000

0.100

0.200

25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

Co

efic

ien

tul

de

core

lați

e

(r)

Distanța (m)

r

U

L

Baia de

Aramă

b)



47

a) b)

Figura 4.12 Detectarea grafică a celor două etape pentru a determina numărul de clustere

Figure 4.12 Graphical detection of the two stages to detect the number of clusters

Rezultatele analizei Bayesiene indică ipoteza unei structuri genetice cu trei clustere (fig.

4.13), dar separarea acestora nu se realizează tranșant. După cum se poate observa în histograma

de mai jos, cele șase populații analizate se pot grupa doar aproximativ în conformitate cu aria

geografică. Populațiile Roșcani, Murfatlar și Cândești prezintă o structură genetică diferită față de

celelalte populații. De asemenea, între aceste populații există cel mai mare grad de afinitate

structurală, fapt dovedit și de analiza coeficientului de diferențiere genetică. Structura genetică a

populației Leamna se diferențiază bine față de restul populațiilor. În populațile Stârmina și Baia

de Aramă se poate observa că doar 11 exemplare aparțin celui de-al treilea cluster, cu o proporție

a coeficientului de apartenență (Q) de peste 76%. În populațiile analizate au fost identificate

numeroase genotipuri multilocus intermediare, deși distanțele geografice mari între populații și

fragmentarea arealului nu susțin producerea fluxului genic interpopulațional.

Figura 4.13 Structura genetică a celor șase populații de C. orientalis, cu opțiunea LOCPRIOR

Figure 4.13 The genetic structure of the six C. orientalis populations, with LOCPRIOR option

Cu ajutorul valorilor probabilității de apartenență a fiecărei populații la unul din cele 3

clustere s-a generat o hartă cu distribuția genotipurilor multilocus în fiecare populație (fig. 4.14).



48

Figura 4.14 Distribuția geografică a clusterelor genetice (K = 3)

Figure 4.14 Geographical distribution of genetic clusters (K = 3)

În urma construit arborele filogenetic UPGMA (Unweighted Pair Group Method

Arithmetic Average) pe baza distanțelor genetice Nei, cu programul PAST (Hammer et al. 2001)

(fig. 4.15), se pot observa aceleași relații genetice ale populațiilor cu cele identificate prin analiza

Bayesiană. Populațiile din sud-vestul României (Leamna, Stârmina și Baia de Aramă) s-au separat

de celelalte, respectiv cele foarte apropiate geografic (Stârmina și Baia de Aramă, aflate la nu mai

mult de 100 km distanță) s-au grupat în același subcluster. Pe ramura celuilalt cluster se remarcă

separarea populației nord-estice Roșcani, aflată la circa 250 km de populația Cândești, aceasta din

urmă constituind un sub-cluster cu populația Murfatlar. Suportul statistic puternic de grupare a

populațiilor Stârmina și Baia de Aramă (valori bootstrap = 96), precum și pentru gruparea

populațiilor din estul arealului cercetat conferă acestei metode de analiză un nivel ridicat de

încredere.

Figura 4.15 Dendrograma UPGMA construită pe baza distanțelor genetice Nei

Figure 4.15 UPGMA dendrogram constructed based on genetic distances Nei



49

Testul AMOVA calculat pentru populațiile de cărpiniță, a arătat că cea mai mare parte a

variației se întâlnește în interiorul populațiilor (95%) și s-a observat doar 5% între populații.

Diferențierea genetică a fost foarte semnificativă (PhiST = 0,047, p <0,0001). Diferențele din

punct de vedere genetic se găsesc la nivel de individ și nu la nivel de populație, ceea ce rezultă că

izolarea nu s-a realizat de mult timp.

Testul Mantel a arătat o corelație nesemnificativă între distanțele geografice și cele genetice

ale populațiilor de cărpiniță analizate (R2 = 0,098; P = 0,388). Au fost efectuate 999 de permutări.

4.1.3.7 Testarea efectului de ,,bottleneck” în populațiile de cărpiniță

Prin reducerea masivă a numărului de indivizi dintr-o populație (,,gâtului de sticlă” - engl.

‚,bottleneck”) duce la reducerea variației genetice în interiorul populațiilor, ca urmare a pierderii

alelelor rare prin deriva genetică (Meffe și Carroll, 1997). Acest efect ,,gât de sticlă” poate rămâne

într-o populație mai multe generații, chiar dacă populația depășește perioada de criză prin refacerea

echilibrului demografic. Însă procesele genetice și demografice pot grăbi dispariția unor populații

aflate într-o astfel de criză, dacă nu se aplică măsurile de conservare a genofondului populațional.

Cauzele unui blocaj genetic depind de: rapiditatea reducerii mărimii populației, lungimea

intervalului blocajului genetic și de rata creșterii populației ca urmare a evenimentului de blocaj

(Nei et al. 1975).

Datele obținute în urma analizei testului statistic de semnificație (engl. sing test) pentru

cele trei modele (IAM, SMM și TPM), a relevat că o singură populație din cele șase luate în studiu

(Leamna) prezintă dovezi ale unui blocaj genetic relativ recent (Tabelul 4.10).

Tabelul 4.10 Rezultatele testului ,,bottleneck” pentru cele șase populații de cărpiniță

Table 4.10 Results of genetic ,,bottleneck” test for six oriental hornbeam populations

Populația He p-sing-IAM p-sing-SMM p-sing-TPM

Roșcani 0,515 0,168 0,241 0,217

Murfatlar 0,545 0,163 0,239 0,220

Cândești 0,543 0,165 0,242 0,215

Leamna 0,545 0,025 0,043 0,038

Stârmina 0,530 0,170 0,243 0,216

Baia de Aramă 0,544 0,169 0,240 0,220

He = heterozigoția așteptată; p<0,05 - valoarea semnificativă detectată prin testul de semnificație este

îngroșată; IAM = infinite allele model; SMM = stepwise mutation model; TPM = two-phased model.

Efectele recente ale blocajului asupra habitatului nu sunt în totalitate detectabile. Au fost

luate în acest studiu și populații cu un număr mic de exemplare care ar fi putut să fie influențate

de efectul ,,bottleneck”.



50

Populația Roșcani constituită dintr-un număr redus de exemplare, posibil mai mare în

trecutul îndepărtat, nu a arătat nicio dovadă a blocajelor recente, dar indicele de fixare arată că

populația este într-un oarecare dezechilibru genetic (există un deficit de heterozigoți, F = 0,045).

Acest rezultat poate sugera că în viitor se poate înregistra un dezechilibru genetic determinat de

efectivul mic din populație, la fel ca și în populația Stârmina (populație cu un număr mic de

exemplare).

Literatura de specialitate menționează că speciile care se confruntă cu fragmentarea

habitatului se pot afla într-un dezechilibru genetic. Structura genetică actuală a populațiilor de

cărpiniță analizate indică în mod evident că a existat o conectivitate istorică între populații iar

diversitatea genetică pe total nu a fost erodată în mod semnificativ, în conformitate cu date similare

din literatura de specialitate (Farias et al. 2015).

4.2 Structura alelică și diversitatea genetică la nivelul ADN-ului cloroplastic

4.2.1 Haplotipurile identificate și frecvențele relative ale acestora în populații

În urma genotipării celor 24 de populații (18 de carpen – 96 de exemplare, respectiv 6 de

cărpiniță – 32 de exemplare), cu ajutorul markerilor ccmp s-au identificat 8 alele.

Dintre cei trei markeri luați în studiu doar markerul ccmp7 a arătat polimorfism în

populațiile de C. betulus (Tabelul 4.11). Având în vedere alelele identificate la cei trei markeri,

două haplotipuri pentru carpen au fost detectate (H1 și H2), cu H1 întâlnit în toate cele optsprezece

populații (82%) și H2 a fost găsit în șapte populații.

În populațiile de C. orientalis s-au observat două alele la nivelul markerului ccmp10, iar

ceilalți doi au relevat monomorfism (Tabelul 4.11). Perechea de baze 115 a fost găsită doar într-o

singură populație la toți arborii luați în studiu. În urma combinării alelelor identificate la cărpiniță

au dus la concretizarea a două haplotipuri (H3 și H4) în șase populații analizate, cu specificația că

haplotipul H4 a fost întâlnit numai în populația izolată Roșcani (Tabelul 4.11).

Tabelul 4.11 Haplotipurile de ADNcp identificate

Table 4.11 Chloroplast DNA haplotypes identified

Marker C. betulus C. orientalis Numărul de

alele H1 H2 H3 H4

ccmp4 118 pb 118 pb 129 pb 129 pb 2

ccmp7 158 pb 157 pb 159 pb 159 pb 3

ccmp10 110 pb 110 pb 117 pb 115 pb 3

Numărul de indivizi 79 17 26 6



51

Variația scăzută la nivelul genomului cloroplastic poate fi asociată atât cu evenimentele

istorice (numărul de refugii glaciare și modul de colonizare), cât și cu impactul activității umane

și/sau o rată de mutație scăzută (Palme, 2002).

A rezultat că cele două specii nu dețin haplotipuri comune. La alte genuri de arbori

forestieri, dimpotrivă, se cunosc cazuri de deținere în comun a haplotipurilor cloroplastice, ca de

exemplu la genul Quercus, pentru specii din cele încadrate la stejarii albi europeni (Moldovan et

al. 2010).

Tabelul 4.12 Frecvențele haplotipurilor în populațiile analizate

Table 4.12 The haplotype frequencies in analyzed populations

4.2.2 Distribuția geografică a haplotipurilor

În urma combinării lungimi fragmentelor observate la acești trei markeri, un total de două

haplotipuri au fost identificate la carpen, respectiv două haplotipuri la cărpiniță. Distribuția

Populația Abreviere

Frecvența Specia

H1 H2 H3 H4

Apa Sărată-Maramureș MM-CB 2 3

C. b

etulu

s

Teaca-Bistrița-Năsăud BN-CB 4 1 Roșcani-Iași IS-CB 4 1

Panciu-Vrancea VN-CB 4 1 Babadag-Tulcea TLB-CB 5 0 Măcin-Tulcea TLM-CB 5 0

Warthe-Brașov BVW-CB 5 0 Tâmpa-Brașov BVT-CB 5 0

Gura-Teghii-Buzău BZGT-CB 2 6 Colți-Buzău BZC-CB 1 4

Măgura-Buzău BZM-CB 7 1 Lotrișor-Vâlcea VL-CB 7 0 Bucovăț-Dolj DJ-CB 5 0

Baia de Aramă-Mehedinți MHBA-CB 5 0 Stârmina-Mehedinți MHS-CB 3 0

Lugoj-Timișoara TM-CB 5 0 Săvârșin-Arad AR-CB 5 0 Huedin-Cluj CJ-CB 5 0 Roșcani-Iași IS-CO 6 0

C. o

rien

tali

s

Murfatlar-Constanța CT-CO 5 0

Cândești-Buzău BZ-CO 5 0

Leamna-Dolj DJ-CO 5 0

Stârmina-Mehedinți MHS-CO 5 0

Baia de Aramă-Mehedinți MHBA-CO 0 6

Frecvența relativă 82% 18% 81,2% 18,8%



52

geografică și frecvența relativă a haplotipurilor de ADN cloroplastic pentru fiecare populație este

prezentată în fig. 4.16.

Figura 4.16 Distribuția haplotipurilor de carpen (a) și cărpiniță (b) în România

Figure 4.16 Distribution of hornbeam (a) and oriental hornbeam (b) chloroplast haplotypes in

Romania

Majoritatea indivizilor (82%) aparțin haplotipului 1, care este cel mai frecvent haplotip în

aproape toate populațiile de carpen analizate, dintre care 11 sunt monomorfe. Mai mult, acest

haplotip este preponderent (80-87,5%) în 4 din cele 7 populații bihaplotipice. Ponderea ridicată a

haplotipului 1 poate fi explicată prin recolonizarea postglaciară din sud, din refugiul balcanic, prin

căile de comunicare din trecătorile carpatice, care ar fi putut avea un astfel de efect omogenizator.

Ca atare, datele din cercetările noastre converg spre ideea că haplotipul predominant H1 provine

din refugii sudice, cu mare probabilitate din Peninsula Balcanică, fiind probabil corespondentul

haplotipului 5 identificat în zona respectivă de Grivet și Petit (2003) cu ajutorul markerilor PCR-

RFLP. Această ipoteză privind originea haplotipului 1 în zona Balcanilor este susținută și în studiul

realizat de Fărcaș et al. (2006).

Haplotipul 2 este dominant în nordul și sud-estul Carpaților, cu o frecvență de 18%. Acesta

este întâlnit împreună cu haplotipul H1. Interesant este faptul că H2 este majoritar în două populații

aflate la curbura externă a Carpaților (Gura Teghii - 75% și respectiv Colți - 80%), zonă pentru

care prin analize palinologice s-a ajuns la concluzia că ar fi existat refugii glaciare pentru carpen

la altitudini mici din ținuturi subcarpatice (Magyari, 2002; Willner et al. 2009).

O a treia populație (Apa Sărată) în care predomină haplotipul H2 (60%) este situată în zona

de nord-vest a arealului cercetat. Reapariția în proporție ridicată a acestui haplotip în zona

respectivă reprezintă un caz de discontinuitate spațială, care ar fi putut fi generat de existența și a

altor refugii la aceste latitudini. Într-adevăr, date din literatură (Magyari, 2002) indică posibilitatea

existenței unui refugiu glaciar pentru carpen pe teritoriul Ungariei, în Munții Matra, care sunt de



53

altitudine mică, iar Mitka et al. (2014) indică refugii posibile și în Carpații Nordici, context în care

se pune întrebarea dacă recolonizarea postglaciară s-ar fi putut realiza și dinspre aceste zone. Și

alte surse bibliografice susțin posibilitatea existenței refugiilor în zone din centrul și vestul Europei

(Magri, 2010) sau de est (Pott, 1997; Komar et al. 2009). Supozițiile referitoare la originea

haplotipului H2 în refugii carpatice și/sau din Munții din nordul Ungariei reclamă continuarea

cercetărilor prezente. Totodată, în contextul acestei ipoteze de origine a haplotipului H2, ținând

seama de prezența acestuia și în curbura externă a Carpaților, se poate aprecia că arealul său

preglaciar era mai extins decât cel identificat prin cercetările de față.

Pentru haplotipul H2, în afară de ipoteza originii sale din mici refugii glaciare locale, ar

rămâne valabilă doar revenirea sa din refugii balcanice, dar datele din cercetările noastre nu pot

explica absența sa din zone aflate mai la sud în arealul cercetat. Din moment ce acest haplotip are

o pondere atât de mare în cele două populații din zona Buzăului, iar prezența sa, chiar diminuată,

a fost identificată în Vrancea și apoi spre nord, se pune, totuși, întrebarea: ar fi putut exista un

refugiu secundar pentru carpen în zona curburii externe a Carpaților?

În populațiile de cărpiniță au fost identificate două haplotipuri specifice, ce diferă prin

două perechi de baze.

Haplotipul 3 prezintă frecvența cea mai mare (81,2%), fiind întâlnit în cele cinci populații

care acoperă arealul cărpiniței pe teritoriul României. Existența sa în zona cercetată în arealul din

ținuturile silvostepice, indică pe de-o parte originea comună a acestor populații, probabil ca

rezultat al recolonizării din refugiul balcanic. Într-un studiu european realizat de Grivet și Petit

(2003) s-au identificat două haplotipuri specifice la C. orientalis cu markeri PCR-RFLP și SSRcp,

unde se consideră că acestea își au originea în refugiile sudice (Peninsula Balcanică pentru

haplotipul 7, respectiv Peninsula Italică pentru haplotipul 8).

Haplotipul H4 identificat prin cercetările de față numai în populația Roșcani (Iași)

reprezintă un caz aparte, în primul rând ca urmare a faptului că este izolată, aflată la peste 200 km

distanță de cea mai apropiată populație de la granița nordică a arealului cvasicontinuu al cărpiniței.

Populații de cărpiniță mai sunt întâlnite la Vaslui (Bogdana, Lupești, Stănilești) (Chifu et al. 2006),

la o distanță de 100-110 km față de populația Roșcani. Structura haplotipică diferită față de

celelalte populații studiate, dar monomorfică, poate fi rezultatul originii ancestrale diferite, aspect

care presupune continuarea și extinderea evaluărilor în afara arealului cercetat prin studiul de față.

Ipoteza transferului de materiale de reproducere din alte zone este puțin plauzibilă, deoarece nu

există date care să confirme o astfel de practică la această specie.

În concluzie, numărul de haplotipuri (patru) este destul de scăzut în comparație cu alte

genuri de angiosperme, ca de exemplu cele din genul Quercus, la care diversitatea haplotipică este



54

mare (Petit et al. 2005; Moldovan et al. 2010). Fragmentarea puternică a habitatului, în cazul

cărpiniței, ar fi dus la absența sau slaba variație a haplotipurilor cloroplastice din anumite zone.

Cercetările noastre au reliefat că cele două specii nu prezintă haplotipuri comune, ceea ce denotă

un nivel mare de divergență genetică. Cu toate că cele două specii prezintă interferențe arealistice,

hibridarea are loc numai prin încrucișări controlate (Santamour, 1995), ceea ce explică separarea

haplotipurilor celor doi taxoni. De asemenea o altă ipoteză ar putea fi ca rezultatul diferenței

genetice majore să fie determinat de faptul că nivelul lor de poliploidie este diferit: 2n = 8x = 64

la carpen (Petrova, 2006), respectiv 2n = 2x = 16 la cărpiniță (Santamour, 1995). Studiul nostru

arată că nu există nicio asemănare din punct de vedere al structurii genetice, nu s-a identificat nicio

alelă comună celor două specii la niciun marker. Ambele specii sunt în mod clar diferențiate, astfel

încât markerii ADNcp ar putea fi utilizați ca markeri de diagnostic pentru diferențierea între specii

(Gailing și Finkeldey, 2016).

4.2.3 Diversitatea genetică intra și interpopulațională

Rezultatele obținute pentru analiza diversității genetice cu ajutorul soft-ului Permut (Pons

și Petit, 1996) sunt prezentate în tabelul 4.13.

Tabelul 4.13 Diversitatea și diferențierea genetică între cele două specii

Table 4.13 Genetic diversity and differentiation between species

Specia Numărul de

indivizi

Numărul de

haplotipuri

hS

(E.S.)

hT

(E.S.)

GST

((E.S.)

RST

(E.S.)

C. betulus 96 2 0,160

(0,051)

0,277

(0,087)

0,422

(0,094)

0,422

(0,093)

C. orientalis 32 2 0,000

(0,000)

0,333

(0,222)

1,000

(NC)

1,000

(NC)

Carpinus ssp. 128 4 0,120

(0,041)

0,563

(0,083)

0,787

(0,074)

0,998

(0,001)

hS - diversitatea genetică intrapopulațională; hT - diversitatea genetică totală; GST - indicele de diferențiere

genetică; RST = indicele de diferențiere specific diferențelor dintre haplotipuri; E.S. – eroarea standard.

În populațiile de carpen diferențierea genetică este mai mare (GST = 0,422) decât

diversitatea totală a haplotipurilor (hT = 0,277) și a diversității genetice intrapopulaționale (hS =

0,160) (Tabelul 4.13). Grivet și Petit (2003) au raportat o valoare a lui hT de 0,683 pentru carpen,

deci semnificativ mai mare decât cea determinată de noi. Valoarea mai mică a acestui indice de

diversitate genetică pe teritoriul României se poate datora numărului mai mic de haplotipuri

identificate. Diversitatea genetică intrapopulațională a înregistrat o valoare mai mare în studiul

nostru comparativ cu cel realizat de Grivet și Petit (2003). Diferențierea genetică relativ scăzută



55

în rândul populațiilor poate fi explicată în principal ca urmare a impactului antropic asupra acestei

specii, dar poate fi și rezultatul polimorfismului ancestral împărtășit între specii (Muir și

Schlötterer 2005), chiar și în absența fluxului de gene. Testul pentru structura geografică este

nesemnificativ deoarece RST (0,422) prezintă aceeași valoare cu GST. Această structură reflectă

faptul că haplotipuri diferit amestecate în aceeași populație sunt, în medie, mai strâns legate decât

haplotipuri diferite din populații diferite. Analiza variației moleculare (AMOVA) a arătat în

continuare că a fost găsită o variabilitate mică (42%) între populații, iar majoritatea variației (58%)

a fost întâlnită în interiorul populațiilor. Cercetările efectuate de Grivet și Petit (2003) pentru un

număr mai mare de populații distribuite în arealul general al speciei au condus la o valoare mult

mai mare a lui GST (0,972). Valori scăzute pentru GST, similare celor determinate pentru carpen în

zona luată în studiu, au fost raportate la Castanea sativa (GST = 0,43, Fineschi et al. 2000) sau la

Betula pendula (GST = 0,424, Palme, 2003). Dealtfel, se apreciază că, în medie, la angiospermele

lemnoase indicele de diferențiere între populații este de 0,73 (Petit, 1999).

Diversitatea totală a haplotipurilor pentru populațiile de cărpiniță a fost de hT = 0,333

(Tabelul 4.13). Această valoare mai ridicată a diversității genetice comparativ cu cea identificată

la carpen, se poate datora haplotipului 4 identificat în populația Roșcani. Această populație este

complet izolată de zona sa de răspândire, la o distanță de circa 220 de km față de stațiunea cea mai

nordică din arealul său din România (Jideni - Râmnicu Sărat), cu excepția celor de la Vaslui

amintite mai sus. De asemenea reprezintă doar fragmente relicte ale arealului său mai vechi și mai

întins din terțiar (Haralamb, 1963). Valorile indicilor de diferențiere (GST/RST) sunt egale cu 1, ceea

ce înseamnă că diversitatea genetică este foarte bine divizată. Fixarea unui haplotip unic creează

scenariul când cea mai mare parte a diversității genetice se întâlnește în rândul populațiilor.

Valoarea ridicată a diferențierii genetice între populații indică o structură geografică puternică.

Valorile ridicate ale indicelui de diferențiere au fost găsite și la alte specii: Quercus robur, Q.

petraea, Q. pubescens (GST = 1,03; 0,84 și respectiv 0,85; Petit et al. 2002); Fagus sylvatica (GST

= 0,855, Vettori et al. 2004); Fraxinus excelsior, F. ornus, F. angustifolia (GST = 0,870; 0,982 și

respectiv 0,964; Heuertz et al. 2006).

În concluzie, acest studiu relevă un nivel relativ scăzut de diversitate genetică și o

diferențiere genetică semnificativă ce există între populații. Recolonizarea postglaciară poate

conduce la o pierdere a diversității genetice, inclusiv pentru cea determinată de organitele celulare,

fenomen care este mai accentuat la speciile cu dificultăți de diseminare pe distanțe mari (Bialozyt

et al. 2006) și cu dispersie leptocurtică (Hewitt, 1996; Newton et al. 1999), respectiv în fazele

timpurii ale recolonizării (Davies et al. 2004). Însă, la cele două specii nu s-a produs recolonizare

timpurie, deoarece expansiunea lor în teritoriul cercetat s-a înregistrat spre mijlocul Holocenului



56

(Feurdean et al. 2010; Fărcaș et al. 2013). Pe de altă parte, fructele de carpen sunt considerate

grele, fiind încadrate de Bhagwat și Willis (2008) alături de cele ale cvercineelor și fagului, ceea

ce le conferă o capacitate redusă de dispersie. Totodată, aceste specii nu sunt considerate printre

cele cu capacitate foarte mare de dispersie a fructelor, deoarece modele experimentale au arătat că

distanța de dispersie de 100 m sau ceva mai mare se realizează cu greu la viteze ale vântului de 20

m/s (Fonger și Pütz, 2002). Dispersia de model leptocurtic, mai ales în cazul cărpiniței, și un blocaj

puternic înainte de ultima colonizare postglaciară ar putea fi o cauză plauzibilă pentru nivelul

foarte scăzut de variație genetică la cele două specii de Carpinus. Fluxul de gene mediat prin polen

și semințe joacă un rol determinant în stabilirea structurii genetice (Heuertz et al. 2003). Reducerea

diversității ADNcp și legătura cu extinderea populațiilor a fost, de asemenea, observată la fag

(Demesure și et al. 1996) și la alun (Palmé, 2002). Rezultatele celor mai multe dintre aceste studii

sugerează că evenimentele istorice cheie (de exemplu, evenimentele glaciare) au un efect profund

asupra structurii geografice a variației ADNcp. Condițiile climatice, activitatea umană și

concurența cu alte categorii de specii de arbori ar fi putut afecta rata de răspândire.

4.2.4 Relațiile filogenetice între haplotipuri

În această rețea (utilizând programul NETWORK, Bandelt et al. 1999) se observă clar

separarea haplotipurilor identificate la carpen de cele identificate la cărpiniță precum și frecvența

lor (fig. 4.17). Prezența haplotipului 1 ca haplotip central, care înregistrează o frecvență mai mare

sugerează că este un haplotip ancestral. Haplotipul 2 are o strânsă relație cu acesta, care se

diferențiază printr-o singură deleție observată la markerul ccmp7. Haplotipul 3 identificat la

cărpiniță diferă față de haplotipul 4 printr-o mutație cromozomială, adică prin două inserții

observate la nivelul markerului ccmp10. Haplotipurile 2 și 3 prezintă cea mai mare distanță

filogenetică față de celelalte haplotipuri.



57

Figura 4.17 Rețeaua filogenetică ,,maximum parsimony” între cele 4 haplotipuri pentru cei 3

markeri SSRcp. Cercurile sunt proporționale cu frecvența medie a haplotipurilor

Figure 4.17 Maximum parsimony phylogenetic network among the 4 haplotypes for 3 cpSSR

markers. Circles are proportional to the haplotype mean frequency

Dendrograma UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic Average) a permis

relevarea unor informații despre dispunerea spațială a structurilor genetice haplotipice. Aceasta a

arătat o separare clară între cele două specii, fiecare specie fiind reprezentată de un cluster (fig.

4.18). Astfel, la carpen se remarcă gruparea în același subcluster a populațiilor din sud-vestul și

vestul arealului cercetat, care sunt în continuare apropiate structural de cele din Dobrogea și zona

Brașov. Populațiile polimorfe de carpen se grupează majoritar în alt cluster, fără însă ca în

interiorul acestuia structura să fie unitară. Pe de altă parte, populațiile de cărpiniță indică

uniformitate structurală, cu excepția populației Roșcani. Acest aspect poate fi determinat de

puternica fragmentare a arealului cărpiniței în zona cercetată, unde specia se află la limita

răspândirii sale în nordul Balcanilor. De asemenea se poate observa și faptul că, ramurile

clusterelor majore se structurează în mare parte în funcție de poziția geografică a populațiilor,

descrise dealtfel în prezentarea arealului actual al acestor taxoni.



58

Figura 4.18 Dendrograma UPGMA bazată pe distanțele genetice Nei între subpopulații

(C. betulus - CB; C. orientalis - CO.)

Figure 4.18 UPGMA dendrogram based on genetic distances Nei between supbopulations

(C. betulus - CB; C. orientalis - CO)

Testul Mantel nu a relevat o corelație între matricea distanțelor genetice și cea a distanțelor

geografice pentru carpen (R2 = 0,0062; p = 0,52). Aceasta indică faptul că izolarea prin distanță

nu este suficientă pentru a explica structura genetică prezentă. Pentru cărpiniță testul Mantel a

relevat de asemenea o corelație nesemnificativă (R2 = 0,995; p = 0,21).

În urma evaluării structurilor genetice a celor două specii cu markeri nucleari, respectiv

cloroplastici, s-au putut observa structuri diferite. De exemplu, populația de cărpiniță de la Roșcani

a prezentat o structură genetică cloroplastică diferită față de restul populațiilor luate în studiu.

Acest rezultat pare în contradicție cu cel al analizei ADN-ului nuclear, care a arătat că această

populație prezintă o structură genetică mai apropiată de populațiile Murfatlar și Cândești.



59

Capitolul V. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. DISEMINAREA

REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE

5.1 Concluzii Finale

5.1.1 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici nucleari

Concluzii rezultate din stabilirea protocolului de interpretare a

electroforegramelor pentru specia octoploidă C. betulus

Pentru reducerea erorilor de citire, la speciile poliploide, cum este și carpenul, se

recomandă ca lecturarea și interpretarea electroforegramelor să se facă manual.

O particularitate în construirea bazei de date la speciile poliploide este de-a

considera microsateliții markeri dominanți, spre deosebire de speciile diploide, la care sunt

considerați markeri codominanți.

Diversitatea genetică a carpenului

Numărul de alele pe populații a variat de la 11 până la 25, întregistrând o medie de

aproximativ 23 de alele/populație. Corelarea acestui număr de alele identificate cu starea de

octoploidie a speciei, putem aprecia că polimorfismul carpenului pentru markerii analizați este

moderat.

Populațiile de carpen din sud-vestul României (Leamna și Baia de Aramă) prezintă

un nivel ușor mai ridicat de diversitate genetică (He mai mare cu 2,8% față de media generală a

eșantionului cercetat), dar și cel mai mare număr de alele private. Totuși, nu se conturează un

model de diversitate genetică gradientală, deoarece următoarea populație ca valoare He superioară

mediei generale se află în nord-estul țării (populația Roșcani).

Atât indicele GST cât și testul AMOVA relevă o diferențiere scăzută între populații

și o diversitate ridicată în interiorul acestora. Fluxul de gene ar fi una din cauzele acestui rezultat,

deoarece este determinat în mare parte de evoluțiile istorice ale speciilor, care sunt condiționate în

modelarea structurii populațiilor.

În patru din cele opt populații analizate din perspectiva existenței structurilor

genetice spațiale au rezultat corelații pozitive semnificative, reduse, pentru prima clasă de distanțe.

Conturarea unor structuri familiale la acest nivel ar putea avea diverse cauze (biologia reproducerii



60

speciei, densitatea populației și respectiv a arboretelor etc.), pentru care însă nu s-au făcut evaluări

prin cercetările de față.

Analiza bayesiană a permis identificarea unor diferențe evidente între clusterele

generate de program (STRUCTURE). Populațiile din sud-vestul României prezintă o structură

genetică mai asemănătoare, comparativ cu restul populațiilor luate în studiu.

Analiza cluster a surprins o grupare a populațiilor analizate în două grupuri

omogene din punct de vedere genetic. Această structură genetică poate fi determintă de evoluțiile

istorice ale speciei.

Diversitatea genetică a cărpiniței

Din cele 18 alele recenzate, 16 sunt comune celor șase populații. Markerul Cb_33

prezintă cel mai mare număr de alele identificate (7 alele).

Diversitatea genetică este relativ ridicată, însă cu diferențe nesemnificative între

populații din punct de vedere statistic, ceea ce sugerează păstrarea intactă a informaţiei genetice

între generaţii.

Indicele de fixare variază de la exces la deficit de heterozigoţi, indicând faptul că

selecţia, dar și panmixia a acţionat diferit în cazul populațiilor.

La nivel intrapopulațional, structura genetică spațială (SGS) a înregistrat o valoare

pozitivă până la distanța de 25 m în populația Cândești și o valoare negativă în populația Baia de

Aramă, având o intensitate redusă dar semnificativă din punct de vedere statistic.

Modelele multilocus rezultate prin analiza bayesiană, indică pe de o parte o

diferențiere structurală slabă (singura populație cu o structură genetică diferită față de restul

populațiilor, este populația Leamna), iar pe de altă parte o grupare discretă a populațiilor în funcție

de poziția lor geografică. Acest rezultat este confirmat și de analiză cluster.

Valorile indicelui de diferențiere genetică (FST) și analiza varianței moleculare

(AMOVA) a arătat că cel mai mare procent de variație genetică există, ca și la carpen, în interiorul

populațiilor, în condițiile în care diferențirea genetică între populațiile de cărpiniță a fost

semnificativă (PhiST = 0,047; p <0,0001).

Rezultatele noastre sugerează că doar populația Leamna ar fi trecut recent printr-un

,,gât de sticlă” dar nu este exclus ca în populațiile cu un număr mic de exemplare sau cele izolate,

în viitorul apropiat, să se înregistreze un dezechilibru genetic.



61

5.1.2 Concluzii rezultate din analiza markerilor genetici cloroplastici

Prin analizele de ADN cloroplastic s-au identificat patru haplotipuri specifice,

dintre care două sunt întâlnite în populațiile de carpen, respectiv două în populațiile de cărpiniță

(cel mai frecvent haplotip la carpen este H1, iar la cărpiniță H3).

O structură haplotipică particulară s-a observat în populația de cărpiniță Roșcani,

populație care trebuie inclusă în categoria resurselor genetice ale acestei specii.

Haplotipurile cloroplastice identificate pe teritoriul României provin, cel mai

probabil, din refugiile glaciare balcanice, aspect susținut de distribuția spațială a haplotipurilor și

de structura genetică relativ asemănătoare cu haplotipurile identificate în alte studii. Absența

datelor din regiunile de est din arealul cărpiniței este o limitare particulară în ceea ce privește

originea haplotipului 4.

Diversitatea genetică totală a haplotipurilor a fost mai mare pentru C. orientalis, în

comparație cu C. betulus, deși diferențele rămân nesemnificative din punct de vedere statistic.

Diferențierea genetică a fost semnificativ mai mare în populațiile de cărpiniță (GST

= 1,00) comparativ cu populațiile de carpen (GST = 0,422).

Prin creionarea relațiilor filogenetice s-a putut observa o separare clară între cei doi

taxoni, precum și o dispunere spațială a structurilor genetice haplotipice.

În urma evaluării nivelului de variație a ADN-ului cloroplastic s-a constatat că

există diferențe semnificative a structuriilor genetice a celor două specii înrudite, considerate

izolate reproductiv, fapt dovedit de lipsa haplotipurilor comune, cu toate că arealul lor se

suprapune.

5.2 Contribuții originale

Prezentul studiu aduce informaţii noi atât pe plan naţional cât şi internaţional,

privind diversitatea genetică și structura populațiilor celor două specii din genul Carpinus, prin

prisma analizării pentru prima dată a microsateliților nucleari.

Este pentru prima dată când, în România, s-au efectuat astfel de evaluări genetice

la o specie poliploidă (carpen), în condițiile în care astfel de studii sunt extrem de puține și la nivel

internațional.

S-a testat pentru prima dată funcționarea unui set de markeri SSRs pe un număr

mare de exemplare eșantionate în populațiile de carpen, și, de asemenea s-a testat funcționarea și

transferabilitatea markerilor respectivi la cărpiniță.



62

În premieră, s-au realizat cercetări referitoare la structura genetică spaţială în

arborete de carpen și cărpiniță, oferind date preliminare pentru studii viitoare care să cuantifice

factorii favorizanți în generarea unor structuri familiale.

S-a derulat primul studiu la nivelul ADN-ului cloroplastic cu markeri SSRs la

cărpiniță, în România, în urma căruia au fost identificate două haplotipuri, între care cel particular

din populația Roșcani.

5.3 Diseminarea rezultatelor

Lucrări ISI:

➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. POSTOLACHE, D. CIOCÎRLAN, E. ȘOFLETEA, N.

2017: Evidence of low chloroplast genetic diversity in two Carpinus species in the northern

Balkans. (lucrare trimisă spre publicare la revista ,,Notulae Botanicae Horti Agrobotanici

Cluj-Napoca”).

Lucrări BDI:

➢ CĂRĂBUŞ, M.C. și ŞOFLETEA, N. 2014: Carpenul (Carpinus betulus L.) și cărpinița

(C. orientalis Mill.): aspecte relevante privind originea, evoluția, fitocenologia și genetica

speciilor. Revista de silvicultură și cinegetică, nr. 35: 28-33.

➢ CĂRĂBUȘ, M.C. LEINEMANN, L. CURTU, A.L. și ȘOFLETEA, N. 2015: Preliminary

results on the genetic diversity of Carpinus betulus in Carpathian populations. Bulletin of

the Transilvania University of Brasov. Forestry, Wood Industry, Agricultural Food

Engineering. Series II, 8(2), 1.

➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. ŞOFLETEA, N. 2016: Testarea funcționării primerilor

nucleari SSR la carpen (Carpinus betulus L.) și cărpiniță (C. orientalis Mill.). Evaluări ale

diversității genetice în fitocenoze de coexistență a celor două specii. Revista de silvicultură

și cinegetică, nr. 38: 15-20.

Lucrări prezentate în cadrul unor conferințe/manifestări științifice

➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. FINKELDEY, R. LEINEMAN, L. ŞOFLETEA, N.

Nuclear and chloroplast microsatellite genetic structure in Romanian population of

Carpinus spp. Forest and Sustainable Developement, Brașov, România 24-25 Octombrie

2014.



63

➢ CĂRĂBUȘ, M.C. CURTU, A.L. ŞOFLETEA, N. Assessment of genetic diversity in two

mixed community of Carpinus betulus and C. orientalis. Forest and Sustainable

Developement, Brașov, România 7-8 Octombrie 2016.

5.4 Direcții viitoare de cercetare

Pentru a spori nivelul de cunoștințe despre diversitatea și structura genetică a speciilor de

Carpinus, care au fost puțin cercetate până în prezent, ar fi utilă o analiză suplimentară folosind

markeri moleculari dominanți, pentru a avea o putere de rezoluție mai bună, cu privire la analiza

comparativă a celor două specii cu niveluri diferite de poliploidie.

Un punct de plecare, în ceea ce privesc analizele ADN-ului cloroplastic, ar putea fi

continuarea cercetărilor privind diversitatea haplotipurilor în partea de sud-est, dar și în vestul și

nordul României, precum și analiza populațiilor marginale/izolate sau periferice din țară, în scopul

stabilirii rutelor de migrație postglaciară.

De asemenea, un alt punct de plecare ar fi recoltarea probelor de cărpiniță din afara

arealului din România, pentru a vedea dacă se mai găsește haplotipul 4 identificat în partea de vest

sau de est a Europei.



64

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Abbe, E.C., 1935: Studies in the phylogeny of the Betulaceae. Floral and inflorescence anatomy. Botanical Gazette

97: 1–67.

Andreakis, N., Kooistra, W.H.C.F., Procaccini, G., 2009: High genetic diversity and connectivity in the polyploid

invasive seaweed Asparagopsis taxiformis (Bonnemaisoniales) in the Mediterranean, explored with

microsatellite alleles and multilocus genotypes. Mol Ecol 18:212–226. doi:10.1111/j.1365-

294X.2008.04022.x.

Ashley, M.V., Wilk, J.A., Styan, S.M.N., Craft, K.J., Jones, K.L., Feldheim, K.A., Lewers, K.S., Ashman, T.L., 2003:

High variability and disomic segregation of microsatellites in the octoploid Fragaria virginiana Mill.

(Rosaceae). Theor Appl Genet 107:1201–1207.

Bai, F.Y., 2014: Association of genotypes with infection types and antifungal susceptibilities in Candida albicans as

revealed by recent molecular typing strategies.Mycology, 5(1), 1-9.

Bandelt, H-J., Forster P., Röhl, A., 1999: Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Mol Biol

Evol 16:37-48.

Barbara, T., Palma-Silva, C., Paggi, G.M., Bered, F., Fay M.F., Lexer, C., 2007: Cross-species transfer of nuclear

microsatellite markers: Potential and limitations. Molecular Ecology 16:3759 – 3767.

Bassil, N., Boccacci, P., Botta, R., Postman, J., Mehlenbacher, S., 2013: Nuclear and chloroplast microsatellite

markers to assess genetic diversity and evolution in hazelnut species, hybrids and cultivars. Genet Resour

Crop Evo. 60:543–568.

Bănărescu, P., și Boşcaiu, N., 1973: Biogeografie. Perspectivă genetică şi istorică. Ed. Ştiinţifică, Bucureşti.

Bergmeier, E., și Dimopoulos, P., 2008: Identifying plant communities of thermophilous deciduous forest in Greece:

species composition, distribution, ecology and syntaxonomy. Plant Biosystems, 142(2), 228-254.

Bhagwat, S.A., și Willis, K.J., 2008: Species persistence in northerly glacial refugia of Europe: a matter of chance or

biogeographical traits?Journal of Biogeography, 35(3), 464-482.

Bialozyt, R., Ziegenhagen, B., Petit, R.J., 2006: Contrasting effects of long distance seed dispersal on genetic diversity

during range expansion. Journal of evolutionary biology, 19(1), 12-20.

Bozilova, E., 1975: Correlation of the vegetational development and climatic changes in the Rila and Pirin Mountains

during the Late Glacial and Post-Glacial time compared to the other areas. In: Problems of Balkan Flora and

Vegetation, Bulg. Acad. Sci. Sofia, 61-71.

Bozilova, E., Tonkov, S., 1985:Palaeoecological studies in Lake Durankulak.Ann Univ Sofia Fac Biol(Bot)76:25-30

Bozilova, E., Atanassova, J., 1989: Palaeoecological conditions and vegetation history in the area of Lake

Durankulak. In: Todorova H (ed) Durankulak 1. Bulg Acad Sci, Sofia, pp 197-202 (in Bulgarian).

Bozilova, E., 1996: Palaeoecological Events During the Last 15000 Years. Bulgaria. In: Berglund BE et al. (eds)

Wiley, Chichester, pp 701-715, 719-721, 726-728.

Čarni, A., Košir, P., Karadžić, B., Matevski, V., Redžić, S., Škvorc, Ž., 2009: Thermophilous deciduous forests in

Southeastern Europe. Plant Biosystems 143(1), 1-13.

Cărăbuș, M.C., Leinemann, L., Curtu, A.L., Șofletea, N., 2015: Preliminary results on the genetic diversity of

Carpinus betulus in carpathian populations. Bulletin of the Transilvania University of Brasov. Forestry, Wood

Industry, Agricultural Food Engineering. Series II, 8(2), p.1.

Cărăbuș, M.C., Curtu, A.L., Şofletea, N., 2016: Testarea funcționării primerilor nucleari SSR la carpen (Carpinus

betulus L.) și cărpiniță (C. orientalis Mill.). Evaluări ale diversității genetice în fiotocenoze de coexistență a

celor două specii. Revista de silvicultură și cinegetică, nr. 38.

Chapuis, M.P., și Estoup, A., 2007: Microsatellite null alleles and estimation of population differentiation. Molecular

Biology and Evolution 24: 621–631.

Chen, Z-D., 1994: Phylogeny and phytogeography of the Betulaceae. Acta Phytotaxonomica Sinica 32: 1–32, 101–

153 (in Chinese with English summary).

Chifu, T., Mânzu, C., Zamfirescu, O., 2006: Flora şi vegetaţia Moldovei. Univ.„Al. I. Cuza” Iaşi. Pp – 42.

Chifu, T., Irimia, I., 2014: Diversitatea fitosociologica a vegetației României. vol. 3 - Vegetația pădurilor și tufișurilor.

Ed. Institutul European. Iași.

Ciocîrlan, E., 2014: Structura genetică în populații marginale de fag (Fagus sylvatica L.) din România – evaluări cu

markeri moleculari. Teză. Universitatea Transilvania din Brașov.

Ciofi, C., Milinkovitch, M.C., Gibbs, J.P., Caccone, A., Powell, J.R., 2002: Microsatellite analysis of genetic

divergence among populations of giant Galápagos tortoises. Molecular Ecology, 11, 2265–2283.



65

Clark, L.V., Jasieniuk, M., 2011: Polysat: an R package for poly ploid microsatellite analysis. Molecular Ecology

Resources, 11, 562 566.

Clark, L.V., Schreier, A.D., 2015: Resolving microsatellite genotype ambiguity in populations of allopolyploid and

diploidized autopolyploid organisms using negative correlations between alleles. bioRxiv, 020610.

Coart, E., Van Glabeke, S., Petit, R.J., Van Bockstaele, E., Roldan-Ruiz, I., 2005: Range wide versus local patterns

of genetic diversity in hornbeam (Carpinus betulus L.). Conservation Genetics, 6(2), pp.259-273.

Coldea, G., Indreica, A., Oprea, A., 2015: Les associations végétales de Roumanie. Tome 3 – Les associations

forestiéres et arbustives. Ed. Presa Universitară Clujeană. Cluj-Napoca.

Comai, L., 2005: The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature reviews genetics, 6 (11), 836-846.

Cornuet, J.M., și Luikark, G., 1996: Description and power analysis of two tests for detecting recent population

bottlenecks from allele frequency data. Gene 144: 2001–2014.

Crane, P.R., 1989: Early fossil history and evolution of the Betulaceae. In Evolution, systematics, and fossil history

of the Hamamelidae. Vol 2: “Higher” Hamamelidae. Crane PR and Blackmore S eds, Clarenton, Oxford. Pp

87-116.

Crane, P.R., Manchester, S.R., Dilcher, D.L., 1990: A preliminary survey of fossil leaves and well-preserved

reproductive structures from the Sentinel Butte Formation (Paleocene) near Almont, North Dakota. Fieldiana

Geology, New Series, no. 20: 1–63.

Crane, P.R., 1998: The phylogenetic position and fossil history of the Magnoliaceae. In: D. Hunt (ed.) Magnolias and

their allies, pp. 21-36. Milborne Port, David Hunt.

Cronquist, A., 1981: An integrated system of classification of flowering plants. Columbia University Press, New York.

Curtu, A. L., Craciunesc, I., Enescu, C. M., Vidalis, A., Sofletea, N., 2015: Fine-scale spatial genetic structure in a

multi-oak-species (Quercus spp.) forest. iForest-Biogeosciences and Forestry, 8(3), 324.

Davies, S., White, A., Lowe, A., 2004: An investigation into effects of long-distance seed dispersal on organelle

population genetic structure and colonization rate: a model analysis. Heredity, 93(6), 566-576.

Degen, B., Caron, H., Bandou, E., Maggia, L., Chevallier, M. H., Leveau, A., Kremer, A., 2001: Fine-scale spatial

genetic structure of eight tropical tree species as analysed by RAPDs. Heredity, 87(4), 497-507.

Demesure, B., 1996: Analyse de la diversite chloroplastique en utilisant des fragments-PCR chez des FagacCes:

Fagus sylvatica L. et Qwcus ssp. Ph.D. Thesis, University of Bordeaux I, France.

Diaconeasa, B., Fărcaș, S., 1998b: Contribuția carpenului în structurile silvestre cuaternare din România. Studia

Univ. ,,Babeș-Bolyai,,, ser. Boil. Cluj-Napoca, XLIII (1-2), 11-26.

Doniţă, N., Popescu, A., Paucă-Comănescu, M., Mihăilescu, S., Biriş, I.A., 2005: Habitatele din România (Vol. 1).

Ed. Tehnică Silvică.

Doyle, J.J., și Doyle, J.L., 1987: A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.

Phytochemical Bulletin, 19, p: 11-15.

Dufresne, F., Stift, M., Vergilino, R. și Mable, B.K., 2014: Recent progress and challenges in population genetics of

polyploid organisms: an overview of current state‐of‐the‐art molecular and statistical tools. Molecular

ecology,23(1), pp.40-69.

Duminil, J. Hardy, O.J. și Petit, R.J. 2009: Plant traits correlated with generation time directly affect inbreeding

depression and mating system and indirectly genetic structure. BMC Evolutionary Biology, 9, 177.

Earl, D.A., și VonHoldt B.M., 2011: STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing

STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources, 4, 359–361.

Ebert, D., și Peakall, R., 2009: Chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs): technical resources and

recommendations for expanding cpSSR discovery and applications to a wide array of plant species. Molecular

Ecology Resources. 9: 673-690.

Eliades, N.G., și Eliades, D.G., 2009: Haplotype analysis: software for analysis of haplotypes data. Distributed by

the authors. Forest Genetics and Forest Tree Breeding, Georg-Augst University Goettingen, Germany.

Esselink, G.D., Nybom, H., Vosman, B., 2004: Assignment of allelic configuration in polyploids using the MAC-PR

(microsatellite DNA allele counting-peak ratios) method.Theoretical and Applied Genetics,109(2),pp.402-408

Evanno, G., Regnaut, S., Goudet, J., 2005: Detecting the number of clusters of individuals using the software

STRUCTURE: a simulation study. Molecular ecology, 14, 2611–2620.

Excoffier L., Smouse P.E., Quattro J.M., 1992: Analysis of molecular variance inferred from metric distances among

DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction sites. In: Genetics, vol. 131, pp. 479–

491.



66

Excoffier, L., și Lischer, H.E. L., 2010: Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population

genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources. 10: 564-567.

Falush, D., Stephens, M., Pritchard, J.K., 2007: Inference of population structure using multilocus genotype data:

dominant markers and null allele. Molecular Ecology Notes, 7, 574– 578.

Falque, M., Keurentjes, J., Bakx-Schotman, J.M.T., van Dijk, P.J., 1998: Development and characterization of

microsatellite markers in the sexual-apomictic complex Taraxacum officinale (dandelion). Theor Appl Genet

97:283–292.

Farias, I.P., Santos, W.G., Gordo, M., Hrbek, T., 2015: Effects of Forest Fragmentation on Genetic Diversity of the

Critically Endangered Primate, the Pied Tamarin (Saguinus bicolor): Implications for Conservation. Journal

of Heredity, 106(S1), 512-521.

Fărcaș, S., Tanțău, I., 1999: L’analyse palynologique du profil tourbeaux ,,Între afini’’ (Monts Călimani). Acta

Paleont. Rom., 2, 157-162.

Fărcaș, S., Popescu, F., Tantau, I., 2006: Spatial and temporal distribution of pedunculate oak, common ash and

hornbeam during late glacial and postglacial period in Romania. Ed. Presa Universitara Clujeana (in

Romanian).

Fărcaş, S., Tanţău, I., Mîndrescu, M., Hurdu, B., 2013: Holocene vegetation history in the Maramureş mountains

(Northern Romanian Carpathians). Quaternary International, 293, 92-104.

Feurdean, A., Willis, K.J., Parr, C.L., Tanţău, I., Fărcaş, S., 2010: Postglacial patterns in vegetation dynamics in

Romania: homogenization or differentiation? Journal of Biogeography, 37(11), 2197-2208.

Fineschi, S., Taurchini, D., Villani, F., Vendramin, G.G., 2000: Chloroplast DNA polymorphism reveals little

geographical structure in Castanea sativa Mill.(Fagaceae) throughout southern European countries.

Molecular Ecology, 9(10), 1495-1503.

Flores-Rentería, L., și Krohn, A., 2013: Scoring Microsatellite Loci. Microsatellites: Methods and Protocols,319-336.

Fonger, P., și Pütz, N., 2002: Take-off in anemochorus dispersal units of Carpinus betulus and Clematis vitalba:

Observation in wind tunnel experiments and measurement of the basic force. Botanische Jahrbücher, 124(1),

105-114.

Furlow, J.J., 1990: The genera of Betulaceae in the southeastern United States. Journal of the Arnold Arboretum 71:

1–67.

Gailing, O., Finkeldey, R., 2016: Genetic diversity and structure of teak (Tectona grandis L. f.) and dahat (Tectona

hamiltoniana Wall.) based on chloroplast microsatellites and Amplified Fragment Length Polymorphism

markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 63(6), 961-974.

Gaut, B.S., și Long, A.D., 2003: The lowdown on linkage disequilibrium. Plant Cell 15: 1502–1506.

Graffelman, J., și Weir, B.S., 2016: Testing for Hardy–Weinberg equilibrium at biallelic genetic markers on the X

chromosome. Heredity, 116(6), pp.558-568.

Grimm, G.W., și Renner, S.S., 2013: Harvesting GenBank for a Betulaceae supermatrix, and a new chronogram for

the family. Botanical Journal of the Linnean Society 172: 465-477.

Grivet, D., 2002: Phylogéographie et évolution moléculaire comparée d'arbres forestiers à l'aide des marqueurs

chloroplastiques. (Doctoral dissertation, Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et

techniques).

Grivet, D., și Petit, R., 2003: Chloroplast DNA phylogeography of the hornbeam in Europe: Evidence for a bottleneck

at the outset of postglacial colonization. Conservation Genetics, 4, 47-53.

Gürcan, K., și Mehlenbacher, S.A., 2010: Transferability of microsatellite markers in the Betulaceae. Journal of the

American Society for Horticultural Science 135 : 159 – 173.

Gürcan, K., Mehlenbacher, S.A., Botta, R., Boccacci, P., 2010: Development, characterization, segregation, and

mapping of microsatellite markers for European hazelnut (Corylus avellana L.) from enriched genomic

libraries and usefulness in genetic diversity studies. Tree Genet Genomes 6:513–531.

Hall, J.W., 1952: The comparative anatomy and phylogeny of the Betulaceae. Botanical Gazette 113: 235–270.

Hammer, Ø., Harperm, D.A.T., Ryan, P.D., 2001: PAST: Paleontological Statistics Software Package for education

and data analysis. Palaeontolia Electronica 4: 1-9.

Hamrick, J.L., 2004: Response of forest trees to global environmental changes. Forest ecology and

management, 197(1), pp.323-335.

Haralamb, A.T., 1963: Cultura speciilor forestiere. Editura Agro-Silvică București. 257-275.

Hardy, O.J., și Vekemans, X., 2002: SPAGeDi: a versatile computer program to analyse spatial genetic structure at

the individual or population levels. Molecular Ecology Notes 2: 618-620.



67

Hartl, D.L., și Clark, A.G., 1997: Principles of Population Genetics. Vol. 116. Sinauer Associates, Sunderland.

Heath, F.G., 2012: Tree Lore. David & Charles. Pp. 65.

Heuertz, M., Carnevale, S., Fineschi, S., Sebastiani, F., Hausman, J.F., Paule, L., Vendramin, G.G., 2006: Chloroplast

DNA phylogeography of European ashes, Fraxinus sp. (Oleaceae): roles of hybridization and life history traits.

Molecular Ecology, 15(8), 2131-2140.

Hewitt, G.M., 1996: Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biol. J. Linn.

Soc. 58, 247–276.

Heywood, V.H., 1993: Flowering plants of the world. B. T. Batsford, London.

Hickey, L.J., Wolf, J.A., 1975: The bases of angiosperm phylogeny: vegetative morphology. Annals of Missouri

Botanical Garden 62: 538-589.

Jentys-Szaferowa, J., 1958: The Genus Carpinus in Europe in the paleobotanical literature. Monographiae Botanicae

7:3–59.

Keller, L.F., și Waller, D.M., 2002: Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution, 17(5),

230-241.

Komar, M., Łanczont, M., Madeyska, T., 2009: Spatial vegetation patterns based on palynological records in the

loess area between the Dnieper and Odra Rivers during the last interglacial–glacial cycle. Quaternary

International, 198(1), 152-172.

Kramer, K., Geburek, T., Jansen, S., 2016: Does the Transfer of Forest Reproductive Material Significantly Affect

Local Tree Diversity?. EU.

Lachashvili, N.J., Eradze, N.V., Khetsuriani, L.D., 2016: Conspectus of trees and shrubs of Tbilisi environs (East

Georgia, South Caucasus). Annals of Agrarian Science.

Leitch, A.R., Leitch, I.J., 2008: Genomic plasticity and the diversity of polyploid plants. Science, 320(5875),481-483.

Li, G., Hubert, S., Bucklin, K., Ribes, V., Hedgecock, D., 2003: Characterization of 79 microsatellite DNA markers

in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Molecular Ecology Notes, 3(2), pp.228-232.

Linnaeus, C., 1737: Genera plantarum. Leiden.

Lloyd, S.S., Steele, E.J., Dawkins, R.L., 2015: Analysis of Haplotype Sequences.

Luikart, G., Allendorf, F., Cornuet J-M., Sherwin, W., 1998: Distortion of allele frequency distributions provides a

test for recent population bottlenecks. Journal Heredity, 89, 238-247.

Mackay, I., și Powell, W., 2007: Methods for linkage disequilibrium mapping in crops. Trends in plant science, 12(2),

pp.57-63.

Magri, D., 2010: Persistence of tree taxa in Europe and Quaternary climate changes. Quaternary International,

219(1), 145-151.

Magyari, E., 2002: Holocene biogeography of Fagus sylvatica L. and Carpinus betulus L. in the Carpathian-Alpine

Region. Folia Historico-Naturalia Musei Matraensis, 26(1): 15-35.

Mantel, N.A., 1967: The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Res., 27,

209–220.

Mauric, N., 2000: Carpinus betulus [archive]. Jardin! L'Encyclopédie, Société des gens de lettres

(http://nature.jardin.free.fr/arbre/ft_carpinus_be.html).

McIntyre, P.J., 2007: Polyploidy and species responses to climate change: Using ecological niche models to explore

predicted range shifts in polyploid and diploid members of the Claytonia perfoliata (Portulacaceae) complex.

COS 102-3.

McIntyre, P.J. 2012: Polyploidy associated with altered and broader ecological niches in the Claytonia perfoliata

(Portulacaceae) species complex. American Journal of Botany, 99(4), pp.655-662.

Meffe, G.K., și Carroll, C.R., 1997: Principles of conservation biology. 2nd edition. Sinauer Associates, Sunderland,

Massachusetts.

Mingeot, D., Husson, C., Mertens, P., Watillon, B., Bertin, P., Druart, P., 2016: Genetic diversity and genetic structure

of black alder (Alnus glutinosa [L.] Gaertn) in the Belgium-Luxembourg-France cross-border area. Tree

Genetics and Genomes, 12(2), 1-12.

Mitka, J., Bąba, W., Szczepanek, K., 2014: Putative forest glacial refugia in the Western and Eastern Carpathians.

Modern Phytomorphology, 5, 85-92.

Moldovan, I.C., Sofletea, N., Curtu, A.L., Abrudan, I.V., Postolache, D., Popescu, F., 2010:Chloroplast DNA diversity

of oak species in Eastern Romania. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 38(3), 301-307.

Muir, G., Schlötterer, C., 2005: Evidence for shared ancestral polymorphism rather than recurrent gene flow at

microsatellite loci differentiating two hybridizing oaks (Quercus spp.). Molecular Ecology 14: 549–561.



68

Muller, J., 1981: Fossil pollen records of extant angiosperms. Botanical Review, 47: 1-142.

Narayan, L., Dodd, R.S., O’Hara, K.L., 2015: A genotyping protocol for multiple tissue types from the polyploid tree

species Sequoia sempervirens (Cupressaceae). Applications in plant sciences, 3(3).

Nei, M., Maruyama, T., Chakraborty, R., 1975: The bottleneck effect and genetic variability in populations. Evolution,

1-10.

Nelson, J.C., și Deam, C.C., 1919: Deam's Trees of Indiana. 188-191.

Newton, A.C., Allnutt, T.R., Gillies, A.C.M., Lowe, A.J., Ennos, R.A., 1999: Molecular phylogeography, intraspecific

variation and the conservation of tree species. Trends in Ecology & Evolution, 14(4), 140-145.

Ortiz-Ramírez, M.F., Andersen, M.J., Zaldívar-Riverón, A., Ornelas, J.F., Navarro-Sigüenza, A.G., 2016: Geographic

isolation drives divergence of uncorrelated genetic and song variation in the Ruddy-capped Nightingale-

Thrush (Catharus frantzii; Aves: Turdidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 94 (Part A):74-86.

Palmé, A.E., 2002: Chloroplast DNA variation, postglacial recolonization and hybridization in hazel, Corylus

avellana. Molecular ecology, 11(9), 1769-1779.

Palmé, A., 2003: Evolutionary history and chloroplast DNA variation in three plant genera: Betula, Corylus and

Salix.: The impact of post-glacial colonisation and hybridisation. Acta Universitatis Upsaliensis.

Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology 795, 59 pp.

Uppsala. ISBN 91-554-5509-3.

Palop-Esteban, M., Segarra-Moragues, J.G., González-Candelas, F., 2011: Polyploid origin, genetic diversity and

population structure in the tetraploid sea lavender Limonium narbonense Miller (Plumbaginaceae) from

eastern Spain. Genetica, 139(10), 1309-1322.

Papageorgiou, A.C., Tsiripidis, I., Mouratidis, T., Hatziskakis, S., Gailing, O., Eliades, Nicolas-George H., Vidalis,

A., Drouzas, A.D., Finkeldey, R., 2014: Complex fine-scale phylogeographic patterns in a putative refugial

region of Fagus sylvatica L. (Fagaceae).Botanical Journal of the Linean SocietyVolume 174, Issue 4,516-528

Paridari, I.C., Jalali, S.G., Sonboli, A., Zarafshar, M., Bruschi, P., 2013: Leaf macro-and micro-morphological

altitudinal variability of Carpinus betulus in the Hyrcanian forest (Iran). Journal of Forestry Research, 24(2),

301-307.

Peakall R., Ruibal M., Lindenmayer D.B., 2003: Spatial autocorrelation analysis offers new insights into gene flow

in the Australian bush rat, Rattus fuscipes. Evolution 57, 1182–1195.

Peakall, P.E., Smouse, R.. 2012: GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching

and research—an update. Bioinformatics, 28, 2537-2539.

Peery, M.Z., Kirby, R., Reid, B.N., Stoelting, R., Doucet-Bëer, E., Robinson, S., Vásquez-Carrillo, C., Pauli, J.N.,

Palsbøll, P.J., 2012: Reliability of genetic bottleneck tests for detecting recent population declines. Molecular

Ecology 21: 3403–3418.

Pembleton, L.W., Cogan, N.O., Forster, J.W., 2013: STAMPP: an R package for calculation of genetic differentiation

and struc ture of mixed ploidy level populations. Molecular Ecology Resources, 13, 946 952.

Petit, R.J., 1999: Diversité génétique et histoire des populations d’arbres forestiers. Dossier d’habilitation à diriger

des recherches, Université de Paris-Sud, Université formation de recherche Scientifique d’Orsay, Paris.

Petit, J.P., Csail, U.M., Bordács, S., Burg, K., Coart, E., Cottrell, J., Van Dam, B., Deans, J.D., Dumolin-Lapègue, S.,

Fineshi, S., Finkeldey, R., Gillies, A., Glaz, I., Goicoechea, P.G., Jensen, J.S., König, K., Lowe, A.J., Madsen,

S.F., Mátyás, G., Munro, R.C., Olalde, M., Pemonge, M-H., Popescu, F., Slade, D., Tabbener, H., Taurchini,

D., de Vries, S.G.M., Ziegenhagen, B., Kremer, A., 2002a: Chloroplast DNA variation in European white

oaks: Phylogeography and patterns of diversity based on data from over 2600 populations. Forest Ecology

and Management,156.

Petit, R.J., Aguinagalde, I., de Beaulieu, J.L., Bittkau, C., Brewer, S., Cheddadi, R., ... & Mohanty, A., 2003: Glacial

refugia: hotspots but not melting pots of genetic diversity. Science, 300(5625), 1563-1565.

Petit, R.J., Duminil, J., Fineschi, S., Hampe, A., Salvini, D., Vendramin, G.G., 2005: Comparative organization of

chloroplast, mitochondrial and nuclear diversity in plant populations. Mol Ecol 14:689–701.

Petre, M., Nicolescu, V.N., Ghirda, B., 2012: Competition and natural mortality in two mixed sessile oak (Quercus

petraea (Matt.) Liebl.) dominated stands. Spanish journal of rural development, Vol. 3, Nº. 4: 41-50.

Petrova, A., 2006: Mediterranean chromosome number reports 16 (1584--1603). Fl. Medit. 16: 431–435.

Pfeiffer, T., Roschanski, A.M., Pannell, J.R., Korbecka, G., Schnittler, M., 2011: Characterization of microsatellite

loci and reliable genotyping in a polyploid plant, Mercurialis perennis (Euphorbiaceae).J.Hered.102:479-488.

Piry, S., Luikart, G., Cornuet, J-M., 1999: BOTTLENECK: a computer program for detecting recent reductions in the

effective population size using allele frequency data. Journal of Heredity, 90, 502–503.

http://dialnet.unirioja.es/servlet/revista?codigo=13425

http://dialnet.unirioja.es/servlet/ejemplar?codigo=325799



69

Pliura, A.L.F.A.S., Rungis, D.A.I.N.I.S., Baliuckas, V., 2009: Population structure of pedunculate oak (Quercus

robur L.) in Lithuania based on analysis of chloroplast DNA haplotypes and adaptive traits. Baltic Forestry,

15(1), 2-12.

Pluess, A.R., Frank, A., Heiri, C., Lalagüe, H., Vendramin, G.G., Oddou‐Muratorio, S., 2016: Genome–environment

association study suggests local adaptation to climate at the regional scale in Fagus sylvatica. New

Phytologist.

Pons, O., și Petit. R.J., 1995. Estimation, variance and optimal sampling of gene diversity. 1. Haploid locus.

Theoretical and Applied Genetics 90: 462–470.

Pons, O., și Petit R.J., 1996: Measuring and testing genetic differentiation with ordered versus unordered alleles.

Genetics 144: 1237-1245.

Pop, E., 1932: Contribuții la istoria pădurilor din Nordul Transilvaniei. Bul. Grăd. Bot. Muz. Bot. Univ. Cluj, XII

(1-2), 29-102.

Pott, R., 1997: Invasion of beech and e stablishment of beech forests in Europe. Annali di Botanica, 55: 27-58.

Premoli, A.C., Souto, C.P., Allnutt, T.R., Newton, A.C., 2001: Effects of population disjunction on isozyme variation

in the widespread Pilgerodendron uviferum. Heredity, 87(3), 337-343.

Prinz, K., Finkeldey, R. 2015: Characterization and transferability of microsatellite markers developed for Carpinus

betulus (Betulaceae) 1. Applications in plant sciences, 3(10).

Pritchard, J.K.M., Stephens Donnelly, P., 2000: Inference of population structure using multilocus genotype data.

Genetics 155: 945-959.

Pruett, L.C., Winker, K., 2008: The effects of sample size on population genetic diversity estimates in song sparrows

Melospiza melodia. Journal of Avian Biology, 39(2), 252-256.

Purina, L., Matisons, R., Katrevics, J., Jansons, A., 2015: Regeneration and sapling growth of European hornbeam

at its northern limit in Latvia. In Research for Rural Development. International Scientific Conference

Proceedings (Latvia). Latvia University of Agriculture.

Ramsey, J., 2011: Polyploidy and ecological adaptation in wild yarrow. PNAS 108, 7096-7101.

Rehder, A., 1960: Manual of cultivated trees and shrubs hardy in North America exclusive of subtropical and warmer

temperate regions. 2nd ed. Macmillan, New York.

Rousset, F., 2008: Genepop’007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux.

Molecular ecology resources, 8, 103–106.

Samah, S., Pardo, C.V.D.T., Cruz, M.A.S., Valadez-Moctezuma, E., 2016: Genetic diversity, genotype

discrimination, and population structure of Mexican Opuntia sp. determined by SSR markers. Plant Molecular

Biology Reporter, 34(1), pp.146-159.

Sampson, J.F. și Byrne, M. 2012: Genetic diversity and multiple origins of polyploid Atriplex nummularia Lindl.

(Chenopodiaceae). Biol. J. Linn. Soc. 105: 218–230.

San-Miguel-Ayanz, J., de Rigo, D., Caudullo, G., Houston Durrant, T., Mauri, A., 2016: European Atlas of Forest

Tree Species. Publications Office of the European Union, Luxembourg.

Santamour, F.S., 1995: Survival, growth, and fertility of Carpinus hybrids. Hort. Science. vol. 30, 6, pp. 1151-1192.

Savill, P.S., 2013: The silviculture of trees used in British forestry. CABI.

Săvulescu, T., 1952: Flora Republicii Populare Române I. Editura Academiei Republicii Populare Române,

București, 190-195.

Schaal, B.A., Hayworth, D.A., Olsen, K.M., Rauscher, T., Smith, W.A., 1998: Phylogenetic studies in

plants: problems andprospects. Molecular Ecology, 7, 465–474.

Selkoe, K.A., și Toonen, R.J., 2006: Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating

microsatellite markers. Ecology letters, 9(5), 615-629.

Slade, D., Ballian, D., Gracan, J., Papes, D., 2008: The Chloroplast DNA Polymorphisms of White Oaks of Section

Quercus in The Central Balkans. Silvae Genetica, 57(4), 227.

Slatkin, M., 2008: Linkage disequilibrium—understanding the evolutionary past and mapping the medical

future. Nat. Rev. Genet. 9:477-485.

Smouse, P.E., Peakall, R.O.D., Gonzales, E.V.A., 2008: A heterogeneity test for finescale genetic structure. Molecular

Ecology 17: 3389-3400.

Sun, Y.L., Wang, D., Lee, H.B., Park, W.G., Kwon, O.W., Hong, S.K., 2011: Phylogeny of Korean Hornbeam

(Carpinus turczaninowii) based on nuclear ribosomal ITS sequence. African Journal of Biotechnology Vol.

10(76), pp. 17435-17442.

Şofletea, N., Curtu, L., 2007: Dendrologie. Editura Universităţii Transilvania, Braşov, p. 182-187.



70

Şulea, C., Oroian, I., Covrig, I., Ioan, T.Ă.U.T., Burduhos, P., 2013: Assessing the importance of biotic factors in tree

development. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca.

Agriculture, 70(2), 317-320.

Teixeira, H., Rodríguez-Echeverría, S., Nabais, C., 2014: Genetic diversity and differentiation of Juniperus thurifera

in Spain and Morocco as determined by SSR. PloS one, 9(2), e88996.

Thomson, A.M., Dick, C.W., Pascoini, A.L., Dayanandan, S., 2015: Despite introgressive hybridization, North

American birches (Betula spp.) maintain strong differentiation at nuclear microsatellite loci. Tree Genetics &

Genomes, 11(5), pp.1-12.

Thorne, R.F., 1973: The ‘‘Amentiferae’’ or Hamamelidae as an artificial group: a summary statement. Brittonia

25:395–405.

Toader, A.V., 2010: Evaluarea variației genetice a stejarului pedunculat (Quercus robur L.) și stejarului brumăriu

(Quercus pedunculiflora K. Koch.) din România cu ajutorul markerilor izoenzimatici și a ADN-ului

cloroplastic. Teză. Universitatea Transilvania Brașov.

Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges, N.A., Valentine, D.H., Walters, S.M., Webb, D.A., 1993: Flora Europea. Vol.

1. 2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge, U.K.

Tzedakis, P.C., 1994: Vegetation change through glacial-interglacial cycles: A long pollen sequence perspective.

Philos. Trans. R. Soc. Lond. B, 345, 103–432.

Van Oosterhout, C., Hutchinson, W.F., Wills, D.P.M., Shipley, P., 2004: MICROCHECKER: software for identifying

and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, 4, 535–538.

Van Oosterhout, C., Weetman, D., Hutchinson, W.F., 2006: Estimation and adjustment of microsatellite null alleles

in nonequilibrium populations. Molecular Ecology Notes, 6(1), 255-256.

Van Puyvelde, K., Van Geert, A., Triest, L., 2010: ATETRA, a new software program to analyse tetraploid

microsatellite data: comparison with TETRA and TETRASAT. Molecular Ecology Resources, 10, 331 334.

Vekemans, X., și Hardy, O.J., 2004: New insights from fine-scale spatial genetic structure analyses in plant

populations. Molecular Ecology 13: 921-935.

Vettori, C., Vendramin, G.G., Anzidei, M., Pastorelli, R., Paffetti, D., Giannini, R., 2004: Geographic distribution of

chloroplast variation in Italian populations of beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical and Applied Genetics,

109(1), 1-9.

Weising, K., Gardner, R.C., 1999: A set of conserved PCR primers for the analysi of simple sequence repeat

polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms. Genome 42: 9–19.

Wigginton, J.E., Cutler, D.J. and Abecasis, G.R., 2005: A note on exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium. The

American Journal of Human Genetics, 76(5), pp.887-893.

Willis, K.J., Sumegi, P., Braun M., Toth, A., 1995: The Late Quaternary history of Batorliget, NE Hungary.

Palaeogeogr, Palaeoclim. Palaeoecol. 118, 25-47.

Willis K.J., 1997: The impact of early agriculture upon the Hungarian landscape. In Landscape in Flux - Central and

Eastern Europe in Antiquity. Oxbow Books, Oxford, 193-207.

Willis, K.J., Sumegi, P., Braun M., Toth, A., 1997: Does soil change causes vegetation change of vice versa? A

temporal perspective from Hungary. Ecology, 78, 740-750.

Willner, W., Di Pietro, R., Bergmeier, E., 2009: Phytogeographical evidence for post‐glacial dispersal limitation of

European beech forest species. Ecography, 32(6), 1011-1018.

Winkler, H., 1904: Betulaceae. In: Engler A ed. Pflanzenreich IV. Lepeig. 61: 1–149.

Wright, S., 1951: The genetical structure of populations. Ann. Eugen. 15: 323–354.

Yeh, F.C., Yang, R.C., Boyle, T.J.B., Ye, Z.H. și Mao., J.X., 1997: POPGENE, the user-friendly shareware for

population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, Univ. Alberta, Edmonton, AB,

Canada. Available online at http://www. ualberta.ca/~fyeh/.

Xu, J., Deng, M., Jiang, X.L., Westwood, M., Gang Song, Y., Turkington R., 2015: Phylogeography of Quercus

glauca (Fagaceae), a dominant tree of East Asian subtropical evergreen forests, based on three chloroplast

DNA interspace sequences Tree Genet. Genomes, 11, pp. 1–17.

Zhu, Z.L., Lin, Q.M., Xu, Y.Y., 2012: Formative arts and landscape application of european hornbeam. In Advanced

Materials Research (Vol. 461, pp. 620-623). Trans Tech Publications.

*** http://ww2.bgbm.org/EuroPlusMed/ [accessed DATE].

*** http://lemn.fordaq.com/news/paduri_suprafata_volum_crestere_44662.html.

http://lemn.fordaq.com/news/paduri_suprafata_volum_crestere_44662.html



71

Rezumat

Distribuția diversității genetice a celor două specii de Carpinus (Carpinus betulus L. şi C.

orientalis Mill.), cu o suprapunere a arealului în România, dar cu cerințe ecologice distincte, a fost

investigată cu ajutorul markerilor genetici ADN de tipul microsateliţilor nucleari (7 la carpen și 5

la cărpiniță) şi cloroplastici (3 markeri).

Prin intermediul SSRn, s-a constatat că, la carpen, populația Leamna din Oltenia a

întregistrat valoarea cea mai ridicată a diversității genetice. Analiza bayesiană și analiza cluster au

permis identificarea unor diferențe evidente între populațiile de carpen din sud-vestul României și

cele din celelalte regiuni. În populațiile de cărpiniță, diversitatea genetică este relativ ridicată (He

= 0,531), iar analiza bayesiană și analiza cluster au surprins o grupare a populațiilor analizate în

trei grupuri omogene.

Analizele la nivelul ADN-ului cloroplastic au reliefat o diversitate foarte scăzută în cele 24

populații, cu doar două haplotipuri specifice pentru fiecare specie. S-a observat, de asemenea, o

structură genetică proprie fiecărei specii, fără a exista haplotipuri comune, ca rezultat că cele două

specii s-au separat cu mult timp în urmă. O structură haplotipică particulară a fost observată într-

o populație izolată de cărpiniță (Roșcani, la nord de Iași), populație care trebuie inclusă în categoria

resurselor genetice ale acestei specii.

Abstract

Distribution of genetic diversity for two Carpinus species (C. betulus and C. orientalis)

with overlapping geographic distribution in Romania but with distinct ecological requirements

was investigated with DNA nuclear microsatellite markers (7 at hornbeam and 5 at oriental

hornbeam) and chloroplast microsatellite markers (3 markers).

Using SSRn, in Leamna population from Oltenia was întregistrat the higher genetic

diversity, at hornbeam. Bayesian analysis and cluster analysis allowed the identification of obvious

differences between southwestern Romania hornbeam populations and other regions. At oriental

hornbeam, genetic diversity is relatively high (He = 0,531), and both bayesian and cluster analysis

have surprised a grouping in three homogeneous clusters.

The analyzes to the chloroplast DNA level have revealed a very low diversity in the 24

populations, with only two specific haplotypes for each species. Also, we observed the specific

genetic structure of each species without there being common haplotypes, without there being

common haplotypes, as a result that the two species have been separated a long time ago. A

particular haplotype structure was observed in a C. orientalis isolated population (Roșcani, at north

of Iași), population which is to be included in the genetic resources category of this species.



72

CURRICULUM VITAE

Date personale:

Nume și prenume: CĂRĂBUȘ (căs. APETREI) Mihaela Cristina

Cetățenie: Română

Stare civilă: căsătorită

Data nașterii: 12/04/1988

Domiciliu: Str. Ioan Popasu, Nr. 15, Bl. C10, Et. 3, Ap. 32, Oraș Brașov, Județul Brașov,

România

Telefon mobil: +40 767 644 373

E-mail: [email protected]

Educație și formare profesională:

2013 - 2017 - Doctorand - Universitatea Transilvania din Brașov/ Facultatea de Silvicultură

și Exploatări Forestiere

20011 - 2013 - Diplomă de master - Managementul Ecosistemelor Forestiere - Universitatea

Transilvania din Brașov/ Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere

2007 - 2011 - Diplomă de inginer - Universitatea Transilvania din Brașov/ Facultatea de

Silvicultură și Exploatări Forestiere

2003 - 2007 - Diplomă de bacalaureat - Liceul Teoretic „Radu Vlădescu’’ Pătârlagele, Buzău

– România.

Limbi străine: Engleză (Nivel B2), Franceză (Nivel B1)

Publicații:

A. Lucrări publicate în reviste ISI: 1 (prim autor; în analiza spre publicare)

B. Lucrări publicate în reviste indexate BDI/B+: 3 (prim autor)

C. Lucrări prezentate la conferințe și simpozioane internaționale: 2



73

CURRICULUM VITAE

Personal data:

Name and surname: CĂRĂBUȘ (married APETREI) Mihaela Cristina

Nationality: Romanian

Marital status: married

Date of birth: 12/04/1988

Address: Str. Ioan Popasu, Nr. 15, Bl. C10, Et. 3, Ap. 32, Oraș Brașov, Județul Brașov,

România

Mobile phone: +40 767 644 373

E-mail: [email protected]

Education:

2013 - 2017 - Doctoral studies - Transylvania University of Brasov/ Faculty of Silviculture

and Forest Engineering

2011 - 2013 – Master diploma in Management of Forest Ecosystems - Transylvania

University of Brasov/ Faculty of Silviculture and Forest Engineering

2007 - 2011 - Diploma Engineer in Forestry - Transylvania University of Brasov/ Faculty of

Silviculture and Forest Engineering

Foreign languages: English (B2), French (B1)

Publications:

A. Papers published in SCI journals: 1 (first author; in press)

B. Papers published in indexed BDI/B+ journals: 3 (first author)

C. Papers presented at international conferences and symposia: 2

Date post:	08-Sep-2019
Category:	Documents
Upload:	others
View:	2 times
Download:	0 times

Cristina CĂRĂBUȘ (căs. APETREI) - old.unitbv.roold.unitbv.ro/Portals/31/Sustineri de...

Documents