contribuţii la studiul histologic şi imunohistochimic al dezvoltării ...

1

Universitatea de Medicină şi Farmacie Craiova

Facultatea de Medicină

TEZĂ DE DOCTORAT

CONTRIBUŢII LA STUDIUL HISTOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC AL DEZVOLTĂRII

MIOCARDULUI UMAN ŞI VASCULARIZAŢIEI SALE

- REZUMAT -

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: DOCTORAND: Prof. Univ. Dr. Laurenţiu MOGOANTĂ Ionel Dorin MARINAŞ

CRAIOVA

-2012-

2

CUPRINSUL TEZEI

Lista de abrevieri ....................................................................... 5

Introducere ................................................................................. 6

PARTEA GENERALĂ

CAP. I: Ontogeneza cordului .................................................... 9

CAP. II: Anatomia şi histologia cordului............................... 36

CONTRIBUŢII PERSONALE

CAP. III: Material şi metode................................................... 52

CAP. IV: Rezultate................................................................... 69

CAP. V: Discuţii ..................................................................... 109

CAP. VI: Concluzii ................................................................ 131

Bibliografie ............................................................................. 133

3

INTRODUCERE

Inima este unul dintre primele organe care începe să se formeze în timpul dezvoltării embrionare la mamifere (Icardo, 1988; Kirby, 1990).

Multe studii au fost făcute pe modele animale pentru a observa secvenţele formării miocardocitelor funcţionale mature. La embrionii de pui contracţiile miocardocitelor pot fi observate după numai 36 de ore de la fecundare (Tokuyasu and Maher, 1987b), şi fluxul sangvin prin inimă începe la 2 zile după concepţie (Sissman, 1970). Miofibrilele încă necompactate încep să fie vizibile în miocardocite cam la 30 de ore post-fecundare. Cu toate acestea, nu se cunosc multe cu privire la stadiul real al formării sarcomerelor în cordul uman in vivo. La vârsta de 3-4 săptămâni, inima umană începe să se contracte, dar nu se ştie cu adevărat în ce măsură sarcomerele sunt dezvoltate structural (Mercola et al., 2011).

Proteinele citoscheletului filamentelor intermediare (FI) au importante roluri structurale şi funcţionale chiar din stadii embrionare timpurii. Desmina formează un schelet pentru filamentele contractile atât în celulele muşchiului cardiac cât şi în fibrele musculare scheletale, unind marginile liniilor Z şi menţinând conexiunea lor cu mitocondriile, nucleii şi sarcolema (Mogoanta et al., 2007; Henrikson, 1977). Vimentina se găseşte în fibroblaste şi alte tipuri de celule, menţinând stabilitatea celulelor mezenchimale şi a precursorilor lor (Steinert and Roop, 1988).

Datele din literatură arată că CD31 (PECAM-1) este una dintre moleculele de adeziune cel mai precoce exprimate de celulele endoteliale în curs de dezvoltare, care mediază interacţiunile dintre celulele endoteliale adiacente dar şi între celulele endoteliale şi leucocite, însă un studiu extins asupra dezvoltării cordului uman nu este încă raportat (Buck et al., 1993; Baldwin et al., 1994).

Endoglina (CD105) este o glicoproteină transmembranară exprimată în principal de către celulele endoteliale ale vaselor nou formate în condiţii de angiogeneză activă (Bourdeau et al., 2000; Bellone et al., 2007), fiind absentă în majoritatea vaselor din ţesuturile mature. De asemenea, s-a arătat că endoglina joacă un rol important în dezvoltarea sistemului vascular şi a cordului (Li et al., 1999).

Ca şi alte proteine citoscheletale, actina este o proteină fundamentală cu rol în suţinerea aparatului contractil în celulele musculare (Pollard and Cooper, 1986). La mamifere, familia actinei musculare este compusă din 6 izoforme distincte. Dintre acestea, actinele β-citoplasmatică şi γ-citoplasmatică proteine citoplasmatice ubicuitare, în timp ce α-actina cardiacă (α-CAA), α-actina scheletală (α-SKA), α-actina muşchiului neted (α-SMA) şi γ-actina muşchiului neted (γ-SMA) se găsesc în ţesutul muscular (Clement et al., 2007). În miocardul normal, izoformele α-CAA, α-SKA şi α-SMA sunt coexprimate la nivele care diferă în funcţie de specie, stadiul dezvoltării, vârstă sau situaţii patologice (Carrier et al., 1992; Winegrad et al., 1990; Schwartz et al., 1986). Experimente pe modele animale au arătat că în timpul ontogenezei cordului, α-SMA este exprimată de către cardiomiocite în timpul diferenţierii lor, şi că în stadiile tardive ale dezvoltării este înlocuită de α-SKA şi α-CAA (Clement et al., 2007; Sawtell and Lessard, 1989). S-a arătat folosind hibridizarea in situ că există o activare secvenţială a genelor α-actinei în timpul cardiogenezei timpurii la pui. Surprizător, în inimă, transcripţia genelor pentru α-SMA precede pe cele pentru actinele α-cardiacă şi α-scheletală, marcând debutul diferenţierii miocardocitelor (Ruzicka and Schwartz, 1988). Cu toate acestea, un studiu al dinamicii α-SMA în cordul uman aflat în diferite stadii ale dezvoltării nu a fost încă făcut.

Deşi filamentele intermediare au fost studiate în dezvoltarea cordului la diferite mamifere (Messina and Lemanski, 1991; Qu et al., 1998), puţine studii au aprofundat acest subiect concomitent cu evaluarea dezvoltării vasculare (Kim, 1996).

Scopul acestui studiu a fost să încerce să descrie aspectele histologice ale cordurilor embrionare umane, dar şi expresia şi localizarea desminei, vimentinei şi a α-actinei muşchiului

4

neted în cordul uman în curs de dezvoltare între ˂5 şi 33 săptămâni de gestaţie, în combinaţie cu cei doi markeri pentru formarea vaselor (C105, CD31) menţionaţi mai sus.

PARTEA I. PREZENTARE GENERALĂ Pe parcursul a două capitole, Capitolul I – Ontogeneza cordului şi Capitolul II –

Anatomia şi Histologia cordului, în lumina datelor din bibliografie, se aduce problema studiată “la zi” din punct de vedere teoretic (stadiul cunoaşterii).

PARTEA a II-a. CONTRIBUŢII PERSONALE Obiectivele studiului: - descrierea diverselor stadii ale dezvoltării cordului uman şi vaselor sale în coloraţiile cu

hematoxilină-eozină şi hematoxilină Heidenhain. - vârsta la care apar primele striaţii transversale ale miocardocitelor în microscopia optică

şi localizarea lor iniţială. - legătura dintre apariţia primelor sarcomere şi capacitatea mitotică nucleară a

miocardocitelor umane, ştiindu-se din studiile pe animale că în a doua parte a gestaţiei şi perinatal majoritatea miocardocitelor şi-au pierdut capacitatea proliferativă dezvoltându-se în principal prin hipertrofie.

- cercetarea dezvoltării vascularizaţiei cordului urmărind expresia CD31 şi CD105 la nivelul endoteliului vascular şi endocardului în formare.

- demonstrarea implicării α-actinei muşchiului neted în formarea şi organizarea sarcomerelor din miocardocitele umane, având în vedere că pe embrioni umani nu există studii în acest sens.

- analiza localizării şi funcţiei desminei şi vimentinei pe parcursul dezvoltării cordului uman.

Capitolul III intitulat ˝Material şi metode˝ are ca prim obiectiv descrierea

materialului de studiu precum şi a tehnicilor folosite. Toţi embrionii necesari pentru acest studiu au fost colectaţi după avorturi din Clinica de

Obstetrică-Ginecologie a Spitalului Judeţean de Urgenţă Craiova. Vârstele gestaţionale au fost calculate de la ultima menstruaţie până în momentul avortului. Embrionii în întregime au fost fixaţi în formol neutru 10% timp de 4 zile, şi apoi au fost disecaţi, iar cordurile au fost izolate şi procesate pentru includerea la parafină (departamentul de Histologie, Universitatea de Medicină şi Farmacie Craiova).

Analiza macroscopică şi histologică a arătat că embrionii selectaţi pentru studiul nostru nu aveau malformaţii (Tabelul 3.1).

Tabelul 3.1. Numărul şi vârsta cordurilor embrionare pentru acest studiu

Soluţia fixatoare de formol 10% s-a obţinut din aldehida formică (formolul comercial) după urmatoarea formulă:

- formol comercial ................................................................. 1 parte;

Vârsta embrionară (săptămâni)

˂5 5 7 8 9 10 12 14 15 16 17 20 33

Numărul cordurilor disponibile

2 2 3 3 1 2 3 4 3 3 2 2 3

5

- apă distilată ......................................................................... 9 părţi;

În această soluţie am adăugat bicarbonat de sodiu până la pH neutru pentru a neutraliza acidul formic ce se formează spontan în soluţiile concentrate.

Fiecare fragment, de la fiecare caz, a fost notat într-un caiet special, fiind marcat de un număr care l-a însoţit pe parcursul desfăşurării tehnicii histologice. După fixarea materialului recoltat la necropsie am procedat la prelevarea pieselelor histologice, respectiv perete de miocard de la nivelul ventriculilor şi atriilor care au avut o suprafaţă de circa 1-2 cm2 şi o grosime de 2- 3 mm. Aceste piese au fost introduse în săculeţi de tifon şi supuse spălării cu apă de robinet timp de 24 de ore, pentru a îndepărta fixatorul din ţesuturi şi apoi au fost incluse în parafină histologică, purificată şi cu punct de topire fix la 56°C. Din piesele incluse la parafină au fost tăiate secţiuni seriate cu grosimea de 4 μm cu ajutorul unui microtom rotativ, fiecare secţiune fiind transportată pe o cascadă de apă din dreptul cuţitului microtomului într-o baie de apă rece. De aici secţiunile au fost culese cu o lamă din sticlă şi depuse pe suprafaţa unei băi de apă caldă (39°C). Aici suprafaţa secţiunilor s-a îndreptat iar înainte de topirea completă a parafinei, secţiunile au fost preluate pe lame acoperite cu poli-lizină.

Histochimic, s-au utilizat procedee clasice de coloraţie precum hematoxilină-eozină şi hematoxilină ferică (Heidenhain).

Tehnica de imunohistochimie propriu-zisă a cuprins un algoritm standard, cu unele variaţii în funcţie de anticorpii folosiţi. (Tabelul 3.2). Pentru studiul imunohistochimic am realizat imunomarcaje pentru diferite structuri ale ţesutului miocardic folosind o serie de anticorpi cum ar fi anticorpii pentru desmina musculară, vimentina stromală, actina muşchiului neted, vasele de sânge mature (CD31) și cu profil angiogen (CD105), componenta stromală (vimentina), şi celulele aflate în proliferare (PCNA).

Tabel 3.2. Anticorpii utilizaţi în acest studiu

Anticorp Epitop / marker Diluţie Recuperare

antigenică

Sursă

CD105 Vase în proliferare 1:100 Citrat, pH=6 Labvision

CD31 Endoteliu vascular matur 1:50 Citrat, pH=6 Dako

Desmina Celule musculare 1:50 Citrat, pH=6 Dako

Vimentina Celule de origine

mezenchimală

1:100 Citrat, pH=6 Dako

PCNA Celule în proliferare 1:100 Citrat, pH=6 Dako

α-SMA Actina muşchiului neted 1:100 Citrat, pH=6 Labvision

6

1. PCNA

Antigenul nuclear al proliferării celulare (PCNA) este o proteină care acţionează ca un factor de procesare pentru ADN-polimeraza delta în celulele eucariote. PCNA a fost prima dată identificată ca un antigen care este exprimat în nucleii celulelor aflate în timpul fazei ciclului celular de sinteză a AND-ului. Anticorpii anti-PCNA sau anticorpul monoclonal Ki-67 pot fi folosiţi în stadializarea diferitelor tipuri de tumori, cum ar fi astrocitomul, având valoare atât diagnostică cât şi prognostică.

2. CD105 Endoglina (CD105) este o glicoproteină transmembranară tip I exprimată în principal de către celulele endoteliale ale vaselor nou formate în condiţii de angiogeneză activă şi absentă în majoritatea vaselor din ţesuturile mature. De asemenea, endoglina joacă un rol important în dezvoltarea sistemului vascular şi cardiac. Expresia endoglinei a fost demonstrată în vascularizaţia tumorilor şi în celulele proliferative, sugerând că este un marker celular endotelial asociat proliferării. CD105 se leagă de TGF-Beta1 şi Beta3 cu mare afinitate.

3. CD31 (PECAM-1) Este o glicoproteină transmembranară cu un singur lanţ tip 1 având o masă moleculară de

aproximativ 135 kDa, aparţinând superfamiliei imunoglobulinelor. Este prezentă în plachetele sanguine, monocite, granulocite, limfocite B. Joacă un rol important în interacţiunile de adeziune dintre celule endoteliale adiacente ca şi dintre leucocite şi celule endoteliale şi în joncţiunile intercelulare ale endoteliului vascular. CD31 este exprimată în toate endoteliile continue, inclusiv cele ale arterelor, arteriolelor, venelor, venulelor şi capilarelor non-sinusoidale. Se utilizează la examinarea angiogenezei tumorale şi a fenomenului de invazie vasculară mai ales în carcinomul mamar, colorectal, pulmonar.

4. Desmina Este o proteină din filamentele intermediare ale muşchiului neted şi striat, cu gm. de 53

kd. În muşchiul striat expresia desminei este localizată în zona benzilor Z, oferind aspect striat caracteristic fibrelor musculare. Se poate identifica şi în alte tipuri de celule, ca miofibroblaşti, celulele stromale ale endometrului şi vilozităţilor coriale şi în celulele reticulare din limfonoduli.

Desmina formează un schelet pentru filamentele contractile atât în celulele muşchiului cardiac cât şi în celulele muşchiului striat scheletic, unind împreună marginile liniilor Z, şi menţinând conexiunea lor cu mitocondriile, nucleii şi sarcolema.

Se utilizează în diagnosticul histopatologic şi diferenţial al tumorilor musculare, în special al rabdomiosarcomului. Există şi alte tumori care exprimă cu intensitate variată desmina, ca sarcomul alveolar de părţi moi, hemangiopericitomul, histiocitomul fibros malign şi unele fibromatoze.

5. Vimentina Este proteina filamentelor intermediare din celulele de origine mezenchimală. Are o greutate moleculară de 57 kd. Poate fi identificată în: fibroblaşti, condroblaşti, osteoblaşti, fibre musculare netede şi striate, celule mezoteliale, endoteliale şi limfocite. Este un indicator al fixării corespunzătoare al pieselor, deoarece fixarea defectuoasă îngreunează sau împiedică vizualizarea acestui marker.

6. α-SMA Este una dintre cele 4 izoforme ale actinei musculare, o proteină fundamentală implicată

în susţinerea aparatului contractil în celulele musculare. α-SMA este în mod obişnuit folosită ca marker al formării miofibroblastelor. Are o greutate moleculară de 42 kD şi predomină în celulele musculare netede vasculare.

Vom descrie în cele ce urmează protocolul standard şi apoi vom face referire la variaţiile

de tehnică folosite. 1. În mod invariabil, primul pas a fost recuperarea antigenică prin fierbere la microunde

într-o soluţie specifică aleasă în funcţie de anticorp. Pentru fierbere, vasul cu lamele conţinând

7

soluţia de recuperare antigenică a fost acoperit cu un capac şi apoi aşezat într-un cuptor cu microunde setat la o putere de 650W. Fierberea a cuprins 7 cicluri de câte 3 minute la puterea dată. La sfârşitul fiecărui ciclu s-a verificat nivelul lichidului din vas, la nevoie acesta completându-se pentru a evita uscarea şi distrugerea secţiunilor. După încheierea celor 21 de minute de fierbere vasul a fost scos din cuptor şi lăsat să se răcească timp de 30 de minute. Lamele au fost apoi transferate într-un alt vas şi spălate din abundenţă cu apă de robinet şi apoi apă distilată.

2. Etapa următoare a fost incubarea cu o soluţie de peroxid de hidrogen 1% în apă distilată pentru 30 de minute în vederea blocării peroxidazei endogene care ar putea interfera cu detecţia semnalului. Secţiunile au fost ulterior spălate abundent în apă distilată şi apoi trecute în soluţie tampon fosfat salin (PBS).

3. Etapa a treia a constat în incubarea secţiunilor într-o soluţie de albumină bovină 1% (în soluţie PBS) pentru alte 30 de minute. Deşi afinitatea antigen-anticorp este foarte mare, este totuşi posibil ca anticorpii primari să se lege nespecific şi cu o afinitate mică de ţesutul de lucru în afara antigenului specific. Această legare nespecifică poate apărea din mai multe motive: moleculele de aldehidă intacte rămase în ţesut pot realiza punţi metilenice cu anticorpul; structurile hidrofobe sau cu o polaritate mare pot “sechestra” anticorpii; sau în cazul anticorpilor policlonali, imunoglobulinele se pot lega şi de antigene înrudite structural. Nu în ultimul rând, receptorii pentru fragmentele Fc pot adsorbi anticorpii pe suprafaţa ţesutului. Aceste potenţiale neajunsuri pot fi prevenite prin tratarea specimenelor cu soluţii de proteine ce vor intra în competiţie cu anticorpii pentru aceste situsuri nespecifice. Agenţii de blocare frecvent folosiţi sunt albumina serică bovină, cazeina (sau o soluţie de lapte praf degresat), gelatină sau ser normal obţinut de la specia de animal în care este dezvoltat anticorpul secundar. În cazul de faţă am folosit albumină bovină pură (Merck) pentru realizarea soluţiei de lucru de 1%. (Mogoanta et al., 2007)

4. Fără spălare, doar prin îndepărtarea soluţiei de blocare, s-a adăugat apoi pe lamă anticorpul primar, lamele fiind apoi incubate peste noapte în frigider la 4ºC într-o cutie umedă pentru a preveni uscarea lor. Soluţia de reconstituire a anticorpului a fost reprezentată de albumină bovină 1% în PBS, iar diferitele diluţii recomandate de producător sunt redate în tabelul de mai sus.

5. A doua zi lamele au fost scoase din frigider şi lăsate să revină la temperatura camerei pentru 30 de minute. S-au realizat apoi trei spălări abundente în soluţie PBS, fiecare de cel puţin 15 minute.

6. A urmat adăugarea pe secţiuni a sistemului secundar de detecţie, şi anume a unui complex anticorp secundar anti-anticorp primar legat de un polimer cu multiple molecule de peroxidază (EnVision, Dako). Prezenţa unui număr mare de molecule de enzimă necesară vizualizării semnalului pentru fiecare moleculă de anticorp secundar din sistem, face această metodă superioară faţă de sistemele clasice de detecţie precum detecţia directă şi detecţia mediată de avidină şi biotină (ABC şi LSAB). Incubarea s-a făcut la temperatura camerei pentru 30 de minute.

7. Ultima etapă a reacţiei a fost cea de detecţie propriu-zisă a semnalului. Iniţial secţiunile au fost spălate din nou abundent cu PBS (15 minute x 3 spălări). Detecţia s-a realizat apoi prin incubarea secţiunilor cu un substrat pentru peroxidază în prezenţa unei surse de protoni: 3-3’ diaminobenzidină (DAB) în prezenţa de apă oxigenată 1%. Oxidarea DAB realizează iniţial un precipitat care apoi formează legături covalente cu ţesutul, devenind astfel insolubil în alcool şi alţi solvenţi organici, şi ca urmare secţiunile vor putea fi deshidratate şi clarificate în continuare, fără a exista riscul pierderii precipitatului.

Deoarece are potenţial carcinogen (deşi scăzut), trebuie preparată în momentul utilizării sub hotă, utilizând mănuşi, iar soluţia se va neutraliza, după folosire, cu hipoclorit pentru a evita poluarea. Reacţia a fost urmărită sub microscop, după colorarea optimă secţiunile fiind spălate abundent în PBS pentru a opri apariţia semnalului de fond. În final secţiunile au fost contrastate

8

cu hematoxilină Mayer pentru urmărirea morfologiei, au fost deshidratate, clarificate şi acoperite cu mediu de acoperire pe bază de xilen (DPX, Fluka).

Pentru studiul de imunofluorescenţă dublă cu CD31/SMA, după recuperarea antigenică şi blocarea în lapte degresat, ambii anticorpi primari au fost incubaţi pe lame într-un mix respectând diluţiile fiecăruia. A doua zi, după spălări abundente, un mix de secundari capră anti-şoarece conjugat cu Alexa 594 şi respectiv capră anti-iepure conjugat cu Alexa 488, a fost adăugat pe lame (fiecare in dilutie de 1:400, Invitrogen, Medicalkit, Craiova) şi incubat pentru 30 de minute. La sfârşit, secţiunile au fost contrastate cu DAPI (Invitrogen) şi acoperite cu un mediu de prezervare a fluorescenţei (Dako).

Procedee de imagistică şi morfometrie Lamele colorate (histo – sau imuno–histochimic) au fost apoi investigate cu ajutorul unui

microscop Nikon Eclipse 55i echipat cu obiective plan apocromate, un senzor CCD de 5 Mp şi un soft dedicat de analiză imagistică morfometrică (Nikon NIS-Elements). Zonele de interes au fost fotografiate cu aceleaşi setări pentru iluminare şi contrast, iar imaginile arhivate în format TIF într-o bază de date. Studiul s-a desfăsurat pe o bază de date de mai mult de 500 de imagini microscopice surprinse cu obiective de 20× şi 40×. Ulterior imaginile au fost pre-procesate prin aplicarea unor algoritmi de îndepărtare a iluminării neuniforme (background substraction tool) în NIS-Elements. Fiecărei imagini din baza de date i s-a atribuit apoi un grosisment corespunzător cu obiectivul cu care a fost capturată, astfel încât softul de analiză imagistică să poată face corelaţia între numărul de pixeli / micrometru real în imagine.

Pentru studiul de imunofluorescenţă, secţiunile au fost vizualizate cu ajutorul unui microscop Nikon 90i (Nikon, Apidrag, Bucuresti), echipat cu o cameră monocromatică de 1,3 Mp (Rolera Qiamging) şi cu cuburi de filtre de excitaţie/emisie pentru fluoroforii Alexa 594, Alexa 488 şi DAPI. Imaginile s-au luat cu obiective apocromate de 40× şi 60×, şi au fost salvate în format TIF în softul Image ProPlus AMS 7 software (Media Cybernetics, Inc., Buckinghamshire, UK).

Morfometria automată bidimensională a urmărit măsurarea pe măşti RGB extrase din

semnalul dat de marcarea cu DAB a intensităţii şi procentului de arie ocupat de semnal, a numărului elementelor de interes identificate. Prin acest procedeu s-a urmărit măsurarea semicantitativă a numărului de nuclei PCNA-pozitivi în miocardul de diferite vârste.

În final, toate datele obţinute atât prin morfometria clasică cât şi prin analiza fractală au fost colectate în pagini Excel, grupate pe categorii şi comparate utilizând testul t student şi testul Anova.

Capitolul IV - ˝Rezultate˝ prezintă separat rezultatele studiului histologic şi

studiului imunohistochimic şi morfometric. 4.1. Rezultatele studiului histologic clasic Studiul pe hematoxilină-eozină a identificat la cel mai tânăr cord embrionar din studiu

(aproximativ 2 săptămâni), aria cardiacă şi primordiul tubului cardiac, format din celule mezenchimale, substanţă fundamentală abundentă şi rare fibre de colagen. Celulele mezenchimale, pe preparatele noastre au apărut ca şi celule alungite, inegale ca volum şi dimensiuni, cu citoplasmă abundentă şi nucleu mare bine vizibil, cu multiple prelungiri care se unesc cu celulele învecinate pentru a forma o reţea celulară. Celulele au apărut destul de rarefiate, fară o dispunere ordonată, separate de spaţii largi pline cu matrice intercelulară uşor acidofilă. În substanţa fundamentală au fost identificate fine fibre de colagen cu dispunere neordonată. De asemenea, au fost identificate celule de tip angioblastic, care aveau tendinţa de a forma capilare sanguine (Fig. 4.1.1).

9

Începând cu vârsta embrionară de 3-4 săptămâni, celulele au început să arate mai distinct, cu citoplasmă mărită şi clară, nucleul fiind mai frecvent rotund şi situat central, cu ariile ventriculare având celule mai dense comparativ cu viitoarele arii atriale.

La 8 săptămâni, primordiul cardiac a fost bine conturat fiind format dintr-o masă densă de celule alungite, bine delimitate, cu tendinţă de a se dispune ordonat, care reprezentau viitorul miocard. Celulele au avut nucleii mari, rotunzi, hipocromi, nucleolaţi, dispuşi central, cu cromatină dispusă neomogen, caracteristic celulelor tinere. Citoplasma a fost abundentă, neomogenă, hipocromă, iar în structura ei s-au pus în evidenţă fine structuri fibrilare, probabil miofibrile în formare. Aceste celule sunt miocardocite tinere, cu mare potenţial de diviziune. Printre miocardocite s-au evidenţiat spaţii largi acelulare, delimitate incomplet de celule turtite, probabil capilare sanguine în proces de angiogeneză. La vârsta de 9 săptămâni, miocardul a apărut ca fiind format din celule tinere, cu densitate celulară mult mai mare, dovadă a ritmului mitotic intens al miocardocitelor. Dispunerea celulelor miocardice a apărut a fi ordonată, iar în citoplasmă, structurile fibrilare au apărut mai evidente decât la 8 săptămâni la periferia celulelor. Nucleii au apărut rotunzi, hipocromi, nucleolaţi, dispuşi central.

La 12 săptămâni miocardul a apărut format dintr-o masă de celule abundente, alungite, în contact intim unele cu altele, cu citoplasma acidofilă, uşor neomogenă şi cu multiple structuri fibrilare dispuse în axul lung al celulei, preponderent în citoplasma periferică şi submembranar. În structura miocardului s-au evidenţiat mici structuri tubulare care reprezintă capilare de angiogeneză. În acest stadiu, la interiorul cavităţilor cardiace, endocardul a apărut ca fiind bine diferenţiat, cu grosime variabilă de la 5 la 12 microni. În structura sa am identificat un endoteliu continuu şi un ţesut conjunctiv subendotelial bine reprezentat, cu caracter de ţesut mezenchimatos tânăr, care se continuă fără nici o delimitare cu ţesutul conjunctiv al interstiţiului miocardic. Şi la nivelul endocardului s-au evidenţiat structuri vasculare sanguine (Fig. 4.1.5). Sacul pericardic la această vârstă a apărut bine delimitat, epicardul fiind mai subţire, iar primordiul pericardului fibros bine dezvoltat. Între cele două foiţe pericardice s-a delimitat foarte clar, cavitatea pericardică. Pericardul extern a apărut ca fiind format din ţesut conjunctiv tânăr.

La 15 săptămâni, miocardul a apărut bine diferenţiat cu miocardocite numeroase, acidofile cu citoplasma bine colorată, cu numeroase structuri fibrilare dispuse în lungul celulei, preponderent în citoplasma periferică. Nucleul celulelor şi-a păstrat poziţia centrală, dar în cea mai mare parte a devenit de aspect ovalar cu axul lung, în axul celulei, ceea ce dovedeşte că structurile contractile, respectiv miofibrilele au devenit funcţionale. În jurul nucleilor s-a identificat un spaţiu mai clar, datorită probabil dispunerii organitelor celulare preponderent perinuclear. Endocardul a fost bine evidenţiat, ţesutul conjunctiv subendotelial devenind mai dens. Epicardul a apărut şi el bine conturat, fiind format din ţesut conjunctiv lax, gros, cu endoteliul de suprafaţă bine vizibil şi cu vase sanguine de tip capilar destul de largi. Delimitarea dintre epicard şi miocard a devenit la această vârstă mult mai evidentă.

La vârsta de 17 săptămâni, la nivelul miocardului, miofibrilele au apărut complet structurate, prezentând striaţia transversală caracteristică fibrelor musculare adulte, funcţionale. Această striaţie este dată de dispunerea ordonată a miofibrilelor şi a sarcomerelor, ceea ce dovedeşte că citoscheletul miocardocitelor este complet format. Nucleii miocardocitelor au devenit ovalari, dar şi-au menţinut aspectul hipocrom, cu nucleoli vizibili, ceea ce denotă faptul că la această vârstă capacitatea lor mitotică este încă prezentă (Fig. 4.1.10).

La 20 de săptămâni miocardul a apărut mult mai omogen, cu miocardocite cu citoplasmă mai bogată, acidofilă, cu miofibrile mai numeroase şi relativ omogen distribuite în ectoplasmă (citoplasma periferică). Endocardul a apărut bine structurat cu ţesutul conjunctiv subendocardic bine diferenţiat. Epicardul a apărut voluminos, cu structură de ţesut conjunctiv lax, bine delimitat de restul miocardului şi cu numeroase vase sanguine cu peretele complet, datorită dezvoltării tunicii muculare medii (Fig. 4.1.13).

La 33 de săptămâni, miocardocitele prezentau un pattern striat comparabil cu cel întâlnit la cordul adult, unele dintre ele fiind binucleate. Tot la această vârstă, în epicardul 1/3

10

superioare a atriului stîng am evidenţiat mai multe formaţiuni ovalare (ganglioni vegetativi) care conţineau neuroni vegetativi, înconjuraţi de celule gliale şi bine delimitaţi de restul ţesutului conjunctiv. Acest aspect confirmă faptul că relaţia dintre sistemul nervos şi structurile cardiace se realizează destul de timpuriu. În plus, noi considerăm că plexul cardiac de la baza cordului de la adult, este format din mai mulţi ganglioni vegetativi, care iniţial pot apare în ţesutul conjunctiv epicardic de unde pot migra spre baza cordului o dată cu dezvoltarea.

Pe hematoxilină Heidenhain, comparativ cu hematoxilină-eozină, încă din săptămâna 15, au început să fie vizibile primele sarcomere, reflectând probabil o stare precedentă de existenţă şi agregare a miofibrilelor, şi acum au fost suficient de dense pentru a fi vizibile în microscopia optică (Fig. 4.1.19). În toate cele 3 corduri embrionare disponibile pentru această vârstă, primele sarcomere vizibile în microscopia optică au apărut la marginea celulei, imediat sub membrana plasmatică. Acest aranjament a fost constant de-a lungul întregii membrane, fără întrerupere evidentă, şi de asemenea, constant pentru ariile atriale şi ventriculare. Între săptămânile 8 şi 17 am evidenţiat aceleaşi aspecte ca în coloraţia cu hematoxilină-eozină. La 20 de săptămâni, aspectul nucleilor era normocrom, sugerând scăderea capacităţii mitotice.

Figura 4.1.1.

Primordiul tubului cardiac la vârsta de ˂5 săptămâni. Col. Hematoxilină – Eozină Ob 20×

Figura 4.1.5.

Miocard şi endocard la 12 săptămâni. Col. Hematoxilină – Eozină Ob 20×

11

Figura 4.1.10.

Miocard la 17 săptămâni. Miofibrile clar vizibile. Col. Hematoxilină – Eozină Ob 60×

Figura 4.1.13.

Miocard la 33 de săptămâni. Aspect aproape matur. Col. Hematoxilină – Eozină Ob 40×

Figura 4.1.19.

Miocard la vârsta de 15 săptămâni. Se observă primele sarcomere, iar nucleii sunt mult mai mari şi alungiţi.

Col. cu hematoxilină ferică Heidenhain Ob 40×

12

4.2. Rezultatele studiului imunohistochimic şi morfometric 4.2.1. Expresia PCNA În imunohistochimia cu PCNA, aşa cum ne aşteptam, am remarcat o scădere a coloraţiei

nucleare cu creşterea vârstei embrionare (Figura 4.2.1.1) (Marinas et al., 2011). În cordurile foarte tinere (<5 săptămâni), practic toţi nucleii celulelor mezenchimale au exprimat puternic PCNA. La această vârstă am numărat în jur de 25,4% (±8,1%) nuclei pozitivi. Pozitivitatea nucleară a scăzut cu o pantă relativ constantă la 21,5%(±7,6%) la 12 săptămâni şi la 18,3% (±11,7%) la 15 săptămâni.

După vârsta de 15 săptămâni, pozitivitatea nucleară a scăzut drastic la 3,3% (±1.6%) la 17 săptămâni, şi respectiv la 1,8% (±1,8%) la vârsta de 20 de săptămâni. După această vârstă a existat un procent aproape constant al coloraţiei cu PCNA în miocardocite.

Comparând formarea primelor sarcomere vizibile în microscopia optică şi reducerea pozitivităţii nucleare la PCNA mai sus descrise, am observat că cele două fenomene nu coincid în toate cazurile studiate cu vârstele corespunzătoare, formarea primelor sarcomere vizibile a fost urmată de un interval de două săptămâni de latenţă, după care maturaţia nucleară a crescut drastic (fapt relevat de colorarea mai slabă cu PCNA).

Figura 4.2.1.1. Coloraţia anti-PCNA arată scăderea capacităţii mitotice nucleare. Între săptămânile 15 şi 17 există o reducere drastică a expresiei PCNA. Barele de eroare reprezintă deviaţiile standard, * diferenţă semnificativă bazată pe testul t student (p<0.05).

13

4.2.2. Expresia CD105 şi CD31 Imunohistochimia pentru endoglină a arătat că reactivitatea începe să apară în inima

umană, la aproximativ 5 săptămâni, în stratul viitorului endocard (Fig. 4.2.2.1). În timp ce la această vârstă nu au existat vase pozitive în miocardul în sine, imunoreactivitatea începe să apară în celulele endoteliale la 9-10 săptămâni (Fig. 4.2.2.4). După această vârstă, semnalul este puternic detectat în vasele endocardului, miocardului şi epicardului.

Încă de la 5 săptămâni de dezvoltare, imunocolorarea anti-CD31 detectează celule endoteliale împrăştiate colorate complet şi vase în miocard, în timp ce stratul endocardic nu exprimă încă pe deplin acest marker (Fig. 4.2.2.9). Până la 7 săptămâni, mai multe vase au putut fi observate, iar endocardul exprimă CD31 pe întreaga sa suprafaţă (Fig. 4.2.2.10). La vârsta de 10 săptămâni ale embrionului, vasele mari sunt observate în stratul epicardic. Numărul de vase a fost relativ constant până în jurul vârstei de 20 de săptămâni când densitatea lor a crescut rapid (Fig. 4.2.2.14). În ansamblu, a existat o exprimare în creştere a CD105 şi CD31 o dată cu creşterea vârstei embrionare, vasele mature părând să-şi păstreze fenotipul pozitiv la endoglină.

Figura 4.2.2.1. Cord embrionar la vârsta de 5 săptămâni.

Se observă reacţie pozitivă la endoglină în stratul viitorului endocard. Imunomarcaj pentru CD105. Ob 20×


Se remarcă reacţie pozitivă la endoglină în vasele miocardului. Imunomarcaj pentru CD105. Ob 20×

14


Se remarcă o reacţie intens pozitivă la endoglină în vasele miocardului. Imunomarcaj pentru CD105. Ob 20×


Reacţie pozitivă slabă la nivelul celuleor endoteliale din miocard. Imunomarcaj pentru CD31. Ob 40×


Reacţie pozitivă la nivelul endoteliului vascular şi al endocardului. Imunomarcaj pentru CD31. Ob 40×

15


De la această vârstă se observă creşterea marcată a densităţii vaselor din miocard. Imunomarcaj pentru CD31. Ob 40×

4.2.3. Expresia desminei şi vimentinei Analiza preparatelor imunocolorate pentru desmină, a arătat că reactivitatea a început să

apară de la vârsta de 9 săptămâni (Fig. 4.2.3.3), cu creşterea intensităţii şi ariei de colorare de la 9-10 săptămâni în sus. Desmina a fost prezentă numai în cardiomiocite. În etapa punctului iniţial de detectare, desmina părea să căptuşească membrana plasmatică a cardiomiocitelor. Începând cu 17 săptămâni de viaţă intrauterină, desmina a fost de asemenea, localizată în striaţiile miofibrilelor în citoplasma cardiomiocitelor. Această caracteristică a atins modelul celulei musculare striate mature începând cu 33 de săptămâni (Fig. 4.2.3.8). La 33 de săptămâni au apărut primele miocite binucleate şi primele discuri intercalare.

Vimentina a fost prezentă în celulele mezenchimale din primul moment analizat (de exemplu, la ˂5 săptămâni. Fig. 4.2.3.9). Pe măsură ce lumenul vaselor de sânge a devenit tot mai clar vizibil, în jurul a 7 săptămâni, vimentina a prezentat de asemenea, o localizare perivasculară (Fig. 4.2.3.10). Vimentina a fost puternic exprimată în celulele musculare netede ale aortei, în timp ce desmina nu a putut fi detectată în acest compartiment. Pe peretele interior al endocardului la nivelul viitoarelor valve atrio-ventriculare rezultatul a fost, de asemenea, pozitiv pentru vimentină (Fig. 4.2.3.12). O dată cu înaintarea în vârstă a embrionului, expresia vimentinei diminuă în miocardul în sine, rămânând prezentă în jurul vaselor şi într-o măsură mai mare în vasele subepicardice (Fig. 4.2.3.13).


Imunomarcaj pentru desmină. Ob 40×

16


Se remarcă apariţia desminei şi în striaţiile miofibrilelor din citoplasma miocardocitelor. Imunomarcaj pentru desmină. Ob 40×

Figura 4.2.3.8. Miocard embrionar la vârsta de 33 săptămâni.

Reacţie intens pozitivă la nivelul striaţiilor miofibrilelor. Se observă apariţia primelor miocardocite binucleate şi discuri intercalare.

Imunomarcaj pentru desmină. Ob 40×

Figura 4.2.3.9.Imunomarcaj citoplasmatic la vimentină a celulelor mezenchimale din parenchimul cordului embrionar cu vârsta de ˂5 săptămâni. Ob 20×

17


Vimentina apare şi perivascular. Imunomarcaj pentru vimentină. Ob 20×

Figura 4.2.3.12. Miocard şi endocard la vârsta de 10 săptămâni.

Reacţie pozitivă şi la nivelul peretelui interior al endocardului. Imunomarcaj pentru vimentină. Ob 20×


Începând cu această vârstă, expresia vimentinei diminuă în miocardul în sine, rămânând prezentă în jurul vaselor şi mai ales în vasele subepicardice.

Imunomarcaj pentru vimentină. Ob 20×

18

4.2.4. Expresia α-SMA/CD31 prin imunofluorescenţă După compunerea imaginilor duble α-SMA/CD31, în compartimentul non-vascular, am

observat de asemenea o variaţie graduală a exprimării α-SMA pe parcursul diferitelor stadii de dezvoltare. Astfel, exceptând o uşoară autofluorescenţă tisulară, celulele mezenchimale nu au fost pozitive la α-SMA înaintea vârstei de 7 săptămâni. α-SMA a început să fie prezentă în celulele viitorului miocard în jurul vârstei de 9 săptămâni, arătând un model de exprimare submembranar cumva în legătură cu exprimarea desminei prezentată mai sus Între săptămânile 8 şi 17 am evidenţiat aceleaşi aspecte ca în coloraţia cu hematoxilină-eozină (Fig. 4.2.4.2). Examinând aceste modele, în săptămâna 15 am observat pentru prima dată formarea structurilor sarcomerice striate, sugerând un rol pentru α-SMA în susţinerea temporară a miofibrilelor în muşchiul striat cardiac (Fig. 4.2.4.9). În săptămânile următoare, exprimarea α-SMA a relevat structura striată tipică a sarcomerelor (Fig. 4.2.4.11), dar cu o scădere abruptă între săptămânile 20 şi 33 de dezvoltare. În cele din urmă, la 33 de săptămâni, α-SMA nu a mai fost detectată în compartimentul miocardocitelor (Fig. 4.2.4.15), la fel ca şi la ţesutul cardiac al nou-născutului şi adultului (colecţie personală, în curs de publicare). În paralel, celulele endoteliale în formare arată o exprimare punctată a CD31. Începând cu vârsta de 20 săptămâni, exprimarea CD31 este completă în pereţii vaselor cu lumene bine conturate.

În compartimentul vaselor de sânge, CD31 a fost prima dată detectată cu un aspect granular în celulele endoteliale, unele dintre ele neavând încă lumene clar formate, dar şi în vase de diferite mărimi, unele dintre ele suficient de mature pentru a etala o tunică musculară. Începând cu vârsta de 20 săptămâni, vase mai mari au prezentat în mod evident o tunică medie pozitivă la α-SMA şi un strat endotelial continuu (Fig. 4.2.4.15).

Figura 4.2.4.2. Cord fetal la 9 săptămâni.

Imunofluorecenţă pentru α-SMA (verde) şi CD31 (roşu) şi contrastare cu DAPI (albastru). Se observă pentru prima dată reacţie pozitivă la α-SMA în celulele miocardice

submembranar şi la CD31 în celulele endoteliale ale vaselor în formare. Ob 40×

19


Imunofluorescenţă pentru α-SMA (verde) şi CD31 (roşu) şi contrastare cu DAPI (albastru). Se observă primele structuri sarcomerice striate în celulele miocardice. Ob 60×


Imunofluorescenţă pentru α-SMA (verde) şi CD31 (roşu) şi contrastare cu DAPI (albastru). Se remarcă scăderea intensităţii exprimării α-SMA în celulele miocardice. Ob 40×


Imunofluorescenţă pentru α-SMA (verde) şi CD31 (roşu) şi contrastare cu DAPI (albastru). Vas mare cu lumen clar format. Reacţie intens pozitivă pentru α-SMA în tunica medie şi

CD31 în endoteliu. Absenţa α-SMA din miocard. Ob 40×

20

Capitolul V - ˝Discuţii˝ integrează rezultatele studiului în multitudinea de date legate de ontogeneza cordului în special la animale, deoarece puţine studii au abordat exprimarea markerilor folosiţi de noi în dezvoltarea cordului fetal uman.

Este universal acceptat că miocardocitele devin rapid funcţionale şi cordul embrionar începe să bată la aproximativ 21 de zile după concepţie, tipic cu o frecvenţă apropiată de cea a mamei. Aceasta sugerează că sarcomerele din muşchiul striat cardiac uman devin pe deplin funcţionale într-un stadiu de dezvoltare foarte timpuriu pentru a putea susţine această funcţie.

Cu toate că formarea miofibrilelor la nivelul inimii a fost pe larg studiată pe modele animale, puţine studii au abordat embrionul uman din acest punct de vedere.

În studiul nostru (Marinas et al., 2011) am arătat, pe hematoxilină Heidenhain, că în cordul uman aflat în săptămâna 15 de gestaţie au început să fie vizibile primele sarcomere, reflectând probabil o stare precedentă de existenţă şi agregare a miofibrilelor, şi acum au fost suficient de dense pentru a fi vizibile în microscopia optică. În toate cele 3 corduri embrionare disponibile pentru această vârstă gestaţională, primele sarcomere vizibile în microscopia optică au apărut la marginea celulei, imediat sub membrana plasmatică. Acest aranjament a fost constant de-a lungul întregii membrane, fără întrerupere evidentă, şi de asemenea, constant pentru ariile atriale şi ventriculare.

Studiile în microscopie electronică pe embrioni de homar au arătat că miofilamente groase şi subţiri apar prima dată la periferia celulei aproape de sarcolemă (Burrage and Sherman, 1979). Ele se aliniază în paralel într-un mod secvenţial pentru a forma unităţi sarcomerice consecutive. Benzi A şi I bine definite apar înainte de a fi prezentă orice urmă de linie Z. Sarcomerele iniţiale sunt ancorate de sarcolemă prin inserarea miofilamentelor subţiri într-o regiune de material electrono-dens strâns asociată cu sarcolema. Miofibrilele cresc spre exterior în câteva planuri la distanţă de aceste regiuni electrono-dense ale membranei care se pare că servesc ca puncte focale pentru formarea miofibrilelor.

Markwald (Markwald, 1973) a studiat amănunţit formarea embrionilor la şobolan şi hamster şi a raportat că majoritatea primelor miofibrile se formează în asociere cu materialul amorf dens localizat ca plăci de-a lungul părţii interne a membranei plasmatice a celulelor musculare cardiace. El şi colegii săi au propus că aceste plăci dense servesc ca şi centre pentru asamblarea miofibrilelor. Oricum, aceste structuri au fost observate la embrionul de pui aflat în stadiul 10 de dezvoltare şi la embrionul de şobolan de 10 zile, ambii fiind în stadiul de primele contracţii miocardice (van der et al., 1987). Astfel, aceste studii nu au furnizat un răspuns clar la întrebarea dacă astfel de plăci sunt generate înainte sau aproape în acelaşi timp cu formarea miofibrilelor.

Inima este primul organ funcţional în embriogeneză. Contracţiile cardiomiocitelor pot fi observate în embrioni de pui deja după 36 de ore în ovo (la etapa de 9 somite) şi după alte 12 ore întregul flux de sânge este gestionat de reţeaua de miofibrile care se contractă ritmic (Tokuyasu and Maher, 1987b). Asamblarea proteinelor miofibrilare în unitatea lor funcţională, sarcomerul, trebuie să fie deci, un proces rapid şi bine coordonat. Pentru a explica acest fenomen numeroase studii au fost efectuate pe culturi primare de cardiomiocite şi mai multe modele au fost propuse. Fascicule groase de actină, aşa numitele structuri asemănătoare cu fibrele de stress (SFLS), sunt o caracteristică importantă a culturilor de cardiomiocite şi ar putea acţiona ca un schelet în timpul asamblării sarcomerelor (Dlugosz et al., 1984). Această ipoteză a fost extinsă în continuare, cu observaţia că, complexele I-Z-I, structuri care conţin componenta sarcomerică α-actinină a discului Z, precum şi α-actină şi titină, ar putea fi puse în registrul acestor structuri filamentoase pentru a construi miofibrile non-striate (NSMF) şi că filamente groase, conţinând în principal miozină, ar putea fi asamblate independent şi doar să fie încorporate în miofibrile mai târziu (Wang et al., 1988; Schultheiss et al., 1990).

Până în prezent, se ştiu relativ puţine despre miofibrilogeneza din timpul dezvoltării normale. Studii asupra musculaturii scheletice de la embrionul de şoarece au indicat faptul că proteinele sarcomerice sunt exprimate într-o secvenţă definită în timpul dezvoltării desminei, un filament proteic intermediar, ce apare primul, urmate de titină şi ulterior toate celelalte

21

componente sarcomerice (Furst et al., 1989). Acest lucru a condus la ideea că titina ar putea acţiona ca un integrator in situ de complexe I-Z-I, precum şi la faptul că asamblarea benzii A se întâmplă independent. Cu toate acestea, miofibrilele din muşchiul scheletic se dezvoltă într-o săptămână (Fischman, 1967), în timp ce o inimă care bate durează doar câteva ore să se matureze. Prin urmare diferite mecanisme ale miofibrilogenezei ar putea fi utilizate în timpul dezvoltării muşchiului cardiac. În studii de pionierat pe inimă embrionară de pui Tokuyasu şi Maher au raportat că α-actinina şi titina s-au organizat în mod periodic într-un moment când actina şi miozina erau încă distribuite neuniform în întreaga celulă. Mai târziu, o dată cu dezvoltarea, miozina a fost observată în aranjamente sarcomerice în timp ce actina era încă filamentoasă (Tokuyasu and Maher, 1987b). Aranjamentul actinei se modifică în timpul dezvoltării inimii; iniţial este prezentă ca reţea filamentoasă, apoi fascicule groase de actină sunt formate înainte de apariţia benzilor I mature (Shiraishi et al., 1992). În ciuda tuturor acestor studii, nici o analiză comparativă detaliată a localizării mai multor proteine miofibrilare în timpul dezvoltării inimii nu a fost efectuată până în prezent.

Pentru a investiga dacă expresiile secvenţiale ale componentelor sarcomerice apar în timpul miofibrilogenezei cardiace şi dacă etapele intermediare de asamblare miofibrilară sau structurile cu rol de susţinere sunt importante în timpul miofibrilogenezei in situ, Elisabeth Ehler şi colaboratorii (Ehler et al., 1999) au efectuat microscopie confocală pe preparate din corduri embrionare de pui imunocolorate, care au fost izolate în momentul în care încep contracţiile miofibrilare. Prin aplicarea tehnicilor de dublă şi triplă marcare s-au putut compara diferitele componente ale sarcomerului în aceeaşi miofibrilă. Toate proteinele sarcomerice investigate erau acumulate cu mult înainte de debutul miofibrilogenezei şi doar două etape majore ale asamblării miofibrilei au putut fi elucidate. În inima imatură înainte de a bate, actina filamentoasă se găseşte aproape de membranele celulare şi numai α-actinina şi titina sunt organizate într-o manieră distinctă. De îndată ce primele contracţii sunt observate, sarcomerele par a fi pe deplin organizate, cu excepţia benzilor I, care ating lungimea lor definitivă numai într-un stadiu de dezvoltare ulterior.

Multe observaţii care s-au făcut pe cultura de cardiomiocite pot fi confirmate prin analiza preparatelor întregi. De exemplu, structuri corpusculare dense, compuse din α-actinină, punctul N-terminus al titinei şi actină pot de asemenea, să fie detectate din primele etape de asamblare a sarcomerului in situ şi par a acţiona ca structuri organizatorice de bază în timpul miofibrilogenezei (Ehler et al., 1999).

Studii asupra embriogenezei la iepure (van der Loop et al., 1992) au arătat că titina a fost prima proteină musculară specifică exprimată exclusiv în cordul embrionar de iepure, urmată de tropomiozină într-un patern striat. Miozina şi desmina au fost organizate în modele striate transversal după titină şi tropomiozină. Actina şi vimentina au fost distribuite în filamente citoplasmatice. Acest studiu arată, în comparaţie cu studiile pe şoarece şi pui, că secvenţa expresiei proteinelor musculare specifice şi proteinelor filamentelor intermediare în timpul miocardogenezei este dependentă de specie şi că expresia şi organizarea lor variază în timp în diferite regiuni ale inimii în dezvoltare.

Primul pas în miofibrilogeneză pare să implice un complex de α-actinină sarcomerică, punctul N-terminus al titinei şi filamente actinice asociate cu membranele. Aceste complexe, care au fost denumite structuri corpusculare dense, sunt deja prezente într-un mod organizat în inima din stadiul de 8 somite şi par a fi primele locuri de construcţie pentru miofibrilogeneza in situ (Tokuyasu and Maher, 1987a; Furst et al., 1989), precum şi in vitro (Schultheiss et al., 1990). Modele recente de organizare a discului Z oferă o explicaţie a modului în care aceste trei molecule ar putea interacţiona reciproc, pentru a face structuri nucleate şi pentru a furniza indicii pentru o organizare polarizată atât a filamentelor de actină precum şi a titinei (Young et al., 1998). Odată ce aceste structuri corpusculare dense s-au asamblat, trebuie să existe un mecanism care să le pună în concordanţă. Cel mai probabil candidat pentru o astfel de funcţie este titina, care se extinde de la discul Z (N-terminus), la linia M (C-terminus), în sarcomerele mature. Cu toate acestea, ca să-şi îndeplinească rolul său de conducător al sarcomerelor, moleculele de titină

22

trebuie să se desfăşoare şi C-terminus ale moleculelor de titină vecine trebuie să interacţioneze reciproc într-un mod antiparalel precum a fost propus într-un model recent al liniei M (Obermann et al., 1996).

Cele mai multe dintre proteinele miofibrilare au fost direcţionate către locul lor corespunzător în sarcomere imediat ce primele contracţii sunt observate în inima din etapa de 9 somite. Cu toate acestea, există o diferenţă importantă în felul cum sunt asamblate filamentele groase şi subţiri. În timp ce filamentele groase au lungimea matură de 1,6 µm din primul moment când sunt identificate, filamentele subţiri ating lungimea lor definitivă abia mai târziu în timpul dezvoltării în etapa de 12-13 somite. În acest moment discurile intercalare în curs de formare sunt deja evidente şi miofibrilele individuale sunt aşezate şi orientate definitiv de-a lungul axei celulare, probabil, prin interacţiune cu desmina şi de asemenea cu costamerii (Tokuyasu, 1989; Shiraishi et al., 1993; Shiraishi et al., 1995; Shiraishi et al., 1997). Această aliniere laterală a miofibrilelor este ultimul pas al miofibrilogenezei şi pare a fi important, în principal pentru gestionarea optimă a stresului, deoarece cardiomiocitele de la şoareci, care sunt nule homozigotic pentru desmină sau respectiv vinculină, pot asambla sarcomere funcţionale (Milner et al., 1996; Xu et al., 1998).

Sunt necesare experimente viitoare pentru a testa acest model de asamblare sarcomerică, de exemplu, prin ablaţia genelor pentru jucătorii-cheie propuşi ai miofibrilogenezei α-actinină, titină şi miomezină. Experimente cu oligonucleotide antisens pentru inhibarea sintezei de titină în cultura de cardiomiocite au evidenţiat rolul său esenţial în timpul miofibrilogenezei şi supraexprimarea unui fragment N-terminal de titină poate duce la un fenotip negativ dominant rezultând dezintegrarea miofibrilului (Turnacioglu et al., 1997). Cu toate acestea, efectele perturbării α-actininei sau miomezinei rămân a fi demonstrate.

Tokuyasu şi Pamela Maher (Tokuyasu and Maher, 1987a) au raportat că punctele imunofluorescente de α-actinină sunt formate în cadrul spoturilor de titină, că punctele α-actininice sunt considerabil mai mici decât spoturile de titină, că benzile dense Z, nou formate, se dovedesc a fi semnificativ mai mici decât regiunile titin-pozitive la microscopia electronică, şi că punctele α-actininice observate cu microscopul cu imunofluorescenţă probabil corespund corpilor Z sau plăcilor de material dens Z observate în studiile anterioare cu microscopul electronic (Manasek, 1968). Anticorpii anti-α-actinină utilizaţi în studiul lor au fost pentru muşchii netezi ai pipotei de pui şi au interacţionat cu izoforme de α-actinină din diferite tipuri de muşchi, precum şi cu celule nonmusculare.

În stadiile de dezvoltare înaintea formării miofibrilelor, un semnal de marcaj scăzut, dar semnificativ pentru α-actinină a fost de multe ori găsit de-a lungul marginilor celulelor, în special în lateralul celulelor, într-un model de marcaj similar cu cel pentru actină. Acest lucru a avut loc nu numai în primodia cardiacă, ci şi în restul mezodermului splahnic, care a indicat faptul că această marcare nu a fost specifică morfogenezei cardiace, dar în legătură, cel puţin parţial, cu prezenţa generală de filamente de actină de-a lungul marginilor celulare.

Marcarea cu dublă imunofluorescenţă a embrionilor din stadiul de 7 somite pentru α-actinină şi titină nu a arătat marcaj prezent pentru α-actinină în spoturile de titină individuale sau în rândurile de spoturi de titină aliniate nonperiodic. Pe de altă parte, în etapa de 9 somite în inima în care s-au aşteptat a fi formate primele miofibrile, puncte minimale ale marcajului pentru α-actinină au fost găsite în spoturile de titină aliniate periodic ale presupuselor miofibrile incipiente, dar nu şi în locaţiile spoturilor de titină individuale. Când spoturile de titină au devenit linii în miofibrilele lărgite, punctele de α-actinină au crescut proporţional în lăţime şi au devenit linii. Cum era de aşteptat, aceste miofibrile lăţite au fost găsite mai des în etapa de 10 somite decât în cea de 9 somite (Tokuyasu and Maher, 1987a).

Punctele de α-actinină au avut o variaţie considerabilă în ceea ce priveşte intensitatea marcajului, reflectând, probabil, o variaţie a gradului de dezvoltare a miofibrilelor sau o variaţie de lăţime sau ambele. Indiferent de variaţie, punctele de α-actinină au fost în mod clar mai mici decât spoturile de titină.

23

Filamentele care au fost vizualizate la o magnificare relativ mică în spaţiul sarcomeric în curs de formare între benzile Z, au arătat lăţimi de 15-20 nm, fiind astfel, foarte probabil filamente groase de miofibrile. Această concluzie este concordantă cu observaţia ultrastructurală că stadiul cel mai timpuriu în care se găsesc filamente groase aproape coincide cu etapa apariţiei primelor miofibrile, în stadiul de 8-9 somite.

S-a demonstrat că punctele de α-actinină se formează în spoturile de titină care au fost aranjate în timpul, dar nu înaintea formării primelor miofibrile şi că punctele de α-actinină sunt în mod sigur mai mici decât spoturile de titină. Examenul prin microscopie electronică al regiunilor spoturilor de titină aşezate periodic, observate prin imunofluorescenţă a relevat prezenţa unor structuri mici şi dense, corpii Z, în unele, dar nu în toate aceste regiuni. Astfel de corpi Z au fost considerabil mai mici decât spoturile de titină conţinătoare. Acestea, împreună cu faptul că astfel de structuri nu au fost observate în etapele anterioare, sugerează că aceste structuri sunt omologii ultrastructurali ai punctelor de α-actinină din imunofluorescenţă şi că acestea nu sunt formate mai devreme, ci aproape sincron cu formarea miofibrilelor. În plus, faptul că lăţimea corpului Z a fost mult mai mică decât lăţimea miofibrilelor în unele dintre miofibrilele în curs de formare sugerează că α-actinina este necesară nu pentru asamblarea iniţială a miofibrilelor, ci pentru stabilizarea lor (Tokuyasu and Maher, 1987a). Astfel, aceste observaţii nu susţin propunerea din studiile anterioare ultrastructurale cum că plăcile dense de material Z (corpii Z ) prezente se formează primele şi că funcţionează ca şi centre de organizare a miofibrilelor. Mai degrabă, filamentele de actină şi miozină sunt deja organizate înainte de apariţia materialului dens Z.

În studiul nostru, prin imunohistochimie cu PCNA, aşa cum ne aşteptam, am remarcat o scădere a coloraţiei nucleare cu creşterea vârstei embrionare. În cordurile foarte tinere (<5 săptămâni), practic toţi nucleii celulelor mezenchimale au exprimat puternic PCNA. Pozitivitatea nucleară a scăzut cu o pantă relativ constantă până la 15 săptămâni.

După vârsta de 15 săptămâni, pozitivitatea nucleară a scăzut drastic până la vârsta de 20 de săptămâni. De la această vârstă a existat un procent aproape constant al coloraţiei cu PCNA în miocardocite. Astfel am demonstrat că la vârsta de 20 de săptămâni nucleii miocitelor au devenit aproape maturi, dar s-a păstrat capacitatea mitotică a miocardocitelor până în stadiile tardive ale ale gestaţiei. Jonker şi colaboratorii (Jonker et al., 2007) au arătat pe cord ovin că majoritatea miocitelor sau toate şi-au pierdut capacitatea de proliferare în cursul perioadei perinatale. Investigaţiile inimilor fetale umane postmortem folosind PCNA, Ki-67, şi notarea morfologică a nucleilor au dus la măsurători ale activităţii ciclului celular, care sunt variabile şi în scădere o dată cu înaintarea gestaţiei. S-a sugerat că scăderea activităţii ciclului miocitar o dată cu maturizarea se datorează într-o oarecare măsură scăderii numărului de miocite capabile de proliferare. Astfel, la vârsta gestaţională de 115 zile, mai mult de 50% din miocite erau intrate în diviziune nucleară diferenţiată terminal. Numărul miocitelor binucleate a crescut rapid între 115 şi 120 zile de vârstă gestaţională cu preţul scăderii numărului de celule mononucleate. La 95 zile de gestaţie aproximativ 7% din miocite au fost în ciclul celular, iar până la 140 de zile mai erau doar maxim 3% , fapt ce se corelează cu rezultatele studiului nostru cu PCNA.

S-a constatat că numărul de miocite a fost în continuă creştere, lentă, în inima fătului aproape de termen şi probabil continuă să crească lent, pentru o anumită perioadă, în inima nou-născutului (Jonker et al., 2007).

Huttenbach şi colaboratorii au studiat activitatea proliferativă a miocardocitelor umane din ventriculul stâng măsurând imunoreactivitatea cu ajutorul anticorpului monoclonal MIB-1 împotriva antigenului nuclear recombinant Ki-67. Ei au arătat că activitatea proliferativă miocitară a rămas constantă în prima parte a gestaţiei şi a scăzut în perioadele tardivă prenatală şi precoce postnatală. Miocardocitele adulte, indiferent de greutatea inimii, nu au avut activitate proliferativă (Huttenbach et al., 2001).

Până la 4 zile după naştere, masa peretelui liber al ventriculului drept la miel este redusă până aproape de 50% (comparativ cu masa măsurată la 145-146 zile de gestaţie). La 4-6 săptămâni de viaţă, numărul miocitelor din peretele liber atât al VS cât şi VD este mai mic decât

24

cel găsit la fetusul cu vârsta gestaţională de 145-146 de zile (termenul∼150 zile) (Burrell et al., 2003).

Miocitele binucleate sunt diferenţiate terminal şi nu pot intra în diviziune celulară (Clubb, Jr. and Bishop, 1984; Li et al., 1996).

Formarea celulelor miocardice binucleate este un indicator precoce al creşterii prin hipertrofie la şobolanul nou-născut şi un rezultat al mitozei fără diviziune celulară (Clubb, Jr. and Bishop, 1984). Astfel, la o vârstă dată a dezvoltării, proporţia miocardocitelor care sunt uninucleate indică capacitatea cordului în dezvoltare de a creşte prin hiperplazie. Până la 110 zile de gestaţie, cordul fetal ovin creşte în principal prin hiperplazie şi după această dată, masa peretelui liber ventricular creşte atât prin hipertrofie cât şi prin hiperplazie (Burrell et al., 2003). Până la 145-146 zile de gestaţie, majoritatea cardiomiocitelor fetale ovine sunt binucleate. Astfel, capacitatea inimii fetale ovine de a creşte prin hiperplazie este limitată după naştere.

La porc, 90% din miocitele cardiace sunt mononucleate la naştere iar după naştere nu există nici o pierdere de miocite din peretele liber al VD; numărul miocitelor din peretele liber al VS creşte cu 28%. Oricum, la aproape toate speciile de mamifere, cordul în dezvoltare încetează să crească prin hiperplazie înainte sau la puţin timp după naştere (Beinlich et al., 1995). Creşterea masei miocardice prenatal în timpul dezvoltării normale se realizează prin hiperplazie (proliferare). Postnatal, creşterea masei miocardice se datorează în principal hipertrofiei miocitelor (Rudolph, 2000).

Studii pe porcul nou-născut au arătat că dezvoltarea cardiacă normală depinde de integritatea sistemului renină-angiotensină neonatal (Beinlich et al., 1991). Astfel, blocada sistemului renină-angiotensină la şobolan în prima săptămână de viaţă a scăzut numărul de miocite proliferative cu 23% (Choi et al., 2002).

Cortizolul este un hormon fetal cheie care influenţează diferenţierea celulară şi organică (Challis et al., 2001). Nivele mari de cortizol apar ca rezultat al travaliului, şi steroizi sintetici sunt folosiţi în tratamentul travaliului prematur. Cortizolul a fost hipertensinogen la fetusul ovin (Tangalakis et al., 1992) şi a produs reducerea nivelelor de ADN cardiac la fetusul ovin (Rudolph et al., 1999). Dexametazona administrată prenatal de asemenea a scăzut cantitatea de ADN în cordurile neonatale de şobolan (Slotkin et al., 1991).

Lindpaintner şi colaboratorii (Lindpaintner et al., 1990) au arătat că pretratamentul cu dexametazonă a stimulat expresia genei angiotensinogenului şi efluxul angiotensinogenului din inima de şobolan adult. Se ştie că Angiotensina II induce hipertrofie cardiacă şi cascadele de semnalizare asociate cu hipertrofia şi creşterea miocitară.

Pornind de la datele din literatură, Lumbers şi colaboratorii (Lumbers et al., 2005) au postulat că nivele mari de cortizol ar afecta rata binucleerii celulelor cardiace şi/sau dimensiunea şi numărul lor. Însă, rezultatele studiului lor au arătat că doze mari de cortizol care ar putea apare în perioada postnatală precoce nu alterează rata diferenţierii terminale a miocardocitelor şi nici numărul lor.

Cu ajutorul imunohistochimiei pentru endoglină (CD105) am arătat că reactivitatea începe să apară în inima umană, la aproximativ 5 săptămâni, în stratul viitorului endocard. În timp ce la această vârstă nu au existat vase pozitive în miocardul în sine, imunoreactivitatea începe să apară în celulele endoteliale la 9-10 săptămâni. După această vârstă, semnalul este puternic detectat în vasele endocardului, miocardului şi epicardului.

Valeria Barresi şi colaboratorii (Valeria et al., 2008) au arătat că în primul trimestru de sarcină, imunoexpresia endoglinei a fost pozitivă în endocardul din cordul unui fetus de nouă săptămâni, în conformitate cu rezultatele deja raportate de către alţi autori privind exprimarea endoglinei în inima omului (Qu et al., 1998) şi la rozătoare la începutul dezvoltării. În embrionul de şoarece, endoglina se ştie că apare după 8.5 zile în tubul cordului primitiv, şi mai târziu în celulele endoteliale de-a lungul sistemului vascular în curs de dezvoltare (Jonker and Arthur, 2002). De fapt, această apariţie timpurie a endoglinei pare a avea un rol important în timpul procesului de dezvoltare a inimii şi vascularizaţiei, fiind demonstrat că şoarecilor cărora le lipseşte endoglina dezvoltă malformaţii arterio-venoase (Sorensen et al., 2003), şi ar putea de asemenea, să stea la baza telangiectaziei hemoragice ereditare (Bourdeau et al., 2000). În

25

concordanţă cu datele raportate la pui (Vincent et al., 1998) şi de alte studii pe om (Qu et al., 1998), pozitivitatea imunohistochimică a endoglinei s-a extins la vasele epicardice şi miocardice la 10 şi 11 săptămâni.

S-a demonstrat că vasele de sânge apar prin intermediul a două mecanisme principale, vasculogeneza şi respectiv angiogeneza. Prima este caracterizată de germinarea de noi vase din cele preexistente, iar ultima este definită de proliferarea de novo şi organizarea de precursori ai celulelor endoteliale, care se asamblează în capilare şi apoi se asociază cu circulaţia sistemică. Vascularizarea inimii începe cu aproximaţie la nouă săptămâni de gestaţie; endoglina îşi exercită rolul în angiogeneză mai degrabă decât în vasculogeneză (Bourdeau et al., 2000). Astfel, lipsa endoglinei în vascularizaţia cordului la nouă săptămâni de gestaţie se poate relaţiona cu prevalenţa unui proces vasculogenic, mai degrabă decât cu unul angiogenic la această vârstă. Putem presupune că angiogeneza începe numai în săptămâna 10 de gestaţie, atunci când apar în peretele cardiac vasele pozitive la endoglină. Deoarece vascularizaţia inimii derivă din epicard, pozitivitatea simultană a endoglinei în vasele epicardice şi miocardice nu este surprinzătoare. Colorarea endoglinei în endocard, precum şi în vasele miocardice şi epicardice, a fost menţinută la majoritatea fetuşilor în trimestrul al doilea de sarcină, la un făt în trimestrul al treilea şi la 2 nou-născuţi prematuri. La fătul la termen, imunoexpresia endoglinei a fost absentă în vasele epicardice.

Persistenţa endoglinei în cordul neonatal, este în concordanţă cu expresia demonstrată a endoglinei în capilare şi în valvele cordului adult şi sugerează că rolul endoglinei nu se limitează la dezvoltarea cardiacă precoce.

În mod consecvent, cu datele existente se poate presupune că procesul de angiogeneză şi de dezvoltare cardiacă, este perpetuu la mijlocul sarcinii şi în gestaţia târzie, precum şi la nou-născut.

Studiul moleculei CD31 (PECAM-1) arată dinamica maturării vaselor şi celulelor endoteliale în intervalul de timp studiat. Este cunoscut faptul că PECAM-1 este unul dintre cei mai vechi receptori de adeziune exprimaţi de către celulele vasculogenice (Pardanaud and eterlen-Lievre, 1993). Este exprimată în sacul vitelin rapid după implantare şi mai târziu în embrionul în sine (Baldwin et al., 1994). În conformitate cu aceste date, studiul nostru a arătat o imunocolorare puternică în celulele împrăştiate pe zona viitorului miocard ventricular la 5 săptămâni de viaţă. A fost interesant de notat faptul că la această vârstă colorarea nu a putut fi observată nici în lumenul structurilor asemănătoare vaselor, nici în endocardul în sine. La 7 săptămâni de dezvoltare endocardul şi vasele bine conturate deja exprimau puternic CD31. O dată cu înaintarea în vârstă a fost înregistrat un număr de vase crescând proporţional, iar această creştere a avut un vârf în jurul vârstei de 20 de săptămâni. Vasele epicardice mari au părut să înceapă exprimarea de CD31 numai după ce molecula a fost deja bine detectabilă în endocard şi miocard. Chiar dacă celulele pozitive la CD31 apar foarte devreme în linia de dezvoltare a cordului, fără a forma structuri tubulare clare, se pare că aceste celule sunt deja diferenţiate şi şi-au pierdut proprietăţile lor pluripotente, după cum s-a demonstrat că, celulele care exprimă antigenul stem SCA-1 nu co-exprimă CD-31 (Pfister et al., 2005). Pe de altă parte, se ştie că epicardul joacă un rol crucial în vascularizaţia inimii, deoarece este un ţesut mezotelial şi o sursă de celule precursoare a vaselor coronare prin tranziţia de la epiteliu la mezenchim (Manner et al., 2001; Olivey et al., 2004). Alte studii au arătat că aceste celule migratorii pot da naştere la celulele endoteliale şi musculare netede vasculare, precum şi la fibroblaştii perivasculari (Vrancken Peeters et al., 1999). Observaţiile noastre arată că vasele subepicardice nu par să se dezvolte mai devreme decât vasele miocardice, şi acest lucru ar putea reflecta faptul că, deşi derivate din mezoteliu, aceste celule au nevoie de alţi factori pentru a se maturiza în celule endoteliale adulte (Wagner et al., 2005).

Prin analiza preparatelor imunocolorate pentru desmină, am arătat că reactivitatea a început să apară de la vârsta de 9 săptămâni numai în cardiomiocite. În etapa iniţială de detectare, desmina părea să căptuşească membrana plasmatică a cardiomiocitelor. Pozitivitatea a fost mai intensă în stratul imediat subepicardic faţă de miocardul în sine. Începând cu 17

26

săptămâni de viaţă, desmina a fost, de asemenea, localizată în striaţiile miofibrilelor în citoplasma cardiomiocitelor, deja atingând modelul celulei musculare striate mature. La 33 de săptămâni au apărut primele miocite binucleate şi primele discuri intercalare. Kim şi Lee au arătat că primele miocite binucleate apar la 32 de săptămâni, acest lucru sugerând că hiperplazia miocitelor ar putea înceta la oameni înainte de naştere (Kim et al., 1992).

Vimentina a fost prezentă în celulele mezenchimale din primul moment analizat. Pe măsură ce lumenul vaselor de sânge a devenit tot mai clar vizibil, vimentina a prezentat, de asemenea, o localizare perivasculară. Vimentina a fost puternic exprimată în celulele musculare netede ale aortei, în timp ce desmina nu a putut fi detectată în acest compartiment. Pe peretele interior al endocadului la nivelul viitoarelor valve atrio-ventriculare rezultatul a fost, de asemenea, pozitiv pentru vimentină. O dată cu înaintarea în vârstă a embrionului, expresia vimentinei diminuă în miocardul în sine, rămânând prezentă în jurul vaselor şi într-o mai mare măsură în vasele subepicardice. Filamentul intermediar desmina furnizează suport pentru mecanismul contractil în celulele musculare, iar vimentina joacă un rol important în menţinerea stabilităţii celulelor mezenchimale şi în propagarea semnalului. Kim (Kim, 1996) a studiat dezvoltarea desminei şi vimentinei în cordurile fetale umane cu vârste cuprinse între 9 şi 28 de săptămâni de gestaţie din punct de vedere imunohistochimic cu anticorpi monoclonali pentru desmină şi vimentină. Densitatea relativă de fluorescenţă a fiecărei probe a fost determinată prin densitometrie. Ţesuturile ventriculului stâng de la un copil de un an au fost analizate imunohistochimic pentru comparaţie postnatală. Desmina de 53-kDa şi vimentina de 54-kDa au fost prezente în toate ţesuturile cordului fetal examinate. Intensitatea desminei a crescut progresiv cu creşterea vârstei fetale, în timp ce intensitatea vimentinei a scăzut. Desmina a fost prezentă numai în cardiomiocite. În perioada precoce (10-14 săptămâni de gestaţie), desmina a fost localizată de-a lungul membranei cadiomiocitului şi/sau liniilor Z la intervale regulate, iar mai târziu (25-28 săptămâni de gestaţie) a fost bine integrată structural; totuşi, reţeaua sa a fost incompletă. Numai cardiomiocitele de la copilul de un an au arătat reţele de desmină înalt dezvoltate şi integrate. Însă vimentina a fost prezentă în ţesutul mezenchimal incluzând fibroblastele şi vasele sangvine înconjurătoare. În parte, anumite miocardocite au arătat o reacţie slab pozitivă cu anticopi monoclonali pentru vimentină în săptămânile 9-14 de gestaţie. Totuşi, ariile pozitive pentru vimentină s-au diminuat progresiv cu creşterea vârstei fetale. Vimentina a fost prezentă numai în ţesutul conjunctiv şi învelişurile inimii copilului de un an. Densitatea relativă de fluorescenţă a desminei a crescut cu creşterea vârstei fetale, pe când cea a vimentinei a scăzut. Aceste rezultate arată că există o expresie a filamentelor intermediare în cordul fetal uman dependentă de vârsta gestaţională: desmina creşte cu creşterea vârstei fetale, în timp ce vimentina scade.

În general, desmina a fost prezentă doar în cardiomiocitele din toate mostrele de VS. Au fost identificate două tipuri de imunofluorescenţă: forma globulară (sau punctiformă) şi liniară (sau fibrilară fină). Desmina globulară a prezentat o fluorescenţă relativ puternică şi a fost localizată, în principal de-a lungul marginii interioare a sarcolemei. Desmina liniară a prezentat o fluorescenţă relativ slabă şi a fost localizată în spaţiul sarcoplasmatic, perpendicular pe axul lung al celulelor. Aceste două tipuri de desmină erau interconectate şi formau o reţea. În timpul săptămânilor 9-14 de gestaţie, o fluorescenţă puternică ar putea fi găsită în regiunile perinucleare; cu toate acestea, localizarea desminei liniare şi formarea reţelelor nu au fost aparente. În timpul săptămânilor 15-19 de gestaţie, localizarea modelului de desmină a fost similară cu cea din perioada precedentă; cu toate acestea, formarea de reţele a fost relativ evidentă. Interconectarea desminei globulare şi liniare a avut loc în porţiunea adâncă a spaţiului sarcoplasmatic şi păreau să fie unite cu cele contralaterale în timpul săptămânilor 20-24 de gestaţie. Acest model de localizare a fost relativ constant pe parcursul săptămânilor 25-28 de gestaţie, dar fluorescenţa a fost mai puternică şi interconectarea desminei (dintr-o parte în alta a sarcolemei) a fost clar observată. Localizarea desminei nu s-a schimbat în mod semnificativ în cardiomiocitele din inima copilului de 1 an, dar formarea reţelelor a fost mai clară.

27

În general, vimentina a fost prezentă în principal în ţesutul mezenchimal (conjunctiv). În timpul săptămânilor 9-14 de gestaţie, vimentina a fost prezentă în ţesutul mezenchimal şi în cardiomiocite, cu intensitate uşoară. Fibroblaştii au prezentat o intensitate puternică. O dată cu înaintarea în vârsta fetală (în cursul săptămânilor 15-19 şi 20-24 de gestaţie), intensitatea vimentinei are o tendinţă de scădere şi a fost prezentă în ţesuturile perimissium-ului, precum şi în apropierea vaselor de sânge. În perioada săptămânilor 25-28 de gestaţie, colorarea vimentinei a fost mai puţin intensă decât în perioadele anterioare, dar localizarea modelului a fost similară. La 1 an după naştere, vimentina a fost prezentă în ţesutul mezenchimal, incluzând endocardul, pericardul, fibroblastele, fibrocitele, şi în apropierea vaselor de sânge, dar modelul de localizare a fost similar cu cel din perioada târzie fetală (săptămânile 25-28 de gestaţie).

Sub 15 săptămâni de gestaţie, o parte dintre cardiomiocite prezintă reacţii relativ slab pozitive cu anticorpi împotriva vimentinei. Motivul pentru care vimentina este localizată în cardiomiocite nu este clar. Vimentina a fost localizată în celulele cardiace nediferenţiate şi cele ale muşchilor scheletici în perioadele fetale timpurii (Gard and Lazarides, 1980), putând să copolimerizeze cu desmina sau proteina glială fibrilară acidă.

Price şi Lazarides au raportat că vimentina este prezentă în cardiomiocitele puilor nou-născuţi, dar este absentă la puii adulţi. Prin urmare, vimentina poate avea o funcţie asemănătoare desminei în perioadele fetale timpurii, şi aceasta poate fi înlocuită cu desmina o dată cu dezvoltarea. Yang şi Makita (Yang and Makita, 1996) au studiat raportul dintre desmină şi vimentină în muşchiul scheletic fetal uman prin studii de microscopie electronică. La 20 de săptămâni de gestaţie, miocitul era plin cu miofibrile diferenţiate. Desmina (particule de aur de 10-nm) şi vimentina (particule de aur de 5-nm) au fost distribuite rar printre miofibrile. Unele FI (filamente intermediare) erau dispuse longitudinal, paralel cu miofibrilele, şi altele erau dispuse transversal peste miofibrile. Desmina şi vimentina au fost distribuite de-a lungul aceloraşi filamente în miocite. Filamente de desmină şi vimentină au fost, de asemenea, identificate în spaţiul subsarcolemal. La o mărire mai mare, vimentina a fost evidentă în acest spaţiu subsarcolemal. Raportul dintre vimentină şi desmină în diferite miocite a variat chiar şi în acelaşi stadiu de dezvoltare. Distanţa cea mai întâlnită între două particule de aur de-a lungul unui FI a fost de aproximativ 40-50 nm. La 29 de săptămâni de gestaţie, filamentele intermediare desmina şi vimentina au fost identificate între miofibrile, în spaţiul subsarcolemal şi mioblast. În apropierea miofibrilelor diferenţiate, cele mai multe FI identificate au fost reprezentate de desmină, deşi vimentina a fost identificată în regiunea nediferenţiată a aceloraşi miocite. În această etapă, reţelele de FI au fost de asemenea identificate în spaţiul subsarcolemal, unde au fost localizate miofibrilele netede. Comparativ cu numărul FI la 20 de săptămâni, numărul FI de desmină a crescut şi cel de vimentină a scăzut. Unele filamente au fost ataşate membranei plasmatice; altele au format reţele complicate care au fost conectate între ele, iar altele au fost asociate miofibrilelor nestriate. Vimentina şi desmina au fost identificate în mioblaşti între săptămânile 20 şi 29 de gestaţie în care miofibrilele diferenţiate nu erau formate. Atât desmina cât şi vimentina erau aranjate într-o reţea filamentoasă în jurul nucleului. Mai multă vimentină (particule de aur de 5-nm) decât desmină (particule de aur de10-nm) a fost identificată în mioblast.

Demonstraţia morfologică directă a coexistenţei de desmină şi vimentină în acelaşi FI a fost raportată în celulele musculare netede vasculare la bovine şi pui şi în cultura de celule renale de pui de hamster (Quinlan and Franke, 1982; Traub et al., 1993). Utilizând dubla imunomarcare cu feritină şi Imposil conjugat, desmina şi vimentina au fost colocalizate în aceleaşi FI în timpul miogenezei la pui in vivo (Tokuyasu et al., 1985) şi in vitro (Gard and Lazarides, 1980). Aceşti cercetători au sugerat că vimentina ar fi convertită în filamente de desmină în timpul miogenezei. În experimentul lui Yang (Yang and Makita, 1996) particule de aur de 5-nm şi 10-nm au fost distribuite în acelaşi FI al musculaturii scheletice de la fetusul uman. Deşi mecanismul precis reglator al expresiei FI nu este cunoscut, vimentina ar putea face schimb de subunităţi cu masă de vimentină depolimerizată sau dezintegrată (Soellner et al., 1985; Vikstrom et al., 1992).].

28

În studiul lui Yang şi Makita, cantitatea de vimentină a scăzut iar desmina a crescut între săptămânile 20 şi 29, în special în spaţiul subsarcolemal. Prin electroforeza bidimensională în gel, vimentina a coexistat cu desmina în discul Z din musculatura scheletică matură la pui (Granger and Lazarides, 1979). În timpul dezvoltării embrionare a musculaturii scheletice de pui, vimentina a dispărut în momentul eclozării (Tokuyasu et al., 1984). Cantitatea de vimentină în musculatura scheletică a embrionului de porc (45 zile), apoi neonatal, şi postnatal (30 luni) a fost de aproximativ 75%, 15% şi respectiv 5% (Bilak et al., 1987).

La fătul uman, raportul desmină/vimentină variază între miocite chiar în acelaşi stadiu al dezvoltării. Schimbarea raportului desmină/vimentină poate să se reflecte într-o modificare subtilă a structurii fine în timpul miogenezei fetale umane.

În general, FI au un rol important în mecanismul miogenezei (Gard and Lazarides, 1980; Tokuyasu et al., 1984). În miocitele fetale umane, FI desmina şi vimentina au fost localizate într-o reţea complexă în mioplasmă şi în spaţiul subsarcolemal. Sunt dispuse longitudinal şi transversal în jurul miofibrilelor diferenţiate. Această dispunere a sugerat că FI ar putea sprijini şi consolida arhitectura celulară şi interconectările dintre miofibrile şi dintre miofibrile şi sarcolemă. În spaţiul subsarcolemal, unele FI de desmină şi vimentină au fost ataşate la sarcolemă, iar altele au format reţele complicate asociate cu miofibrilele nestriate. În mioblast, FI de desmină şi vimentină din jurul nucleului pot juca un rol în fixarea poziţiei nucleare. Orientarea longitudinală a filamentelor de vimentină în mioblaşti şi în miocitele imature ar ajuta la menţinerea formei bipolare a celulelor si ajută la alinierea paralelă a miofilamentelor alungite. Relaţia dintre complexul de FI cu miofibrilele poate fi asemănătoare cu cea dintre filamentele de ţesut conjunctiv şi celulele parenchimatoase. Membrana plasmatică şi filamentele submembranare asociate acesteia sunt, probabil, direct implicate în asamblarea miofibrilelor (Yang and Makita, 1996).

În musculatura scheletică umană şi în miogeneza in vitro la pui, desmina nu a fost încorporată în miofibrile până nu a apărut alinierea completă a sarcomerelor (van, V et al., 1992; van, V et al., 1993). Au fost raportate diferenţe temporare în expresia desminei între mioblaştii din musculatura scheletică embrionară la pui (Yablonka-Reuveni and Nameroff, 1990). Desmina apare înaintea α-actinei în mioblaştii embrionari şi desmina poate fi un marker al etapei iniţiale în miogeneză (Babai et al., 1990). Desmina a fost găsită în mioblast înaintea diferenţierii miofibrilelor, sprijinind astfel constatările altora (Yablonka-Reuveni and Nameroff, 1990). În gena umană a desminei, regiuni potenţatoare specifice pentru mioblast s-au diferenţiat de regiunile potenţatoare specifice miotubului.

Am studiat de asemenea, α-SMA, atât pentru maturarea vasculară cât şi pentru miocardocitele per se. Astfel, în timpul ontogenezei cordului uman, am demonstrat prezenţa tranzitorie a α-SMA începând cu vârsta de 9 săptămâni şi că înainte de săptămâna 33, expresia α-SMA în miocard scade până la dispariţie.

Studiile anterioare efectuate pe păsări sau non-primate au arătat că există o activare secvenţială a genelor pentru SMA în timpul cardiogenezei timpurii (Ruzicka and Schwartz, 1988; Clement et al., 2007).

Semnificaţia acestei exprimări tranzitorii a α-SMA în timpul dezvoltării muşchiului striat nu este complet cunoscută. De vreme ce creşterea expresiei sale coincide cu începutul formării miofibrilelor, acest fapt ar putea sugera că ar putea avea un rol în organizarea şi contractilitatea sarcomerului (Clement et al., 2007; Marinas et al., 2011). De asemenea, exprimarea ei scade pe măsură ce sarcomerele devin mai organizate, în stadiile ulterioare (Sawtell and Lessard, 1989).

La şobolan, unde dezvoltarea cardiacă apare rapid între zilele de gestaţie 9 şi 11, progresând de la mezenchimul cardiac primordial la un cord bătând tetracameral, studiile imunohistochimice nu au detectat reacţie pozitivă pentru anticorpii specifici actinei musculare înainte de ziua 10 de gestaţie. Totuşi, în ziua a 10-a gestaţională, anticorpii monoclonali pentru actina musculară şi pentru α-SMA au colorat intens stratul celulelor miocardului inimii în dezvoltare. La embrionii de la sfârşitul zilei a 10-a au putut fi identificate atriul, ventriculul şi sinusul venos şi o reacţie intens pozitivă pentru anticorpii monoclonali actină musculară şi α-

29

SMA a fost prezentă în toate celulele miocardului atrial şi ventricular. În schimb, deşi majoritatea celulelor care formau sinusul venos s-au colorat cu actină musculară, numai o subpopulaţie dintre acestea a arătat reacţie pozitivă la α-SMA (Sawtell and Lessard, 1989).

În muşchiul scheletic şi cardiac în dezvoltare, a fost vizibil un pattern striat atât cu α-SMA cât şi cu actina musculară. Până în ziua 10 de gestaţie, deja multe miocardocite conţineau α-SMA în unităţi aliniate sistematic.

Imunocolorarea cu anticorpi pentru actina musculară şi pentru α-SMA a continuat să fie prezentă în miocardul atrial şi ventricular din ziua 13 de gestaţie, însă secţiunile prin diferite regiuni ale inimii la această vârstă au arătat că intensitatea reacţiei pozitive la α-SMA printre miocardocite nu a mai fost omogenă. Cu toate că o reacţie uniformă foarte intensă a fost prezentă în pereţii bulbului arterial, nu toate miocardocitele din grosimea peretelui ventricular au exprimat în mod egal α-SMA. Până în ziua 17 de gestaţie (termenul fiind 22-23 zile), a avut loc o scădere marcată a colorării cu α-SMA în straturile interne ale miocardului ventricular, în contrast cu intensitatea uniformă a colorării cu actină musculară în această regiune. Miocardul atrial însă, a continuat să exprime puternic atât actină musculară cât şi α-SMA (Sawtell and Lessard, 1989).

Postnatal, până la sfârşitul primei săptămâni, nu a mai fost detectată reacţie pozitivă la α-SMA în miofibrele striate atât scheletale cât şi cardiace. La şobolanul adult, actina musculară este exprimată în toate miocitele striate ca şi în celulele musculaturii netede din pereţii vaselor, spre deosebire de α-SMA care s-a pozitivat doar în celulele musculare netede din jurul vaselor mari şi din multe vase cu diametre mai mici.

La embrionii de şoarece, s-a arătat că în ziua 9.5 de gestaţie, toate izoformele α-actinei sunt prezente în inimă. În ziua 17 de gestaţie, expresia α-SMA a început să scadă şi, la 2 săptămâni după naştere, a fost exprimată numai în celulele musculare netede din interiorul vaselor (Clement et al., 2007).

Studiul nostru a arătat de asemenea că, în cordul uman, începând cu săptămâna 20, expresia α-SMA a fost preponderentă la nivelul tunicii medii a vaselor mai mari, iar la 33 de săptămâni şi în vasele mai mici.

Ruzicka şi colaboratorii au arătat că, la embrionul de pui aflat în stadiul Hamburger-Hamilton 12, expresia genei pentru α-SMA a scăzut selectiv în inimă astfel încât numai conul cardiac, care participă ulterior la formarea trunchiurilor vasculare, a continuat să exprime această genă (Ruzicka and Schwartz, 1988).

Clement şi colaboratorii au demonstrat expresia temporală a izoformelor de actină prin triplă imunofluorescenţă pe corpii embrioizi din ziua 6, 8, 12 şi 15 (Clement et al., 2007). Astfel, prima izoformă de actină exprimată este α-SMA, apărând în ziua 6 în celulele stratului extern al corpilor embrioizi. În ziua 8, s-a observat că toate cele 3 izoforme erau organizate în striaţii dar că expresia lor era heterogenă în aria contractilă. α-SMA a fost de asemenea, înalt exprimată în celulele asemănătoare fibroblastelor care mărginesc corpii embrioizi, aşa cum a fost descris mai înainte (Ng et al., 1997). Din ziua a 12-a, expresia α-SMA a diminuat marcat în miocardocite, dar nu şi în celulele asemănătoare fibroblastelor (Clement et al., 2007). Astfel s-a confirmat că expresia izoformelor de α-actină musculară arată o secvenţă temporală similară în timpul diferenţierii celulelor stem embrionare in vivo şi dezvoltării cardiace in vitro (Clement et al., 2007).

Inhibiţia exprimării şi organizării α-SMA cu ajutorul peptidelor de fuziune prin interferare (SMA-FP) a blocat procesul de diferenţiere, aşa cum s-a reflectat prin scăderea procentului de corpi embrioizi contractili (Clement et al., 2007). Acest efect poate fi explicat prin 3 mecanisme: (1) α-SMA ar putea constitui un schelet pentru organizarea proteinei contractile în timpul miofibrilogenezei. Faptul că SMA-FP alterează în mod specific formarea miofibrilelor este un argument în favoarea acestei noţiuni, aşa cum se presupusese anterior (Ehler et al., 2004). (2) α-SMA ar putea fi un factor major în producerea tensiunii celulare. S-a arătat că forţele fluide hemodinamice joacă un rol important în timpul miocardogenezei, iar pierderea stresului de forfecare duce la formarea anormală a camerelor şi valvelor cardiace (Illi et al., 2005). Se poate

30

astfel imagina că absenţa α-SMA duce la o tensiune celulară redusă şi, în consecinţă, la o blocadă a cardiogenezei. (3)

S-a arătat că activităţile α-SMA şi α-SKA infuenţează diferit ritmicitatea miocardocitelor. O dată ce miocardocitele se contractă spontan, SKA-FP scade frecvenţa bătăilor miocardocitelor, în timp ce SMA-FP induce aritmii (Clement et al., 2007). Mai complexă este interpretarea efectului SMA-FP. Dat fiind faptul că celulele stem embrionare pot forma in vitro un sistem de conducere cardiac funcţional (White and Claycomb, 2005), o explicaţie tentantă pentru această inducere de aritmii ar putea fi că celulele pacemaker sunt afectate preferenţial de SMA-FP. O observaţie favorizând această idee este aceea că, în timpul dezvoltării cordului şobolanului, exprimarea α-SMA persistă mai mult timp în sistemul de conducere ventricular (Ya et al., 1997). La embrionul de 33 săptămâni am descoperit în 1/3 superioară a peretele atriului stâng la nivelul epicardului, ganglioni vegetativi bine formaţi, înconjuraţi de ţesut conjunctiv cu tendinţa de a forma o capsulă. Navaratnam (1965) a demonstrat prezenţa ganglionilor vegetativi începând cu vârsta de 8 săptămâni pe suprafaţa anterioară a atriului stâng (Navaratnam, 1965). În cordul adult, Singh şi colaboratorii (1996) au realizat o topografie a ganglionilor vegetativi. Astfel, ei au găsit cele mai mari populaţii de ganglioni cardiaci în jurul nodului sinusal şi nodului atrioventricular. Populaţii mai mici au fost descoperite pe suprafaţa anterioară şi superioară a atriului stâng şi lateral de venele pulmonare stângi. În plus, au fost identificaţi ganglioni cardiaci şi la baza marilor vase şi a ventriculilor (Singh et al., 1996).

Capitolul VI - ˝Concluzii˝

• Studiul nostru a arătat că formarea miofibrilelor în miocardocitele umane începe să fie

vizibilă în microscopia optică la vârsta embrionară de 15 săptămâni, imediat subsarcolemal. Aceasta se corelează cu studiile in vitro sau pe modele animale care descriu plăcile dense ce par să iniţieze formarea miofibrilelor şi care par să fie ancorate în partea internă a membranei plasmatice.

• Am descoperit o maturare nucleară bruscă între săptămânile 15 şi 17, cu o pierdere rapidă a

expresiei proteinei PCNA. Interesant, acest fenomen de maturare a apărut după ce primele miofibrile au început să fie observate în microscopia optică. Dat fiind faptul că microscopia electronică ar putea de fapt să detecteze aceste structuri mai devreme în evoluţie, acest interval de timp este chiar mai mare de 2 săptămâni. Astfel, se pare că miocardocitele îşi păstrează capacitatea mitotică până după ce începe sinteza miofibrilelor. Pentru viitor, o mai bună înţelegere a modului cum aceste procese sunt cuplate ar putea oferi noi speranţe pentru regenerarea miocardocitelor adulte în bolile cardiace.

• Studiul nostru a comparat pentru prima dată, expresiile CD31 şi CD105 în analiza dezvoltării

vascularizaţiei cordului, împreună cu două filamente intermediare larg distribuite, desmina şi vimentina, dar şi cu α-actina muşchiului neted.

• Am arătat că există diferenţe legate nu doar de momentul exprimării acestor markeri, dar, de

asemenea, şi diferenţe legate de structură. Astfel, aratăm că, în timp ce CD105 apare în endocard, CD31 este prezent mult mai devreme în zona viitorului miocard. Angiogeneza începe la vârsta de aproximativ 10 săptămâni. Densitatea vaselor a crescut rapid începând cu vârsta de 20 de săptămâni, majoritatea dintre ele având lumenul clar format.

• În ceea ce priveşte elementele citoscheletale, α-SMA şi desmina par a fi strâns legate de

formarea miofibrilelor, deoarece ambele încep de la periferia miocitelor, în timp ce vimentina pare în principal, să moduleze integritatea ţesutului de susţinere.

31

• Vimentina a fost găsită şi în peretele aortei şi la nivelul viitoarelor valve atrio-ventriculare. O dată cu înaintarea în vârstă a embrionului, expresia vimentinei diminuă în miocardul în sine, rămânând prezentă în jurul vaselor şi mai ales în vasele subepicardice.

• Studiul cu imunofluorescenţă a descris pentru prima dată prezenţa tranzitorie a α-SMA în

miocardocitele cordului fetal uman între săptămânile 9 şi 20 de dezvoltare, cu dispariţia sa din miocard înainte de săptămâna 33, sugerând un rol în formarea sarcomerelor. Începând cu săptămâna 33, exprimarea α-SMA a fost prezentă doar la nivelul tunicii medii a vaselor. În plus, expresia CD31 a fost pozitivă sub formă punctată în celulele endoteliale în formare şi, începând cu săptămâna 20 de dezvoltare, sub formă liniară în endoteliul vaselor cu lumen bine individualizat.

• De asemenea, am observat apariţia primelor miocite binucleate şi a primelor discuri

intercalare la vârsta de 33 de săptămâni, acest lucru corelându-se cu alte studii pe cord fetal uman care sugerează că hiperplazia miocitară ar putea înceta la oameni înainte de naştere.

• Tot la 33 de săptămâni am identificat în peretele atriului stâng la nivelul epicardului

ganglioni vegetativi bine individualizaţi. • Deoarece dinamica de formare a cordului şi a bolilor sale este condusă de un echilibru între

componentele vasculare, miocite şi stromă, înţelegerea interacţiunilor lor va îmbunătăţi cunoştinţele noastre în ambele direcţii.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Babai,F., Musevi-Aghdam,J., Schurch,W., Royal,A., and Gabbiani,G. (1990). Coexpression of alpha-sarcomeric actin, alpha-smooth muscle actin and desmin during myogenesis in rat and mouse embryos I. Skeletal muscle. Differentiation 44, 132-142.

2. Baldwin,H.S., Shen,H.M., Yan,H.C., DeLisser,H.M., Chung,A., Mickanin,C., Trask,T., Kirschbaum,N.E., Newman,P.J., Albelda,S.M., and . (1994). Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1/CD31): alternatively spliced, functionally distinct isoforms expressed during mammalian cardiovascular development. Development 120, 2539-2553.

3. Beinlich,C.J., Rissinger,C.J., and Morgan,H.E. (1995). Mechanisms of rapid growth in the neonatal pig heart. J. Mol. Cell Cardiol. 27, 273-281.

4. Beinlich,C.J., White,G.J., Baker,K.M., and Morgan,H.E. (1991). Angiotensin II and left ventricular growth in newborn pig heart. J. Mol. Cell Cardiol. 23, 1031-1038.

5. Bellone,G., Solerio,D., Chiusa,L., Brondino,G., Carbone,A., Prati,A., Scirelli,T., Camandona,M., Palestro,G., and Dei,P.M. (2007). Transforming growth factor-beta binding receptor endoglin (CD105) expression in esophageal cancer and in adjacent nontumorous esophagus as prognostic predictor of recurrence. Ann. Surg. Oncol. 14, 3232-3242.

6. Bilak,S.R., Bremner,E.M., and Robson,R.M. (1987). Composition of intermediate filament subunit proteins in embryonic, neonatal and postnatal porcine skeletal muscle. J. Anim Sci. 64, 601-606.

32

7. Bourdeau,A., Faughnan,M.E., and Letarte,M. (2000). Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, 279-285.

8. Buck,C.A., Baldwin,H.S., DeLisser,H., Mickanin,C., Shen,H.M., Kennedy,G., Chen,A., Edelman,J.M., and Albelda,S.M. (1993). Cell adhesion receptors and early mammalian heart development: an overview. C. R. Acad. Sci. III 316, 838-859.

9. Burrage,T.G. and Sherman,R.G. (1979). Formation of sarcomeres in the embryonic heart of the lobster. Cell Tissue Res. 198, 477-486.

10. Burrell,J.H., Boyn,A.M., Kumarasamy,V., Hsieh,A., Head,S.I., and Lumbers,E.R. (2003). Growth and maturation of cardiac myocytes in fetal sheep in the second half of gestation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 274, 952-961.

11. Carrier,L., Boheler,K.R., Chassagne,C., de la,B.D., Wisnewsky,C., Lakatta,E.G., and Schwartz,K. (1992). Expression of the sarcomeric actin isogenes in the rat heart with development and senescence. Circ. Res. 70, 999-1005.

12. Challis,J.R., Sloboda,D., Matthews,S.G., Holloway,A., Alfaidy,N., Patel,F.A., Whittle,W., Fraser,M., Moss,T.J., and Newnham,J. (2001). The fetal placental hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, parturition and post natal health. Mol. Cell Endocrinol. 185, 135-144.

13. Choi,J.H., Yoo,K.H., Cheon,H.W., Kim,K.B., Hong,Y.S., Lee,J.W., Kim,S.K., and Kim,C.H. (2002). Angiotensin converting enzyme inhibition decreases cell turnover in the neonatal rat heart. Pediatr. Res. 52, 325-332.

14. Clement,S., Stouffs,M., Bettiol,E., Kampf,S., Krause,K.H., Chaponnier,C., and Jaconi,M. (2007). Expression and function of alpha-smooth muscle actin during embryonic-stem-cell-derived cardiomyocyte differentiation. J. Cell Sci. 120, 229-238.

15. Clubb,F.J., Jr. and Bishop,S.P. (1984). Formation of binucleated myocardial cells in the neonatal rat. An index for growth hypertrophy. Lab Invest 50, 571-577.

16. Dlugosz,A.A., Antin,P.B., Nachmias,V.T., and Holtzer,H. (1984). The relationship between stress fiber-like structures and nascent myofibrils in cultured cardiac myocytes. J. Cell Biol. 99, 2268-2278.

17. Ehler,E., Fowler,V.M., and Perriard,J.C. (2004). Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: role of actin isoforms and of the pointed end actin capping protein tropomodulin during thin filament assembly. Dev. Dyn. 229, 745-755.

18. Ehler,E., Rothen,B.M., Hammerle,S.P., Komiyama,M., and Perriard,J.C. (1999). Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. J. Cell Sci. 112 ( Pt 10), 1529-1539.

19. Fischman,D.A. (1967). An electron microscope study of myofibril formation in embryonic chick skeletal muscle. J. Cell Biol. 32, 557-575.

20. Furst,D.O., Osborn,M., and Weber,K. (1989). Myogenesis in the mouse embryo: differential onset of expression of myogenic proteins and the involvement of titin in myofibril assembly. J. Cell Biol. 109, 517-527.

33

21. Gard,D.L. and Lazarides,E. (1980). The synthesis and distribution of desmin and vimentin during myogenesis in vitro. Cell 19, 263-275.

22. Granger,B.L. and Lazarides,E. (1979). Desmin and vimentin coexist at the periphery of the myofibril Z disc. Cell 18, 1053-1063.

23. Henrikson,R.C. (1977). Histology. (Baltimore.

24. Huttenbach,Y., Ostrowski,M.L., Thaller,D., and Kim,H.S. (2001). Cell proliferation in the growing human heart: MIB-1 immunostaining in preterm and term infants at autopsy. Cardiovasc. Pathol. 10, 119-123.

25. Icardo,J.M. (1988). Heart anatomy and developmental biology. Experientia 44, 910-919.

26. Illi,B., Scopece,A., Nanni,S., Farsetti,A., Morgante,L., Biglioli,P., Capogrossi,M.C., and Gaetano,C. (2005). Epigenetic histone modification and cardiovascular lineage programming in mouse embryonic stem cells exposed to laminar shear stress. Circ. Res. 96, 501-508.

27. Jonker,L. and Arthur,H.M. (2002). Endoglin expression in early development is associated with vasculogenesis and angiogenesis. Mech. Dev. 110, 193-196.

28. Jonker,S.S., Zhang,L., Louey,S., Giraud,G.D., Thornburg,K.L., and Faber,J.J. (2007). Myocyte enlargement, differentiation, and proliferation kinetics in the fetal sheep heart. J. Appl. Physiol 102, 1130-1142.

29. Kim,H.D. (1996). Expression of intermediate filament desmin and vimentin in the human fetal heart. Anat. Rec. 246, 271-278.

30. Kim,H.D., Kim,D.J., Lee,I.J., Rah,B.J., Sawa,Y., and Schaper,J. (1992). Human fetal heart development after mid-term: morphometry and ultrastructural study. J. Mol. Cell Cardiol. 24, 949-965.

31. Kirby,M.L. (1990). Overview of problems and approaches in heart development. Ann. N. Y. Acad. Sci. 588, 1-7.

32. Li,D.Y., Sorensen,L.K., Brooke,B.S., Urness,L.D., Davis,E.C., Taylor,D.G., Boak,B.B., and Wendel,D.P. (1999). Defective angiogenesis in mice lacking endoglin. Science 284, 1534-1537.

33. Li,F., Wang,X., Capasso,J.M., and Gerdes,A.M. (1996). Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746.

34. Lindpaintner,K., Jin,M.W., Niedermaier,N., Wilhelm,M.J., and Ganten,D. (1990). Cardiac angiotensinogen and its local activation in the isolated perfused beating heart. Circ. Res. 67, 564-573.

35. Lumbers,E.R., Boyce,A.C., Joulianos,G., Kumarasamy,V., Barner,E., Segar,J.L., and Burrell,J.H. (2005). Effects of cortisol on cardiac myocytes and on expression of cardiac genes in fetal sheep. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 288, R567-R574.

34

36. Manasek,F.J. (1968). Embryonic development of the heart. I. A light and electron microscopic study of myocardial development in the early chick embryo. J. Morphol. 125, 329-365.

37. Manner,J., Perez-Pomares,J.M., Macias,D., and Munoz-Chapuli,R. (2001). The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues. Organs 169, 89-103.

38. Marinas,I.D., Marinas,R., and Mogoantã,L. (2011). Light microscopy study on myofibril formation and mitotic potential in human myocardocytes. Studia Universitatis "Vasile Goldis"Seria Stiintele Vietii (Life Sciences Series) 21, 519-524.

39. Markwald,R.R. (1973). Distribution and relationship of precursor Z material to organizing myofibrillar bundles in embryonic rat and hamster ventricular myocytes. J Mol. Cell Cardiol. 5, 341-350.

40. Mercola,M., Ruiz-Lozano,P., and Schneider,M.D. (2011). Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes Dev. 25, 299-309.

41. Messina,D.A. and Lemanski,L.F. (1991). Studies of hamster cardiac myofibrillogenesis in vivo with antibodies to spectrin, desmin, and alpha-actinin. Am. J. Anat. 191, 85-94.

42. Milner,D.J., Weitzer,G., Tran,D., Bradley,A., and Capetanaki,Y. (1996). Disruption of muscle architecture and myocardial degeneration in mice lacking desmin. J. Cell Biol. 134, 1255-1270.

43. Mogoanta,L., Popescu,C.F., Georgescu,C.V., Comanescu,V., and Pirici,D. (2007). Ghid de tehnici de histologie si imunohistochimie. (Craiova: Editura Medicala Universitara).

44. Navaratnam,V. (1965). Development of the nerve supply to the human heart. Br. Heart J. 27, 640-650.

45. Ng,W.A., Doetschman,T., Robbins,J., and Lessard,J.L. (1997). Muscle isoactin expression during in vitro differentiation of murine embryonic stem cells. Pediatr. Res. 41, 285-292.

46. Obermann,W.M., Gautel,M., Steiner,F., van,d., V, Weber,K., and Furst,D.O. (1996). The structure of the sarcomeric M band: localization of defined domains of myomesin, M-protein, and the 250-kD carboxy-terminal region of titin by immunoelectron microscopy. J. Cell Biol. 134, 1441-1453.

47. Olivey,H.E., Compton,L.A., and Barnett,J.V. (2004). Coronary vessel development: the epicardium delivers. Trends Cardiovasc. Med. 14, 247-251.

48. Pardanaud,L. and eterlen-Lievre,F. (1993). Emergence of endothelial and hemopoietic cells in the avian embryo. Anat. Embryol. (Berl) 187, 107-114.

49. Pfister,O., Mouquet,F., Jain,M., Summer,R., Helmes,M., Fine,A., Colucci,W.S., and Liao,R. (2005). CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circ. Res. 97, 52-61.

50. Pollard,T.D. and Cooper,J.A. (1986). Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu. Rev. Biochem. 55, 987-1035.

35

51. Qu,R., Silver,M.M., and Letarte,M. (1998). Distribution of endoglin in early human development reveals high levels on endocardial cushion tissue mesenchyme during valve formation. Cell Tissue Res. 292, 333-343.

52. Quinlan,R.A. and Franke,W.W. (1982). Heteropolymer filaments of vimentin and desmin in vascular smooth muscle tissue and cultured baby hamster kidney cells demonstrated by chemical crosslinking. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 79, 3452-3456.

53. Rudolph,A.M. (2000). Myocardial growth before and after birth: clinical implications. Acta Paediatr. 89, 129-133.

54. Rudolph,A.M., Roman,C., and Gournay,V. (1999). Perinatal myocardial DNA and protein changes in the lamb: effect of cortisol in the fetus. Pediatr. Res. 46, 141-146.

55. Ruzicka,D.L. and Schwartz,R.J. (1988). Sequential activation of alpha-actin genes during avian cardiogenesis: vascular smooth muscle alpha-actin gene transcripts mark the onset of cardiomyocyte differentiation. J. Cell Biol. 107, 2575-2586.

56. Sawtell,N.M. and Lessard,J.L. (1989). Cellular distribution of smooth muscle actins during mammalian embryogenesis: expression of the alpha-vascular but not the gamma-enteric isoform in differentiating striated myocytes. J. Cell Biol. 109, 2929-2937.

57. Schultheiss,T., Lin,Z.X., Lu,M.H., Murray,J., Fischman,D.A., Weber,K., Masaki,T., Imamura,M., and Holtzer,H. (1990). Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. J. Cell Biol. 110, 1159-1172.

58. Schwartz,K., de la,B.D., Bouveret,P., Oliviero,P., Alonso,S., and Buckingham,M. (1986). Alpha-skeletal muscle actin mRNA's accumulate in hypertrophied adult rat hearts. Circ. Res. 59, 551-555.

59. Shiraishi,I., Takamatsu,T., and Fujita,S. (1993). 3-D observation of N-cadherin expression during cardiac myofibrillogenesis of the chick embryo using a confocal laser scanning microscope. Anat. Embryol. (Berl) 187, 115-120.

60. Shiraishi,I., Takamatsu,T., and Fujita,S. (1995). Three-dimensional observation with a confocal scanning laser microscope of fibronectin immunolabeling during cardiac looping in the chick embryo. Anat. Embryol. (Berl) 191, 183-189.

61. Shiraishi,I., Takamatsu,T., Minamikawa,T., and Fujita,S. (1992). 3-D observation of actin filaments during cardiac myofibrinogenesis in chick embryo using a confocal laser scanning microscope. Anat. Embryol. (Berl) 185, 401-408.

62. Shiraishi,I., Takamatsu,T., Price,R.L., and Fujita,S. (1997). Temporal and spatial patterns of phosphotyrosine immunolocalization during cardiac myofibrillogenesis of the chicken embryo. Anat. Embryol. (Berl) 196, 81-89.

63. Singh,S., Johnson,P.I., Lee,R.E., Orfei,E., Lonchyna,V.A., Sullivan,H.J., Montoya,A., Tran,H., Wehrmacher,W.H., and Wurster,R.D. (1996). Topography of cardiac ganglia in the adult human heart. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 112, 943-953.

64. Sissman,N.J. (1970). Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am. J Cardiol. 25, 141-148.

36

65. Slotkin,T.A., Seidler,F.J., Kavlock,R.J., and Bartolome,J.V. (1991). Fetal dexamethasone exposure impairs cellular development in neonatal rat heart and kidney: effects on DNA and protein in whole tissues. Teratology 43, 301-306.

66. Soellner,P., Quinlan,R.A., and Franke,W.W. (1985). Identification of a distinct soluble subunit of an intermediate filament protein: tetrameric vimentin from living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82, 7929-7933.

67. Sorensen,L.K., Brooke,B.S., Li,D.Y., and Urness,L.D. (2003). Loss of distinct arterial and venous boundaries in mice lacking endoglin, a vascular-specific TGFbeta coreceptor. Dev. Biol. 261, 235-250.

68. Steinert,P.M. and Roop,D.R. (1988). Molecular and cellular biology of intermediate filaments. Annu. Rev. Biochem. 57, 593-625.

69. Tangalakis,K., Lumbers,E.R., Moritz,K.M., Towstoless,M.K., and Wintour,E.M. (1992). Effect of cortisol on blood pressure and vascular reactivity in the ovine fetus. Exp. Physiol 77, 709-717.

70. Tokuyasu,K.T. (1989). Immunocytochemical studies of cardiac myofibrillogenesis in early chick embryos. III. Generation of fasciae adherentes and costameres. J. Cell Biol. 108, 43-53.

71. Tokuyasu,K.T. and Maher,P.A. (1987b). Immunocytochemical studies of cardiac myofibrillogenesis in early chick embryos. I. Presence of immunofluorescent titin spots in premyofibril stages. J Cell Biol. 105, 2781-2793.

72. Tokuyasu,K.T. and Maher,P.A. (1987a). Immunocytochemical studies of cardiac myofibrillogenesis in early chick embryos. II. Generation of alpha-actinin dots within titin spots at the time of the first myofibril formation. J. Cell Biol. 105, 2795-2801.

73. Tokuyasu,K.T., Maher,P.A., and Singer,S.J. (1985). Distributions of vimentin and desmin in developing chick myotubes in vivo. II. Immunoelectron microscopic study. J. Cell Biol. 100, 1157-1166.

74. Tokuyasu,K.T., Maher,P.A., and Singer,S.J. (1984). Distributions of vimentin and desmin in developing chick myotubes in vivo. I. Immunofluorescence study. J. Cell Biol. 98, 1961-1972.

75. Traub,P., Kuhn,S., and Grub,S. (1993). Separation and characterization of homo and hetero-oligomers of the intermediate filament proteins desmin and vimentin. J. Mol. Biol. 230, 837-856.

76. Turnacioglu,K.K., Mittal,B., Dabiri,G.A., Sanger,J.M., and Sanger,J.W. (1997). An N-terminal fragment of titin coupled to green fluorescent protein localizes to the Z-bands in living muscle cells: overexpression leads to myofibril disassembly. Mol. Biol. Cell 8, 705-717.

77. Valeria,B., Maddalena,G., Enrica,V., Onofrio,T., and Gaetano,B. (2008). Endoglin (CD105) expression in the human heart throughout gestation: an immunohistochemical study. Reprod. Sci. 15, 1018-1026.

37

78. van der Loop,F.T., Schaart,G., Langmann,W., Ramaekers,F.C., and Viebahn,C. (1992). Expression and organization of muscle specific proteins during the early developmental stages of the rabbit heart. Anat. Embryol. (Berl) 185, 439-450.

79. van der,M.E., Harper,I.S., Owen,P., Lochner,A., Wynchank,S., and Opie,L.H. (1987). Ultrastructural observations on the effects of different substrates on ischaemic contracture in global subtotal ischaemia in the rat heart. Basic Res. Cardiol. 82 Suppl 2, 285-287.

80. van,d., V, Schaart,G., Croes,H.J., Jap,P.H., Ginsel,L.A., and Ramaekers,F.C. (1993). Titin aggregates associated with intermediate filaments align along stress fiber-like structures during human skeletal muscle cell differentiation. J. Cell Sci. 106 ( Pt 3), 749-759.

81. van,d., V, Schaart,G., Jap,P.H., Sengers,R.C., Stadhouders,A.M., and Ramaekers,F.C. (1992). Differentiation of human skeletal muscle cells in culture: maturation as indicated by titin and desmin striation. Cell Tissue Res. 270, 189-198.

82. Vikstrom,K.L., Lim,S.S., Goldman,R.D., and Borisy,G.G. (1992). Steady state dynamics of intermediate filament networks. J. Cell Biol. 118, 121-129.

83. Vincent,E.B., Runyan,R.B., and Weeks,D.L. (1998). Production of the transforming growth factor-beta binding protein endoglin is regulated during chick heart development. Dev. Dyn. 213, 237-247.

84. Vrancken Peeters,M.P., Gittenberger-de Groot,A.C., Mentink,M.M., and Poelmann,R.E. (1999). Smooth muscle cells and fibroblasts of the coronary arteries derive from epithelial-mesenchymal transformation of the epicardium. Anat. Embryol. (Berl) 199, 367-378.

85. Wagner,N., Wagner,K.D., Theres,H., Englert,C., Schedl,A., and Scholz,H. (2005). Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19, 2631-2642.

86. Wang,S.M., Greaser,M.L., Schultz,E., Bulinski,J.C., Lin,J.J., and Lessard,J.L. (1988). Studies on cardiac myofibrillogenesis with antibodies to titin, actin, tropomyosin, and myosin. J. Cell Biol. 107, 1075-1083.

87. White,S.M. and Claycomb,W.C. (2005). Embryonic stem cells form an organized, functional cardiac conduction system in vitro. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 288, H670-H679.

88. Winegrad,S., Wisnewsky,C., and Schwartz,K. (1990). Effect of thyroid hormone on the accumulation of mRNA for skeletal and cardiac alpha-actin in hearts from normal and hypophysectomized rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 2456-2460.

89. Xu,W., Baribault,H., and Adamson,E.D. (1998). Vinculin knockout results in heart and brain defects during embryonic development. Development 125, 327-337.

90. Ya,J., Markman,M.W., Wagenaar,G.T., Blommaart,P.J., Moorman,A.F., and Lamers,W.H. (1997). Expression of the smooth-muscle proteins alpha-smooth-muscle actin and calponin, and of the intermediate filament protein desmin are parameters of cardiomyocyte maturation in the prenatal rat heart. Anat. Rec. 249, 495-505.

38

91. Yablonka-Reuveni,Z. and Nameroff,M. (1990). Temporal differences in desmin expression between myoblasts from embryonic and adult chicken skeletal muscle. Differentiation 45, 21-28.

92. Yang,Y. and Makita,T. (1996). Immunocytochemical localization of desmin in human fetal skeletal muscle. J. Electron Microsc. (Tokyo) 45, 401-406.

93. Young,P., Ferguson,C., Banuelos,S., and Gautel,M. (1998). Molecular structure of the sarcomeric Z-disk: two types of titin interactions lead to an asymmetrical sorting of alpha-actinin. EMBO J. 17, 1614-1624.

Date post:	31-Dec-2016
Category:	Documents
Upload:	dangquynh
View:	223 times
Download:	1 times

contribuţii la studiul histologic şi imunohistochimic al dezvoltării ...

Documents