CAPITOLUL I

OBIECTUL DE STUDIU AL GENETICII UMANE

Biologia este stiinta care se ocupa cu studiul legilor ce stau la baza originii, organizarii si evolutiei organismelor vii.

Desi cunoscuta din antichitate, Biologia s-a dezvoltat si se dezvolta permanent, reprezentand fundamentul teoretic pentru discipline ca : genetica, anatomia, fiziologia, embriologia, antropologia, patologia genetica, imunobiologia, biologia celulara, etc.

Dezvoltarea biologiei a fost si este conditionata de dezvoltarea tehnicii si perfectionarii metodelor de studiu si cercetare, cautandu-se o permanenta preocupare de a elucida relatia omului cu universul, cu mediul inconjurator care este in permanenta schimbare. Este stiinta cu caracter nerestrictiv.

Dar lumea vie se compune dintr-un mare numar de individualitati, care, prin similitudini de forma, structura, functii, se grupeaza in populatii, in specii. Similitudinile se mentin in succesiunea generatiilor in populatie datorita capacitatii de a transmite, in forma codificata, ansamblul de caractere specifice populatiei sau speciei, dar si cu particularizari fenotipice ale fiecarui individ in populatie.

Diversitatea fenotipica a indivizilor in populatie este consecinta recombinarii aparatului genetic in meioza si fecundatie, a proceselor cronogenetice si cronobiologice in activitatea genomului. Este influenta unor secvente tranzitionale din genom, sau efectul distructiv indus de factori fizico-chimici si biologiei agresivi, capabili sa modifice aparatul genetic al celulelor din organism.

Complexitatea acestor procese particulare organismelor vii a impus aparitia unei stiinte biologice bine delimitata : GENETICA.

GENETICA este stiinta ereditatii, variabilitatii si reproducerii organismelor vii. Este stiinta fundamentala.

Relativ tanara, genetica a avut o evolutie rapida, diversificandu-se in mai multe directii de cercetare si anume:

- genetica umana fundamentala- genetica moleculara- genetica medicala- genetica populatiei sau antropologica- cronogenetica

9

- si cronobiologia dezvoltarii organismelor.Genetica, sinteza dinamica a datelor si descoperirilor din biofizica,

biochimie, biomatematica, cibernetica, semantica, citologie, etc., ne ofera cheia" dezlegarii necunoscutelor fiintelor vii.

Genetica permite sa cunoastem structura materialului ereditar, mecanismelor de conservare sau de diferentiere a caracterelor pe fond genetic, sa cunoastem factorii cu potential de modificare a structurii si functiei aparatului genetic (mutatiile). Tot genetica descifreaza macanismele si procesele de diferentiere, de dezvoltare ontogenetica (normala si/sau patologica). Ea permite elaborarea de metode pentru clonarea terapeutica, de fertilizare in vitro, etc.

Prin extrapolarea principiilor Biologiei si Geneticii in patologia umana, s-a conturat o disciplina medicala fundamental : Genetica Medicala".

Genetica umana, Genetica medicala studiaza principiile, procesele, mecanismele si legile care guvemeaza diferentierea, cresterea, reproducerea si dezvoltarea indivizilor din populatiile umane. Analizeaza relatiile dintre individ si populatiile conspecifice, ca produs al evolutiei normale sau patologice a omului, in raport cu mediul sau de viata.

Genetica medicala contribuie la elaborarea mijloacelor terapeutice eficiente in combaterea, corectarea si preintampinarea aparitiei bolilor genetice in familie, in populatie. Deasemenea asigura starea de sanatate fizica si psihica a omului.

Recentele achizitii stiintifice in genetica confirma valoarea extrapolarii principiilor acestei stiinte in medicina, cu posibilitatea cunoasterii complexe a omului normal sau bolnav.

Datorita progreselor in biologie si biogenetica, J. Bernard afirma ca Genetica este strans legata de interesele omului, de societate. De aceea spunea Bernard: ....genetica cere cu necesitate clarificarea stiintifica a proceselor biologice, abordarea stiintifica a evolutiei genomului uman, cunoasterea, la toate nivelele de organizare, a organismului si viitorul genetic al omului..."

Linus Carl Pauling (1949) afirma urmatoarele: ...dintre toate sistemele naturale, materia vie este aceea care, prin imensele sale transformari, pastreaza cea mai mare parte a propriei sale treceri istorice inscrise in organizarea sa. Ca nu exista alt sistem ca eel biologic, care sa fie constant suprimat si simultan mentinut, si ca este suficient a ne interoga pe noi insine pentru a sti in care dintre sistemele vii actuale s-a realizat cea mai mare parte a trecerii istorice...".

10

Genetica cauta sa descifreze interrelatiile dintre componenta genetica a organismului si factorii de mediu, de a descifra interferentele de influenta si/sau efectele distinctive, intre genotip si mediul ambiant. Genetica, stiinta cu caracter nerestrictiv, studiaza complexitatea structural-functional-comportamentala a omului, in care rolul primordial il are genomul, constituit in momentul formarii zigotului prin procesul de fecundatie.

Pentru o corecta apreciere a aparatului genetic care controleaza caracterele exprimate fenotipic, este necesara cunoasterea unor marimi pe care Dubinin (1969) le mentiona pentru om :

- celula gametica la om contine aproximativ un sfert de microni cubi(miu3) de acizi nucleici, in greutate de 4x1012 g (grame) ;

- populatia terei este estimata la sase miliarde de locuitori : 6x109;- nasterea acestui numar de oameni necesita 12xl09 gameti haploizi

(6x109 ovule si 6x109 spermatozoizi);- volumul total al acizilor nucleici existent in cele 12 miliarde de

gameti haploizi se estimeaza la 4,8 mm3 si o greutate de 48 mg ADN;- intr-un vol urn egal cu o picatura de ploaie este inmagazinata

componenta moleculara, ADN-ul, pentru cele 6 miliarde de indivizi umani;- dar corpul uman are aproximativ 6xl013 celule, din care se distrug

in 24 de ore cca 5x10" celule. Dar tot atatea se produc, asigurandregenerarea fiziologica si mentinerea integritatii morfo-functionale aorganismului.

Datele prezentate de Dubinin evidentiaza complexitatea constitutionala a speciei Homo sapiens.

11

CAPITOLUL II

EREDITATEA LA OM

Ereditatea este functia biologica a organismelor vii de a conserva si transmite caracterele morfo-structurale, moleculare, fiziologice si comportamentale de la o generatie la cele care-i succed.

Este latura sincronica, de conservare si transmitere a informatiei genetice, prin care este mentinut axul structural-functional al speciei in spatiu si timp.

Ereditatea conserva caracterele, le stabilizeaza.Pentru studiul ereditatii, in fata geneticienilor au fost formulate o serie de

intrebari ca:- Ce se transmite? Care este natura fizico-chimica a materialului

genetic mostenit de la parinti?- Cum este transmis materialul genetic? Care sunt mecanismele ce

asigura continuitatea intre generatii?- Cum actioneaza materialul genetic?- Daca raspunde destructiv la interferentele cu factorii agresivi din

mediu si care sunt efectele fenotipice asupra indivizilor?Sunt intrebari fundamentale la care genetica raspunde, explica, demonstreaza, convinge.

Viata precede intricatiei fenomenelor dinamice, legate de structurile specifice ale celulei, ale organismului.

Dinamismul", propriu vietii, este exprimat sub diversele activitati metabolice care asigura cresterea si functiile organismului.

Suportul acestui dinamism este asigurat de moleculele proteice, cu rol structural sau enzimatic, ce se caracterizeaza prin specificitate de structura si functie.

Identitatea si specificitatea proteinelor de la o generatie la alta in cadrul speciei sunt garantate si realizate prin mecanisme informational codificate, de biomoleculele genomului uman.

Biomoleculele care detin, in forma codificata, informatiile genetice se caracterizeaza prin aranjari particulare ale componentelor structurale, realizand ceea ce numim masinaria genetica", "banca genetica" de informatii din genomul organismului. Dar spre deosebire de variabilitate, ereditatea, ca functie sincronica, stabilizeaza caracterele datorita macromoleculelor codante.

12

Macromoleculele codante implicate in functiile de ereditate si variabilitate trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii :

- sa detina informatia necesara structurii, functiei si stabilitatii" dereproducere in celulele organismului. Aceasta informatie o gasim codificatain ordonarea aperiodica a monomerilor, ca unitati de structura ce alcatuiescaparatul genetic molecular al celulei, in ADN;

- sa fie capabile de autoreplicare (autocatalitica), mecanism careasigura trecerea nemodificata" a informatiei genetice din celula mama sprecelulele fiice ce rezulta prin diviziune;

- sa exercite functia heterocatalitica, cand, prin decodificareainformatiilor genetice inscrise in structura lor, sa asigure sinteza de ARNmesager care, in citoplasma, realizeaza sinteza proteinelor cu structuraspecifica, in conformitate cu mesajul genetic copiat.

- sa prezinte o oarecare labilitate" ca raspuns la interferanta cufactorii de mediu potentiali agresivi si cu efecteie distructive asupramoleculelor codante.

Aceste conditii sunt indeplinite de acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul), care, virtual, isi exercita functiile la toate organismele: procariote si eucariote.

Datorita procesului convergent intre informatia codanta si proteine, apar similitudini de forma structura si functii intre indivizii conspecifici, dar si o divergenta fenotipica interindivizi, definind individualitatile in populatie.

De exemplu, fenotipul unui individ este o sinteza" complexa de elemente mostenite de la generatiile ascendente, realizata prin procesul informativ, codificata , transmisa si mostenita.

Trasaturile fenotipice le grupam in categorii de caractere dupa cum urmeaza:

- caractere specifice care particularizeaza specia;- caractere intraspecifice sau individuale particulare si de

diferentiere a indivizilor conspecifici;- caractere dobandite de novo"posibile a fi inscrise in zestrea

genetica a individului. Ele au efecte severe distructive - morbide sau letale- si care pot deveni transmisibile.

13

1. Suportul molecular al ereditatii

Dupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick (1953) au elucidat structura in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici.

In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituenti principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite histone.

Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in forme virulente, cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul infectiei" bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda), unde, prin autosinteza, se asigura multiphcarea bacteriofagilor.

Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiphcarea prin sinteza de ARN.

In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG = Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea nucleotidelor din moleculele ADN ce apartineau diverselor specii de plante si animale.

In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi nucleotidice din structura ADN-ului.

Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei genetice.

S-a demonstrat ca molecula tipar" genereaza noi molecule complementare cu molecula initiala.

S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5 nucleotidele in molecula, determinant o structura liniara si ordonata care este ADN-ul.

14

1. Suportul molecular al ereditatii

Dupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick (1953) au elucidat structure in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici.

In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituent! principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite histone.

Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in fonne virulente, cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul infectiei" bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda), unde, prin autosinteza, se asigura multiplicarea bacteriofagilor.

Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiplicarea prin sinteza de ARN.

In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG = Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea nucleotideior din moleculeie ADN ce apartineau diverselor specii de plante si animale.

In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi nucleotidice din structure ADN-ului.

Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei genetice.

S-a demonstrat ca molecula tipar" genereaza noi molecule complementare cu molecula initiala.

S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5'-3' cupleaza nucleotidele in molecula, determinand o structure liniara si ordonata care este ADN-ul.

14

Totusi momentul revolutionar" in studiul structurii si dispozitiei spatiale a ADN-ului este anul 1953, cand Watson si Crick (laureati ai premiului Nobel) folosind ca metoda de studiu spectreie de difractie a razelor X, au demonstrat ca molecula ADN are o structura spatiala (o arhitectura) ordonata sub forma de dublu helix.

Argumentele de ordin general rezultate din cercetarile biochimistilor si geneticienilor, prin care este atestat rolul ADN-ului ca suport molecular al ereditatii si variabilitatii sunt urmatoarele:

- ADN-ul este o molecula cu structura speciala determinata deordonarea aperiodica a nucleotidelor in catenele cuplate complementar;

- ADN-ul este molecula capacitata cu functia de autoreproducere,functia autocatalitica, care se realizeaza prin replicare semiconservativa.Este functia care asigura conservarea informatiei genetice in generatiile cesucced;

- ADN-ul serveste ca tipar pentru a i se decodifica mesajul geneticinscris in structura sa. Prin decodificare si respectarea principiuluicomplementaritatii bazelor, rezulta molecula de ARN mesager, care, incitoplasma celulei, asigura sinteza de proteine cu structuri si functiispecifice;

- avand structura neramificata, informatia genetica din ADN estestocata si dispusa liniar. Este principiul care asigura decodificareacorecta";

- cantitatea de ADN este aceeasi in toate celulele somatice (cuaproximatie), fiind celule diploide;

- in celulele gametice, care sunt haploide (cu numarul injumatatit decromozomi fata de celulele somatice - la organismele cu reproduceresexuata) cantitatea de ADN este redusa la jumatate in raport cu celulasomatica diploida;

- cantitatea de ADN variaza in raport cu fazele ciclului celular sinumarul cromozomilor :

- in ciclul mitotic (fig. 1) :-in stadiul interfazic Gi gasim:

- 2n cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 1 cromatida pentru fiecare cromozom;- in stadiul interfazic S are loc sinteza ADN-ului prin

replicare semiconservativa. La sfarsitul acestui stadiu cantitatea de ADN vafi de 4n;

- in stadiul G2 interfazic gasim:- 2n cromozomi;- 4n cantitate ADN;

15

- 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom;- la sfarsitul ciclului mitotic gasim:- 2n cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

cantitate ADN

4o ADN

2n ADN

INfTERFAZA 10 12 14 16 18 imi20 Z.

|P:'M! ATI

Fazeieji durata(h)

MTTOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor somatice- in meioza, cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2)- In diviziunea primara a meiozei:

- in stadiul d gasim :- 2n cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 1 cromatida pentru fiecare cromozom;

- in stadiul G2 gasim :- 2n cromozomi;- 4n cantitate ADN;- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;- la sfarsitul diviziunii primare celulele au :- in numar cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;- In diviziunea secundara a meiozei :- in interfaza, profaza si metafaza gasim :- in numar cromozomi;

16

- 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom;- la sfarsitul ciclului mitotic gasim:- 2n cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

ADN

4n ADN

2n ADN

0,5 C2 C,

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 iiili 20 22 Riwfeji

, fc.11111 duratairsTTERFAZA ^T^-s W|P!M ATI

* fcMITOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor somatice- in meioza. cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2)- In diviziunea primara a meiozei:

- in stadiul d gasim :- 2n cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 1 cromatida pentru fiecare cromozom;

- in stadiul G2 gasim :- 2n cromozomi;- 4n cantitate ADN;- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;- la sfarsitul diviziunii primare celulele au :- in numar cromozomi;- 2n cantitate ADN;- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;- In diviziunea secundara a meiozei :- in interfaza, profaza si metafaza gasim :- in numar cromozomi;

16

- 2n cantitate ADN;- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;

-la sfarsitul diviziunii secundare celulele vor avea :- in numar cromozomi;- in cantitate ADN;- 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

Observam ca in celula gametica numarul cromozomilor si cantitatea de ADN sunt reduse la jumatate in raport cu celula somatica;

- cand structura ADN este modificata, efect al actiuniiagresive a factorilor potentiali mutageni, sau printr-un mecanism decrossing-over inegal, apar caractere noi (normale - adaptative saupatologice).

Fig. 2 Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celular in gametogeneza.

2. Structura moleculei de acid dezoxiribonucleic (ADN)

Molecula de ADN din genomul procariotelor si eucariotelor are o structura polidezoxiribonucleotidica dublu catenara, catenele fimd cuplate intre ele pe principiul complementaritatii bazelor azotate componente. Cele doua catene cuplate realizeaza o dispozitie spatiala, o arhitectura in dublu helix.

17

legaturi fosfodiester 5 -3 formand scheletul glucido-fosforic. ADN-ul este molecula inalt polimerizata.

2.1. Unitatea de structura a molecuiei de ADN

Unitatea de structura a ADN-ului este nucleotidul. Este un monomer in componenta caruia exista trei tipuri de molecule, inseparabile intre ele : o baza azotata, o pentoza si un radical fosfat.

Bazele azotate pot fi purinice si pirimidinice.Bazele purinice prezinta doua heterocicluri : un hexaheterociclu

(pirimidinic) si un pentaheterociclu (imidazolic). Bazele purinice in structura ADN-ului sunt : adenina (A) si guanina (G) (fig. 3).

NM, 0

I ! CM

W I

NM, O

N CH HN Cit i *C XH C .CM

O XMM O XNM

"

m

Fig.3 Structura bazelor purinice (A; G) si pirimidinice (T; C).

18

Bazele pirimidinice se prezinta sub forma unui hexaheterociclu pirimidinic. In structura ADN-ului bazele pirimidinice sunt reprezentate de timina (T) si citozina (C) (fig.3).

A doua componenta din structura nucleotidului este pentoza, un glucid care se prezinta ca heterociclu de tip beta ((3)- furanozic.

Cele doua componente, baza azotata si pentoza, esterifica cu formarea nucleozidului. Esterificarea se face printr-o legatura N-glucidica, legatura covalenta. Esterificarea se face intre hidroxidul din pozitia Ci al pentozei si azotul din pozitia N3 la pirimidine si pozitia N9 pentru purine.

A treia componenta a nucleotidului este radicalul fosfat, care se cupleaza, prin esterificare, de nucleozid, cuplarea stabilindu-se cu hidroxidul de la C3 sau C5 al pentozei.

Cuplarea celor trei componente fmalizeaza structura nucleotidului (fig.4sifig.5).

Fig. 4 Structura nucleotidului cu baza pirimidinica ( Timina ) ; esterificare C5-

Structura nucleotidului cu baza purinica (Adenina) ; esterificare C5.

19

H-'

HO' P">-CM>/li 0

H\H H/M1

OK OK(Acidul fosforic poate esterifica si la OH de la carbonul 3, ramane liber de la carbonul 5).

Fig. 5 Structura nucleotitului cu citozina

NH

01

O-P-

-0-

0

Structura nucleotidului cu guaninaOH OH

ADN-ul este molecula rezultata din esterificarea si ordonarea liniara acelorpatru tipuri de nucleotide.

2.2. Structura primara a ADN

Structura primara analizeaza modul de formare a monocatenei din structura moleculei de ADN.

Se urmareste ordonarea nucleotidelor si gradul de polimerizare a monocatenei ADN-ului.

Polimerizarea nucleotidelor se face prin legaturi fosfodiesterice, intre radicalul fosfat al nucleotidului,cu hidroxidul din pozitia 3' sau 5', a pentozei nucleotidului urmator. Prin polimerizare se formeaza scheletul glucido-fosforic al monocatenei liniare din molecula ADN-ului.

Desi prezente, bazele azotate nu participa la realizarea structurii scheletului glucido-fosforic. Bazele sunt cuplate cu hidroxidul Ci al pentozei fiecarui nucleotid.

Prezenta si ordinea bazelor din monocatena polinucleotidica determina specificitate structural-functionala moleculei de ADN. Ordonarea

21

o:

specifica realizeaza informatia genetica inscrisa in ADN-ul genomic (fig. 6).

ADN-ul

Fig. 6 Structura primara a ADN (scheletui glucido-fosforic) - esterificare3'-5\

22

Nucleotidele sunt molecule orientate, cuplate intre ele prin legaturi fosfo-diester in ordinea:

. . .-y-s'-y-S'-y-S'-y-S'-y-S'-ys'-y'S'-ys'-y-s'-y-s'-....Ordonarea nucleotidelor confera polaritate moleculei de ADN.

Polaritatea confera proprietati fizico-chimice deosebite si functii biologice particulare moleculei de ADN.

Monocatena are la un capat pentoza terminala cu hidroxidul liber in pozitia OH-3', iar la capatul opus pentoza cu hidroxidul liber OH-5\ Acesti hidroxili terminali asigura cuplarea si dispunerea in tandem a moleculelor de ADN, cu realizarea structurii tridimensionale in cromozomul celular. Este distributia in spatiu sau arhitectura cromozomilor.

Dupa descoperirea rolului ADN-ului in ereditatea organismelor, analizele fizico-chimice care s-au efectuat ulterior, au identificat prezenta a patru tipuri de nucleotide in structura sa.

Initial s-a crezut ca in molecula ADN-ului, cele patru tipuri de nucleotide ar respecta ordonarea periodica, care ar structura cele doua catene polinucleotidice. Periodicitatea considera ordonarea regulata a celor patru nucleotide, conform schemei :

.....A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C ....

.....L_____J L_____J L____J L_____J L_____J 1_____J I______I L_____J_.

...... 1 2 3 4 V 2' 3' 4' ....

Conform principiului ordonarii periodice a nucleotidelor, structura moleculelor de ADN ar fi trebuit sa fie identica atat la procariote cat si la eucariote, atat la protozoare (organisme unicelulare) cat si la om, atat la regnul vegetal cat si la eel animal. Ca urmare, datorita identitatii structurii moleculelor de ADN, si cum ADN-ul are functia de determinism genetic, ar fi trebuit ca toate speciile de pe Tera: plante-animale, bacterie-om, sa prezinte aceleasi caractere, cu aceleasi structuri si functii.

Dar studiile fizico-chimice cantitative au consemnat ca nucleotidele nu au ordonare periodica. Rationamentele pentru care nu s-a acceptat periodicitatea nucleotidelor sunt urmatoarele:

- s-ar fi realizat o informatie genetica limitata;- prin periodicitatea nucleotidelor s-ar fi obtinut numai patru tipuri

de triplete (codoni) care sa specifice aminoacizii din structurile proteice;- cum exista o stricta corespondenta intre codon si aminoacid (un

codon specifica strict un tip de aminoacid) ar fi trebuit ca toate moleculeleproteice sa contina numai patru aminoacizi a caror ordonare respectaordonarea periodica a codonilor (tripletelor), iar proteinele sa prezinte

23

Nucleotidele sunt molecule orientate, cuplate intre ele prin legaturi fosfo-diester in ordinea:

...-y-s'-ys'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s''.....Ordonarea nucleotidelor confera polaritate moleculei de ADN.

Polaritatea confera proprietati fizico-chimice deosebite si functii biologice particulare moleculei de ADN.

Monocatena are la un capat pentoza terminala cu hidroxidul liber in pozitia OH-3', iar la capatul opus pentoza cu hidroxidul liber OH-5'. Acesti hidroxili terminali asigura cuplarea si dispunerea in tandem a moleculelor de ADN, cu realizarea structurii tridimensionale in cromozomul celular. Este distributia in spatiu sau arhitectura cromozomilor.

Dupa descoperirea rolului ADN-ului in ereditatea organismelor, analizele fizico-chimice care s-au efectuat ulterior, au identificat prezenta a patru tipuri de nucleotide in structura sa.

Initial s-a crezut ca in molecula ADN-ului, cele patru tipuri de nucleotide ar respecta ordonarea periodica, care ar structura cele doua catene polinucleotidice. Periodicitatea considera ordonarea regulata a celor patru nucleotide, conform schemei :

......A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C ....L____J L____J L___J L_____J L____J L____J I____J L____J..

....... 1 2 3 4 1' V 3' 4' ....

Conform principiului ordonarii periodice a nucleotidelor, structura moleculelor de ADN ar fi trebuit sa fie identica atat la procariote cat si la eucariote, atat la protozoare (organisme unicelulare) cat si la om, atat la regnul vegetal cat si la eel animal. Ca urmare, datorita identitatii structurii moleculelor de ADN, si cum ADN-ul are functia de determinism genetic, ar fi trebuit ca toate speciile de pe Tera: plante-animale, bacterie-om, sa prezinte aceleasi caractere, cu aceleasi structuri si functii.

Dar studiile fizico-chimice cantitative au consemnat ca nucleotidele nu au ordonare periodica. Rationamentele pentru care nu s-a acceptat periodicitatea nucleotidelor sunt urmatoarele:

- s-ar fi realizat o informatie genetica limitata;- prin periodicitatea nucleotidelor s-ar fi obtinut numai patru tipuri

de triplete (codoni) care sa specifice aminoacizii din structurile proteice;- cum exista o stricta corespondenta intre codon si aminoacid (un

codon specifica strict un tip de aminoacid) ar fi trebuit ca toate moleculeleproteice sa contina numai patru aminoacizi a caror ordonare respectaordonarea periodica a codonilor (tripletelor), iar proteinele sa prezinte

aceeasi structura, acelasi numar de aminoacizi, aceiasi aminoacizi ca structura la toate organismele vegetale si animale.

Ca urmare din structurile proteice ar fi trebuit sa lipseasca 16 aminoacizi (cunoscuti in structurile proteice sunt 20 aminoacizi) si prezenti numai patru tipuri .

Cel care a demonstrat ca cele patru tipuri de nucleotide au o ordonare aperiodica, aleatorie, a fost Chargaff (1950). Folosind metode fizico-chimice cantitative, prin degradare enzimatica a moleculelor de ADN, a demonstrat ordonarea aperiodica si ca cele patru tipuri de nucleotide, ce structureaza monocatena polinucleotidica a moleculei de ADN, au o ordonare aleatorie, non-periodica.

Dupa Chargaff, ordonarea aperiodica, aleatorie in monocatena ADN-ului s-a realizat in cursul evolutiei bio-genetice a moleculelor de ADN.

Sa consideram ipotetic o secventa aperiodica din catena moleculei deADN:

.......A T T C C G A G C T T A C G A G T T G C T T A C C C C A A T A . . . .L_J I____I I___J IJ L___I I___I L_J L_J l__J L_J L_.............

...... 123 45 6 7 8 9 10Analizand aceasta secventa observam ca numarul tripletelor

(codonilor), ca tipuri diferite, asigura o crestere numerica a tipurilor de triplete (43 = 64 - vezi codul genetic), dar si pozitia tripletelor este aleatorie.

Datorita ordonarii aperiodice a nucleotidelor si tripletelor se realizeaza o cantitate inepuizabila de informatie genetica depozitata in structura moleculelor de ADN.

Informatia genetica realizata prin aperiodicitatea nucleotidelor, confera fiecarei molecule de ADN specificitate structural-functionala, obtinindu-se marea diversitate a tipurilor de mesaje genetice depozitate in structurile ADN-ului. Mesajele genetice inscrise in structurile ADN pot fi decodificate si matedalizate in molecule de ARN mesager. Cum ARNm este implicat direct in sinteza de proteine, imprima acestor proteine o structura specifica (conform mesajului genetic decodificat din ADN), proteine care vor exercita si functii specifice in celula, in organism.

Pentru o mai corecta intelegere a semnificatiei biologice a aperiodicitatii nucleotidelor ce structureaza, biochimic, monocatena polinucleotidica din molecula ADN, vom analiza o secventa arbitrara" in componenta careia sunt 1000 nucleotide. Cum fiecare nucleotid este reprezentat de una din cele patru tipuri de baze azotate, conform principiului aperiodicitatii (ordonarea aleatorie), se pot realiza combinatii polinucleotidice de ordinul 41000, respectiv 10600. Dar genomul uman

24

contine aproximativ 3.500.000.000 perechi de nucleotide. In consecinta[ ordonarea aperiodica ar determina combinatii de ordinul 43.500.000.000 perechi

de nucleotide. Si daca folosim preceptul lui Einstein ca numarul atomilordin Univers ar fi 0.88 x 1079 se poate considera ca informatia genetica ar fi

I inepuizabila in spatiu si timp, datorita aperiodicitatii structurii primare.Importanta structurii primare:- asigura specificitate structural-functionala moleculelor ADN;- realizeaza informatia genetica , care este depozitata sub forma de

mesaje ereditare pentru caracterele moleculare, celulare, tisulare, de organsi pentru activitatea metabolica a organismului uman;

- sub forma de mesaje genetice, informatia genetica estedecodificata prin sinteza de ARNm, care, in citoplasma, determina sintezadeproteine cu structuri si functii specifice in celula.

2.3. Structura secundara a ADN

Cu exceptia unor bacteriofagi, la care ADN-ul este monocatenar, toate procariotele si eucariotele au molecula ADN structurata din doua I monocatene cuplate.

ADN-ul este dublu catenar. catenele fiind copolimerice.Catenele copolimerice sunt cuplate intre ele prin punti de hidrogen,

punti ce se stabilesc intre bazele azotate prezente in structura monocatenelor.

Chargaff (1950), este cercetatorul care a demonstrat ca ADN-ul are o structura secundara dublu catenara.

Folosind metode fizico-chimice de analiza cantitativa, Chargaff stabileste raportul de complementaritate intre bazele purinice si cele pirimidinice, complementaritate care asigura cuplarea catenelor copolimerice.

Rezultatele lui Chargaff pot fi sintetizate astfel : -intre bazele azotate intercatenare se stabilesc punti de hidrogen. I Complementaritatea, in conditii fiziologice normale a structurii ADN-ului, se realizeaza intre: Adenina cu Timina (A - T) si Guanina cu Citozina (G-C);

- raportul de complementaritate se bazeaza pe urmatorulrationament valoric: indiferent de specie si regn, s-a constatat ca adeninaeste valoric egala cu timina, iar cantitatea de guanina este egala cu a

I citozinei. Aceste raporturi valorice: A = T si G = C explica complemen-

25

taritatea. Acest raport complementar in baze A = T si G = C este numit regula Chargaff sau ratio baza" ;

- complementaritatea este demonstrata prin cinetica reactiilor fizico-chimice, conform urmatoarelor principii de analiza : hidrogenul dincomponenta bazelor azotate are un nucleu" cu volum mic si intens pozitiv.In jurul acestui nucleu graviteaza un electron negativ (e~). Acest electronnegativ este incapabil" sa satisfaca sarcina pozitiva a nucleului atomic. Inconsecinta, hidrogenul poate primi un electron negativ de la alt atom, cucare isi completeaza orbita. In aceste conditii se poate stabili o legaturaelectrovalenta. Hidrogenul reahzeaza aceste legaturi si cu atomul de azotsau cu oxigenul din structura altei baze azotate, care poate fi purina saupirimidina ;

- in molecula ADN-ului cu structura normala, adenina (ca bazapurinica) poate stabili doua punti de hidrogen cu timina (baza pirimidinica),iar guanina (ca baza purinica) reahzeaza trei punti de hidrogen cu citozina(baza pirimidinica), (fig.7). Sunt cupluri complementare in ADN: A = T;T = AsiG = C;C = G. Cuplarea complementara prin punti de hidrogeneste principiul structurii secundare a moleculei de ADN;

I r r , ' r r |&*\ UM.............o OH, K**\ o- ...im

/ ?\ / >\ / / *\ /' 5\ /

A T G H C{***) l*irtft) foMBMI jcftorirt}

Fig. 7 Cuplarea bazelor azotate prin legaturi de hidrogen. T se leaga cu A prin doua legaturi de hidrogen ; C se leaga cu G prin trei legaturi de hidrogen.

- analiza cantitativa a moleculelor de ADN extrase de la diverse specii animale sau vegetale au evidentiat urmatorul aspect : cantitatea de A + T nu este egala cu cantitatea G + C :

26

A + T---------^ 1G+C

Datorita raportului valoric neunitar este confirmata aperiodicitatea ordonarii nucleotidelor in catenele copolimerice (deci intre purinele si pirimidinele din componenta celor doua catene este respectata complementaritatea de cuplare). Valoarea neunitara a raportului Chargaff confirma aperiodicitatea celor doua catene (aperiodice) copolimerice , desi intre bazele purinice si cele pirimidinice este respectata complementaritatea.

A + T- raportul ---------, valoric , variaza in limite foarte largi.

G + C De exemplu:

- la Saccharomyces cerevisie cuplul A + T este in proportie de 64%fatadeG + C-36%; "

- la Bos taurus A + T este in proportie de 58% iar G + C in proportiede 42%;

- la Homo sapiens (om) proportia este de 62% A + T iar G + C de38% etc.Observam ca intre specii apar diferente valorice intre A + T si G + C;

- desi valoarea raportului Chargaff variaza valoric intre specii, laindivizii conspecifici se mentine aproape constant si apropiat valoric. In1978 Lints confirma aperiodicitatea cuplurilor complementare.

Ca importanta, complementaritatea structurii secundare confera moleculei de ADN functii bio-genetice esentiale:

- respectand principiul complementaritatii se asigura replicareasemiconservativa a ADN-ului (autocatalitica) si continuitatea informatieigenetice (functia sincronica si conservarea ei);

- pe principiul complementaritatii bazelor azotate, se realizeazadecodificarea mesajelor genetice inscrise in structura ADN-ului de catremoleculele de ARNm. Moleculele de ARNm sunt complementare fata desecventele decodificate din ADN;

- metode de analiza a structurii ADN-ului prin denaturare sirenaturarea moleculei se bazeaza tot pe principiul complementaritatiibazelor purine si pirimidine;

27

- pe principiul complementaritatii bazelor azotate se construiesc" sise folosesc sondele si amprentele genetice pentru identificarea si localizareagenelor, pentru secventierea moleculelor de ADN.

2.4. Structura tertiara a ADN

Prin tehnica difractiei razelor X s-a stabilit ca ADN-ul are o arhitectura spatiala ordonata.

Wilkins (1950) este primul cercetator care a folosit tehnica difractiei razelor X in studiul moleculei ADN , urmat de Franklin in 1951. Rezultatele obtinute de Wilkins si Franklin au confirmat ca:

- cele doua catene copolimerice, cuplate complementar, audispozitia spatiala in dublu helix. Aceasta observatie confirma ca moleculaADN are structura tridimensionala sau dispozitie spatiala;

- structura tridimensionala a ADN-ului este asemanatoare pentruprocariote si eucariote, indiferent de gradul de evolutie a speciilor.

In 1953, Crick si Watson care, fara sa cunoasca lucrarile si observatiile lui Wilkins si Franklin, folosind tehnica difractiei razelor X, elaboreaza ipoteza asupra structurii tridimensionale a moleculei ADN din genomul celular. Modelul elaborat de Watson si Crick a fost publicat in 1953 in revista Nature", rezultate pentru care li s-a acordat Premiul Nobel pentru Medicina.

La elaborarea modelului tridimensional, Watson si Crick au folosit raportul de complementaritate intre cele doua catene copolimerice din molecula ADN. Pe baza datelor obtinute prin difractia razelor X cei doi cercetatori au elaborat postulatul: ADN-ul este molecula dublu catenara. Cele doua catene sunt cuplate prin punti de hidrogen, conform principiului complementaritatii intre purine si pirimidine (A = T si G = C). Catenele cuplate se spiraleaza formand un a helix iar catenele copolimerice fiind antiparalele. Planele pentozelor cuplate cu acidul fosforic sunt dispuse la exteriorul duplexului, formand scheletul glucido-fosforic paralel pe axa virtuala a dublului helix. Bazele azotate, cuplate complementar si dispuse in interiorul moleculei au planele perpendiculare pe axa virtuala a moleculei de ADN".

Planele cuplurilor complementare sunt la distanta de 3,4 A (0,34nm) intre ele. Fiecare cuplu complementar de baze are un unghi de rotatie de 36 in raport cu cuplul urmator. Cuplurile complementare sunt

Valori folosite in studiul moleculei ADN:lm = 102cm = 103mm = 106um = 109nm = 1010A metru centimetri milimetri micrometri nanometri Angstromi

28

etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus de stabilitate moleculei de ADN.

Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui ax central virtual", se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360 are un pas de 34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri complementare de baze azotate.

Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin interrelatii termodinamice:forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen.

La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine bazice care neutralizeaza sarcinile negative.

Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen.

In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are o structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G = C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista toate permutarile posibile de inserare secventiala.

Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea, denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca proprietati fizico-chimice mentionam:

- prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei moleculeADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiuluicorespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesajegenetice in ADN-ul genomului uman;

- ADN-ul este molecula neramificata, putin rigida. Este o moleculapolimerica flexibila si fragila" ;

- masa moleculara a moleculei de ADN poate fi estimata la 12-16x106 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7>

etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus de stabilitate moleculei de ADN.

Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui ax central virtual", se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360 are un pas de 34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri complementare de baze azotate.

Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin interrelatii termodinamice:forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen.

La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine bazice care neutralizeaza sarcinile negative.

Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen.

In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are 0 structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G = C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista toate permutarile posibile de inserare secventiala.

Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea, denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca proprietati fizico-chimice mentionam:

- prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei moleculeADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiuluicorespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesajegenetice in ADN-ul genomului uman;

- ADN-ul este molecula neramiflcata, putin rigida. Este o moleculapolimerica flexibila si fragila" ;

- masa moleculara a moleculei de ADN poate fl estimata la 12-16x10 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7>

complementare cuplate in dispozitie rectiliniara s-ar obtine un filament ADN a carui lungime poate ajunge la 200 cm;

- in lumina ultravioleta (UV), absorbtia ADN se face la lungimea deunda de 260nm;

- structura tridimensionala asigura functiile: autocatalitica,heterocatalitica si variabilitatea (prin mutatie, repararea eronata sau prinrecombinarea genetica a moleculelor ADN).

Stabilitatea termodinamica a ADN-ului se asigura prin:- legaturile slabe de hidrogen, numite si legaturi metastabile. Cuplul

G-C cu trei punti de hidrogen este mai puternic", mai stabil, decat cuplulA-T, care are numai doua punti de hidrogen.

- fortele Van der Waals, desi slabe, sunt suficiente" pentru aorganiza si mentine molecula in helixuri de homopolimeri nucleotidici;

- interactiunile hidrofobe intre planurile cuplurilor de bazecomplementare si hidratarea gruparilor P04";

- de proteinele histonice, care, combinandu-se cu dublul helix alADN-ului, neutralizeaza sarcinile negative.

30

3. Formele izomorfe de ADN

(Forme geometrice" de ADN)

Din analiza moleculelor de ADN prin metoda spectrelor de difractie a razelor X, metoda de rotatie a luminii polarizate si imaginile electronomicroscopice s-a evidentiat existenta formelor izomorfe de ADN.

S-a observat ca prin cresterea numarului de rotatii complete pe unitatea de lungime, se produce o tensiune" helicoidala crescuta. Aceasta tensiune poate fi dispusa prin formarea unei bucle cu rotatie levogira sau superinfasurarea pozitiva (positive super coil"). Daca ADN-ul are rotatia opusa fata de normal, apar bucle dextrogire sau superinfasurare negativa (negative super coil").

Moleculele de ADN lipsite de bucle dextrogire sau levogire laterale sunt considerate molecule relaxate".Cand numarul de spiralizari pozitive creste, in duplexul moleculei se produce si o condensare a spirelor.

Tensiunea superficiala induce suprasolicitarea" structurii tertiare a ADN-ului cu alternative potentiale, cum ar fi: catenele neperechi, ADN-ul de tip Z si/sau forma in agrafa, ac de par". Ca alternative potentiale sunt si regiunile zonale ale duplexului ADN-ului de tip B , formate dintr-o monocatena autocomplementara, numita palindrom.

Tensiunea superhelicoidala poate exista in interiorul celulelor sau nucleului celular daca exista un mecanism biologic care ar determina comprimarea capetelor moleculelor de ADN.

0 structura simpla, in care capetele moleculei de ADN sunt comprimate (constranse), este ADN-ul in cere inchis covalent, prezent in genomul multor virusuri, in ADN-ul mitocondrial si cloroplaste, sau in genomul unor procariote mici.

La eucariote ADN-ul se asociaza cu proteinele histonice prin legaturi saline formand nucleoproteine. Proteinele histonice au dispozitie discontinua, cu formarea nucleozomilor si solenoizilor. Prin aceasta dispozitie histonica se mareste diametrul moleculei de ADN. Histonele, impreuna cu ionii de Ca2+, au rol in mentinerea arhitecturii spatiale a ADN-ului.

In general, spiralizarea dublului helix al moleculei de ADN este dextrogira. Dar imaginile electrono-microscopice si analizarea in lumina polarizata au consemnat ca rotatia helixurilor poate fi atat dextrogira cat si levogira.

31

De exemplu, Alexander Crick (1979), folosind metoda observatiei cristalografice cu variatia gradului de hidratare a mediului, a descoperit ca pe secventa de 4-12 perechi de nucleotide obtinute artificial, apare o spiralizare diferita de cea dextrogira.

In prezent putem vorbi de existenta a trei forme izomorfe de ADN (fig.8): ADN-ul de tip A , ADN-ul de tip B si ADN-ul de tip Z.

Forma A Forma Z Forma B

Fig.8 Forme izomorfe de ADN

Saenger (1984), folosind spectrele de difractie a razelor X, constata ca distanta dintre cele doua catene cuplate complementar dispuse in spirala, nu este uniforma , chiar daca ele sunt dextrogire in lumina polarizata.

Dupa aspectul depresiunilor intercatenare, Saenger considera ca, la eucariote, molecula de ADN se poate gasi sub doua forme izomorfe: forma tip A si tip B.

32

ADN-ul de tip A este forma deshidratata si cristalizata a moleculei. Este forma care roteste lumina polarizata de la dreapta spre stanga. Este forma dextrogira. Bazele azotate sunt exact perpendiculare pe axa virtuala dextrogira a helixului. Tipul A este putin alungit, distanta dintre cuplurile complementare redusa, iar diametrul moleculei este mai mare. Acest tip nu are existenta histologica de lunga durata in ciclul celular.

ADN-ul de tip B este forma hidratata a moleculei. Este forma dextrogira. Are existenta biologica.

Saenger, analizand comparativ molecula deshidratata si cristalizata de tip A si molecula hidratata de tip B, constata diferente de dimensiune si aspect in traseul de spiralizare a celor doua catene cuplate, si anume: prezenta depresiunilor primare si secundare (major si minor) (fig. 9).

De exemplu ADN-ul de tip A prezinta un helix larg, iar pasul helixului dupa o revolutie completa, este mai mic. Ca urmare, depresiunea primara (major) are o deschidere mica, dar foarte adanca (profunda), si o depresiune secundara putin vizibila. La ADN-ul de tip B sunt vizibile ambele depresiuni: depresiunea primara cu deschidere foarte larga dar putin adanca si depresiunea secundara, vizibila.

Saenger a mai stabilit ca cele doua forme A si B sunt forme reversibile. Si anume, conversia helixuluide tip B intr-un helix de tip A si invers, este conditionata de hidratarea mediului in care sunt introduse cristalele. Este consecinta directa a interferentei stereochimice intre depresiunea larga si cea ingusta, precum si prezenta moleculelor de apa, al caror numar variaza in raport cu gradul de depresiune.

Rich (1979), Saenger (1984) si altii au descoperit ADN-ul de tip Z ADN-ul de tip Z este forma levogira ca spiralizare a moleculei. Este un ADN format aproape in exclusivitate din G-C. Helixurile se rotesc de la stanga spre dreapta, iar scheletul glucido-fosforic al celor doua catene cuplate are aspect de zig-zag (linie franta), de unde si numele de ADN de tipZ.

ADN-ul de tip Z are helixurile mai alungite si cu diametru mai mic fata de ADN-ul de tip B. Depresiunea majora este cu deschidere larga dar aplatizata.

Guanina din ADN tip Z se gaseste la periferia moleculei. Aceasta din cauza excesului de guanina in componenta lanturilor polinucleotidice. ADN de tip Z poate fi obtinut artificial. Retine atentia deoarece, prezentand guanina eversata spre exteriorul moleculei, are tendinta de a se cupla spontan cu substantele necunoscute cu potential cancerigen.

In conditii fiziologice nu s-a constatat tranzitia" ADN -ului de tip A sau B intr-un ADN de tip Z. Experimental s-a obtinut aceasta tranzitie din tipul A sau B, dar procesul nu este reversibil.

33

Imbach si Gosselin (1982), analizand procesul tranzitional, spuneau: ADN-ul de tip Z levogir este bogat in repetitia cuplurilor G-C, secvente I care in ADN-ul de tip A sau B la eucariote sunt rare". In stare nativa tipul i de ADN Z, cu inalta repetitivitate a cuplului G-C, este prezent in secventele genomice ale unor virusuri potential oncogene.

Se pare totusi ca acest tip de ADN Z este uneori prezent si la eucariote. El ar avea rol in reglarea functiei aparatului genomic. Argumentele care presupun existenta in vivo" a ADN-uluide tip Z la eucariote, sunt urmatoarele:

- enzimele nucleare, topoizomerazele, pot forma sau pot distrugereversibil, structura tipului Z in vivo";

- anticorpii produsi prin imunizare cu ADN sintetic, se fixeaza pe IADN-ul nuclear in puncte precise (situsuri) ale cromozomilor.

Sunt ipoteze de lucru care sustin existenta ADN-ului cu structura levogira Z in vivo", molecule cu distributie specifica si care ocupa situsuri precise in cromozomii nucleari.

De asemenea, s-a observat ca trecera formei dextrogire A sau B in forma levogira Z, in vivo", antreneaza dereglari in mecanismele reglatoare ' in expresia mesajului genetic.

In prezent nu sunt cunoscute exact situsurile cromozomale unde sunt localizate moleculele ADN-ului Z si nici rolul exercitat in genomul celular.

4. ADN-ul nuclear

Dupa ce Avery (1944) a stabilit rolul fundamental al ADN-ului in ereditatea caracterelor, cercetarea ADN-ului, la eucariote, s-a intensificat si diversificat.

Primii care si-au concentrat cercetarile asupra ADN-ului au fost Boivin si Vendrely (1948) care analizand ADN-ul, la Bos taurus, extras din diverse tesuturi (timus, ficat, pancreas, rinichi) au constatat ca:

- indiferent de tesutul analizat, in nucleul celulelor cantitatea deADN este aceeasi. Au mai stabilit ca nucleul diploid al celulelor somaticeare o cantitate de ADN de aproximativ 6,5x10-l2gv

- fata de celulele somatice diploide, in gametii cu nucleul haploid,cantitatea de ADN este redusa cu aproximativ 50% (3,4x 10-12 grame);In 1949, Mirsky si Ris constata ca in componenta moleculelor de ADN exista aceleasi baze azotate, indiferent de regn sau specie.

34

In 1950 Mirsky, analizand cantitatea de ADN la diverse specii de eucariote, observa existenta unor diferente valorice. Datorita acestor observatii, Mirsky a demonstrat urmatorul aspect: cantitatea de ADN nu este direct proportionala cu numarul cromozomilor existenti in nucleul celulelor si nici cu gradul evolutiei biologice a speciilor.

Determinarile efectuate au evidentiat urmatoarele: specii putin" (evoluate au o cantitate mai mare de ADN nuclear, iar specii mult" evoluate au o cantitate mai mica.

De exemplu:-Procariotele au o cantitate ADN de 10 ori mai mare in raport cu

numarul proteinelor codificate.-Euglena viridis contine o cantitate de ADN aproximativ egala cu

cea existenta in nucleul celulelor somatice la Homo sapiens (om).-Salamandra (Amphiuma), precum si unele specii de pesti inferiori,

au o cantitate de ADN de 50 de ori mai mare in raport cu cantitatea de ADNla om.

-Unele plante si specii de batracieni au in genomul lor de 100 de orimai mult ADN fata de ADN-ul genomului uman.

-Ariciul de mare (nevertebrat superior) contine de 50 de ori maimult ADN decat cantitatea ADN la Rattus norvegicus (soarece).

Daca am lua in consideratie ^cantitatea de ADN" criteriu de apreciere a gradului de evolutie biologica si complexitate structural (fiinctionala , si daca tot ADN-ul existent ar fi codant, ar trebui sa admitem pa ariciul de mare ar fi de 50 de ori mai evoluat ca soarecele, ca unele specii de batracieni si pesti inferiori si chiar unele plante, sa prezinte un grad de polutie de 50 de ori si chiar de 100 de ori mai mare decat al omului; sau Euglena sa o pozitionam pe aceeasi treapta de evolutie cu omul actual.

S-a consemnat o neconcordanta intre cantitatea de ADN si gradul de polutie a speciilor, o neconcordanta intre cantitatea de ADN si numarul de gene codante.

De exemplu, Mirsky (1950) a lansat ipoteza ca in genomul prganismelor vii exista o cantitate mare de ADN necodant, non-functional indeterminismul genetic al sintezei de proteine.

Rezultatele obtinute i-au determinat pe geneticieni sa-si concentreze bercetarile asupra studiului ADN-ului eucariotelor.

Primele incercari apartin lui Marmur si col. (1963), care elaborand si folosind tehnica denaturarii si renaturarii ADN-ului, purificat dupa bxtragerea de la diverse specii de eucariote, au constatat diferente in lapiditatea de reasociere si refacere a moleculelor. In procesul de reasociere a catenelor complementare apar diferente de timp. Unele catene reasociaza intr-un timp foarte scurt, altele reasociaza lent sau foarte lent.

35

Britten si Kohne (1968), folosind aceeasi metoda au facut un studiu comparativ al procesului de denaturare-renaturare a ADN-ului de la procariote si eucariote. Ei au extras ADN-ul de la Escherichia coli (procariot) si de la Bos taurus (eucariot) si cu fragmentele de ADN, a caror lungime era variabila, au urmarit cinetica procesului de denaturare-renaturare. Fragmentele folosite de ei aveau o lungime in jur de 500 perechi de nucleotide.

Rezultatele au fost urmatoarele: viteza si tipul de renaturare a ADN-ului la Escherichia coli difera semnificativ fata de renaturarea ADN la Bos taurus. O alta observatie a fost ca in interiorul unei molecule ADN de la Bos taurus sunt secvente polinucleotidice ce difera intre ele prin viteza de renaturare, concentratie molara si timp de refacere a moleculei (fig9).

hibridizarea % (Fractia neasociata)

i i i i i i i ii i i i i i i ii i i i i i i ii i i i i i i ii i i i i i i ii i i i i i i i

0 10-3 10-2 10-1 1 10 102 103 104Cot (moli x

secunde)

Fig.9 Cinetica renaturarii ADN la Escherichia coli si Bos taurus (dupa Britten si Kohne - 1968).

Din studiul comparativ al moleculelor de ADN procariotic si eucariotic, au obtinut o curba cu mai multe sigmoide la Bos taurus in comparatie cu cele de la E. coli

36

Aceste observatii au fost premiza elaborarii ipotezei referitoare la heterogenitatea tipurilor de ADN in genomul nuclear al eucariotelor, ipoteza confirmata ulterior. Dupa ei, la eucariote este o cantitate de ADN care are runctie de a codifica sinteza de proteine (are informatie genetica), darsi o mare cantitate de ADN non-codant, denumit ADN egoist". Rezultatele obtinute au permis acceptatrea a trei tipuri de ADN. In raport cu cinetica renaturarii si a heterogenitatii secventelor polinucleotidice constitutionale, in genomul eucariotelor gasim : ADN inalt repetitiv, ADN moderat repetitiv si ADN nerepetitiv (fig. 10).

Fig.10 ADN-ul NUCLEAR DIN GENOMUL UMAN TIPURI DE ADN

N ER E P ET IT IV

*

S EC V E N T E(C O P II)U N IC EC O D A N T E

FA M IL II D E G EN E C O D A N T E

/

D IS P E R SA T E TANDEM

1DET EI

GEN

VlINlbM

IETIC

ARNr

ARNt

ADN NUCLEAR

COPII MULTIPLE

HETEROCROMATIMACONSTITUTIVA :

CENTROMER.TELOMER,

CONSTRICTII SECUNDARE

37

4.1. Denaturarea si valoarea Cot de renaturare a ADN-ului celular

Principiul metodei: moleculele de ADN, extrase si purificate, se I supun la temperatura de 100C timp de 10 minute. La aceasta temperatura si intr-un mediu alcalin, legaturile de hidrogen stabilite intre bazele I complementare se rup separandu-se catenele copolimerice. Acest proces este numit denaturare.

Dupa 10 minute are loc o racire lenta a mediului de reactie cand se restabilesc legaturile de hidrogen, recuplandu-se complementar cele doua catene, cu refacerea integrala a dublului helix al moleculei de ADN, proces numit renaturare.

Britten si Kohne (1968) au observat ca la temperatura ridicata si un pH alcalin, legaturile de hidrogen dintre catenele complementare se rup cu suprimarea interactiunilor Van der Waals.

O alta observatie pe care au facut-o este ca in timpul denaturarii creste absorbtia in UV(k = 260nm) a bazelor azotate dupa decuplarea complementara, in timp ce I cantitatea de lumina UV absorbita de molecula de ADN in dublu helix este I mai mica. Autorii explica diferenta de absorbtie a UV astfel: prin rupereal puntilor de hidrogen si separarea catenelor complementare, bazele azotate; sunt mai expuse la actiunea UV, efect denumit hipercromic. Cand molecula de ADN este in dublu helix, datorita spiralizarii, o parte din bazele azotate dispuse etajat, sunt partial mascate" de scheletul glucido-fosforic al ADN- | ului. In consecinta, absorbtia in UV a moleculei este mai scazuta. Acest efect 1-au numit efect hipocromic.

Autorii considera ca prin denaturare se manifesta efectul de hipercromaticitate, iar prin renaturare efectul de hipocromaticitate.

Denaturarea si renaturarea sunt procese reversibile. Cand temperatura si pH-ul sunt aduse la valorile fiziologice, fortele necovalente se refac, catenele se recupleaza complementar, iar molecula de ADN isi I reface dublul helix.

In prezent, principiul de lucru in procesele de denaturare-renaturare este urmatorul:ADN-ul extras din celula procariota sau eucariota se fragmenteaza in I secvente de aproximativ 1000 perechi de nucleotide. Fragmentele se supun procesului de disociere, cand catenele complementare se separa. Daca

38

repunem catenele singulare in conditii fiziologice (temperatura si concentratie ionica favorabila) ele se vor recupla.

Cand fragmentele de ADN nu contin secvente repetitive, refacerea moleculei se face cu aceeasi viteza (ex. ADN-ul la procariote). Daca fragmentele contin secvente repetitive si nerepetitive, recuplarea monocatenelor se realizeaza la valori diferite de timp (ex. ADN-ul la eucariote).

Parametrii care influenteaza gradul si viteza de recuplare a monocatenelor dupa denaturarea ADN-ului sunt:-concentratia initiala a ADN-ului - Co;-timpul necesar pentru renaturare - t;

Valoarea Cot este produsul dintre concentratia molara a ADN-ului si timpul necesar pentru reasocierea monocatenelor complementare exprimat in secunde.Cot - Cot' = valoarea de comparatie a vitezei de recuplare a diferitelorsecvente de ADN. ,

Cu cat diferenta valorii Cot este mai mica, cu atat viteza de recuplare a catenelor este mai rapida iar timpul necesar refaceii moleculei ADN este mai mic.

Pentru valoarea Cot se foloseste ca referinta valoarea Cot a unui ADN "standard" (un homopolimer) sau a unui ADN procariotic cu lungime cunoscuta.

Complexitatea genomului compus din secvente repetitive se stabileste prin curba Cot:

Cot = Co x t

- de unde - Co - este concentratia initiala a ADN-ului in moli de nucleotide /litru;

-1 - este timpul de renaturare in secunde.Valorile Cot se exprima pe un grafic, curba exprimand repetarea

secventelor din genomul studiat (fig. 11).

39

Perechi de nucleotide

t 10 102 1p 10 105 1Q6 1{)7

J....,J......1......-i

____-LT

W 0.1 1 10 Col (molxs/1)

10* 1G50 10^i_____I

100 1000 10000

v-4Fig.ll Curba Cot. Valoarea Cot 10" - 10" exprima un ADN inalt repetitiv. Valoarea Cot 10 - 10" exprima un ADN moderat repetitiv. Valoarea Cot peste 102 este un ADN nerepetitiv (dupa J. M. robert, 1983).

In 1975, L. Stryer, studiind cinetica reasocierii catenelor complementare si curbele Cot, a stabilit :

- ADN-ul cu un timp de renaturare foarte mic - 10"4 < Cot < 0.01(renaturare foarte rapida) si refacerea integrala a moleculei, este un ADNinalt repetitiv. Este tipul de ADN usor de identificat si analizat, cuoligoelemente repetitive scurte (de 5-300 perechi de nucleotide) dispuse intandemuri lungi.

- ADN-ul cu o valoare Cot cuprinsa intre 0,01 < Cot < 10corespunde ADN-ului moderat repetitiv, la care secventele au lungimivariabile cuprinse intre 100-1000 perechi de nucleotide.

40

Ticr3

10 1CT*

- ADN-ul la care valoarea Cot de reasociere variaza intre 10 < Cot < |l000. deci are o valoare mare, este un ADN nerepetitiv sau cu secvente junice. Datorita secventelor nerepetitive, timpul necesar pentru recunoastere si recuplare a catenclor complementarc este mai mare.

Cinetica renaturarii ADN este in raport de logaritmul Cot, adica produsul concentratiei initiale si al timpului, exprimat in moli litruxsecunde.

Cand Cot are valoare de 50% mai mica fata de valoarea Cot a ADN inalt repetitiv, se noteaza Cot '/2 si este ADN moderat repetitiv.

5. Heterogenitatea ADN-ului din genomul uman sipnctiile lui

Plecand de la demons'tratiile lui Chargaff (1974) si in raport cu frecventa secventelor de ADN care apar in genomul nuclear, in genomul uman exista dona grupe mari de ADN:

-ADN-ul repetitiv, care poate fi inalt repetitiv si moderat repetitiv;-ADN-ul nerepetitiv sau cu secvente unice ;

|ln analiza lungimii secventelor polinucleotidice din genomul uman si atuturor speciilor din regnul animal si vegetal, sunt folosite urmatoarelenotatii valorice:|-pb =perechi debaze;|-Kb = kilobaza = 1000 pb = 10? pb;bib = megabaza = 1000 kb = 1.000.000 pb = 106 pb;lGb = gigabaza - 1000 Mb = 1.000.000 kb =1.000.000.000 pb = 10 pb.

5.1 Familii de ADN repetitiv

In genomul eucariotelor si/sau unor organisme eucariote superioare rvoluate din regnul animal gasim ADN repetitiv. In raport cu dimensiunea numarul secventelor repetitive, cu functia codanta sau nu, in genomul ^rnian gasim ADN moderat repetitiv si inalt repetitiv.

a) ADN-ul moderat repetitiv. La organismele eucariote 25-30% in totalul ADN-ului nuclear se reasociaza cu o viteza a carei valoare Cot variaza in limite largi: intre 0.1 si 10.

41

Toate moleculele din ADN-ul genomic nuclear care au valoare Cot intre aceste limite de reasociere sunt denumite ADN nulear moderat repetitive.

Coeficientul de repetabilitate a secventelor identice variaza intre 10 - 104. Secventele repetitive sunt scurte. Contin intre 300-1000 pb. Numarul perechilor de baze este mai mare in ADN-ul moderat repetitiv, respectivele secvente fiind foarte scurte, cu un numar foarte mic de cupluri complementare.

In raport cu sensibilitatea la enzimele care degradeaza ADN-ul si temperatura de topire" (TM), de disociere-reasociere, s-au stabilit urmatoarele:

- secventele ADN-ului moderat repetitiv nu se caracterizeaza prinrepetabilitate secventiala ordonata si reasociere exacta. Ordonarea estediscontinua; '

- renaturarea, reasocierea, se poate face in secvente inrudite" dar nuidentice, rezultand un hibrid .

Distributia ADN-ului moderat repetitiv in cromozomi este discontinua. Secvente moderat repetitive se pot intercala si printre moleculele de ADN nerepetitiv.

Aceasta discontinuitate in distributia intracromozomiala a ADN-ului moderat repetitiv a fost demonstrata experimental.

De exemplu, prin fragmentarea moleculelor de ADN cromozomial in secvente a caror dimensiune este de aproximativ 5 Kb, urmata de procesul de denaturare la o valoare Cot corespunzatoare ADN-ului moderat repetitiv, se constata ca mai mult de 50% din totalul secventelor disociate vor forma hibrizi ADN-ADN, iar restul secventelor, reasociind foarte lent, este nerepetitiv.

Un alt indicator care confirma distributia discontinua a secventelor moderat repetitive este frecventa cu care clonele de ADN recombinat contin secvente de ADN moderat repetitive.

De exemplu, prin folosirea de ADN din genomul celular uman pentru prepararea unui situs de clonare" genomica, a carui lungime medie este de 20 Kb, s-a observat ca aproximativ 90% din moleculele donate contin secvente moderat repetitive.

Young (1979) a demonstrat ca secventele repetitive intermediare variaza ca numar si pozitie in ADN-ul diverselor specii. De asemenea, el a mai demonstrat ca apar diferentieri de repartitie chiar intre indivizii conspecifici, diferentieri de repartitie intracromozomiala. Diferentierile de numar si pozitie a secventelor repetitive intre indivizii conspecifici sunt si rezultatul recombinarilor intracromozomiale prin crossing-over inegal".

42

Secventele cu pozitie si ordine neomogena intre indivizii conspecifici, pot fi folosite ca marked genetici pentru studiul populatiilor, camarkeri pentru identificarea indivizilor (criminalistica, medicina legala), sau folosite ca markeri corelat cu diverse boli determinate genetic.

0 serie de cercetatori, precum Pardue (1973), Sanger (1981), Li (2001), Venter (2001), IHGSC (2001), Whitfield (1995), s.a. au stabilit ca printre secventele de ADN moderat repetitiv se gasesc numeroase secvente codante. Conform datelor obtinute, secventele codante sunt gene care, genetic, determina sinteza histonelor (histogenele) sau gene care codifica jtipurideARNrsiARNt.

De exemplu, se presupune existenta in genomul uman haploid a circa 200 gene pentru ARNr 5S, iar pentru ARNf aproximativ 1300 gene (Pardue si col.,1973).

Pe baza indicatorilor mentionati se estimeaza existenta in genomul uman a circa 3x10' fragmente repetitive din ADN.

Printre secventele ADN repetitive se mai gasesc si alte tipuri de secvente genetic active. Acestea ar codifica, informational genetic, diverse sinteze proteice necesare activitatii celulare.

Din acest grup de secvente informational active din ADN moderat repetitiv, mentionam :

- genele ribozomale care codifica molecule de ARNr (acidribonucleic ribozomal). Transcrierea este catalizata de enzimele ARNpolimeraze III, cu locusuri pe bratul scurt p"al cromozomilor acrocentrici|(vezi cromozomii). In segmentele cromatidice denumite organizatorinucleolari" se gasesc intre 150-200 copii genice (familia de gene aleARN,). Pe bratul lung q", in apropierea centromerului cromozomuluinumarul 1. ar fi locusul genei pentru ARNr 5S.

- genele pentru sinteza ARNt (acid ribonucleic de transport) culocusurile pe cromozomii nr. 1 si 6 sunt catalizate tot de ARN polimerazaIII;

- secventele SINEs (short interspred repeated sequences) a carorlungime este estimata intre 100 si 400 pb si reprezinta 3-5 % din totalulADX-ului genomului uman. In genomul uman se estimeaza un numar deaproximativ 500.000 de secvente SINES (nature, 2001, 411). Uniicercetetori includ secventele SINEs si Alu in grupa elementelortranspozabile, cu rol in activitatea replicarilor (vezi initierea sintezei ADN).

- secventele LINEs (long interspred repeated sequences) suntsecvente de 6-7 kb . In genomul uman se estimeaza existenta a 100.000 desecvente LINEs. Amplificarea lor s-ar face prin reverstranscriere(retrotranspozitie). Se presupune a avea rol in cuplarea cromozomilor

43

omologi in zigomerul profazei primare a meiozei si implicare in crossing-over.

Se crede ca secventele SINEs si LINEs ar proveni din gene codante printr-un mecanism de retroinsertie. Aceste secvente nu sunt transcrise in molecule de ARMm .

Tabel I. Tipul si numarul copiilor din genomul uman al familiei ADN repetitiv (dupa IHGSC, 2001; Li si col., 2001)

Familia secventelor Numar relativ de copii inrepetitive genomul uman

SINEs: 155800Alu 109000MIR 39300MIR3 75000

LINEs: 868000LINEs-1 516000LINEs-2 315000LINEs-3 37000

Elemente LTR 443000Transpozoni ADN 294000

5.2. Tipuri de ADN inalt repetitivDin totalul genomului uman, aproximativ 10% este ADN inalt|

repetitiv. Este reprezentat de secvente cu dimensiuni de 1 pana la 200 pb (si mai multe), dispuse in tandem. Moleculele de ADN inalt repetitiv au lungimi variabile in raport cu dimensiunea secventelor si gradul de repetabilitate a secventelor. Se considera ca acest tip de ADN poate aveaun coeficient de repetabilitate a microsecventelor ce pot depasi si un milionde ori.

De exemplu, Walker si col. (1969) apreciau ca secventele scurte deCCCTAAGGGA TT se Pt repeta, prin dispunerea in tandem de peste 1.000.000 de ori.

ADN-ul inalt repetitiv este necodant, fiind in exclusivitate un ADNegoist" deoarece isi exercita numai functia de autoreplicare.Intr-un studiu efectuat de Tartoff in 1975, s-a constatat ca raportul bazelor

A+C complementare G+C IN ADN-ul inalt repetitiv, valoric, este diferit fata deADN-ul repetitiv.

44

Tartof a mai observat ca, in majoritate, ADN-ul inalt repetitiv este localizat in zonele cu heterocromatina constitutiva (respectiv in benzile C) ale cromozomilor si anume: regiunea pericentromerica (majoritar), la nivelul telomerelor si constrictiilor secundare (Tabel II) .

Tabel II. Secvente de ADN inalt repetitiv satelitic in regiunea pericentromerica (dupa Tartof, 1975)

Specia Componenta secventelor repetitive

Drosophila melanogaster AGAAGATAATATATAATAATAACATAGAGAGAAGAAG

Drosophila viridis ACAAACT ATAAACT ACAAATT

Cancer boscalis ATPagurus pollicaris CGT

ATCCCavia porcellus CCCTAADipodomys ordii ACACAGCGGG

Un studiu facut pe cromozomul Y uman a evidentiat ca secventele repetitive din celulele gametice sunt hipometilate, iar in cromozomii celulelor somatice secventele sunt hipermetilate (Dib si col. 1996; Bird, 1999).

Se presupune ca ADN-ul inalt repetitiv ar avea rol in imperecherea liniara a cromozomilor in stadiul de zigonem din profaza primara a meiozei. Dupa dimensiune, numar si limgimea dispunerii in tandem, secventele inalt repetitive din ADN pot fi de tipul:

- ADN satelit;- ADN mini satelit;- ADN microsatelit;- ADN interspres (transpozonic), (fig. 12 si fig. 13);

Clasificarea familiilor secventelor inalt repetitive din ADN genomicuman a fost facuta de Casanova si col. (1985), Nogo si col. (1986),

45

Malaspina si col. (1990), Lavett (1997), Venter si col. (2001), IHGSC3 (2001), s.a.

ADN-ul satelit. Este ADN-ul cu numar foarte mare de secvente repetitive a caror lungime variaza in limite cuprinse intre 5 si 25 pb. Prin dispunerea lor in tandem, lungimea satelitului ajunge la cca 100 kb. Se apreciaza ca unitatile repetitive ale ADN-ului satelit sunt simple sau moderat complexe. Densitatea ADN-ului satelit este determinata de componenta in baze azotate a unitatilor de repetitie , care-i total diferita de restul ADN-ului nuclear.

Folosindu-se metoda ultracentrifugarii in gradient de densitate Ag-CsSCU, s-a stabilit ca in raport de numarul unitatilor repetitive dispuse in tandem, se pot identifica trei familii majore de ADN satelit:

- familia de ADN satelit compusa din unitati repetitive foarte scurte,prin numarul bazelor/secventa;

- familiile II si III (familia II = 1,693 g/cm3; familia III = 1,697g/cnr) ce contin, dispuse in tandem, secvente de tipul ATTCC.........

Prin centrifugare in gradient de densitate nu s-a putut stabili heterogenitatea complexa a secventelor ADN-ului repetitiv satelitic. Totusi heterogenitatea a fost demonstrata prin folosirea digestiei ADN-ului cu enzime de restrictie, care recunosc un singur situs din unitatea repetitiva.

"' IHGSC = International Human Genome Sequencing Consortium .46

z 3'

3' 4--------------------5' 3'-

Crestere Crestere

Fig. 24 Replicarea bidirectionala in sinteza ADN.

Spre deosebire de procariote, complexitatea zonelor de initiere a replicarii este consecinta naturala a genomului, care este complex si necesita mecanisme ample de activare si reglare a replicarii.

Se presupune ca activarea unei zone de origine si initiere a replicarii ADN-ului ar depinde de pozitia in structura tridimensionala si cuaternara a cromozomilor si mai putin de compozitia specifica in nucleotide a repliconului.

Huberman si Riggs (1968) au observat ca rata replicarii este diferita la eucariote fata de procariote. Folosind tehnica autoradiografica de analiza a replicarii ADN-ului a observat ca furca de replicare la mamifere ar inainta cu 3kb/min.

Dupa initierea replicarii ADN-ului rata de alungire a catenelor de novo" pare a fi constanta, ca derulare, pentru fiecare tip de celula din organism.

De exemplu la procariote, intregul ADN din unicul cromozom inelar se replica in 20 minute.

La Escherichia coli cromozomul prezinta o singura zona de initiere a replicarii. Are un singur replicon cu doua furci de replicare care inainteaza in sensuri contrare pana cand se vor intalni. Fiecare furca de replicare are o rata de 1600 pb (perechi baze) pe secunda.

La om rata replicarii in celulele somatice este mult redusa valoric. Se estimeaza ca ar fi de aproximativ 100-150 pb/sec pentru fiecare furca de replicare.

cS4

Daca luam in consideratie numanil cromozomilor, tipul si cantitatea de ADN (repetitiv si nonrepetitiv), arhitectura moleculelor ADN, prezenta histonelor si arhitectura cuaternara a cromozomilor (nucleozomi, solenoizi, bucle, etc.) la eucariote, sunt consemnate deosebiri esentiale intre procariote si eucariote.

Procariotele au un singur replicon, un singur situs de initiere in replicarea ADN-ului, genomul este lipsit de histone si tipuri diferite de ADN (Cairn, 1962).

Spre deosebire de procariote, eucariotele au in genomul celular o cantitate foarte mare de molecule ADN, care insumeaza in total un numar de aproximativ 3.5 x 109 pb. Ca urmare prin structure si componenta repetitiva si nerepetitiva este putin probabil existenta unui singur situs de initiere in replicarea ADN (Cairn).

La eucariote, replicarea intregului ADN genomic se face intr-un timp limitat, in stadiul interfazic S'. La eucariote apar doua probleme fundamentale in replicarea ADN-ului genomic:

- probleme de ordin topografic determinate de structura cromatinei cromozomiale: nucleozomii, solenoizii, buclele. Sunt elemente legate de arhitectura cromozomilor care pot introduce" superspire negative" in morfologia cromozomilor;

- o alta problema este ca moleculele ADN-ului in dublu helix, cuplate cu histonele si prezentand si secvente repetitive, trebuie sa se replice integral, intr-un interval foarte scurt de timp.

Daca am raporta procesul la eucariote fata de procariote, prin cantitatea si heterogenitatea ADN-ului, ar trebui ca la eucariote timpul necesar pentru replicarea integrala a ADN-ului sa fie de peste 100 ori mai mare la om fata de procariote.(Eschericia coli).

Asa cum s-a mentionat, Huberman si Riggs au identificat formarea mai multor puncte de initiere in replicarea ADN-ului cromozomial, puncte ce se gasesc la distante intre ele de 100-300 kb. In raport cu numarul punctelor de initiere putem aprecia numarul repliconilor / cromozom.

In genomul uman punctele de initiere s-ar gasi la 150-200 kb distanta intre ele. Luand in consideratie numarul perechilor de nucleotide si distanta intre punctele de initiere, se aproximeaza un numar de aproxiativ 3000 situsuri de initiere.

La om repliconii nu se replica sincron. Se observa o replicare asincrona. Asincroniile sunt legate de momentul activarii situsului de initiere si de elongatia repliconului. Asincronia replicarii ADN-ului se observa in stadiul interfazic S".

85

Asincronia in activitatea repliconilor este determinata si de forma de condensare a fibrilei de ADN, de abundenta cuplurilor complementare G = C in structura repliconilor, de cantitatea de ADN repetitiv per molecula si cromozom.

7.6.Erori de replicare a ADN si repararea erorilor in genomul uman

ADN-ul din componenta genomului celular, prezent la procariote si/sau eucariote, datorita interrelatiei cu factorii ambientali ai organismelor vii, poate fi influentat, distructiv , de interferenta agresiva" a unor factori exogeni sau endogeni (vezi cap. mutatii). Aceste distructii mutationale in structura ADN-ului genomic au ca efecte directe modificarea mesajelor genetice inscrise, iar ca efecte secundare aparitia unor caractere noi, care la om se manifesta ca sindroame severe pe fond genetic.

Daca s-ar mentine erorile induse in structura si functiile ADN-ului, frecventa, incidenta bolilor pe fond genetic, ar fi alarmant de ridicata. Mai mult, cu fiecare generatie care succede frecventa ar fi in permanenta crestere valorica.

Se apreciaza ca frecventa erorilor punctiforme in structura ADN-ului, manifestate ca boli genetice, ar fi de 10~6 la nivelul intregii populatii umane. Dar ADN-ul genomic dispune de mecanisme si procese prin care sa-si corecteze erorile din structura proprie.

In cazul cand ADN-ul n-ar avea capacitatea de autoreparare structurala, atunci valoarea mutatiilor punctiforme ar creste de la 10"6, cat se considera mutatiile spontane in populatiile umane, la peste 1000 de ori.

Dar ADN-ul genomic uman isi corecteaza propriile erori mutationale, ceea ce explica incidenta scazuta a mutatiilor genice la nivel populational.

Factorii populationali ce indue erori in structura ADN-ului genomic pot fi endogeni si/sau exogeni.a) Factorii endogeni - intracelulari. La nivel intracelular pot avea loc oserie de procese care favorizeaza producerea leziunilor in structura ADN-ului genomic. Acestea sunt:

pierderea unei baze purinice sau pirimidinice, urmarea hidrolizei legaturilor glicozidice;

86

trans form area adeninei in hipoxantina, care modiflca raportul de complementaritate. In urma dezaminarii adeninei, hipozantina ce rezulta va complementariza cu guanina;

radicalii de oxigen rezultati in concentratii crescute pot interfera distructiv (mutagen) ADN-ul;

prin procese de metilare a bazelor azotate cu modificarea complementaritatii.b) Factorii exogeni ce produc leziuni in ADN. Factorii exogeni, potentiali mutageni, cu actiune distructiva a structurii si functiei ADN-ului sunt:

factori fizici (radiatii ionizante, ultraviolete);factori chimici;factori medicamentosafactori biologici.Catalogul acestor factori mutageni este impresionant valoric si mult

diversificat (vezi cap. mutatii).

7.6.1.Mecanisme de reparare a erorilor in structura ADN

In prezent s-a demonstrat ca in genomul celular au loc procese reparatorii, care asigura integritatea structurala si functia ADN-ului.

In procesele de reparare si realizarea integritatii ADN-ului celular sunt implicate complexe enzimatice in mecanismele desfasurate in genomul eucariotelor.

a) Complexe enzimatice ce intervin in repararea erorilor ADN.

Endonucleazele - Actioneaza asupra situsurilorapurinice/apirimidinice dupa excizia bazelor, excizie indusa de ADN-glicozidaze , sau prin incorporarea eronata a bazelor in structura ADN-ului genomic.

Unele endonucleaze isi intensifica activitatea de reparare dupa iradierea genomului cu UV (ultraviolete). Prin iradierea cu UV unele endonucleaze excizeaza dimerii pirimidinici care se formeaza pe cateneie ADN-ului. Acest grup de endonucleaze este denumit UV-endonucleaze.

ADN-polimerazele - Sunt implicate catalitic in repararea exciziilor din cateneie ADN-ului care prezinta terminatii 3'-OH.

87

ADN-ligazele - Sunt enzime care cupleaza doua catene din structura moleculei ADN prin formarea de legaturi difosforice intre hidroxilii3'-OHsi5'-OH.

Topoizomerazele I si II - care pot sectiona una sau ambele catene ale ADN-ului unde s-au produs erori in molecula.

b) Mecanismele de reparare a erorilor din ADN la eucariote

Spre deosebire de procariote, la care mecanismele de corectare a erorilor din ADN-ul genomic sunt bine studiate, la eucariote, datorita complexitatii genomului (numar mare de cromozomi, numar mare molecule ADN, etc.) mecanismele nu sunt complet elucidate si cunoscute.

Erorile pot rezulta prin cuplarea incorecta intre purine/pirimidine. In timpul replicarii semiconservative cuplarea complementara intre nucleotide nu este respectata" datorita interferentei distructive a unor factori ambientali agresivi".

Erorile se produc in urmatoarele situatii:cand incepe despiralizarea si separarea catenelor, este posibila fisura pe

una sau ambele monocatene;nerespectarea principiului complementaritatii intre purine si I pirimidine

(normal A-T si G-C) a nucleotidelor care se esterifica pe catena I de novo" in raport cu catena matrita". Se pot forma dimerii", cupluri I nucleotidice false (necomplementare);

cand asupra nucleului, ADN in replicare, actioneaza factori potential mutageni, inducand suprimare de nucleotide, substitutie sau insertie de baze in catena matrita sau in cea de novo";

formele tautomere ale bazelor azotate, sau ionizarea lor, modifica I raportul de complementaritate cu formarea de dimeri si erori in structura I ADN.

Sunt cercetatori care mentioneaza ca sunt posibile erori, dar in I procente foarte mici, datorita cuplarii gresite (eronate) intre purine si I pirimidine.

Dupa Covic si Stefanescu (2004), conform reactiilor | stoichiometrice , greselile de necomplementaritate intre nucleotidele de pe catena matrita" si cele esterificate pe catena de novo" se pot produce in raport de 1/10000.

5 Stoichiometria (gr. Stoikheion = element + metron = masura). Chimia fizicace studiaza raporturile cantitative intre elemente in combinatii sau i