Eritrocite artificialeEritrocite artificiale

Biotehnologii industriale, an

III

microEA EA submicrometrice cu membrană lipidică nanoEA cu membrană biodegradabilă

Eritrocite artificialeEritrocite artificiale

Eritrocite artificiale. SusSus: compoziţia eritrocitelor şi a EA. Dreapta josDreapta jos: eritrocite artificiale

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

•

celule cu acelaşi conţinut ca al eritrocitelor, dar cu membrană artificială•

conţinutul este reprezentat de hemolizat eritrocitar încapsulat în

membrane artificiale

Hemoglobina•

microEA cu membrană de butilbenzoat

conţin o combinaţie de oxiHb şi metHb. OxiHb păstrează abilitatea de a se combina reversibil cu oxigenul• dacă în celule se înglobează CAT, are loc o reducere puternică a formării de metHb• comportament similar au EA cu membrană de cauciuc silastic (cauciuc+plastic), polistiren, etilceluloză, dextran stearat•

în microEA cu membrană de nylon se formează o cantitate

mai mare de metHb

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Curba de disociere a oxigenului în eritrocitele normale (A) şi microEA (B)

A B

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Structura hemoglobinei

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Anhidraza carbonicăAnhidraza carbonică•

Prezentă în concentraţie mare în eritrocite, este implicată în transportul CO2•

În microEA, îşi păstrează activitatea

CatalazaCatalaza•

Catalizează reacţia de descompunere a apei oxigenate la apă şi oxigen

•

Dacă este înglobată în microEA, îşi păstrează activitatea şi poate fi folosită în terapia enzimatică a animalelor cu lipsă congenitală a catalazei

Imunologia EAImunologia EA•

EA nu posedă antigene de grup sangvin, deci celulele nu aglutinează, chiar dacă EA conţin hemolizat de la eritrocite umane incompatibile

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

A B

Implicarea anhidrazei carbonice în menţinerea echilibrului acido-

bazic la nivel (A) pulmonar şi (B) renal

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Injectarea intravenoasă a microEAEA cu membrană polimerică cu dimensiuni ≥

1 μm

Comportamentul EA în circulaţia sangvină a fost studiat prin injectarea intravenoasă a celulelor la pisică timp de 1,5 min, urmată de recoltarea probelor pe o perioadă de 30 min.

Cele mai multe EA realizează două circuite, după care sunt eliminate rapid din fluxul sangvin de către plămâni, ficat şi splină

În timpul infuziei, scade presiunea arterială şi creşte cea venoasă şi apar semnele embolismului pulmonar, deoarece EA nu se pot deforma ca să traverseze capilarele mici

Chiar dacă au dimensiuni submicrometrice, EA sunt eliminate rapid din circulaţie. De aceea, pentru prelungirea timpului de circulaţie, trebuie modificate proprietăţile membranei celulare, în special încărcarea electrică determinată de prezenţa acidului N-acetilneuraminic

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Injectarea intravenoasă a microEA

Timpul de circulaţie al EA după infuzie

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Injectarea intravenoasă a microEAAcidul neuraminic şi timpul de circulaţie al eritrocitelor

Eritrocitele autoloage marcate cu 51Cr reinjectate, supravieţuiesc în circulaţie 3-4 luni

Eritrocitele autoloage tratate cu neuraminidază, pentru distrugerea acidului N-acetilneuraminic, sunt eliminate rapid din circulaţie, nivelul lor scăzând exponenţial, iar timpul de înjumătăţire este de 2 ore

supravieţuirea eritrocitelor în circulaţie depinde de prezenţa la suprafaţa celulelor a acidului N-acetilneuraminic

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Injectarea intravenoasă a microEA

Timpul de circulaţie al eritrocitelor autoloage reinfuzate, marcate cu 51Cr. Datele provin de la patru câini: fiecare punct reprezintă radioactivitatea unei probe de sânge provenite dintr-o venă a unui membru. În fiecare caz, primul şi al treilea test s-a realizat cu eritrocite provenite de la acelaşi câine. În al doilea test s-au utilizat eritrocite tratate cu neuraminidază, provenite de la acelaşi câine.

1. 1. microEA cu membrană polimerică ultrasubmicroEA cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Injectarea intravenoasă a microEAEfectele încărcării particulelor polimerice asupra timpului de circulaţie

al eritrocitelor

atât particulele din polistiren, cât şi cele din polistiren sulfonat dispar rapid din circulaţie (30 sec.)

particulele de polistiren sulfonat sunt preluate de către sistemul reticuloendotelial, pe când cele nesulfonate de către plămâniEA cu membrană de nylon sulfonată

se prepară prin adăugare de diamine sulfonatesupravieţuiesc în circulaţie mai mult decât cele nesulfonate,

datorită faptului că nu sunt preluate eficient de către plămâni şi sistemul reticuloendotelial

1. 1. EA micrometrice cu membrană polimerică ultrasubEA micrometrice cu membrană polimerică ultrasubţţireire

Injectarea intravenoasă a microEAEA cu membrană de nylon sulfonată

Timpul de circulaţie al EA marcate cu 51Cr (diametru mediu 5 μm), după infuzarea intravenoasă la pisică. SusSus: EA cu membrană de nylon sulfonată. JosJos: EA cu membrană de nylon

Încorporarea polizaharidelorsuprafaţa eritrocitelor şi a endoteliului vascular este acoperită de mucopolizaharide de aceea, s-au realizat EA cu membrană de nylon cu heparină încorporată celulele cu heparină au fost eliminate din circulaţie rapid, însătotuşi

mai lent decât cele fără heparină

1. 1. EA micrometrice cu membrană polimerică ultrasubEA micrometrice cu membrană polimerică ultrasubţţireire

ConcluziiSe pot prepara EA in vitro Problema majoră este perioada extrem de scurtă de

supravieţuire a acestora în circulaţieChiar şi EA cu diametru mai mic de 1 μm sunt preluate de

către sistemul reticuloendotelial Răspunzător pentru menţinerea în circulaţie a eritrocitelor

este acidul sialicÎnglobarea acidului N-acetilneuraminic în membrana EA

prelungeşte perioada de supravieţuire a acestora în circulaţie, dar nu suficient de mult pentru a fi utilizate în diverse aplicaţii practice

2. 2. EA submicrometrice cu membrană lipidicăEA submicrometrice cu membrană lipidică

•

EA cu dimensiuni mai mici de 1 μm şi membrană lipidică sau lipoproteică au un timp de înjumătăţire în circulaţie semnificativ mai mare decât al EA cu membrană polimerică ultrasubţire •

Cele mai eficiente EA submicrometrice sunt cele care au înglobat PEG

(polietilenglicol) în membrană. Timpul de înjumătăţire în circulaţie –

mai lung de 30 ore

Injectarea intravenoasă a EA micrometrice

EA cu membrană lipidică. Stânga:Stânga: Bistrat lipidic care formează membrana hemoglobinei încapsulate. DreaptaDreapta: Încorporarea polietilenglicolului (PEG) în membrana lipidică determină îmbunătăţirea marcantă a timpului de circulaţie a veziculelor cu Hb.

2. 2. EA submicrometrice cu membrană lipidicăEA submicrometrice cu membrană lipidică

Compoziţia membraneiColesterol şi fosfolipideCreşterea eficienţei încapsulării Hb – utilizarea unor

cantităţi minime de lipideTimpul de circulaţie creşte semnificativ prin includerea

în membrană a lipidelor anionice, dar acestea interacţionează in vivo cu complementul

Utilizarea acidului 1,5-dipalmitoil-L-glutamat-N-succinic sintetic împiedică activarea complementului

Sistemul complementSistemul complement

•

un sistem seric de 25 de proteine enzime care se activează în cascadă sub acţiunea unui triggertrigger

•

cascadă biochimică ce ajută sau “completează” abilitatea anticorpilor de a curăţa organismul de agenţi patogeni

•

alcătuit din mai multe proteine sangvine circulante, cele mai multe dintre ele fiind sintetizate în ficat

•

circulă sub formă de precursori inactivi (pro-proteine). Când sunt stimulate de agenţii infecţioşi, proteazele din sistem clivează aceste pro-proteine şi iniţiază cascada enzimatică

•

procesul prin care se iniţiază şi propagă

această cascadă de reacţii se numeşte

activarea complementului

•

rezultatul activării cascadei enzimatice este amplificarea masivă a răspunsului şi activarea complexului de atac al membranei

Sistemul complementSistemul complement

Calea alternativăCalea alternativă Calea clasicăCalea clasicăCompuşi de suprafaţăai agentului infecţios

Complex antigen- anticorp (IgG sau IgM)

Activarea complementuluiActivarea complementuluiC convertazaC convertaza

C3 C3 ==

C3bC3b

+ C3a+ C3a

OpsonizareaOpsonizareaagenagenţţilor infecilor infecţţioioşşii

DeclanDeclanşşarea area inflamainflamaţţieiiei

Lizarea agenLizarea agenţţilorilorinfecinfecţţioioşşii

Complexul de atac al membranei

2. 2. EA submicrometrice cu membrană lipidicăEA submicrometrice cu membrană lipidică

Prepararea membranelor Se pasteurizează Hb pentru inactivarea virusurilor Hb este convertită la carbonilHb, ceea ce creşte stabilitatea Hb în timpul pasteurizăriiÎn timpul pasteurizării, are loc denaturarea şi precipitarea tuturor celorlalte proteine (inclusiv a methemoglobin-reductazei şi catalazei), ceea de duce la obţinerea Hb pureSe co-încapsulează apoi catalaza, glutationul şi efectorii alosterici cu Hb pură

După pasteurizare, Hb pură se trece printr-o serie de filtre pentru a îndepărta orice tip de viruşi, apoi se concentrează prin ultrafiltrare

După ajustarea concentraţiei de electroliţi, Hb se încapsulează în membrană lipidică care conţine PEG

CarbonilHb este convertită înapoi la oxiHb prin iluminarea veziculelor cu lumină vizibilă, în prezenţa O2

Hb nu exercită presiune coloid osmotică. De aceea, se adaugă soluţiei dextran sau amidon

EA astfel preparate se pot păstra la 4-23°C timp de 2 ani

2. 2. EA submicrometrice cu membrană lipidicăEA submicrometrice cu membrană lipidică

Methemoglobina•

Agenţii reducători şi glucoza nu pot străbate membrana

EA pentru a inhiba formarea metHb. În plus, enzimele eritrocitare se distrug în timpul pasteurizării. Chiar dacă se adaugă metHb-reductază EA, aceasta are nevoie de glucoză ca şi cofactor

Hb din EA este convertită lent

la metHb după infuzie la temperatura corpului•

Pentru încetinirea formării de metHb, se pot adăuga

antioxidanţi de tipul glutationului sau homocisteinei sau EA pot fi deoxigenate prin perfuzare cu azot lichid şi depozitate la 4°C

2. 2. EA submicrometrice cu membrană lipidicăEA submicrometrice cu membrană lipidică

Timpul de circulaţie după infuzie•

EA cu diametru mai mare de 200 nm sunt eliminate rapid din

circulaţie•

Cele cu diametru mai mic de 200 nm sunt eliminate destul

de repede de către sistemul reticuloendotelial•

EA cu diametru de ~ 60 nm sunt captate destul de rapid de

către ficat, prin endoteliul hepatic fenestrat• Scăderea diametrului EA scade eficienţa de încapsulare a Hb. Dacă EA se închid cu membrane lipidice cu PEG şi fosfatidiletanolamine, atunci veziculele cu diametru de 210-

275 nm au un timp de circulaţie destul de îndelungat (30 ore). Veziculele cu diametru mai mic, indiferent de compoziţia membranei, sunt eliminate rapid din circulaţie

2. 2. EA submicrometrice cu membrană lipidicăEA submicrometrice cu membrană lipidică

Siguranţa EA submicrometrice cu membrană lipidicăStudiile clinice au arătat că:

Indicatorii funcţiei hepatice (ALAT, ASAT, LDH) se menţin în limite normale

Bilirubina şi fierul se menţin la niveluri scăzuteConcentraţia lipidelor creşte după infuzie, dar revine la nivelul

normal după 2 săptămâniInfuzarea de EA cu diametru de 250 nm nu produce efecte

vasopresoare

Concluzii•

Singurul obstacol major în realizarea practică a EA este timpul

de circulaţie• Utilizarea de EA cu membrană lipidică şi PEG creşte timpul de circulaţie suficient de mult pentru ca EA să poată fi folosite în scop clinic

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Deşi EA submicrometrice rezolvă problema timpului de circulaţie, rămân cel puţin alte două

probleme:1.

Cu cât este mai mică dimensiunea particuleiCu cât este mai mică dimensiunea particulei, cu atât este mai , cu atât este mai mare suprafamare suprafaţţa sa a sa îîn acelan acelaşşi volum de suspensiei volum de suspensie. Astfel, suprafaţa totală a 1 ml suspensie de EA cu diametrul de 200 nm este de 10 ori mai mare decât a 1 ml suspensie de eritrocite. De

asemenea, cantitatea de lipide conţinută de membranele EA este de 10 ori mai mare comparativ cu membranele eritrocitelor, iar cantitatea mare de lipide determină reducerea funcţiei fagocitice a sistemului reticuloendotelial2.

O altă problemă nerezolvată este formarea metHbformarea metHb. In vivo, agenţii reducători prezenţi în plasmă, traversează membrana eritrocitelor şi acţionează în interiorul celulelor. Însă agenţii reducători nu pot traversa membrana lipidică a EA. De asemenea, glucoza necesară activării methemoglobin-reductazei nu poate traversa membrana EA.

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Proprietăţile membranelor biodegradabile1.

Nu conţin lipide în membrană sau le conţin în cantitate mică2.

Persistă în circulaţie un timp suficient de lung3.

Sunt stabile 4.

Rămân stabile după infuzie pe toată durata acţiunii ca substituent al sângelui, dar sunt degradate imediat după ce îşi îndeplinesc funcţia

5.

Materialul membranar şi produşii săi de degradare nu sunt toxici6.

Pe lângă Hb, conţin enzime specifice eritrocitelor precum SOD, CAT, anhidraza carbonică sau methemoglobin-reductaza

7.

Membrana este permeabilă pentru agenţii reducători şi/sau glucoză

La ora actuală, membrana EA nanometrice se confecţionează din acid polilactic (PLA), PLA-PEG sau alte materiale biodegradabile, iar diametrul nanocapsulelor este mai mic de 0,2 μm

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Motivele utilizării poliesterilor pentru membranele biodegradabilePoliesterii acidului polilactic, poliglicolic şi copolimerii lor sunt degradaţi la acid lactic şi acid glicolic care sunt metaboliţi normali în organismul umanRata degradării acestor compuşi poate fi ajustată prin variaţii ale masei moleculare, mărimii particulelor şi raportului copolimerilorPotenţiala toxicitate a EA nanometrice poate proveni de la monomerii reziduali sau substanţele chimice utilizate pentru polimerizare (acid butiric, poli-O-esteri, polianhidride). Toxicitatea poate fi totuşi diminuată/eliminată prin folosirea metodei evaporării în solventAcidul polilactic, poliglicolic şi polilactoglicolizii sunt folosiţi în chirurgie la suturi sau implanturi încă din 1982 şi nu provoacă reacţii adverse sau toxice

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Electronomicroscopie a unei EA cu membrană de acid polilactic

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Sinteza şi soarta EA nanometricePentru sinteza EA nanometrice este necesar mai puţin material decât pentru submicroEA. Acidul polilactic este degradat în organism la acid lactic, apoi la CO2.

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Siguranţa şi eficacitatea EA nanometriceEficienţa Hb nanoîncapsulate – variază între 13-29% din Hb

iniţială, în funcţie de polimerii utilizaţi

Enzimele şi sistemele enzimaticeUn mare numar de enzime prezente în mod normal în eritrocite au fost nanoîncapsulate şi s-a observat ca îşi păstrează activitatea (de ex., methemoglobinreductaza catalizează transformarea metHb la Hb)Activitatea methemoglobinreductazei poate fi optimizată în prezenţa glucozei şi a NADHMembranele EA nanometrice sunt permeabile pentru glucoză şi agenţi reducători, dar impermeabile pentru NADH. De aceea, NADH necesar methemoglobinreductazei trebuie încorporat în EA odată cu Hb

3. 3. EA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilăEA nanometrice cu membrană polimerică biodegradabilă

Siguranţa şi eficacitatea EA nanometriceEnzimele şi sistemele enzimatice

Nanoîncapsularea determină creşterea nivelului de metHb. Incubarea EA la 37°C determină creşterea în continuare a metHb. Adăugarea unui agent reducător, acidul ascorbic, previne creşterea nivelului de metHb. Adiţia de glucoză şi NADH determină scăderea şi mai accentuată a metHb.