Cercetări experimentale privind efectul hepatoprotector al apei minerale carbogazoase de la Băile Tuşnad în ficatul alcoolic

Dr. Gabriela Dogaru, Dr.Marieta Motricală, Dr.Vasile Rus, Dr. Constantin Crăciun, Akos

Molnar, Nicu Rădulescu

Universitatea de Medicină şi Farmacie Cluj- NapocaFacultatea de Medicină Veterinară Cluj- Napoca

Centru de Microscopie Electronică U.B.B Cluj NapocaBăile Tuşnad

Obiectiv

• Surprinderea eventualelor modificări apărute în ficat, în urma administrării de alcool etilic la animale de experienţă• Surprinderea unor diferenţe în tabloul anatomopatologic, prin microscopie optică şi electronică între animalele care au consumat apă de robinet şi cele care au consumat apă minerală de la Băile Tuşnad, izvor nr.3 ,după încetarea administrării de alcool •Studierea efectelor biologice, posibil efecte hepatoprotectoare a apei minerale de la izvorul nr.3 , Baile Tusnad în ficatul alcoolic indus experimental asupra ţesutului hepatic.• Studiu experimental , perioada 2015-2016

Iuliu Hatieganu" University of Medicine and Pharmacy Cluj-Napoca, Romania- Centul de medicină experimentală

Clinical Rehabilitation Hospital Cluj-Napoca Tusnad Spa Complex - Baile TusnadUniversity of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Faculty of

Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania Centru de Microscopie Electronică Universitatea Babes- Balyai ,

Facultatea de Biologie , Cluj Napoca

Afecţiunile hepato-biliare sunt la ora actuală în creştere fiind favorizate de accentuarea poluării mediului, de consumul de alcool şi de medicamente de sinteză

Apa minerală de la izvorul 3 de la Băile Tuşnad cu o mineralizare totală de 3351,0 mg/l, este recomandată în boli cronice ale ficatului , steatoza hepatică

În literatura de specialitate consultată, nu am gasit studii clinice sau experimentale în care să se urmarească prin investigatii de microscopie optică şi electronică efectele consumului de apă minerală izvor număr 3 de la Băile Tuşnad asupra unor ţesuturi

Băile Tuşnad- izvor nr.3

Indicaţii- ivzorul nr. 3

Compoziţia chimică apa minerală iz.nr 3 Băile Tuşnad

Mineralizare totală de 3351,0 mg/dl

►carbogazoasă (Co2 1646,0 mg/l), ►natriu 288mg/l►potasiu 76mg,0mg/l►magneziu 35,5 mg/l►fier 17,3 mg/l►clorurosodică (ioni Clor 617mg/l) ►HCO3 378,2mgl , brom urme►feruginoasă Fe 17,3 mg/l ►calcică Ca 93,8 mg/l, borică, slab iodurată►acidulată, ph de 6►temperatura este de 14,5° C.

Material şi metodă

Avizul Comisiei de Etică de la Universitatea de Medicină şi Farmacie Cluj-Napoca numarul 533/23.12.2015

Avizul Direcţiei de Sănătate Veterinară nr.17/13.12.2016Condiţile de vivariu au fost standard conform Directivei Europene 63 / 2010 şi a

Legii 43 / 2014 privind protecţia animalelor folosite în scopuri ştiinţifice

Animale de experienţă: şobolani albi , rasa Wistar, masculi, greutate de aproximativ 350 g, în număr de 25.

Materiale : alcool etilic 12% , apă minerală carbogazoasă mixtă de la izvorul numarul 3, din Băile Tuşnad, apă de la robinet.

Model experimental

Studiu a fost efectuat pe 25 de şobolani albi, rasa Wistar şi a durat 100 de zile.Animale au fost împartite în 3 loturi:

Lotul I – martor negativ – 5 animale, pe toată durata experimentului, le-a fost administrată

mâncare şi apă de robinet (50-75 ml / zi/animal)

Lotul II – martor pozitiv – 6 animaleLotul III - lot experimental – 14 animale

În primele 70 de zile le-a fost administrat alcool etilic 12% (12-15 ml / animal / zi), mâncare

In ultimele 30 de zile din experiment animalele din lotul II au primit apă de robinet (50-75 ml / zi/animal) iar cele din lotul III apă minerală Tuşnad (50-75 ml / zi/animal), mâncare

In ziua 70 a experimentului au fost eutranasiate 5 animale (2 din lotul I, 1 din lotul II şi 2 din lotul III) iar în ziua 100 restul de 20.

De la animalele eutanasiate au fost recoltate fragmente sub formă de felii cu grosimea de 4 mm din ficat pentru efectuarea de investigaţii histologice.

Eutanasierea prin injectarea intramusculară de supradoză de anestezice (ketamina 10% şi xilazină 2%).

Pentru analiza ultrastructurală şi analiza prin secţiuni semifine, probele de ficat au fost prefixate în soluţie de glutaraldehidă 2,7% în tampon fosfat 0,1M, timp de 1,5 ore (90 minute), la 4°C, apoi spălate în 4 bai de tampon fosfat 0,15M (pH 7,2), cate o ora în fiecare baie.

Postfixarea s-a făcut în soluţie de acid osmic 2% în tampon fosfat 0,15M, o oră la 4°C.

Deshidratarea s-a făcut în acetonă, iar includerea în răşina epoxidica Epon 812.

Secţionarea blocurilor s-a realizat la un ultramicrotom de tip Leica UC 6, la grosimea de 70 nm.

Secţiunile contrastate cu soluţii de acetat de uranil şi citrat de plumb au fost examinate la un microscop electronic de tip Jeol JEM1010

Prof. Dr. Constantin Craciun

Rezultate Lot martor – Ficat- Microscopie optică

Supravieţuirea animalelor a fost de 100% la toate loturile de şobolani

M.O. - Ficat- lot martor- structură hepatică normală, citoplasmă colorată în roșu, nucleii în albastru

MICROSCOPIE ELECTRONICĂ- ficat – lot martor

ME- Ficat- lot martor- unele hepatocite cu 1-2 nucleoli, mitocondrii numeroase, cu structură integră, reticulul endoplasmatic rugos cu profile înguste, cu numeroși ribosomi atașați, proprice pentru sintezele de proteine. Picăturile lipidice sunt prezente în cantitate foarte mică, o parte din ele fiind acumulate la nivelul celulelor Ito - activitate metabolică normală

MICROSCOPIE OPTICĂ- lot tratat cu alcool

Ficat- Acumulare de lipide și congestie vasculară, capilară

MICROSCOPIE ELECTRONICĂ- Lot tratat cu alcool

Ficat- Acumulare de lipide, proliferare de reticol endoplasmatic neted, semnificând o stimulare a creșterii sintezei de lipide. Scăderea profilelor reticulului endoplasmatic rugos sugerând scăderea capacității de sinteză a proteinelor.

Celula Ito fără lipide

Hepatocite cu mitocondrii cu matricea și cristale rarefiate având o slabă activitate metabolică, unele hepatocite au nucleul cu contur neregulat și proliferare de REN,reaţionare la un toxic

Lotul tratat cu alcool și apă de la robinet

MO- ficat - Ușoară acumulare de picături lipidice, congestie vasculară capilară

ME-ficat -Rare picături lipidice, scăderea cantității de reticol endoplasmatic neted, congestie vasculară, număr mai mare de lizozomi. Diminuare în timp a acțiunii alcoolului și consumul de apă de robinet au păstrat încă

o serie de modifică induse de alcool dar toate acestea sunt probabil reversibile și vor dispărea în timp.

Lotul tratat cu alcool și apă izvor nr. 3

MO- Aspect aproape normal cu multiple hepatocite dublu nucleate.

ME-ficat- Nuclei sferici, mitocondrii numeroase cu aspect normal, reticulul endoplasmatic granular,rugos, dispus în profile paralele sugerând intensificarea procesului de sinteză proteică, picături lipidice mult diminuate, nucleu cu trei

nucleoli sugerând o intensificare a sintezei proteice.

Reticulul endoplasmatic neted este discret reprezentat prin rare vezicule, creșterea numărului de lizozomi semnificând mobilizarea capacițătii de apărare a hepatocitelor față de intoxicația cu alcool.

Hepatocite binucleate- capacitate crescută de regenerare hepatică ca răspuns la acțiunea nocivă a unui stimul toxic, acumulare de lipide în celulele Ito.

De la animale au fost recoltate fragmente sub formă de felii cu grosimea de 4 mm din ficat, rinichi, pancreas şi stomac pentru efectuarea de investigaţii histologice.Singurele modificari decelabile prin microscopie optică au fost prezente în ficat. Restul organelor luate în studiu nu prezintă aspecte lezionale decelabile prin microscopie optică.

Discuţii

În alcoholic liver disease (ALD) leziunile hepatice au un spectru larg de la steatoză până laciroză (Louvert și Mathurin, 2015).

Aspectele cele mai tipice sunt reprezentate de balonizarea hepatocitelor, rarefieri alecitoplasmei, distrugerea citoscheletului şi chiar formarea corpusculilor Mallory-Denk.Aceste modificari apar la început în zona centrolobulară dupa care se extind spre periferialobulului unde leziunile sunt din ce în ce mai pronunţate (Theise, 2013).

Steatoza hepatică şi steatohepatita este frecvent întâlnită la persoanele care consumă cantitățimari de alcool etilic.

Alcoolul etilic induce steatoza hepatica prin alterarea unor mecanisme de metabolizare aacizilor graşi (Maher, 2002).

Mecanismul defensiv față de acțiunea toxică a alcoolul etilic conferit de către peroxizomi estemai redus la femeie cât și la șobolance, astfel încât la acestea se poate ajunge să seacumuleze cantități mari de acizi grași liberi, suficienți pentru a produce leziuni la nivelulmembranelor, provocând necroză, inflamație și progresia spre fibroză și ciroză (Lieber,2004).

Întrerupera consumului de alcool face ca steatoza sa dispară relativ rapid (în câtevasăptamani) iar după perioade mai lungi chiar procesele de fibroză să se reducă (Theise,2013).

Pe parcursul anilor s-au efectuat studii referitoare la efectele benefice ale apelor minerale asupraorganismului.

In studiu "Acţiunea apei de Covasna, izvorul principal asupra secreţiei gastrice" care este o apăbicarbonată, clorurată- sodică- calcică magneziană, carbogazoasă, slab mineralizată, s-a constatat căatât pe animal cât şi pe om exercită o acţiune excito- secretorie asupra stomacului.

Studiu asupra acţiunii apelor minerale sulfuroase clorurate, Călimăneşti 8, asupra hepatiteiexperimentale subacute, indusa prin administrarea de tetraclorură de carbon, arată că leziunile suntmai puţin intense la lotul care a ingerat apă minerală după încetarea administrării toxicului.

Apa minerală de la Malnaş, hipotonă, carbogazoasă, bicarbonată, calcică sodică magneziană, pe animalcu stomac Pavlov, exercită o acţiune excito -secretorie cantitativă. Prin degazeificare secreţia şiaciditatea sunt mai reduse la animalul cu stomac Pavlov.

Experimentată pe animal cu fistulă biliară, apa minerală alcalino teroasă, carbogazoasă, hipotonă, de laBiborţeni a exercitat o acţiune excito- secretorie manifestă, intensă mai ales în prima oră, diluândsecreţia biliară.

.E. Cociasu.O. Carbunescu. Actiunea apei de la Covasna asupra secretiei gastrice.Lucrarile de balneologie si fiyioterapie.Reyumate, 1961.

.E. Cociasu. A. Grigoriu. V. Slavescu, A.Radulescu, C. Protopopescu.,S. Vasilescu. Cercetari asupra actiunii apelor minerale sulfuroase clorurate tip Calimanesti 8 asupra hepatitei experimentale subacute printetraclorura de carbon. Lucrarile de balneologie si fizioterapie.Rezumate, 1961.

.I.B.F.Actiunea apei de Malnas de la Grota, asupra secretiei gastrice. Lucrarile de balneologie si fizioterapie.Rezumate, 1961.

.I.B.F.Actiunea apei Biborteni asupra secretiei biliare. Lucrarile de balneologie si fizioterapie.Rezumate, 1961.

În experimentele pe animale, aplicarea unei băi cu CO2 are un efect asupra inflamaţiei induse experimental.

S-a arătat că apa carbonatată de la sine agravează adesea inflamaţia, dar căadaugarea de Na Cl 3% asigură un efect antiinflamator.

Aceasta sugerează că trebuie să se păstreze întotdeauna în minte imaginea de ansamblu în ceea ce priveşte constituenţii chimici într-un izvor terapeutic.

Hartmann B, Bassenge B (1987) Alte und neue Grundlagen der Balneotherapie mit Kohlen-säurethermen. Z phys MedBaln Med Klim 16: 205-206.

Concluzii de etapă

În urma administrării de alcool etilic 12% timp de 70 de zile la animalele de experienţă, în ficat au fost observate aspect de steatoză hepatică şi discretă fibroză perivasculară.

Gradul de afectare a ficatului la animalele din lotul II atât în ziua 70 cât şi în ziua 100 a experimentului sunt comparabile cu cele de la lotul III din ziua 70 a experimentului.

In ziua 100 a experimentului gradul de afectare al ficatului la sobolanii din lotul III este mai redus decat cel prezent în ziua 70 astfel încat putem susţine faptul că apa minerală de la izvorul numărul 3 Baile Tuşnad consumată a potenţat capacitatea regenerativă a ficatului

Apa minerală de la izvorul nr 3 Băile Tuşnad are, posibil, proprietăţi hepatoprotectoare, prin capacitatea sa de a diminua acţiunea toxică a alcoolului în hepatocite şi a păstra foarte aproape de normal structura şi funcţia hepatică.

Concluzii

Nu au existat pana în prezent studii clinice şi experimentale referitor la efecteleterapeutice , în diferite afecţiuni , a apei minerale carbogazoase mixte izvor nr3 Băile Tuşnad

Am ales ficatul alcoolic, avand în vedere creşterea numarului de consumatori dealcool sau medicamente şi implicaţiile lor nocive asupra ficatului

S-au efectuat analize de sange, 3 etape, vom corela ulterior datele de laborator, curezultatele de la microscopieoptică şi eletronică, studiul este foarte amplu

Recoltări glicemie, uree, creatinină, TGO, TGP, proteine totale, sideremie, Mg, Na,K, Ca total

Se vor corela rezultatele din acest studiu cu date de ME din studiu 2 , în careanimalele au consumat 70 de zile de alcool 12% apoi 50 de zile de apă.

“Nu există nici o cale de a deveni mai bun dacă nu ai devenit în prealabil mai fericit”- Horia-Roman Patapievici