Școala de Studii Avansate a Academiei Române
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
STUDII PRIVIND ROLUL LIMFOCITELOR T
REGLATOARE ÎN PATOGENEZA ŞI PERSISTENŢA
INFECŢIEI CU MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
CONDUCĂTOR DE DOCTORAT:
Dr. MIHAI STOIAN, CSI
Doctorand:
NEAGU ANA-IULIA
2017
2
Cuprins (numerotarea paginilor este cea din teza de doctorat)
CAPITOLUL 1: INFECȚIA TUBERCULOASĂ - O PROVOCARE A SECOLULUI 21 ................... 5
1.1 Epidemiologie ............................................................................................................................... 5
1.2 Deziderate și limitări în controlul infecției TB ............................................................................ 10
1.3 Patogenia infecției TB și rolul mecanismelor imune................................................................... 11
CAPITOLUL 2: DIAGNOSTICUL INFECȚIEI TUBERCULOASE, SCREENING ȘI PREVENȚIE ............................................................................................................................................................... 20
2.1 Diagnosticul infecției tuberculoase ............................................................................................. 20
2.2. Teste de screening ...................................................................................................................... 25
2.3 Prevenție - vaccinarea BCG, noi vaccinuri ................................................................................. 27
CAPITOLUL 3: LIMFOCITELE T REGLATOARE........................................................................... 29
3.1 Originea și populațiile de limfocite T reglatoare ......................................................................... 29
3.2 Caracterizarea fenotipica a celulelor T reglatoare ....................................................................... 32
3.3 Mecanisme de supresie ................................................................................................................ 47
3.4 Rolul Treg în infecții ................................................................................................................... 50
3.5 Potențiale aplicații terapeutice ale Treg ...................................................................................... 53
CAPITOLUL 4: LIMFOCITELE T REGLATOARE ÎN TUBERCULOZĂ ....................................... 59
4.1 Rolul Treg in fazele timpurii și tardive ale ale infecției cu MTB ................................................ 60
4.2 Treg în TB activă și LTBI ........................................................................................................... 63
4.3 Treg - posibil biomarker pentru monitorizarea tratamentului antituberculos .............................. 64
4.4 Treg și eficacitatea vaccinării BCG; Treg și noi vaccinuri candidat ........................................... 69
4.5. Limitări și perspective. Concluzii ............................................................................................... 69
3
CONTRIBUȚII PROPRII ..................................................................................................................... 72
CAPITOLUL 5. MOTIVAȚIA TEMEI ALESE ................................................................................... 73
CAPITOLUL 6. MATERIALE ȘI METODE. TEHNICI DE LABORATOR UTILIZATE ÎN CADRUL STUDIILOR ........................................................................................................................ 78
6.1 Material biologic ......................................................................................................................... 78
6.2 Teste de diagnostic pentru tuberculoza latentă și activă .............................................................. 80
6.3 Separarea celulelor mononucleare din sânge periferic (PBMC) și lichid pleural (LP) ............... 91
6.4 Selecția celulelor T reglatoare ..................................................................................................... 92
6.5 Caracterizarea fenotipică a celulelor mononucleare din sânge periferic și a celulelor Treg-tehnica citometriei în flux .................................................................................................................. 95
6.6 Analiza funcțională in vitro a celulelor Treg ............................................................................... 98
6.7 Evaluarea proliferării celulare - CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay ................ 100
6.8 Evaluarea nivelului de expresie al FoxP3 la pacienții cu AI (extracția ARN, reacția de rever-transcriere, amplificarea ADNc) ..................................................................................................... 102
6.9 Caracterizarea profilului de citokine ......................................................................................... 104
6.10 Analiza statistică a datelor ....................................................................................................... 105
CAPITOLUL 7. REZULTATE ȘI DISCUȚII .................................................................................... 106
7.1 OBIECTIVUL I ......................................................................................................................... 106
7.1.1 Evaluarea subiecţilor cu tuberculoză pulmonară și a indivizilor clinic sănătoși incluși în studiu ........................................................................................................................................... 106
7.1.2 Evaluarea profilului imunologic standard la pacienții cu TB activă și la subiecții sănătoși ..................................................................................................................................................... 107
7.1.3 Evaluarea fenotipică a celulelor mononucleare din lichid pleural (LP) și lichid de lavaj bronhoalveolar (LLBA) ............................................................................................................... 111
7.1.4 Selecția celulelor T reglatorii în diferite condiții de lucru .................................................. 113
7.1.5 Caracterizarea populației Treg din probe clinice ................................................................ 118
7.1.6 Determinarea viabilității și potențialului proliferativ al populației Treg ............................ 122
7.1.7 Evaluarea funcționalității celulelor Treg ............................................................................ 123
7.1.8 Analiza profilului de citokine plasmatice la pacienții cu TB activă înaintea începerii tratamentului ................................................................................................................................ 126
4
CONCLUZII ............................................................................................................................... 131
7.2 Obiectivul II .............................................................................................................................. 132
7.2.1. Evaluarea fenotipică a celulelor Treg la pacienții cu tuberculoză activă inainte si după tratament ...................................................................................................................................... 132
7.2.2 Izolarea celulelor Treg din PBMC și caracterizarea lor funcțională înainte și după tratament ..................................................................................................................................................... 133
CONCLUZII ............................................................................................................................... 138
7.3 Obiectivul III ............................................................................................................................. 139
7.3.1. Evaluarea clinică și paraclinică a subiecților incluși în studiu (testare cutanată tuberculinică, testare Quantiferon TB Gold, T-SPOT.TB ) ........................................................ 139
7.3.2 Izolarea celulelor Treg de la pacienții cu artropatii inflamatorii și caracterizarea lor funcțională ................................................................................................................................... 141
7.3.3 Studiul populației Treg înainte și după administrarea de anti-TNFα ................................ 142
7.3.4 Definirea rolului terapiei anti TNF-α asupra expresiei genei FoxP3 .................................. 144
7.3.5 Caracterizarea in dinamica a profilului proteomic plasmatic la pacienții cu artropatii inflamatorii .................................................................................................................................. 146
CONCLUZII ............................................................................................................................... 152
CONCLUZII GENERALE ................................................................................................................. 153
BIBLIOGRAFIE ................................................................................................................................. 155
ANEXE .................................................................................................................................................. 185
CAPITOLUL 1. Infecția tuberculosă – o provocare a secolului 21-prezintă aspecte
legate de epidemiologia tuberculozei la nivel global și național, deziderate și limitări în controlul
infecției tuberculoase, precum și aspecte legate de patogenia infecției și rolul mecanismelor
imune
Tuberculoza (TB), una dintre cele mai vechi boli umane, rămâne o problemă majoră de
sănătate la nivel global. În 2016 a fost printre primele 10 cauze de mortalitate la nivel mondial,
clasându-se deasupra infecției HIV / SIDA ca una din principalele cauze de deces cauzate de o
boală infecțioasă, în ciuda faptului că, dacă este diagnosticată în timp util și tratată corect
tuberculoza este vindecabilă în cele mai multe cazuri (Pai et al., 2016; Smith, 2003; WHO,
2017b).
Potrivit Raportului Global pentru Tuberculoză din 2017 publicat de OMS, în 2016,
aproximativ 10,4 milioane de persoane au dezvoltat tuberculoza activă, iar 1,67 milioane au
decedat-incluzând aici 374.000 decese în rândul persoanelor coinfectate HIV. Dintre persoanele
nou-infectate 5,9 milioane au fost bărbați, 3,5 milioane femei și 1 milion copii. Per total, 90%
dintre cazuri au fost adulți și 10% copii, iar raportul barbați: femei a fost de 1,85:1.
Un rol cheie în progresia de la expunere la infecția TB activă îl au atât factori de risc
exogeni cât și factori endogeni. Factorii exogeni sunt reprezentați de încărcătura bacilară din
spută și contactul apropiat cu un caz contagios de TB. Printre factorii endogeni recunoscuți se
numără: infecția HIV, malnutriția și vârsta tânără, precum și o serie de factori mai recent
precizați ca diabetul zaharat, poluarea aerului din încăperi, alcoolul, utilizarea medicamentelor
imunosupresoare (corticosteroizi, infliximab) și fumatul ce joacă un rol semnificativ la nivel
individual dar și populațional. Factorii socio-economici și comportamentali sunt, de asemenea,
dovediți a crește susceptibilitatea la infecție..
CAPITOLUL 2. Diagnosticul infecției tuberculoase, screening și prevenție cuprinde
elemente legate de diagnosticul infecției latente (LTBI) și al TB active, teste de screening și
metode de prevenție a TB. Sunt prezentate TCT și metodele de diagnostic bazate pe eliberarea de
IFN- γ (teste IGRA). Pentru diagnosticul TB active sunt utilizate metode imagistice (radiografia
toracică și tomografia cu emisie de pozitroni PET-CT), microscopice (frotiu din spută),
bacteriologice (izolarea în cultură) și moleculare. Testele de screening pentru TB nu sunt
recomandate spre a fi folosite în populația generală, ci ele sunt utilizate pentru a examina
persoanele care prezintă un risc crescut de expunere la TB, cum ar fi persoanele cu afecțiuni care
slăbesc sistemul imunitar (infecția HIV/SIDA), persoane găzduite în spații aglomerate precum
adăposturi pentru persoane fără locuință, tabere de refugiați, azile, școli, închisori, lucrătorii din
domeniul sanitar și alte persoane, a căror ocupație le aduce în contact apropiat cu indivizi care
pot avea TB activă, persoane aflate în contact strâns cu pacienți diagnosticați cu TB activă,
persoanele care vin sau au trăit pentru o perioadă de timp într-o țară cu rată mare de TB, etc.
Măsurile de prevenire a transmisiei TB vizează vaccinarea BCG a copiilor, screeningul
populaţiilor cu risc crescut, practicile îmbunătăţite de control al infecţiei în unităţile sanitare şi
din laboratoare.
CAPITOLUL 3. Limfocitele T reglatoare descrie originea si rolul subpopulațiilor de
celule T reglatoare, markerii fenotipici utilizați pentru caracterizarea celulelor Treg (CD25,
FoxP3, CD39, GITR, CTLA-4, etc.), mecanisme de supresie ale Treg, rolul Treg în diverse
patologii umane și în special în boli infecțioase. În final sunt prezentate potențiale aplicații
terapeutice ale celulelor Treg.
CAPITOLUL 4. Limfocitele T reglatoare în tuberculoză prezintă rolul celulelor T
reglatoare în infecția timpurie dar și în stadiul tardiv al TB, în boala activă vs. infecția latentă,
potențiala utlizare a Treg în monitorizarea tratamentului antituberculos, precum și rolul Treg în
vaccinare.
În infecții, Treg protejează gazda prin evitarea reacțiilor imune dăunătoare care altfel pot
conduce la afectarea tisulară. Pe de altă parte, prin suprimarea răspunsului imun al gazdei, Treg
inhibă eliminarea patogenului conducând la progresia bolii (Scott-Browne et al., 2007; Belkaid et
al., 2002; Berod et al., 2014). Deși numeroase rapoarte evidențiază rolul Treg în progresia și
determinarea severității TB, multe aspecte privind rolul celulelor Treg în imunitatea la TB rămân
încă neexplorate.
Ținând seama de obstacolele în tratamentul eficient al TB (lipsa de complianță a
pacienților la tratament, apariția tulpinilor rezistente la medicamente, absența markerilor de
tratament pentru cazurile extrapulmonare, etc.), monitorizarea eficacității tratamentului la
pacienții cu tuberculoză reprezintă un alt domeniu de interes. Metodele convenționale
bacteriologice disponibile în prezent pentru monitorizare, sunt limitate, prin urmare, este nevoie
urgentă de instrumente alternative mai eficiente. În acest context, utilizarea Treg ca biomarker
pentru monitorizarea tratamentului pare a fi promițătoare și merită o atenție suplimentară,.
Limfocitele Treg pot fi considerate o sabie cu două tăișuri: pe de o parte au un rol benefic
deoarece limitează activitățile dăunătoare ale celulelor imune care ar putea leza țesutul gazdă, în
timp ce, pe de altă parte, facilitează progresia TB și persistența MTB datorită comportamentului
imunosupresiv, ceea ce contribuie la cronicizarea bolii.
Strategiile de manipulare a Treg trebuie realizate cu mare precauție a pentru a fructifica
beneficiile și a minimiza efectele dăunătoare asupra gazdei.
CONTRIBUȚII PROPRII
CAPITOLUL 5. Motivația temei alese În pofida progreselor semnificative în managementul tuberculozei, aceasta rămâne o
problemă majoră de sănătate publică pe plan mondial; eradicarea tuberculozei până în 2030
reprezintă unul dintre obiectivele de dezvoltare durabilă recent adoptate de Organizația
Națiunilor Unite (ONU, 2015).
În cadrul Regiunii Europene a OMS, România se numără printre cele 18 țări cu incidență
crescută a TB, considerate, de asemenea, țări cu prioritate ridicată pentru controlul tuberculozei
(high-priority countries), întrucât ele concentrază 85% din povara de TB și 99% din TB
multirezistentă (WHO, 2017a).
Răspunsul imun mediat celular este esențial pentru protecția eficientă împotriva MTB.
Limfocitele T CD4+ activate produc un răspuns imun de tip Th1 care constă în secreția de IFN-γ
(citokină cu rol central în imunitatea MTB) care activează macrofagele alveolare pentru a
produce o varietate de molecule implicate în inhibarea creșterii și distrugerea micobacteriilor. IL-
12, secretat de APC și inductor potent al sintezei de IFN-γ, promovează diferențierea celulelor T
spre fenotipul Th1 și generarea limfocitelor T citotoxice. MTB induce secreția de TNF-α de către
macrofage, celule dendritice și celule T, precum și alte citokine inflamatorii cum ar fi IL-1 și IL-
6. Răspunsul imun Th1, deși eficient în limitarea infecției cu MTB, poate determina distrucție
celulară și leziuni tisulare.
Producția de citokine antiinflamatorii în răspuns la infecția cu MTB, precum IL-4, IL-10
și TGF-β, poate regla răspunsul imun și limita leziunea țesutului. Totuși producerea excesivă a
acestor citokine poate duce la imposibilitatea de a controla infecția.
Mecanismele responsabile de persistența infecției tuberculoase și de apariția bolii active
la indivizi imunocompetenți sunt incomplet elucidate.
Limfocitele Treg suprimă răspunsul imun antimicrobian, în special în cazul patogenilor
care stabilesc infecții persistente. Treg inhibă activarea și expansiunea celulelor T efectoare și
neutralizează citokinele pro-inflamatorii cu scopul limitării răpunsului imun excesiv potențial
dăunător la nivel tisular. În acest proces, pe de o parte Treg pot avea un rol benefic în prevenirea
leziunilor tisulare excesive, iar pe de altă parte favorizează persistența patogenului prin
restrângerea răspunsurilor imune efectoare.
Efectul inhibitor al celulelor Treg asupra răspunsului imun Th1 ar putea constitui un
mecanism de persistență al infecției tuberculoase, mai ales în contextul faptului că studiul
populației de celule Treg la pacienții cu TB a arătat prezența în număr crescut și/sau cu activitate
crescută a acestor celule.
În acest context, scopul lucrării îl constituie cercetarea rolului celulelor T reglatorii
în patogeneza și persistența infecției cu Mycobacterium tuberculosis într-o zonă cu endemie
crescută, așa cum este România. Elucidarea unui astfel de rol în persistența infecției cu MTB și
în mecanismul de producere al TB poate conduce la identificarea de metode terapeutice noi care
să moduleze numărul și funcția celulelor Treg cu un potențial efect de amplificare a răspunsului
imun de tip Th1, ceea ce poate contribui la creșterea efectului protectiv al unui vaccin împotriva
TB și prevenirea îmbolnăvirii la cei predispuși, precum și la creșterea ratei de vindecare.
Pentru atingerea acestui scop am urmarit următoarele obiective generale:
1. Definirea profilului imunologic standard și a profilului plasmatic de citokine la
pacienții cu TB activă, precum și caracterizarea populației de celule Treg la pacienți
imunocompetenți cu diferite forme clinice de boală activă înaintea începerii tratamentului.
Prezenţa celulelor Treg la pacienţii cu TB activă în număr crescut sau cu activitate
crescută este demonstrată de unele studii, însă nu există o opinie unanimă în acest sens. O
posibilă cauză a acestor rezultate controversate poate fi justificată de diferențele în ceea ce
privește caracteristicile epidemiologice ale TB în regiunile în care s-au desfășurat studiile
anterioare, precum şi lipsa unor studii comparative între diferite forme de tuberculoză. În acest
context prezenta lucrare își propune caracterizarea populaţiei de celule T reglatorii comparativ, la
pacienţii cu TB activă cu forme localizate (pumonară, pleurală), în sânge și la sediul infecţiei
(lichid pleural, lavaj bronhoalveolar), folosind drept control atât indivizi cu infecție latentă, cât și
indivizi neinfectaţi. Descoperirea unor diferenţe în ceea ce privește numărul sau activitatea
celulelor Treg la pacienţii cu TB activă poate constitui un argument în plus pentru implicarea
Treg în patogeneza tuberculozei şi în zone cu incidenţă crescută. Un element de noutate este
implicarea posibilă a acestor celule în determinarea formei de boală la pacienţi
imunocompetenţi.
Într-o primă etapă s-a realizat selecția și evaluarea clinică și paraclinică a pacienților cu
tuberculoză și a subiecților control. Au fost evaluate performanțele protocoalelor de selecție a
celulelor Treg în diferite condiții de lucru, iar ulterior s-au stabilit metodele de caracterizare a
populației Treg din probe clinice. În plus a fost analizat și profilul plasmatic de citokine la
pacienții luați în studiu comparativ cu subiecții control.
2. Studiul dinamicii populației Treg la pacienții cu TB activă în cursul tratamentului
antituberculos.
Informațiile din literatura de specialitate privind dinamica populației de celule T reglatorii
în cursul tratamentului antituberculos sunt controversate și depind de tipul studiului efectuat
(transversal versus longitudinal) și de momentele în care celulele au fost evaluate, fiind raportate
astfel, în cursul tratamentului, atât creșteri, scăderi, cât și valori nemodificate în numărul
celulelor T reglatorii. Studiul în dinamică al acestei populații este foarte important deoarece ar
putea oferi date despre severitatea bolii, rezistența la terapie și șansele de eradicare a infecției.
De asemenea, dinamica populației Treg poate influența gradul de extindere al sechelelor fibrotice
ca urmare a unui răspuns imun exagerat.
Pentru a monitoriza dinamica populației Treg la pacienții cu TB activă, celulele Treg
izolate de la pacienții cu TB la diferite momente în cursul tratamentului au fost caracterizate
fenotipic și funcțional.
3. Al treilea obiectiv este reprezentat de studiul efectului unor terapii biologice asupra
populației de celule T reglatorii la pacienții cu artropatii inflamatorii (AI).
Este cunoscut faptul că terapia biologică cu agenți anti TNF-α crește riscul de reactivare a
TB la persoanele LTBI, cu dezvoltarea predominantă a formelor extrapulmonare și diseminate de
boală. Administrarea acestei medicații este însoțită de creșterea numărului de celule T reglatorii,
ceea ce poate contribui la diminuarea răspunsului imun inflamator exacerbat la pacienții cu AI,
având astfel un efect benefic. Pe de altă parte creșterea frecvenței celulelor Treg în cursul
tratamentului poate favoriza dezvoltarea de infecții cronice sau neoplazii. Având în vedere faptul
că nu au fost raportate studii care să incrimineze creștererea numărului celulelor Treg în
mecanismul de reactivare al TB consecutiv terapiei anti TNF-α, confirmarea acestui efect ar
putea avea consecințe terapeutice prin dezvoltarea unor strategii care să reducă sau să elimine
riscul de dezvoltare a TB.
Evaluarea efectului tratamentului cu anti-TNF-α asupra populației de celule Treg la
pacienții cu AI a inclus următoarele etape:
-diagnosticul infecției TB latente la pacienții cu AI (pentru comparație a fost inclus și un
grup de pacienți transplantați);
-definirea rolului terapiei anti TNF-α asupra expresiei genei FoxP3;
-caracterizarea profilului proteomic plasmatic al pacienților cu artropatii inflamatorii
înainte de începerea tratamentului, la 2 respectiv 6 săptămâni de tratament cu anticorpi
monoclonali anti-TNF-α.
CAPITOLUL 7. REZULTATE ȘI DISCUȚII
7.1 OBIECTIVUL I Definirea profilului imunologic standard și a profilului plasmatic de citokine la pacienții
cu TB activă, precum și caracterizarea populației de celule Treg la pacienți imunocompetenți cu
diferite forme clinice de boală activă înaintea începerii tratamentului.
Pentru definirea profilului imunologic standard expresia antigenelor de suprafață
limfocitară CD3, CD4, CD8, etc. a fost evaluată prin marcarea cu anticorpi cuplați cu
fluorocromi, conform instrucțiunilor producătorilor anticorpilor. Analiza datelor obținute a
evidențiat un procent crescut al populației de monocite din sângele periferic la pacienții cu TB
activă. Deși LB au scăzut la pacienții cu TB activă comparativ cu indivizii aparent sănătoși din
lotul de control, valorile nu diferă semnificativ și se încadrează în domeniul de referință stabilit
în laboratorul nostru. Comparativ, se observă un procent ușor crescut de celule CD25+ și HLA-
DR+ în lotul de pacienți, dar valorile mediii se încadrează în domeniul de referință, și
modificările nu sunt semnificative statistic..
La analiza formulei leucocitare la pacienții cu TB comparativ cu lotul de control, s-a
constatat un raport monocite/ limfocite (M/L) semnificativ crescut (P < 0,0001). Într-un studiu
din 2015, Wang și colab. a raportat aceeași tendință spre monocitoza și a remarcat relația între
raportul monocite/limfocite și statusul clinic al pacientilor cu tuberculoză activă (Wang et al.,
2015).
În lichidele pleurale și lavajele bronhoalveolare analizate în cadrul acestui studiu,
pacienții cu tuberculoză activă au prezentat în medie 74 ± 2% limfocite T în lichidul pleural, în
timp ce în lavajele bronheoalveolare procentul de limfocite T a fost de 10 ori mai mic, iar
proccentul de limfocite B a fost similar cu procentul gasit in lichidul pleural, însă foarte scăzut
față de procentul găsit în sângele periferic. În ceea ce privește celulele „Natural killer” (NK),
procentul acestora este de trei ori mai mare în lichidul pleural față de lavajul bronhoalveolar. Un
review foarte recent menționează procentul crescut de limfocite T și procentul scăzut de
limfocite B în lichidul pleural al pacienților cu tuberculoză (Bode-Lesniewska, 2016).
Rezultatele obținute arată că numărul de celule Treg (CD127-/CD4+/CD25+) în sângele
periferic al pacienților cu tuberculoză activă (TB) este nesemnificativ mai mare decât în sângele
periferic al subiecților control neinfectați cu MTB. Totuși, în ceea ce privește proporțiile
celulelor Treg din totalul de celule mononucleare izolate, diferența între procentul găsit la
pacienții cu tuberculoză (3,8 ± 0,2 %, domeniu 4,8 – 3,6) si subiecții control (3,3 ± 0,2 %,
domeniu 3,5 – 3,1) este semnificativă (P < 0,001).
Analiza datelor arată că la separarea celulelor Treg din sânge periferic s-au obținut
populații CD4+CD25+ cu puritate medie de 55,7 ± 27,1% după prima selecție pozitivă și de 79,2
± 5,4% după a doua selecție pozitivă a 5 probe povenite de la indivizi aparent sănătoși și fără TB
activă și cu puritate medie de 80,6 ± 7,5% după prima selecție pozitivă la probele de sânge
obținute de la 5 pacienți cu tuberculoză. La evaluarea lichidelor pleurale de la 5 pacienți cu
tuberculoză s-a obținut, încă după prima selecție pozitivă, 85,7 ± 4,2 celule CD4+CD25+.
Diferența între categorii nu este semnificativă statistic.
Proporția de celule Treg în totalul de celule CD4+ a fost investigată utilizând marcarea cu
anticorpii anti-CD4 și anti-CD25, dar și anti-FoxP3, factorul de transcripție considerat ca fiind
un marker mai specific celulelor Treg. Marcarea cu anti-FoxP3-APC s-a realizat după
permeabilizarea și fixarea celulelor utilizând reagenții din kitul Tregs detection kit (Miltenyi
Biotec).
Analiza PBMC la subiecții control și celule izolate din fluidul pleural și PBMC de la
pacienți cu tuberculoză pulmonară, a indicat o creștere semnificativă a populației Treg
CD4+CD25+FoxP3+ în totalul populației CD4+ din fluidul pleural (PF), comparativ cu
procentul de celule Treg din totalul de limfocite CD4+ din sângele periferic (P < 0,05) și
creșterea acestei proporții în ambele tipuri de probe de la pacienții cu tuberculoză comparativ cu
Treg din sângele periferic la subiecții sănătoși investigați (P < 0,05 pentru PBMC control versus
PBMC pacient cu tuberculoză; P < 0,001 pentru PBMC pacient cu tuberculoză versus PF pacient
cu tuberculoză) (Diaconu et al., 2012).
Deși prin selecția CD4+CD25+CD127dim/- și verificarea purității cu anti-CD4 și anti-
CD25 s-au obținut purități destul de mari ale populației separate, prin marcarea cu anti-FoxP3
însă, procentul de celule identificat ca Treg a fost mult mai mic și anume: 21,7 ± 18,3% pentru
probe control, 30,0 ± 0,4% la probele de la pacienți cu TB atât din sânge periferic cât și din
lichidul pleural. În urma primei și a celei de-a doua separări magnetice s-a realizat o concentrare
a celulelor CD25high+ despre care s-a sugerat relativ recent că ar reprezenta subsetul de celule
Treg naturale, diferențiate în timus și migrate apoi în periferie.
Identificarea FoxP3 ca reglator major al celulelor Treg a fost o etapă critică în definirea
celulelor Treg ca subset distinct al liniei limfocitare T. Totuși, în prezent, este din ce în ce mai
clar că exprimarea Foxp3 poate fi indusă și în celulele care nu au funcție de celule Treg. În plus,
localizarea nucleară a FoxP3 împiedică folosirea acestuia ca marker pentru izolarea Treg viabile,
iar numărul mic de celule Treg, chiar și în patologii în care se estimează creșterea numărului lor,
face dificilă utilizarea acestui marker mai mult decât în scop de verificare.
Cercetări publicate într-un jurnal de primă linie în citometrie (Law et al., 2009) arată
importanța alegerii anticorpului anti-FoxP3 și a combinațiilor de sisteme tampon de
Fixare/Permeabilizare în identificarea celulelor CD4+CD25+/FoxP3+ Treg. Utilizarea altor
markeri antigenici pe suprafața Treg, a permis separarea până la purități destul de înalte a
celulelor viabile care să poată fi apoi utilizate în experimentele de verificare a activității lor
supresive.
Obținerea de celule Treg viabile și funcționale este esențială în analiza funcției lor
supresoare în TB și elucidarea implicării lor în eludarea mecanismelor imune fiziologice de către
MTB la cei 5 – 10% din indivizii imunocompetenți infectați care dezvoltă boala tuberculoasă.
Evaluarea viabilității și proliferării celulelor Treg a fost realizată atât prin măsurarea
ATP (produs de celulele viabile, metabolic active). Rezultatele noastre arată că celulele CD4+/
CD127-/CD25+ sortate cu bile magnetice, stimulate sau nu cu anti-CD3 și IL-2 sau cu
Supression inspector (Miltenyi Biotec) au fost anergice. Potențialul proliferativ al celulelor Treg
izolate de la pacienții cu tuberculoză activă nu a diferit semnificativ de cel al celulelor Treg
izolate de la subiecții sănătoși.
Analiza funcțională in vitro a celulelor Treg a fost realizată printr-un test de supresie
utilizând un reagent comercial optimizat pentru stimularea limfocielor T – Treg Suppression
inspector (particule anti-biotin MACSiBead încarcate cu anticorpi anti-CD2, anti-CD3, și anti-
CD28 biotinilati - Miltenyi Biotec) În acest scop, celulele Treg separate anterior din PBMC au
fost co-cultivate cu celule T CD4+CD25- (T efectoare, Tef) în diferite rapoarte (Tefectoare/Treg
1:0, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 0:1) în prezența și în absența stimulilor. Co-cultura a fost investigată
luminometric (proliferarea celulara) și microscopic.
Testul de supresie cu ajutorul celulelor Treg izolate nu a relevat diferențe majore în
capacitatea de supresie a proliferării celulelor Tef între pacienții cu TB activă și subiecții control.
Imaginile de microscopie în contrast de fază relevă efectul supresor marcat în cocultura Tef:Treg
1:1 și condensarea celulelor caracteristică procesului apoptotic,atât în culturile cu celule de la
pacienții cu TB activă cât și în culturile cu celule de la subiecții control.
Celulele Tef și Treg izolate au fost caracterizate și în ceea ce privește producția de IFN-γ,
citokina necaracteristică liniei Treg și cu care putem monitoriza efectul celulelor Treg asupra
celulelor efectoare. Supernatantele obținute în urma cultivării/co-cultivării Tef/Treg în diferite
rapoarte (Tef/Treg 1:0, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 0:1) în prezenta Supression inspector), au fost utilizate
în scopul determinării producției de IFN-γ.
Rezultatele noastre indică scăderea concentrației de IFN-γ produs de celulele efectoare,
dependența de proporția celulelor Treg în co-cultura celulelor CD4+/CD25- cu celulele
CD4+/CD25+ de la subiecții control. La pacienții cu tuberculoză activă investigați, celulele Treg
s-au dovedit a avea o capacitate de supresie a producției de IFN-γ semnificativ mai mare (P <
0,005) decât în cazul celulelor obținute de la subiecți control.
Analiza profilului de citokine a arătat diferențe importante ale nivelurilor plasmatice ale
unor citokine la pacienții cu TB activă comparativ cu subiecții din lotul control. Cel mai mare
nivel plasmatic s-a înregistrat pentru TNF- α. (cresteri de aproximativ 200 ori). Nivele
plasmatice de peste 5 ori mai mari în pool-ul plasme TB vs plasme lot control, s-au înregistrat
pentru: IP-10, CD40 ligand, sTREM-1GM-CSF , I-TAC (CXCL-11), IL-12p70.De asemenea
diferențe semnificative (de peste 2 ori) s-au observat și în cazul IL-2 și IL-8; un rezultat
surprinzător l-a reprezentat scăderea IFN-γ (0.5X)
7.2 Obiectivul II Evaluarea fenotipică a celulelor provenite de la pacienții cu TB activă înainte și
după tratament, precum și a indivizilor control, a relevat scăderea semnificativă a populației
Treg la pacienții tratați față de cei netratați;; procentul de celule Treg este similar celui găsit și la
indivizi control. Rezultatele obținute confirmă un procent Treg semnificativ mai mare la
pacienții cu TB activă comparativ cu procentul Treg la indivizii control și de asemenea, o
diferență semnificativă între pacienții tratați și cei netratați.
Pentru izolarea celulelor Treg din PBMC și caracterizarea lor funcțională înainte și
după tratament s-a pornit de la un volum de sânge de aproximativ 40 mL care sa permită
obținerea unui număr de aproximativ 45x106 celule mononucleare PBMC.
Proporțiile celulelor Treg din totalul de celule mononucleare izolate, arată că diferența
între procentul găsit la pacienții cu tuberculoză înainte de terapie (3,7 ± 0,6 %, domeniu 2,9 –
4,4) și subiecții control (3,3 ± 0,2 %, domeniu 3,5 - 3,1) este semnificativă (P < 0,05). Aceste
rezultate sunt similare celor obținute de alți cercetători (Wu et al., 2010; Wergeland et al., 2011)
la pacienții cu infecție activă și la cei cu MDR-TB înainte de intervenția chirurgicală. Prezența de
celule T reglatorii în număr crescut la pacienții cu tuberculoză activă este totuși controversată în
literatură. Diferența între proporția de celule Treg izolate de la pacienții TB post-terapie (3,1 ±
0,2 %, domeniu 2,9 - 3,3) și cea de celule obținute de la pacienți TB nt este semnificativă statistic
(P = 0,01) în experimentele noastre.
Scăderea frecvenței celulelor Treg după terapie este de asemenea controversată în
literatură. Recent s-a arătat că după trei luni de tratament preventiv, a existat o creștere a fracției
Treg FoxP3+ (Wergeland et al., 2011).
Cercetările anterioare au fost efectuate mai ales la pacienți din zone cu caracteristici
diferite de epidemiologie a tuberculozei.
Confirmarea fenotipului Treg s-a realizat și prin testele de supresie a proliferării și a
producției de IFN-γ. Testul de supresie s-a realizat atât utilizând un reagent comercial optimizat
pentru stimularea limfocielor T – Treg Suppression inspector (SI) cât și antigene specifice MTB,
care sunt codate de gene situate în regiunile de diferenţă RD1 (early secreted antigen target 6,
ESAT-6; sau culture filtrate protein 10, CFP10).
Celulele Tef și Treg izolate și verificate în ceea ce privește fenotipul, au fost caracterizate
în ceea ce privește viabilitatea și proliferarea lor și în cele din urmă, supernatantele obtinuțe în
urma cultivării sau a co-cultivării lor în diferite rapoarte (Tef/Treg 1:0, 1:1, 0:1) în prezența
ESAT-6, au fost utilizate în scopul determinării producției de IFN-γ, citokina necaracteristică
liniei Treg și cu care putem monitoriza efectul celulelor Treg asupra celulelor efectoare.
Studiul populației Treg la pacienți cu tuberculoză activă față de subiecții control a aratăt o
activitate supresivă crescută asupra IFN-γ, o proporție mai mare în cadrul PBMC, dar un număr
absolut al celulelor T reglatorii similar în sângele periferic. Administrarea tratamentului
antituberculos a indus o revenire la valori similare cu subiecții normali a proporției de Treg din
cadrul PBMC. Nu au fost observate însă diferențe semnificative ale funcției populației Treg
înainte și după administrarea tratamentului antituberculos.
Rezultatele noastre sugerează o expansiune compartimentată a acestei populații celulare
ce ar putea fi incriminată în producerea bolii tuberculoase cu diferite localizări.
Identificarea unui potențial rol al celulelor Treg în persistența infecției tuberculoase și/sau
în producerea bolii tuberculoase ar permite identificarea unor metode terapeutice care să
moduleze numărul / funcția celulelor T reglatorii, și care ar avea un efect potențial de amplificare
a răspunsului imun tip Th1 cu cel puțin două consecințe favorabile (ceea ce ar corespunde la
două direcții de cercetare ulterioară): creșterea efectului protectiv al unui vaccin împotriva
tuberculozei (Kaufmann SH.E., Immunity, 2010; Diaconu CC et al., 2011), și respectiv
prevenirea îmbolnăvirii de tuberculoză la cei predispuși și/sau creșterea ratei de vindecare la
pacienții cu tuberculoză chimiorezistentă.
7.3 Obiectivul III
Studiul populației Treg la pacienții cu artropatii inflamatorii a inclus optimizarea
numărului de celule inițiale, verificarea fenotipului, viabilității și a capacității supresive a
celulelor Treg obținute din sange periferic. Celulele izolate au fost caracterizate fenotipic și
utilizate în teste funcționale. Obiectivul este esențial pentru a putea înțelege rolul limfocitelor
Treg in procesele care au loc în urma tratamentului cu anti-TNFalfa având în vedere că
tratamentul cu anti-TNFα constituie un model cvasi-experimental de creștere a riscului de
tuberculoză la indivizii cu infecție tuberculoasă latentă (Tubach et al., 2009).
Pentru a compara testul cutanat tuberculinic (TCT) cu testele IGRA (Quantiferon TB
GOLD și T-SPOT.TB ) la pacienți cu artropatii inflamatorii, a fost examinat un lot de 50 de
pacienți cu poliartrită reumatoidă.
Coeficientii de corelație Pearson între diferite perechi de teste diagnostice au indicat o
corelație modestă între testele IGRA și testul cutanat tuberculinic, mai bună pentru valoarea prag
de 5 mm față de 10 mm și respectiv mai bună pentru QFTG decât pentru T-SPOT.TB. Corelația
între cele două teste IGRA a fost excelentă; ambele teste au avut un număr foarte redus de teste
nedeterminate.
Izolarea celulelor Treg a fost realizată, la fel ca și în cazul experimentelor anterioare,
pornind de la numere diferite de celule mononucleare din sânge periferic, în scopul optimizării
numărului de celule Treg izolate, număr care să permită realizarea experimentelor ulterioare. De
asemenea, a fost testat fenotipul, viabilitatea și funcționalitatea celulelor Treg obținute în urma
acestor proceduri. Separările s-au realizat utilizând principiul de separare MACS
CD4+/CD25+/CD127dim/- (Miltenyi Biotec). S-au obținut eficiențe bune de separare și purități
de aproximativ 90% ale celulelor CD4+CD25+CD127dim/- (Treg) rezultate după a doua selecție
pozitivă (Diaconu et al., 2012). Celulele izolate au fost apoi utilizate în teste funcționale, de
fenotipare și în testarea nivelurilor de IFN-γ.
Celulele mononucleare din sânge periferic (PBMC) au fost analizate și din punct de
vedere al expresiei FoxP3 la nivel mRNA, atât la pacienții netratați cât și la două săptămâni post-
tratamentul cu anti-TNFalfa (2s).
Pentru evaluarea celulelor T reglatoare înainte și după administrarea de anti-
TNFalfa au fost selectați patru pacienți, câte doi cu poliartrita reumatoidă și respectiv spondilită
ankilopietică, cu indicație de tratament cu infliximab. Prelevarea eșantioanelor de sânge a fost
efectuată înainte de administrarea primei doze de infliximab (în aceeași zi) și respectiv după 14 ±
1 zi. Analiza prin citometrie în flux a proporției celulelor Treg din totalul de celulele CD4+ din
celulele mononucleare, a relevat creșterea semnificativă a acestei populații la pacienții tratați (AI
2s); acesta creștere este însă nesemnificativă față de procentul Treg din celulele CD4+ la indivizi
control. Pacienții AI 2s au frecvența Treg semnificativ mai mare decât cei netratați (AI)
Celulele Treg (CD4+CD25+) și celulele Tefectorii, Tef (CD4+CD25-) separate magnetic,
au fost investigate în ceea ce privește capacitatea lor proliferativă și producția de IFN-γ în
prezența stimulilor nespecifici de tipul Treg supression inspector (Miltenyi) și a
fitohemaglutininei (PHA) utilizată ca și control pozitiv în kitul Tspot TB (Oxford Immunotec).
Pentru a pune în evidență caracterul anergic al celulelor Treg izolate, am adaptat metoda
ELISPOT (enzyme-linked immune spot) T-SPOT.TB (Oxford Immunotec) utilizată pentru
diagnosticul infecţiei TB latente, la testarea productiei de IFN-γ în culturi de celule Tef, Treg sau
co-culturi ale lor, în prezența SI sau a PHA
Același efect a fost evidențiat și în supernatantele culturilor și co-culturilor de celule Tef
și Treg prin determinarea producției de IFN-γ prin ELISA.
Surprinzător, nivelul IFN-γ în plasma pacienților cu AI înainte și după tratamentul cu
anti-TNFα, a fost foarte scăzut.
Pentru a verifica ipoteza că în urma tratamentului cu anti-TNF alfa are loc creșterea
nivelului de expresie a FoxP3, am analizat prin qPCR nivelul relativ de expresie al acestui
factor de transcripție, modulator cheie al limfocitelor Treglatorii, față de beta-actina (control
endogen). Rezultatele au relevat modificarea nivelurilor genei FoxP3 în urma tratamentului și de
asemenea, s-a putut verifica nivelul de expresie al acestei gene în celulele depletate de celule
reglatorii prin metoda de separare magnetică (figura 39). Celulele Treg obținute în urma separării
magnetice au fost utilizate doar în teste funcționale, totuși evaluarea expresiei FoxP3 în celulele
depletate de Treg poate confirma indirect faptul ca acestea au un nivel scăzut de expresie al
FoxP3.
Nivelul mRNA FoxP3 a crescut după două săptămâni de la începerea tratamentului deși,
probabil datorită dimensiunii mici a lotului investigat, aceasta diferență nu este semnificativă
Administrarea anti-TNFα crește numărul de celule T reglatorii ceea ce poate constitui un
mecanism de acțiune în reducerea răspunsului imun și inflamator excesiv la pacienții cu
artropatii inflamatorii. Acest efect prezintă un risc potențial de a induce o dereglare a
homeostaziei imune cu apariția de infecții cronice (de ex. tuberculoza) sau cancere. Studiul
asocierii dintre efectul anti-TNFα de scădere a populației de celule T reglatorii și respectiv
efectul de creștere a riscului de tuberculoză este o direcție importantă de studiu pe un lot extins
de subiecți. Confirmarea acestei asocieri pe un lot cu dimensiune relevanta din punct de vedere
statistic ar implica celulele T reglatorii în predispoziția de a face tuberculoză a pacienților sub
anti-TNFα și ar deschide o direcție de cercetare în identificarea unor metode terapeutice ce pot
diminua sau elimina acest risc.
Caracterizarea în dinamică a profilului proteomic plasmatic la pacienții cu
artropatii inflamatorii s-a realizat cu kitul Proteome Profiler Array Human Cytokine (R&D
Systems).
Profilul de citokine plasmatice observat în „poolul” de plasme analizat înaintea începerii
terapiei biologice, a arătat modificări la pacienții cu AI comparativ cu indivizii sănătoși din lotul
studiat; s-au observat niveluri crescute ale CD154, IP-10, TNF-α, STREM-1, G-CSF, GM-CSF,
IL-1β, IL-8, IL-12p70, IL-2, IL-13, MCP-1, I-TAC, SDF-1. Există numeroase date privind
implicarea acestor citokine si chemokine în patogenia artropatiilor inflamatorii atât în artita
reumatoidă cât și în spondilartropatiile seronegative; cu toate acestea există discerpanțe între
rezultate, explicate de diferențele de vârstă la debutul bolii, sex, stadiul bolii, metoda de lucru.
Conform majorității studiilor IL-1 β și TNF-α sunt crescute în serul pacienților cu AR și se
corelează cu gradul de activitate a bolii. Alte studii demonstrează niveluri serice crescute ale
GM-CSF, IL12p70, IL-8 (Burska et al., 2014).
Modificările induse de terapia biologică arată o tendință generală de scădere a nivelurilor
citokinelor studiate la 2 săptămâni de la inițierea tratamentului. O variație semnificativă statistic
s-a înregistrat pentru: IL-12 p70, IL-13, IP-10, I-TAC, RANTES, SDF-1, TNF-α, G-CSF,
GROα, IL-1β, IL-1α, IL-10, I-309. Dintre acestea se remarcă scăderea relevantă a IP-10, IL-12
p70, TNF-α ceea ce pare să reprezinte o consecință logică a inhibătii cascadei TNF-α.
În mod surprinzător în studiul nostru, la evaluarea efectuată la 6 săptămâni de la inițierea
terapiei biologice, s-a observat o tendință de creștere față de nivelul bazal a celor mai multe
citokine și chemokine studiate, care înregistraseră scădere la 2 săptămîni. Printre acestea se
remarcă IL-12 p70, IL-10 , MCP-1 (P<0.001) și TNF-α, IL-1β,(p<0.05). Acest ”rebound” ar
putea să reprezinte un indiciu privind persistența procesului inflamator în AI, sugerând un
răspuns mai puțin eficient al terapiei anti TNF.
Pe de alta parte, C5 a evidențiat o scădere chiar mai marcată decât valoarea înregistrată la
2 săptămâni (p<0.05). Componenta 5 a complementului (C5) joacă un rol important în procesele
inflamatorii. Peptida activatoare C5a, o anafiatoxină cu proprietăți spasmogenice și activitate
chemotactică este derivată din polipeptida alfa prin clivare sub acțiunea unei convertaze.
Alterările genei care codifică C5 determină maladii caracterizate de infecții recurente severe și
au fost asociate cu susceptibilitatea la artrita reumatoidă. Interacțiunea dintre TNF-α și sistemul
complement poate contribui la patogeneza bolii. Pe model murin s-a arătat că animalele lipsite de
proteinele sistemului complement nu dezvoltă artrită indusă de colagen (modelul murin de artrită
reumatoidă) și administrarea anticorpilor monoclonali anti-C5 previne debutul artritei.
În ceea ce privește nivelul plasmatic al IFN-γ, acesta a înregistrat o scădere la 6
săptămâni, fără însă a fi semnificativă statistic.
Inhibitorii TNF scad efectele IFN-γ și stimulează apoptoza unor celule cheie ale
răspunslui imun precum monocitele, LT CD4+ și LT CD8+ reactive față de MTB. Terapia anti
TNF este asociată cu creșterea funcției celulelor Treg, ceea ce conduce la susceptibilitatea la TB
(Harris și Keane, 2010). Deși scăderea nivelului plasmatic al IFN-γ nu a fost semnificativă în
studiul nostru, aceasta ar putea totuși să reprezinte un indiciu al activității supresoare Treg
crescute, cu favorizarea reactivării TB sub tratament cu inhibitori TNF.
CONCLUZII GENERALE
În urma studiului nostru se desprind următoarele concluzii:
1.! Imunofenotiparea subseturilor limfocitare la pacienții cu TB activă comparativ cu indivizii
aparent sănătoși din lotul de control nu a înregistrat diferențe semnificative, valorile
înregistrându-se în domeniul de referință stabilit în laboratorul nostru.
2.! Raportul M/L înregistrează o valoare semnificativ crescută la pacienții cu TB față de lotul
de control, ceea ce indică importanța liniei monocitare în patogeneza TB.
3.! Populaţia de celule T reglatoare reprezinta o proporţie semnificativ mai mare din totalul
PBMC la subiecţii TB faţă de Cotrol şi o tendinţă spre un număr absolut mai mare la aceiaşi
subiecţi.
4.! Administrarea tratamentului antituberculos a indus o revenire a proporției de Treg din
totalul PBMC la valori similare cu subiecții normali.
5.! De asemenea s-a constatat o activitate supresoare crescută a celulelor T reglatoare izolate de
la pacienţi cu TB activă versus control demonstrată prin inhibiţia semnificativ mai mare a
eliberării de IFN-γ de către celulele T efectoare cocultivate cu celule T reglatoare de la
acelaşi subiect; inhibarea proliferării celulelor T efectoare nu a fost diferită între cele cele
două grupuri. Nu au fost observate însă diferențe semnificative ale funcției populației T
reglatoare înainte și după administrarea tratamentului antituberculos.
6.! Supresia eliberării IFN-γ la subiecţii cu TB faţă de subiecţii Control a fost mult mai mare, şi
nu credem că ar putea fi explicată doar printr-o creştere uşoară a proporţiei Treg.
Considerăm în concluzie că aceste rezultate sugerează mai curând o activitate supresorie
intrinsecă crescută a Treg la subiecţii cu TB faţă de indivizi neinfectaţi cu MTB, si ne
propunem investigarea în detaliu a acestei ipoteze ca o continuarea a prezentei lucrări..
7.! La analiza profilului de citokine plasmatice s-a observat un nivel scăzut de IFN-γ la
pacienții cu TB față de indivizii sănătoși, care se corelează cu rezultatul obținut la testele
funcționale.
8.! Compararea testelor IGRA cu TCT la pacienții cu AI a evidențiat o sensibilitate mai mare a
IGRA față de TCT, dar o corelație relativ modestă între acestea și TCT, mai bună pentru
valoarea prag de 5 mm față de 10 mm și respectiv mai bună pentru QFTG decât pentru T-
SPOT.TB; corelația între cele două teste IGRA a fost excelentă; ambele teste au avut un
număr foarte redus de teste nedeterminate
9.! Studiul comparativ al pacienților cu AI înainte și după tratamentul cu anti-TNFα a dus la
obținerea unui procent similar de celule Treg, rezultatele obținute au demonstrat caracterul
anergic al Treg atât la stimularea nespecifică cu fitohemaglutinina (PHA) sau la cea cu Treg
Supression Inspector.
10.!Prin analiza comparativă a nivelului de expresie a genei FoxP3 la pacienților cu AI înainte și
după tratamentul cu anti-TNFα s-a constatat creșterea expresiei genei FoxP3, sugerând o
activitate Treg crescută.
11.!Evaluarea nivelului de expresie relativă a citokinelor din panelul “Proteome Profiler™ a
indicat scăderea expresiei unor citokine cu rol important în răspunsul imun-inflamator și
chemotaxie la 2 săptamâni de la ințierea tratamentului cu anti-TNF, dar creșterea neașteptată
la 6 săptămâni. Acest lucru ar putea sugera un răspuns inadecvat la terapia anti-TNF sau
faptul că modificările semnificative de citokine ar fi înregistrate la situsul inflamației
(sinovială) mai degrabă decât în plasmă. Verificarea acestei ipoteze ar putea fi o extindere
interesantă a acestui studiu.
12.!Deși scăderea nivelului plasmatic al IFN-γ nu a fost semnificativă în studiul nostru, aceasta
ar putea totuși să reprezinte un indiciu al activității supresoare Treg crescute, cu favorizarea
reactivării TB sub tratament cu inhibitori TNF.
Bibliografie selectivă:
BELKAID, Y., PICCIRILLO, C. A., MENDEZ, S., SHEVACH, E. M. & SACKS, D. L. 2002. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature, 420, 502-7.
BEROD, L., STUVE, P., VARELA, F., BEHRENDS, J., SWALLOW, M., KRUSE, F., KRULL, F., GHORBANI, P., MAYER, C. T., HOLSCHER, C. & SPARWASSER, T. 2014. Rapid rebound of the Treg compartment in DEREG mice limits the impact of Treg depletion on mycobacterial burden, but prevents autoimmunity. PLoS One, 9, e102804.
BODE-LESNIEWSKA, B. 2016. Flow Cytometry and Effusions in Lymphoproliferative Processes and Other Hematologic Neoplasias. Acta Cytol, 60, 354-364.
BURSKA, A., BOISSINOT, M. & PONCHEL, F. 2014. Cytokines as biomarkers in rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm, 2014, 545493.
DIACONU, C. C., NEAGU, A. I., LUNGU, R., TARDEI, G., ALEXIU, I., CHIVU ECONOMESCU, M., BUMBACEA, R. S., IOANA, A., MATEI, L., DRAGOMIR NECULA, L., BLEOTU, C., DRAGU, L. D., STANCU, C. I., ATAMAN, M. & BUMBACEA, D. 2012. Regulatory T lymphocytes in evaluation of the local protective cellular immune response to Mycobacterium tuberculosis in Romanian patients. Romanian Biotechnological Letters, 17, 6862-6868.
HARRIS, J. & KEANE, J. 2010. How tumour necrosis factor blockers interfere with tuberculosis immunity. Clin Exp Immunol, 161, 1-9.
KAUFMANN, S. H. 2002. Protection against tuberculosis: cytokines, T cells, and macrophages. Ann Rheum Dis, 61 Suppl 2, ii54-8.
LAW, J. P., HIRSCHKORN, D. F., OWEN, R. E., BISWAS, H. H., NORRIS, P. J. & LANTERI, M. C. 2009. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry A, 75, 1040-50.
ONU 2015. Resolution adopted by the General Assembly on 25 September 2015. Transforming our world: the 2030 Agenda for Sustainable Development
PAI, M., BEHR, M. A., DOWDY, D., DHEDA, K., DIVANGAHI, M., BOEHME, C. C., GINSBERG, A., SWAMINATHAN, S., SPIGELMAN, M., GETAHUN, H., MENZIES, D. & RAVIGLIONE, M. 2016. Tuberculosis. Nat Rev Dis Primers, 2, 16076.
SCOTT-BROWNE, J. P., SHAFIANI, S., TUCKER-HEARD, G., ISHIDA-TSUBOTA, K., FONTENOT, J. D., RUDENSKY, A. Y., BEVAN, M. J. & URDAHL, K. B. 2007. Expansion and function of Foxp3-expressing T regulatory cells during tuberculosis. J Exp Med, 204, 2159-69.
SMITH, I. 2003. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. Clin Microbiol Rev, 16, 463-96.
TUBACH, F., SALMON, D., RAVAUD, P., ALLANORE, Y., GOUPILLE, P., BREBAN, M., PALLOT-PRADES, B., POUPLIN, S., SACCHI, A., CHICHEMANIAN, R. M., BRETAGNE, S., EMILIE, D., LEMANN, M., LORTHOLARY, O., MARIETTE, X. & RESEARCH AXED ON TOLERANCE OF BIOTHERAPIES, G. 2009. Risk of tuberculosis is higher with anti-tumor necrosis factor monoclonal antibody therapy than with soluble tumor necrosis factor receptor therapy: The three-year prospective French Research Axed on Tolerance of Biotherapies registry. Arthritis Rheum, 60, 1884-94.
WANG, J., YIN, Y., WANG, X., PEI, H., KUAI, S., GU, L., XING, H., ZHANG, Y., HUANG, Q. & GUAN, B. 2015. Ratio of monocytes to lymphocytes in peripheral blood in patients diagnosed with active tuberculosis. Braz J Infect Dis, 19, 125-31.
WERGELAND, I., ASSMUS, J. & DYRHOL!RIISE, A. 2011. T regulatory cells and immune activation in Mycobacterium tuberculosis infection and the effect of preventive therapy. Scandinavian journal of immunology, 73, 234-242.
WHO. 2017a. Basic facts on tuberculosis (TB) in the WHO European Region [Online]. Available: http://www.euro.who.int/en/health-topics/communicable-diseases/tuberculosis/data-and-statistics 2017].
WHO. 2017b. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT [Online]. Available: http://www.who.int/tb/publications/global_report/MainText_13Nov2017.pdf?ua=1.
WU, Y. E., PENG, W. G., CAI, Y. M., ZHENG, G. Z., ZHENG, G. L., LIN, J. H., ZHANG, S. W. & LI, K. 2010. Decrease in CD4+CD25+FoxP3+ Treg cells after pulmonary resection in the treatment of cavity multidrug-resistant tuberculosis. Int J Infect Dis, 14, e815-22.
