Colagenul Colagenul este prezent în toate animalele pluricelulare şi reprezintă cea mai abundentă

proteină din vertebrate. Are localizare extracelulară şi este organizat în fibre cu mare rezistenţă la întindere. Este component al ţesuturilor conjunctive fiind prezent în oase, dinţi, cartilaje, tendoane, ligamente, tegument şi vase de sânge. În cantitate mică, se găseşte practic în orice ţesut. Mamiferele prezintă 30 de catene polipeptidice distincte din punct de vedere genetic care se asociază pentru a forma 16 tipuri de colagen care există în acelaşi individ în ţesuturi diferite.

Această proteină extracelulară este alcătuită dintr-un triplu helix , fiecare catenă din acesta, conţinând câte 1000 resturi de aminoacizi. Secvenţa în aminoacizi este regulată, în sensul că aproape fiecare al treilea aminoacid este reprezentat de glicină. Secvenţa Gly-Pro-Hyp se repetă în mod curent

Colagenul este o moleculă cu o lungime de circa 3000 Å şi un diametru de 15 Å.

Figura 3.42 Secvenţa în aminoacizi la capătul C terminal al unui lanţ de colagen α I bovin ce aparţine unei regiuni triplu helicale (Hyp* reprezintă 3-hidroxiprolina).

Pe lângă 4-hidroxiprolină (Hyp), în această proteină fibroasă se mai găsesc şi alţi aminoacizi hidroxilaţi şi anume: 3-hidroxiprolina şi 5-hidroxilizina, dar în cantităţi mult mai mici. Prolina este hidroxilată la hidroxiprolină, sub acţiunea prolil hidroxilazei, după ce catena polipeptidică a fost sintetizată. Prezenţa aminoacizilor hidroxilaţi permite formarea de legături de hidrogen intramoleculare care stabilizează colagenul.

Prolil hidroxilaza are nevoie de prezenţa acidului ascorbic (vitamina C) pentru a-şi manifesta activitatea enzimatică. Carenţa de vitamină C din hrana oamenilor provoacă boala numită scorbut, în care colagenul sintetizat nu poate forma fibre, ceea ce determină apariţia leziunilor la nivelul pielii şi fragilitate vasculară.

Catenele polipeptidice individuale din colagen adoptă o structură de helix de stânga şi se agregă în triplul helix, răsucindu-se una în jurul celeilalte spre dreapta. (Fig. 7-31 Voet). Caracteristicile acestui superhelix sunt n=3,3 şi p=10Å. Evident, în centrul acestui triplu helix

spaţiul disponibil pentru catenele laterale ale aminoacizilor este foarte strâmt şi aşa se explică de ce fiecare al treilea rest este reprezentat de Gly.

Figura 3.43 Structura triplu helix a colagenului

Legăturile peptidice sunt astfel orientate încât hidrogenul iminic al

unui rest de Gly de pe o catenă polipeptidică formează o legătură de hidrogen cu oxigenul carbonilic al unui rest de alt aminoacid de pe o catenă învecinată. Resturile de Pro şi Hyp voluminoase şi relativ inflexibile, conferă rigiditate întregului ansamblu. Colagenul conţine glucide legate covalent, care reprezintă 0,4-12% din masa totală, în funcţie de ţesutul de origine. Acestea sunt reprezentate în special de glucoză, galactoză şi dizaharidele rezultate din combinarea lor şi sunt ancorate la nivelul resturilor de 5-hidroxilizină din colagen sub influenţa unor enzime specifice. Colagenii de diferite tipuri formează fibrile bandate sau agregate de tipul reţelelor. Fibrele bandate sunt alcătuite din diferite tipuri de colagen: I, II, III, V şi IX. Aceste fibrile prezintă o peridiocitate de 680 Å şi un diametru de 100 – 2000 Å, în funcţie de tipurile de colagen pe care le conţin şi de ţesutul de origine.

Figura 3.43 Tip de structură glucidică ancorată covalent de moleculele de colagen

În cadrul fibrilei, moleculele de colagen se aliniază cap la coadă şi interacţionează hidrofob. Zonele clare apar la nivelul discontinuităţilor dintre două triplu helixuri consecutive. Resturile glucidice sunt localizate în zonele clare, ceea ce sugerează că sunt implicate în direcţionarea asamblării fibrilelor.

Figura 3.44 Aspectul bandat al fibrilelor de colagen aşa cum apare la microscopul electronic, se datoreşte aranjamentului supraetajat al moleculelor de colagen, ceea ce conferă un aspect striat. D, reprezintă lungimea ansamblului format dintr-un disc clar şi unul întunecat (D≈680 Å)

Colagenul este insolubil în solvenţi polari datorită legăturilor covalente încrucişate intramoleculare şi intermoleculare, care se formează cu participarea catenelor laterale ale lizinei şi histidinei.

Prima etapă a acestui proces de înreţelare este catalizată de lizil oxidază, o enzimă cu Cu2+ şi în cadrul acesteia resturile de lizină sunt transformate în alizină. Apoi două molecule de alizină suferă o condensare crotonică, iar produsul rezultat reacţionează cu histidina. Acest ultim produs formează o bază Schiff cu 5-hidroxilizina. Astfel se pot lega până la patru lanţuri polipeptidice unul de altul. Aceste legături încrucişate se produc în special la capetele N- şi C- terminale ale moleculelor de colagen. Gradul de înreţelare a colagenului creşte cu vârsta animalului.

3.3.2 Conformaţia tridimensională a proteinelor

3.3.2.1 Legătura peptidică Legătura peptidică, plană şi rigidă, cu puţine excepţii, prezintă o conformaţie trans, astfel încât atomii de carbon α succesivi sunt situaţi pe părţile opuse ale grupării peptidice care îi uneşte. Conformaţia cis este cu aproximativ 8 kcal/mol mai puţin stabilă decât cea trans. Această diferenţă de energie este mai mică în legăturile peptidice urmate de resturi de prolină şi de aceea, circa 10% din resturile de prolină din proteine sunt implicate într-o astfel de legătură în conformaţie cis.

Scheletul unei proteine poate fi privit ca secvenţa legăturilor peptidice plane şi rigide legate între ele (Figura 3.17).

Figura 3.16 Conformaţiile trans şi cis ale legăturii peptidice

Caracterul parţial de dublă legătură al unităţii peptidice se datoreşte delocalizării electronilor π în cadrul sistemului reprezentat de oxigenul carbonilic, carbonul carbonilic şi atomul de azot iminic. În consecinţă, atomii implicaţi în legătura peptidică împreună cu atomii ce carbon α ai aminoacizilor care participă la formarea acesteia, se găsesc în acelaşi plan.

Ca urmare, mărimile geometrice ce definesc conformaţia scheletului catenei polipeptidice sunt unghiurile formate de legăturile covalente simple care leagă fiecare Cα de grupările peptidice plane adiacente. Acestea sunt unghiurile de torsiune sau diedrale referitoare la legăturile dintre Cα – N (unghiul φ) şi Cα – C (unghiul ψ) corespunzătoare fiecărui rest de aminoacid (Figura 3.18). În principiu, unghiurile φ şi ψ pot lua valori între -180˚ şi +180˚, astfel încât toate conformaţiile posibile ale catenei polipeptidice pot fi descrise de aceste unghiuri conformaţionale. Prin convenţie, conformaţia în care φ=0˚ şi ψ=0˚ este cea în care legăturile peptidice consecutive sunt coplanare. Variaţiile pozitive ale unghiurilor φ şi ψ corespund rotaţiei în jurul acelor de ceasornic. Experimentele cu peptide model au dovedit că multe combinaţii ale unghiurilor φ şi ψ nu sunt posibile datorită coliziunilor sterice dintre atomii implicaţi în legătura peptidică, pe de o

parte, şi aceştia şi grupările laterale ale aminoacizilor, pe de altă parte. Informaţiile de acest tip sunt furnizate de diagrama Ramachandran (Figura 3.19).

Glicina, care este singurul aminoacid care nu conţine nici un atom de carbon la nivelul catenei laterale, permite existenţa mult mai multor valori posibile pentru unghiurile φ şi ψ. Diagrama Ramachandran referitoare la resturile de glicină dintr-o catenă polipeptidică dovedeşte acest plus de permisivitate. De aceea acest aminoacid se găseşte în locurile unde catena polipeptidică face o întoarcere în scurt.

Figura 3.17 Conformaţia extinsă a unui lanţ polipeptidic

Figura 3.18 Unghiurile de torsiune ale fiecărei catene polipeptidice

În schimb, prolina este aminoacidul cu cele mai multe constrângeri conformaţionale, datorită catenei sale laterale ciclice.

3.3.2.2 Structura secundară a proteinelor

Structura secundară a unei proteine poate fi definită drept conformaţia locală a scheletului

catenei polipeptidice.

Figura 3.19 Diagrama Ramachandran ce arată valorile unghiurilor φ şi ψ permise din punct de vedere steric pentru poli-L-alanină

Figura 3.20 Diagrama Ramachandran pentru resturile de glicină dintr-un lanţ polipeptidic

Pauling şi Corey, doi clasici ai chimiei proteinelor, au postulat un principiu structural important, conform căruia, în proteine trebuie să se formeze numărul maxim posibil de legături de hidrogen între grupările carbonil şi imino din cadrul legăturilor peptidice de la nivelul catenei polipeptidice.

Modelele de pliere a scheletului catenei polipeptidice sunt: helixul, structurile β pliate, care sunt structuri repetitive şi curbele (bends, loops sau turns), care sunt structuri nerepetitive.

Proteinele ce pot adopta, în soluţie, o serie de conformaţii au o structură dezordonată (random coil).

3.3.2.2 a Helixul

Prin rotirea cu acelaşi unghi în jurul fiecărui atom de carbon α, catena polipeptidică adoptă o conformaţie helicală. Helixul poate fi caracterizat prin:

• numărul de unităţi de aminoacizi per tur de spiră (n), • pasul spirei (p), care este proiecţia unui tur de spiră complet pe axa

helixului • creşterea helixului pentru fiecare rest de aminoacid (d); d=p/n Helixurile pot fi de dreapta sau de stânga, deci prezintă chiralitate. De asemenea, trebuie să prezinte unghiuri φ şi ψ, care să se găsească în

regiunile permisive ale diagramei Ramachandran. Structura α helix este un aranjament rigid al catenei polipeptidice, care prezintă simultan unghiuri conformaţionale permisive şi numărul maxim de legături de hidrogen între unităţile peptidice. A fost descoperită de Pauling în 1951. În cazul polipeptidelor alcătuite din α-aminoacizi din seria sterică L, α helixul este de dreapta şi este caracterizat de n=3,6 resturi de aminocizi per tur de spiră, p=5,4Å, d=1,5 Å şi unghiurile de torsiune φ=-57˚ şi ψ=-47˚. Legăturile

de hidrogen se formează între oxigenul carbonilic al aminoacidului n şi hidrogenul iminic al aminoacidului n+4, ceea ce conduce la o la o distanţă N···O de 2,8 Å care este aproape de optimumul necesar pentru formarea legăturii de hidrogen (2,55-2,77 Å). Între atomii implicaţi în legătura peptidică se stabilesc şi interacţii van de Waals, pe lângă cele de hidrogen, ceea ce explică stabilitatea remarcabilă a acestui tip de structură secundară.

Figura 3.21 Exemple de helixuri. Helixul de dreapta şi stânga sunt definite cu valori n pozitive, respectiv negative.

Teoretic, se pot forma şi α helixuri de stânga, dar acestea nu au fost detectate până acum în proteine. Catenele laterale R ale aminoacizilor sunt orientate spre exteriorul cilindrului delimitat de α helix, pentru a evita împiedicările sterice rezultate în urma interacţiei cu scheletul catenei polipeptidice sau cu alte resturi. Peptidele cu cel puţin 13 resturi de aminoacizi îşi asumă spontan, în apă, această conformaţie. Deşi diferenţa între stabilitatea termodinamică a structurii α helix şi cea complet nepliată, dezordonată, numită random coil, este mică, poli-L-alanina adoptă o conformaţie helicală în soluţii apoase. O proprietate importantă ce decurge din regularitatea acestui tip de structură secundară, care se aplică şi altora este cooperativitatea în pliere. După ce s-a format un singur tur de spiră, adăugarea succesivă a resturilor următoare de aminoacizi se face mult mai rapid. Având în vedere restricţiile sterice, unghiul φ este aproximativ corect pentru fiecare rest adăugat, iar pentru unghiul ψ se ajunge la conformaţia corectă prin formarea legăturii de hidrogen dintre oxigenul carbonilic şi hidrogenul dintr-o grupare imino a unei legături peptidice deja fixată într-o conformaţie helicală. Glicina dezorganizează acest tip de structură secundară, probabil datorită entropiei crescute a lanţului polipeptidic conferite de posibilităţile conformaţionale ale unghiurilor φ şi ψ pentru resturile glicil. Prolina dezorganizează α helixul, datorită valorilor restrictive ale unghiurilor φ şi ψ, care fac ca helixul să se torsioneze. De regulă, resturile prolil se găsesc la sfârşitul helixurilor. Toţi ceilalţi aminoacizi se pot integra în acest element de structură secundară, putând să-l stabilizeze sau să-l destabilizeze. În general, aminoacizii cu catene laterale ce prezintă constante dielectrice mici, stabilizează α helixul, pentru că favorizează formarea legăturilor de hidrogen dintre unităţile peptidice.

Structura α helix prezintă un moment de dipol, pentru că toate legăturile de hidrogen sunt orientate în aceeaşi direcţie şi sunt paralele cu axa structurii. Structura α helix este un helix 3,613, adică conţine 3,6 resturi de aminoacizi per tur de spiră şi 13 atomi, inclusiv atomul de hidrogen implicat în formarea legăturii de hidrogen (Figura 3.23). Alte structuri helicale posibile sunt: 2,27, 310 şi 4,416. Helixul 2,27 numit şi panglică (ribbon) nu a fost observat în natură niciodată. Helixul de dreapta 310 este mai subţire şi mai alungit decât cel cel α şi a fost observat ocazional în proteine, făcând legătura între α helix şi o porţiune adiacentă a catenei polipeptidice. Helixul π (4,416) a fost observat rar în proteine, la capătul C-terminal, şi este mai scurt şi mai lat comparativ cu α helixul.

Figura 3.22 Structura unui α-helix de dreapta

Figura 3.23 Modelul legăturilor de hidrogen în mai multe tipuri de helix

Conţinutul proteinelor în α helix variază de la 0 la 100%. De exemplu, mioglobina are o astfel de structură secundară în proporţie de 75-80%, pe când chimotripsina nu o prezintă de loc.

3.3.2.2 b Structura β pliată

Acest element de structură secundară (numit β pentru că a fost descoperit după α helix)

este stabilizat prin legături de hidrogen ce se formează între lanţuri polipeptidice învecinate. Şi-n acest caz, unghiurile φ şi ψ se găsesc în regiunea permisivă a diagramei Ramachandran şi este utilizată capacitatea maximă de formare a legăturilor de hidrogen. O catenă polipeptidică β pliată, este numită catenă β şi este aproape complet extinsă. Ca urmare, distanţa axială între aminoacizii vecini este de 3,5 Å, în contrast cu 1,5 Å pentru α helix. În conformaţia β legăturile de hidrogen se pot forma intracatenar sau între catene polipeptidice adiacente. Structura β pliată poate exista în două variante:

• antiparalelă, în care lanţurile polipeptidice învecinate au polaritate opusă, iar legăturile de hidrogen formate sunt paralele

• paralelă, în care catenele sunt orientate în aceeaşi direcţie, iar punţile de hidrogen constituite sunt concurente

Catenele laterale ale aminoacizilor sunt orientate de o parte şi de alta a lanţului polipeptidic. Structura β pliată se prezintă ca o foaie de hârtie împăturită în evantai.

În anumite situaţii există limitări referitoare la tipul de aminoacizi ce pot participa la formarea β structurii. Atunci când catenele β sunt foarte aproape una de alta într-o proteină, cum este cazul fibroinei din mătase şi al proteinei din pânza de păianjen, au un conţinut foarte ridicat de resturi de glicină şi alanină, care au radicalii R cei mai mici. Aceşti aminoacizi sunt preponderenţi la nivelul unei mari părţi din secvenţa proteică

Structura β pliată antiparalelă apare în proteine fibrilare de tipul fibroinei, care este o β keratină, produsă de viermele de mătase. Dar se găseşte şi în aproximativ 80% din proteinele globulare analizate până în prezent. În multe cazuri, întreaga proteină conţine numai β structură. La nivelul proteinelor globulare, acest motiv structural constă din 2 până la 15 catene polipeptidice (media fiind 6). Catenele β au până la 15 resturi de aminoacizi, prezentând în medie 6 resturi. De exemplu, lectina concanavalina A prezintă şase catene β antiparalele. Arareori se întâlneşte o structură β paralelă cu mai puţin de 5 lanţuri, ceea ce sugerează că aceasta este mai puţin stabilă de cea antiparalelă

Figura 3.24 Formarea legăturilor de hidrogen în structuri β pliate

Este posibil ca aceasta să se datoreze distorsionării legăturilor de hidrogen comparativ cu cele din structura paralelă. De asemenea, în unele proteine, se întâlnesc şi β structuri mixte paralelă-antiparalelă.

3.3.2.2 c Structurile nerepetitive

Structurile secundare repetitive reprezentate de α helix şi structură β

pliată reprezintă circa jumătate dintr-o proteină globulară medie, restul fiind reprezentat de segmente polipeptidice nerepetitive care formează o conformaţie de buclă (coil sau loop conformation). Totuşi, aceste structuri nu sunt mai puţin ordonate decât cele repetitive. În proteine, porţiunile de catenă polipeptidică cu o anumită structură secundară repetitivă sunt legate cu fragmente care schimbă brusc direcţia, numite reverse turns sau β bends (numite aşa pentru de cele mai multe ori fac legătura între două structuri β antiparalele), care se găsesc în general la suprafaţa proteinelor. Acestea se mai cunosc şi sub denumirea de bucle în formă de ac de păr (hairpin bends).

Caracteristica esenţială a acestor structuri este că sunt alcătuite din patru aminoacizi şi că oxigenul carbonilic al restului de aminoacid n din prima legătură peptidică a acestui motiv formează o legătură de hidrogen cu hidrogenul iminic n+4 al celei de-a treia legături peptidice (ultima). Conformaţiile acestor elemente de structură secundară variază în funcţie de secvenţa în aminoacizi. S-a constatat că glicina şi prolina se găsesc frecvent în β bends, datorită rolului de „balama flexibilă” a glicinei între regiuni de lanţ polipeptidic, pe de o parte, şi al restricţiilor conformaţionale impuse de prolină pe de alta. La ora actuală, se apreciază că secvenţele care conţin prolină contribuie la constituirea β bends. Este probabil ca formarea acestor structuri secundare nerepetitive în stadiile iniţiale ale plierii proteinelor să determine asamblarea cooperativă a elementelor de β structură. Există două tipuri de structură β bends, care diferă prin valorile unghiurilor de torsiune: Tipul I cu : φ2=- 60˚, ψ2= - 30˚ φ3=- 90˚, ψ3=0˚ Tipul II cu: φ2=- 60˚, ψ2= 120˚ φ3= 90˚, ψ3=0˚ Tipul I este considerat o formă distorsionată de helix 310, iar tipul II prezintă adeseori glicina în poziţia 3. De asemenea, în ambele tipuri de β bends, al doilea rest de aminoacid este frecvent prolina.

Aproape toate proteinele cu mai mult de 60 de resturi de aminoacizi conţin elemente curbe ce conţin 6 până la 16 unităţi constitutive, numite bucle Ω (Ω loops, pentru că au forma literei greceşti omega), care pot conţine β bends şi care constituie entităţi globulare compacte, ale căror cavităţi sunt ocupate de catenele laterale ale aminoacizilor constituenţi. Acestea se găsesc de regulă la suprafaţa proteinelor şi probabil au rol în recunoaşterea biologică.

Multe proteine prezintă regiuni dezordonate, care pot fi reprezentate de secvenţe ce conţin aminoacizi cu radical ionizat la pH fiziologic, sau de capetele N- şi C-terminale, care sunt caracterizate de posibilitatea de a se mişca liber în soluţie. Adeseori, aceste segmente polipeptidice au rol funcţional, respectiv, pot lega o moleculă specifică. Astfel, ele au o structură dezorganizată în absenţa ligandului şi una organizată în prezenţa acestuia. Această flexibilitate asigură posibilitatea proteinei de a-şi exercita funcţia biologică.

Figura 3.25 Tipuri de β bends

3.3.2.3 Structura terţiară

Din punct de vedere al conformaţiei spaţiale, proteinele pot fi globulare sau fibrilare. Proteinele fibrilare prezintă secvenţe repetitive sau pseudorepetitive, care sunt răspunzătoare pentru conformaţia lor regulată, pe când cele globulare nu au o asemenea caracteristică a structurii primare. O structură primară unică determină o structură tridimensională unică care se formează prin plierea în spaţiu a unei proteine. Structura terţiară a unei proteine este aranjamentul tridimensional realizat prin plierea elementelor de structură secundară şi interacţiile dintre catenele laterale ale aminoacizilor constituenţi. Unitatea constitutivă a structurii terţiare este reprezentată de domeniu, care conţine combinaţii de elemente de structură secundară, este alcătuit din circa 50-200 de resturi de aminocizi şi prezintă un diametru de aproximativ 25 Å. Domeniile sunt unităţi independente din punct de vedere structural şi au caracteristicile unei proteine globulare mici. Proteinele de mici dimensiuni pot avea unul, două sau trei domenii. În schimb, titina, care este o proteină enormă din muşchi, de 3000 kilodaltoni, prezintă 260 de domenii. În cele mai multe proteine, catena polipeptidică se pliază pentru a forma un domeniu, după care trece printr-o regiune flexibilă, de tip „balama” şi apoi se organizează următorul domeniu. Chiar când o proteină este alcătuită dintr-un singur domeniu, acesta conţine adesea doi lobi între care se găseşte o fosă. Multe proteine, de exemplu hemoglobina, constau din subunităţi de mărimea domeniilor globulare ale unor proteine de dimensiuni mici.

Domeniile structurale ale proteinelor sunt adeseori codificate de o singură secvenţă codantă de ADN, adică de un exon al unei gene de la eucariote. Domeniile de acest tip pot servi ca module mobile din punct de vedere evolutiv, care apar în noi proteine şi se multiplică în timpul evoluţiei. Astfel, de exemplu, domenii structurale din imunoglobuline se găsesc nu numai în

anticorpi ci şi într-o serie de proteine de suprafaţă ale celulelor. La interfaţa dintre domenii se găsesc în principal aminoacizi nepolari, dar se formează şi un număr mic de legături de hidrogen. Centrul catalitic activ al enzimelor este localizat de regulă la interfaţa dintre domenii. În timpul actului catalitic pot avea loc mişcări ale domeniilor şi reorganizări ale legăturilor de hidrogen de la nivelul interfeţelor. De asemenea, situsurile de legare a unor molecule mici, de tipul nicotinamid adenin dinucleotidului (NAD+), se găsesc între două domenii ale unei proteine ce prezintă mai multe astfel de unităţi, ceea ce înseamnă că la acest proces participă grupări ale aminoacizilor prezenţi în ambele domenii.

Prin studii de difracţie cu raze X pe proteine cristalizate, s-a putut determina structura tridimensională a multor proteine şi s-a observat că, în toate acestea, apar combinaţii de elemente de structură secundară cu aranjamente geometrice specifice, care se numesc superstructuri secundare sau motive. Cele mai des întâlnite motive structurale sunt: helix-loop-helix, haipin β, β-α-β.

Figura 3.26 Variante ale motivului helix-loop-helix

Figura 3.27 Motivul hairpin β

Figura 3.28 Motivul βαβ

În figura 3.26 sunt prezentate două variante ale motivului helix-loop-helix. În acest caz, două segmente α sunt legate printr-o regiune loop de lungime variabilă. Varianta (a) se întâlneşte în proteinele ce se leagă la ADN (unul din segmentele helicale interacţionează cu acidul nucleic) iar varianta (b) este asociată cu proteinele ce leagă calciu (un cation divalent de calciu se ancorează în mijlocul regiunii loop). Motivul hairpin β prezintă două catene β, legate printr-o buclă de lungime variabilă, care pot fi antiparalele (Figura 3.27a) sau paralele (Figurile 3.27 b şi c). Conexiunea dintre catenele β se poate face spre dreapta (Figura 3.27 b), ceea ce se întâlneşte mai frecvent, sau spre stânga (Figura 3.27 c).

Al treilea motiv, β-α-β, este constituit din două catene β paralele, legate spre dreapta cu un α helix (Figura 3.28). În α keratină se întîlneşte motivul αα, în care două α helixuri cu polaritate diferită sunt legate direct. Figura 3.21 Motivul αα din unele proteine

În funcţie de polaritatea lor, aminoacizii au o distribuţie spaţială diferită. Astfel, aminoacizii nepolari se găsesc în principal în interiorul proteinelor, fără să aibă contact cu solventul apos. Totuşi, în unele cazuri, aceştia sunt prezenţi şi la suprafaţa externă, unde sunt aglomeraţi în regiuni hidrofobe, care constituie situsuri de interacţie cu alte proteine sau lipide de la nivelul membranelor. Cei ionizaţi la pH

fiziologic se găsesc în principal la suprafaţa proteinelor şi interacţionează cu solventul apos. Dacă aceştia se găsesc în interiorul proteinei, au o funcţie bine definită, participând, de exemplu, la cataliza enzimatică sau la legarea unui ion metalic. În sfârşit, aminoacizii polari dar neionizaţi la pH fiziologic se găsesc distribuiţi atât la suprafaţa proteinelor cât şi în interiorul acestora, unde participă la formarea legăturilor de hidrogen cu alte grupări din interiorul acestora.

Forţele ce stabilizează structura terţiară

În urma plierii în spaţiu a catenelor polipeptidice, resturile de aminoacizi aflate la distanţă mare în cadrul structurii primare, devin învecinate iar catenele lor laterale interacţionează. Tipurile de interacţii care se pot stabili sunt: Legături disulfurice, care sunt legături covalente, stabilite între resturi de cisteină apropiate în urma organizării spaţiale a proteinei. Acestea stabilizează structura tridimensională a catenelor polipeptidice. Interacţii electrostatice ce se realizează prin interacţii ionice (punţile saline) şi prin interacţii dipol-dipol. Interacţiile ionice se realizează între radicali ai aminoacizilor de semn contrar. Un exemplu de astfel de perechi de ioni sunt: Glu···Lys sau Asp···Arg. Radicalii ionizaţi ai aminoacizilor, fiind expuşi la exteriorul moleculei proteice, sunt solvataţi de moleculele de apă. Perechile de ioni de semn contrar care se găsesc mascate în miezul proteinelor globulare, contribuie însă la stabilizarea structurii terţiare, deşi contribuţia acestor interacţii la stabilizarea structurii tridimensionale este mică.

Interacţiile dipol-dipol, care apar în dipoli induşi şi/sau permanenţi ai unor molecule neutre din punct de vedere electric, sunt cunoscute sub denumirea de forţe van der Waals. Datorită faptului că grupările carbonil şi imino ale legăturilor peptidice sunt dipoli permanenţi, pe lângă legăturile de hidrogen, datorită câmpurilor electrice reziduale acestea interacţionează şi prin forţe van der Waals. De asemenea, dipolii permanenţi induc un moment de dipol în grupări vecine, ceea ce determină apariţia unor forţe de atracţie. Aceste interacţii sunt mult mai slabe decât cele ionice, variază cu r-3, astfel încât diminuează cu creşterea distanţei. De altfel, orice moleculă neutră din punct de vedere electric are un moment de dipol mic rezultat din mişcarea rapidă a electronilor. Acest moment de dipol tranzitoriu polarizează electronii din grupările învecinate generând un moment de dipol (Figura 3.29 c) care determină atragerea grupărilor una de către cealaltă. Acestea sunt forţe de dispersie London, care sunt extrem de slabe (energia de asociere este proporţională cu r-6). Numărul mare de contacte interatomice în proteine fac ca forţele London să influenţeze major conformaţia acestora. În miezul proteic cu constantă dielectrică scăzută, interacţiile dipol-dipol influenţează semnificativ plierea proteinelor.

Figura 3.29 Interacţiile dipol-dipol. Intensitatea dipolului este reprezentată de grosimea săgeţii (a) Interacţii dipol-dipol (b) Interacţii dipol-dipol indus (c) Forţe de dispersie London

Legături de hidrogen iau naştere între un rest cu o grupare donor slab acidă (D-H) şi un alt rest cu un atom acceptor (A), care conţine o pereche de electroni neparticipanţi. În sistemele biologice, A poate fi C, N şi S. Legăturile de hidrogen sunt mai puternice decât cele van der Waals, dar mai slabe decât punţile saline şi

legăturile covalente. Astfel de legături se pot forma între resturile Ser···Ser, Asn···Ser, Gln···Cys, etc. În proteine, multe legături de hidrogen sunt membre ale unei reţele în care fiecare donor formează aceste legături cu acceptori multipli şi fiecare acceptor formează legături de hidrogen cu mai mulţi donori. Legăturile de hidrogen interne din proteine se formează astfel încât ia naştere numărul lor maxim posibil. În solvenţi apoşi, proteinele complet nepliate formează legături de hidrogen cu moleculele de apă. Legăturile de hidrogen interne constituie o bază structurală pentru plierea catenelor polipeptidice. Forţele hidrofobe sunt cele ce determină substanţele nepolare să îşi minimizeze contactul cu apa şi moleculele amfipatice (cu o parte polară şi una apolară) să formeze micele în soluţii apoase. Datorită faptului că proteinele formează un fel de micele intramoleculare, în care catenele laterale ale aminoacizilor nepolari sunt departe de contactul cu moleculele de apă, interacţiile hidrofobe sunt importante pentru structura proteinelor. Deşi aceste forţe sunt mai slabe şi decât forţele van der Waals, în ansamblurile moleculare care implică un număr mare de contacte nepolare, ele constituie o reală forţă şi influenţează major plierea proteinelor în conformaţia nativă.

Figura 3.30 Tipuri de interacţii care stabilizează structura tridimensională a proteinelor

În interiorul moleculelor proteice, catenele laterale ale aminoacizilor sunt împachetate foarte strâns. Eventualele fose existente sunt umplute cu molecule de apă. Densitatea de împachetare (raportul dintre volumul învelişurilor van der Waals ale atomilor dintr-o regiune şi volumul total al regiunii) în interiorul proteinelor globulare este de aproximativ 0,75. Această valoare este de acelaşi ordin de mărime cu cea corespunzătoare cristalelor moleculare formate de molecule organice mici. De aceea s-a tras concluzia că interiorul unei proteine este asemănător cu un cristal molecular, bine împachetat. Totuşi, regiunile cu multe legături de hidrogen sunt împachetate mai lax.

3.3.2.4 Structura cuaternară a proteinelor

Deşi multe proteine globulare funcţionează ca monomeri, în sistemele biologice există un număr imens de exemple de ansambluri proteice complexe. Structura cuaternară a proteinelor reprezintă asocierea ordonată a subunităţilor globulare pentru a forma un agregat funcţional. Aceasta implică două tipuri de ansambluri proteice:

Primul tip, în care subunităţile sunt, din punct de vedere structural, foarte diferite, iar organizarea lor spaţială depinde de natura specifică a interacţiilor dintre subunităţile diferite. În general, aceste ansambluri prezintă forme geometrice foarte neregulate.

Al doilea tip, în care agregatele moleculare sunt alcătuite din copii multiple ale unuia sau mai multor tipuri de subunităţi diferite. Datorită recurenţei interacţiilor structurale specifice dintre subunităţi, asemenea agregate formează, în general, aranjamente regulate din punct de vedere geometric. Proteinele alcătuite din subunităţi identice se numesc oligomere, iar subunităţile respective se numesc protomeri. Un protomer poate fi constituit dintr-un singur lanţ polipeptidic sau din mai multe lanţuri diferite. Astfel, hemoglobina, care este alcătuită din două catene polipeptidice de α-globină şi două de β-globină (α2β2), poate fi considerată un dimer alcătuit din doi protomeri αβ. Legăturile care se stabilesc între subunităţile dintre ambele tipuri de ansambluri proteice sunt: hidrofobe, de hidrogen şi uneori sub formă de punţi disulfurice. Având în vedere că proteinele sunt compuşi fundamental asimetrici (pentru că sunt alcătuite numai din L-aminoacizi), este evident că cel mai simplu model de structură cuaternară este formarea agregatelor liniare (Figura 3.31 a, b). Formarea unor asemenea agregate se realizează în urma repetiţiei unui singur tip de interacţie structurală specifică dintre unităţile identice, adiacente ale ansamblului. O altă modalitate de aranjare pentru acest nivel de organizare a proteinelor este simetria ciclică sau rotaţională. În urma asocierii subunităţilor rezultă structuri plate (3.32 a-e) sau poliedrală (3.32 f, g). Moleculele simetrice cu structură plată sunt de regulă dimeri sau trimeri. Agregatele mai mari, sunt în general poliedrice, ceea ce dovedeşte existenţa mai multor tipuri de interacţii intermoleculare între subunităţile. De asemenea, acestea încorporează un număr fix de copii ale unei subunităţi, spre deosebire de agregatele liniare şi cu simetrie helicală.

Figura 3.31 Agregate proteice cu structură cuaternară liniară sau helicală

De asemenea, destul de frecvent, se observă şi aranjamente helicale ale subunităţilor moleculare identice (Figura 3.31 c, d). Agregatele moleculare helicale sunt, în general, asociate cu structurile ce au proprietatea de autoasamblare şi se întâlnesc în învelişul proteic al virusurilor filamentoase, unde formează un container cilindric în care este adăpostit acidul nucleic viral (Figura 3.32). Datorită faptului că învelişul este rezultatul interacţiei a numeroase copii ale aceleiaşi proteine, acest aranjament reprezintă o utilizare foarte eficientă a informaţiei conţinute în acidul nucleic viral (Figura 3.33). Structurile cuaternare helicale şi poliedriece joacă un rol central în autoasamblarea structurilor biologice de dimensiuni foarte mari pornind de la subunităţi identice. Stabilizarea acestora se realizează atunci când toate subunităţile interacţionează în mod similar din punct de vedere geometric, precum ionii într-un cristal de sare. Interacţiile din cadrul structurii cuaternare nu sunt simetrice sau echivalente chiar dacă au loc între subunităţi identice. Cel mai simplu tip de neechivalenţă se înregistrează la unele contacte între dimeri, unde catenele laterale ale unor aminoacizi individuali situate în apropierea axei de simetrie sunt forţate să adopte poziţii diferite pentru a evita unele suprapuneri sterice. Formarea agregatelor din subunităţi are consecinţe funcţionale foarte importante. Interacţiile de la nivelul suprafeţelor de contact permit o modalitate de comunicare între subunităţile individuale. Evenimentul produs atunci când o subunitate din agregat interacţionează cu un ligand sau un substrat se propagă şi la nivelul celorlalte subunităţi. Asemenea interacţii constituie baza fenomenului de cooperativitate în sistemele biochimice şi permit o serie de mecanisme de control pentru reglarea proceselor biochimice.

Figura 3.32 Tipuri de structuri cuaternare cu simetrie rotaţională şi poliedrică

Figura 3.33 Structura nucleocapsidei virusului mozaicului tutunului

3.3.2.5 Corelaţii între structura primară şi conformaţia unei proteine

Structurile secundară şi terţiară sunt determinate de structura primară, ceea ce este o confirmare a faptului că conformaţia pliată nativă este structura cea mai stabilă ce se poate forma. Pornind de la aceasta, teoretic este posibil să se realizeze anticiparea structurii proteinei pornindu-se de la secvenţa de aminoacizi. Practic, acest tip de predicţie, rămâne un deziderat încă greu de atins. La ora actuală, având în vedere că un număr mare de proteine conţin un număr mic de tipuri de domenii, este posibil să se prezică structura unora, folosind informaţiile acumulate din studiile de difracţie cu raze X ale proteinelor înrudite. În acest moment este clar că unii aminoacizi tind să formeze structuri secundare de un anumit tip. Analizând figura 3.34 se observă că acidul glutamic, metionina şi alanina par să fie cei mai importanţi formatori de α helix, pe când valina, izoleucina şi tirozina tind să formeze structuri

β pliate. De asemenea, prolina, glicina, asparagina , acidul aspartic şi serina se găsesc cel mai frecvent în conformaţia β turns, care permite o schimbare în scurt a direcţiei catenei polipeptidice.

Figura 3.34 Probabilitatea relativă a unui aminoacid de a se găsi într-un anumit element de structură secundară

În 1956, Christian Anfinsen a efectuat un experiment, devenit clasic, care a dovedit existenţa relaţiei dintre secvenţa de aminoacizi şi conformaţia ribonucleazei bovine, proteină, cu activitate enzimatică, alcătuită dintr-o singură catenă polipeptidică formată din 124 resturi de aminoacizi, care conţine şi patru legături disulfurice. Prin tratarea acesteia cu β mercaptoetanol, agent de scindare a legăturilor disulfurice, soluţie de uree 8M, care depliază proteina, la pH=8, s-a obţinut o structură complet dezorganizată (conformaţia random coil), care nu mai prezintă activitate enzimatică.

Figura 3.35 Reducerea şi denaturarea ribonucleazei

Enzima denaturată în urma acestui tratament, şi-a recăpătat activitatea prin îndepărtarea β mercaptoetanolului şi ureei prin dializă. Anfinsen a dedus că grupările sulfhidril ale enzimei denaturate sunt reoxidate în prezenţa aerului iar enzima se repliază spontan în forma activă din punct de vedere catalitic. Acest experiment a dovedit că informaţia conţinută în secvenţa de aminoacizi determină structura tridimensională complexă a ribonucleazei.

Figura 3.36 Formarea ribonucleazei native în prezenţă de urme de β-mercaptoetanol

Dacă reoxidarea ribonucleazei reduse s-a realizat în prezenţă de uree 8M, după care

ulterior, agentul denaturant a fost îndepărtat, refacerea activităţii a fost în jur de 1%. Motivul este că, în acest caz, refacerea punţilor disulfurice s-a făcut greşit. Conformaţia acestei forme enzimatice prezintă o energie liberă mare. În prezenţa unor urme de β mercaptoetanol în soluţie, această formă trece în una complet activă, pentru că agentul de reducere catalizează reformarea punţilor disulfurice până când este reconstituită enzima nativă. Conformaţia nativă este caracterizată de cea mai mică energie liberă, deci are cea mai mare stabilitate comparativ cu forma cu legături disulfurice greşit formate.

Proteinele globulare

Proteinele globulare se prezintă ca molecule sferice compacte şi îndeplinesc roluri de enzime, proteine transportoare sau receptori.

Mioglobina

Mioglobina este o proteină musculară care fixează O2. Este alcătuită dintr-un singur lanţ polipeptidic, care conţine 153 de aminoacizi şi are o masă moleculară de aproximativ 17 kDa şi o grupare prostetică, reprezentată de hem. În 1957, Kendrew a determinat structura tridimensională a mioglobinei din muşchi scheletic de caşalot , care este stabilă, şi serveşte ca rezervă de oxigen în timpul scufundării.

Această proteină are o structură compactă, cu un procent de α-helix de aproximativ 75%. Cele opt segmente helicale, de dreapta, au fost denumite de la A la H. Primul rest de aminoacid în helixul A este desemnat A1, al doilea A2, etc. Între helixuri există cinci segmente nehelicale, (numite AB, CD, etc., dacă sunt localizate între helixurile A şi B, respectiv între C şi D).

Figura 3.46 . Modelul tridimensional al mioglobinei

Legăturile peptidice sunt plane, iar grupările carbonil şi imino sunt în conformaţie trans.

Interiorul moleculei constă aproape în totalitate din resturi de aminoacizi nepolari: leucină, valină, metionină şi fenilalanină, iar treonina, tirozina şi triptofanul, care prezintă o parte polară şi una apolară sunt orientaţi astfel încât porţiunea polară protuberează spre interior. Unicele două resturi de aminoacizi polari din miezul hidrofob sunt reprezentate de histidină, care au rol în legarea hemului.

Hemul este format dintr-un derivat porfirinic şi un ion Fe (II). Derivatul porfirinic care se găseşte în hemoglobină, ca şi în mioglobină este protoporfirina IX, care conţine patru inele pirolice (notate de la A la D) legate prin punţi metinice, substituite cu patru grupări metil, două grupări vinil şi două propionat.

Gruparea hem este situată într-o adâncitură în molecula de mioglobină. Patru situsuri de coordinare sunt ocupate cu electronii atomilor de azot pirolic.

Figura 3.47 Structura hemului

Situsurile 5 şi 6 sunt situate de o parte şi de alta a planului inelului protoporfirinic. Ionul de Fe (II) este legat de unul din resturile de histidină, restul F8 (histidina

proximală), care ocupă a cincea poziţie de coordinare a ionului, iar în a şasea poziţie se găseşte molecula de oxigen. Celălalt rest de histidină, E7 (histidina distală), se găseşte între molecula de hem, dar nu este legată de aceasta.

Figura 3.48 Modelul situsului de legare a mioglobinei, care prezintă gruparea hem, histidina proximală (F8) şi distală (E7).

Mioglobina se poate găsi sub formă de deoxihemoglobină şi oxihemoglobină, care prezintă a şasea poziţie de coordinare a ionului divalent de fier liberă, respectiv ocupată de O2 sau sub formă de ferimioglobină, care conţine ionul Fe (III), în care această poziţie este ocupată de o moleculă de apă. Apoproteina din mioglobină, micşorează susceptibilitatea ionului Fe (II) din hem la oxidare.

Hemoglobina Hemoglobina este o proteină cu rol de transportor al oxigenului molecular de la plămân la ţesuturile periferice.a fost prima proteină a cărei masă moleculară a fost determinată cu acurateţe. De asemenea este una din primele proteine a cărei structură tridimensională a fost determinată de către Max Peruz. Este un tetramer α2β2 (sau un dimer alcătuit din protomerii αβ). Subunităţile α şi β sunt înrudite între ele din punct de vedere structural şi evolutiv şi cu mioglobina. Hemoglobina transportă oxigenul molecular de la plămâni, branhii şi piele la capilarele din ţesuturi. Animalele foarte mici nu prezintă această proteină, pentru că respiraţia se face prin difuzia pasivă a oxigenului. Începând de la anelide apare sistemul circulator şi deci necesitatea unui transportor de oxigen, care poate fi hemoglobina, hemocianina sau hemeritrina. Hemocianina este o hemoproteină care conţine cupru şi care este albastră în prezenţa oxigenului şi incoloră în absenţa acestei interacţii iar hemeritrina este o proteină cu fier dar fără hem. Peştii din Antarctica au sângele incolor şi sunt unicele vertebrate adulte fără hemoglobină, pentru că au un metabolism diminuat, iar solubilitatea oxigenului la temperatura de -1,9˚C este foarte mare.

Cele patru subunităţi ale hemoglobinei leagă necovalent câte o grupare hem. Hemul este responsabil pentru culoarea roşie a hemoglobinei, citocromilor şi catalazei. Oxigenarea modifică starea electronică a complexului Hem-Fe(II), aşa cum se observă din schimbarea de culoare de la roşu închis a sângelui venos la roşu deschis a sângelui arterial. CO, NO şi H2S pot coordina a şasea poziţie de ligand a ionului Fe(II) cu o mai mare afinitate decât oxigenul molecular.

Fe(II) poate fi oxidat la Fe(III), cu formare de methemoglobină, care nu leagă oxigenul molecular. Molecula de hemoglobină este aproape sferică, cu un diametru de 55 Å, cele patru subunităţi fiind aranjate tetraedric. Grupările hem sunt situate în adânciturile aflate la exteriorul catenelor polipeptidice, câte una pentru fiecare subunitate.

Figura 3.49 Figura Hem-Fe(II) (feroprotoporfirina IX). Ionul de fier divalent este hexacoordinat, patru situsuri fiind ocupate cu electroni neparticipanţi ai atomilor de azot pirolic, al cincilea fiind coordinat de electronii neparticipanţi ai unui atom de azot imidazolic dintr-un rest de histidină din lanţul globinic iar al şaselea de o moleculă de oxigen

Figura 3.50 Structura deoxihemoglobinei (a) şi oxihemoglobinei (b)

Catena α conţine 141 iar catena β, 146 resturi de aminoacizi. Structurile terţiare ale celor două lanţuri şi a mioglobinei sunt similare, deşi doar 18% din resturile de aminoacizi sunt identice în cazul celor trei proteine. Concluzia ce se poate trage este că secvenţe de aminoacizi diferite pot genera structuri tridimensionale similare. La ora actuală este cunoscută secvenţa în aminoacizi a peste 60 de specii, iar în urma analizei acesteia s-a constatat că o variabilitate semnificativă a multor poziţii, cu excepţia a 9 aminoacizi care sunt conservaţi în majoritatea speciilor şi au rol important pentru funcţionarea moleculei de hemoglobină. Lanţurile polipeptidice ale hemoglobinei sunt aranjate astfel încât interacţiile semnificative au loc între subunităţile neidentice. Astfel, interacţia α1β2 (respectiv α2β1) implică 19 de resturi de aminoacizi, pe când la interfaţele α1β1 respectiv α2β2 interacţionează 35 de resturi. Natura interacţiilor este predominant hidrofobă, dar există şi legături de hidrogen şi ionice. În schimb, interacţiile α1-α2 şi β1-β2 sunt puţine şi au caracter polar. Oxigenarea determină modificări importante de structură cuaternară a hemoglobinei, astfel că oxi- şi deoxihemoglobina (proteina care are a şasea poziţie de coordinare a Fe (II) ocupată de o moleculă de apă, în loc de oxigen molecular) prezintă forme cristaline diferite.

Oxigenarea determină rotaţia dimerului α1β1 cu 15˚ faţă de dimerul α2β2. Molecula oxigenată este mai compactă, astfel încât distanţa între ionii de Fe (II) din lanţurile β scade de la 40 (cât este în molecula de deoxihemoglobină) la 33 Å. În oxihemoglobină, resturile C-terminale ale celor patru lanţuri polipeptidice prezintă o libertate de rotaţie aproape completă, pe când în deoxihemoglobină, aceste grupări terminale sunt legate între ele. Grupările carboxil terminale şi catenele laterale ale resturilor C-terminale participă la interacţii electrostatice care rigidizează tetramerul. În consecinţă, structura cuaternară a deoxihemoglobinei este denumită T (tensionată) iar cea a oxihemoglobinei R (relaxată) (Figura 3.50). Legarea O2 la deoxihemoglobină modifică structura cuaternară a moleculei prin faptul că determină mişcarea în planul porfirinei. Atunci când Fe2+ se mişcă în planul hemului, antrenează în mişcare şi restul de His, ceea ce determină modificări conformaţionale la nivelul interfeţei subunităţilor. Acest fapt determină trecerea T→R. Deci o modificare structurală la nivelul unei subunităţi este transmisă la nivelul interfeţei dintre subunităţi. Legarea oxigenului la o moleculă de hem este comunicată la nivelul unor părţi din molecula de hemoglobină aflate la distanţe mai mari.

Hemoglobina nu transportă numai oxigenul molecular ci şi H+ şi CO2. Proprietăţile de legare a oxigenului sunt reglate prin interacţii dintre situsuri separate neadiacente. Hemoglobina este o proteină alosterică, în timp ce mioglobina nu este. Această diferenţă se manifestă în trei moduri:

1) Legarea oxigenului molecular la hemoglobină favorizează legarea unei alte molecule de oxigen la aceeaşi moleculă de hemoglobină. Cu alte cuvinte, oxigenul se leagă cooperativ la hemoglobină, situaţie care nu se întîlneşte în cazul mioglobinei

2) Afinitatea hemoglobinei pentru oxigen depinde de pH, în timp ce în cazul mioglobinei, acest parametru este independent de pH. Molecula de CO2 afectează şi ea caracteristicile de legare a oxigenului de către hemoglobină. Atât H+ cât şi CO2 favorizează eliberarea O2 legat şi reciproc, O2 determină eliberarea H+ şi CO2 legaţi.

3) Afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei este reglată de 2,3- bifosfoglicerat. Ca urmare hemoglobina prezintă o afinitate mai scăzută pentru oxigen decât mioglobina. Dacă se reprezintă grafic saturaţia Y (fracţia de situsuri de legare a oxigenului ocupate) în funcţie de presiunea parţială a oxigenului, pO2 se obţine aşa numita curbă de disociere a oxigenului

Figura 3.51 .Curbele de disociere a oxigenului pentru mioglobină şi hemoglobină

Analizînd Figura 3.51 se observă că, la

orice valoare a presiunii parţiale a oxigenului,

mioglobina prezintă o saturaţie în oxigen mai mare decât hemoglobina, ceea ce înseamnă că mioglobina are o afinitate pentru oxigen mai mare decât hemoglobina. Curba de disociere a mioglobinei este hiperbolică, pe când cea pentru hemoglobină are caracter sigmoid, ceea ce arată că legarea O2 la hemoglobină este cooperativă, şi în consecinţă, moleculele de hem din aceeaşi moleculă de hemoglobină comunică între ele. În condiţii fiziologice, scăderea pH determină scăderea afinităţii hemoglobinei pentru O2

(Figura 3.52). De asemenea, creşterea concentraţiei de CO2 scade afinitatea pentru oxigen.

Figura 3.52 Efectul pH asupra afinităţii hemoglobinei pentru oxigen

În contracţia musculară se formează CO2 şi H+ şi de aceea, în capilarele din muşchi oxihemoglobina eliberează O2. Astfel, se realizează nivelul ridicat de O2 necesar pentru producerea de energie în ţesuturile active din punct de vedere metabolic. Acest efect a fost descoperit de Christian Bohr în 1904.

Efectul invers a fost observat de Haldane, în 1914, la nivelul capilarelor alveolare din plămân, unde, la concentraţia mare de O2, hemoglobina eliberează CO2 şi H+ şi fixează O2. Relaţia dintre legarea O2, CO2 şi H+ se numeşte efect Bohr.

Afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei din hematii este mai mică decât a hemoglobinei în soluţie. Acest fapt se datorează prezenţei 2,3-bifosfogliceratului, care este un compus intermediar în glicoliză, în hematii la concentraţie aproximativ egală cu cea a hemoglobinei. Acest metabolit scade afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei de 26 ori, ceea ce permite proteinei să cedeze oxigen la nivelul capilarelor din ţesuturile periferice.

Hemoglobina fetală sau hemoglobina F (α2γ2) manifestă o afinitate pentru oxigen mai mare în condiţii fiziologice decât hemoglobina A (α2β2), ceea ce optimizează transferul oxigenului din circulaţia maternă în cea fetală. Hemoglobina F leagă 2, 3-bifosfogliceratul mai slab decât hemoglobina A şi de aceea are o afinitate mai mare pentru oxigen.

S-a constatat că doar o moleculă de 2, 3-bifosfoglicerat se leagă la deoxihemoglobină, ceea ce a sugerat că acest compus fosforilat se leagă în cavitatea centrală situată pe axa de simetrie a moleculei proteice, unde cele patru subunităţi devin foarte apropiate. Studii ulterioare de difracţie cu raze X au confirmat presupunerea iniţială.

Figura 3.53 Structura 2,3-bifosfogliceratului

Figura 3.54 Efectul 2,3 bifosfogliceratului asupra curbei de disociere a oxigenului în hemoglobină

Situsul de legare al 2,3-bifosfogliceratului este constituit din resturi de

aminoacizi încărcaţi pozitiv de pe fiecare lanţ β şi anume: gruparea α-amino, His 2, Lys 82 şi His 143. Acestea interacţionează electrostatic cu molecula puternic negativă la pH fiziologic a 2, 3-bifosfogliceratului. În oxihemoglobină, cavitatea centrală devine prea mică pentru acest compus polianionic. Practic, 2, 3-bifosfogliceratul stabilizează structura cuaternară a deoxihemoglobinei prin legarea încrucişată a lanţurilor β, deci deplasează echilibrul spre forma T. Prin acest mecanism scade afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei. De asemenea, CO2 diminuează afinitatea hemoglobinei pentru oxigen. Acesta este transportat de hemoglobină sub formă de carbamat, datorită faptului că grupare α-amino neionizată a hemoglobinei poate reacţiona reversibil cu CO2, iar anionii carbamat formează punţi saline care stabilizează forma T.

În legătură cu mecanismul alosteric s-au formulat două modele:

• Modelul secvenţial al lui Koshland • Modelul simetric, propus de Monod, Wyman, Changeux

Modelul lui Koshland se bazează pe trei presupuneri, şi anume: 1) Pentru fiecare subunitate sunt accesibile două stări

conformaţionale T şi R 2) Tranziţia T→R la nivelul unei subunităţi este indusă de

legarea ligandului la o anumită subunitate 3) Modificările conformaţionale rezultate în urma legării

ligandului la o subunitate pot creşte sau descreşte afinitatea altor subunităţi din aceeaşi moleculă pentru acesta

Figura 3.55. Modelul secvenţial pentru o proteină alosterică tetramerică

Modelul simetric se bazează pe următoarele ipoteze: 1) Proteina nu poate avea decât două stări conformaţionale R şi T.

Toate subunităţile pot exista numai în forma T sau numai în forma R. Hibrizi de tip RT nu sunt posibili.

2) Ligandul se leagă cu afinitate scăzută la forma T şi cu afinitate ridicată la forma R.

3) Legarea fiecărui ligand creşte probabilitatea ca toate subunităţile să fie în formă R. Această tranziţie alosterică este concertată,<astfel încât toate subunităţile suferă la unison trecerea T→R.

Mecanismul alosteric real al hemoglobinei este mult mai complex, decât cel descris de cele două modele, care trebuie privite drept cazuri limită. În realitate, procesele alosterice combină elemente din ambele. În general, o proteină alosterică nu are proprietăţi fixe, pentru că caracteristicile sale funcţionale sunt reglate de molecule specifice din mediu. În consecinţă, interacţiile alosterice au importanţă imensă în funcţionarea celulei. În evoluţie, trecerea de la mioglobină la hemoglobină, care este capabilă să preia informaţii din mediu a constituit un salt calitativ.

Figura 3.56. Modelul simetric pentru o proteină alosterică tetrameră

3.3 Nivelele de organizare ale proteinelor

Funcţia proteinelor poate fi înţeleasă numai în corelaţie cu structura acestora, adică relaţia tridimensională dintre atomii componenţi. În mod clasic, descrierea din punct de vedere structural a proteinelor se referă la patru nivele de organizare:

1. Structura primară care reprezintă secvenţa de aminoacizi a catenei polipeptidice, respectiv numărul şi succesiunea resturilor de aminoacizi

2. Structura secundară care se referă la aranjamentul spaţial local al atomilor aminoacizilor implicaţi în formarea legăturii peptidice

3. Structura tridimensională ce constituie rezultatul interacţiilor dintre catenele laterale ale aminoacizilor din catenele polipeptidice

4. Structura cuaternară care este rezultatul interacţiunii dintre catenele polipeptidice independente, cu structuri primare, secundare şi terţiare bine definite

3.3.1 Structura primară a proteinelor Prima determinare a structurii primare a unei proteine a fost realizată de Frederick Sanger în 1953, care a determinat compoziţia în aminoacizi a insulinei bovine. După ce această tehnică de secvenţiere a fost pusă la punct, a fost elucidată secvenţa în aminoacizi a altor mii de proteine.

Figura nr.3 1. Structura primară a insulinei bovine

Cunoaşterea structurii primare a proteinelor este esenţială pentru cunoaşterea mecanismelor moleculare de acţiune ale acestora, precum şi pentru elucidarea spectrelor de raze X şi rezonanţă magnetică nucleară. Compararea secvenţelor proteinelor analoage dintr-un individ, sau ale aceleiaşi proteine de la indivizii aceleiaşi specii sau din specii înrudite permite stabilirea unor relaţii evolutive între proteine şi organismele care le produc, care completează studiile taxonomice bazate pe comparaţii morfologice. De asemenea, cunoaşterea secvenţei în aminoacizi are aplicaţii clinice, pentru că o serie de boli ereditare se datorează unor mutaţii ce conduc la substituirea unui singur aminoacid dintr-o proteină.