Virusologie generală 1 C U P R I N S 1. Obiectul și istoricul microbiologiei. caracterizarea principalelor grupe de microorganisme: 1.1. Definiția și obiectul microbiologiei………………………………………...11 1.2. Microorganisme, filogene și taxonomie…………………………………....11 1.3. Ramurile microbiologiei și contingențele ei cu alte ramuri ale biologiei. …………………………….…………….....13 1.4. Istoricul microbiologiei………………………………………………….…14 1.5. Etapa intuitivă, de admitere ipotetică a existenței microorganismelor…………………………………………...….14 1.6. Etapa descoperirii microorganismelor, a studiului lor morfologic și a primelor încercări de diferențiere și clasificare a acestora………………………………….….16 1.7. Etapa constituirii microbiologiei ca știință și a dezvoltării ei pe baze moderne……………………………………………..18 1.8. Etapa contemporană de dezvoltare a microbiologiei……………………….23 1.9. Dezvoltarea microbiologiei în Romania………………………………..…..26 2. Caracterizarea generală a principalelor grupe de microorganisme 2.1. Prioni……………………………………………………………………....29 2.2. Viroizi……………………………………………………………………..31 2.3. Virusuri……………………………………………………………………32 2.4. Bacterii…………………………………………………………………….33 3. Virusologie generală 3.1. Ipoteze privind originea virusurilor…………………………………...…..36 3.2. Teorii privind natura virusurilor……………………………………..……37 3.3. Formele de existență a virusurilor în natură………………………………40 3.4. Constantele virionului……………………………………………………..41 3.4.1. Forma……………………………………………………….41 3.4.2. Dimensiunile………………………………………………..42 3.5. Structura virionului………………………………………………………..43 3.5.1. Capsida virală……………………………………………....43 3.5.2. Pericapsida ……………………………………………...….49 3.5.3. Genomul viral………………………………...……………..51 3.6. Particularitățile structurale ale unor virusuri zoopatogene complexe……..54 3.7. Particularitățile structurale ale bacteriofagilor…………………………….56 4. Tropismul virusurilor ……………………………………………………………….59 5. Multiplicarea virusurilor…………………………………………………………….60 5.1. Multiplicarea virusurilor zoopatogene……………………………………..61 5.1.1. Adsorbția sau fixarea virionilor pe celulă…………………..61 5.1.2. Pătrunderea virionilor în celulă………………………...…..61 5.1.3. Decapsidarea………………………………………………..62 5.1.4. Multiplicarea propriu-zisă……………………………….....63 5.1.5. Eliberarea virionilor din celulă…………………………..…71 6. Dinamica ciclului de multiplicare……………………………………………..……72 7. Aspecte particulare ale multiplicării virusurilor zoopatogene…………………..74 7.1. Infecția endosimbiotică……………………………………………………74
Transcript
Virusologie generală
1
C U P R I N S
1. Obiectul și istoricul microbiologiei. caracterizarea principalelor grupe de
microorganisme: 1.1. Definiția și obiectul microbiologiei………………………………………...11 1.2. Microorganisme, filogene și taxonomie…………………………………....11 1.3. Ramurile microbiologiei și contingențele
ei cu alte ramuri ale biologiei. …………………………….…………….....13 1.4. Istoricul microbiologiei………………………………………………….…14 1.5. Etapa intuitivă, de admitere ipotetică a
existenței microorganismelor…………………………………………...….14 1.6. Etapa descoperirii microorganismelor, a
studiului lor morfologic și a primelor încercări de diferențiere și clasificare a acestora………………………………….….16
1.7. Etapa constituirii microbiologiei ca știință și a dezvoltării ei pe baze moderne……………………………………………..18
1.8. Etapa contemporană de dezvoltare a microbiologiei……………………….23 1.9. Dezvoltarea microbiologiei în Romania………………………………..…..26
2. Caracterizarea generală a principalelor grupe de microorganisme 2.1. Prioni……………………………………………………………………....29 2.2. Viroizi……………………………………………………………………..31 2.3. Virusuri……………………………………………………………………32 2.4. Bacterii…………………………………………………………………….33
3. Virusologie generală 3.1. Ipoteze privind originea virusurilor…………………………………...…..36 3.2. Teorii privind natura virusurilor……………………………………..……37 3.3. Formele de existență a virusurilor în natură………………………………40 3.4. Constantele virionului……………………………………………………..41
7.2. Infecția abortivă………………………………………………………...…75 7.3. Infecția simultană cu asociații virale de tip cooperant………………...….75 7.4. Infecția cu virusuri, interferente…………………………………...…...…77 7.5. Infecția cu acizi nucleici purificați (transfecția)………………………..…77
11.Comportarea virusurilor față de factorii de mediu………………………….…….….103 11.1. Comportarea virusurilor față de factorii fizici………………….….…...103 11.2. Comportarea virusurilor față de factorii chimici……………….….…...105 11.3. Substanțele chimioterapice și antibiotice……………………….…....…105 11.4. Inhibitori ai pătrunderii virusului în celulă……………………….....….106 11.5. Inhibitori ai replicării sau biosintezei…………………………….…….106 11.6. Inductori de interferoni…………………………………………….…...108
Familia CORONAVIRIDAE……………………………………………………………160 Genul Coronavirus……………………………………………………………...161 Virusul bronșitei infecțioase a puilor de găină……………………….161 Virusul gastroenteritei infecțioase virotice a porcului…………….....162 Virusul encefalomielitei de Ontario………………………………….163 Genul Torovirus………………………………………………………………...163
Am răspuns cu plăcere invitației autorului, de a prefața fructul unei munci asidue, concretizată într-o valoroasă și utilă lucrare de “Microbiologie veterinară”. Datorită progresului tehnic, o carte de specialitate este mereu așteptată, atât datorită necesității în procesul instructiv, cât și în activitatea zilnică, practică a medicului de laborator. De la primele rânduri, lucrarea atrage atenția prin noutatea modului de abordare și de sistematizare a tematicii, respectiv a problematicii tratate, bacteriologice și virusologice, a formei de prezentare, care te îmbie să o consulți, renunțându-se la forma clasică cu care eram obișnuiți. După modul cum este alcătuită, ca formă și conținut, lucrarea se încadrează în normele pentru un tratat de specialitate, deoarece dezbate exhaustiv și actual toate problemele esențiale privitoare la bacteriile și virusurile implicate în patologia animală. Pe toată întinderea ei, tratarea problemelor este extrem de constantă, așa încât raportul dintre conținut și dimensiunea lucrării nu e nici prolix, nici concentrat, ci mai degrabă moderat. Totuși, problemele de virusologie sunt tratate într-o viziune modernă și personală, limitându-se numai la cadrul necesar înțelegerii aspectelor practice, aplicative în diagnostic. Prin sinteza și sistematizarea materialului, autorul reușește să pună în valoare experiența acumulată în peste 30 ani, în munca de laborator și în activitatea diagnostico-podagogică. Stilul clar, iconografia în bună parte originală, măresc din plin accesibilitatea unei lucrări care, cu tot aspectul tehnic, te atrage și îți dă o satisfacție reală de împlinire a unei misiuni de adâncă utilitate. Sunt convins că acestea vor fi și sentimentele cititorilor, ceea ce mă determină să o recomand cu încredere. Felicitări sincere autorului, editurii “VENUS” Iași și tuturor
celor care într-un fel sau altul au contribuit ca această valoroasă și utilă lucrare de “Microbiologie veterinară” să vadă lumina
tiparului. 6 iulie 2001 Prof.dr. unv. Tudor PERIANU
Virusologie generală
8
1. OBIECTUL ȘI ISTORICUL MICROBIOLOGIEI. CARACTERIZAREA
PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME
1.1. DEFINIȚIA ȘI OBIECTUL MICROBIOLOGIEI
Microbiologia (gr. micros = mic + bios = viață + logos = știință, doctrină) este știința care se ocupă cu studiul viețuitoarelor invizibile cu ochiul liber, denumite în sens larg microbi.
Termenul de microb a fost creat de SÉDILLOT în 1878 și se înțelege toate microorganismele cu structură celulară sau subcelulară care, deși morfologic pot fi diferite, au un caracter comun de încadrare, dimensiunea microscopică. În conformitate cu acest criteriu unic, microbiologia se ocupă cu studiul virusurilor (Virusologia), bacteriilor (Bacteriologia), ciupercilor microscopice (Micologia) și protozoarelor (Protozoologia).
Termenul de microb sau microorganism va fi folosit în sens generic pentru denumirea bacteriilor, virusurilor, viroizilor, prionilor și a ciupercilor microscopice, iar protozoarele, încadrabile fără echivoc în microorganisme au rămas prin convenție și tradiție în sfera de preocupări a parazitologiei.
Ca urmare a dezvoltării cunoștințelor despre microorganisme în cadrul microbiologiei au apărut o serie de discipline noi (umbrela microbiologiei devenind neîncăpătoare) (fig. 1).
1.2. MICROORGANISME, FILOGENIE ȘI TAXONOMIE Microorganismele au poziții diferite în arborele filogenetic și în sistematica biologică.
Virusologie generală
9
Astfel virusurile se găsesc la limita dintre materia organică și sistemele vii iar poziția bacteriilor și ciupercilor (micetelor) depinde de împărțirea lumii vii în două, trei, patru sau chiar cinci regnuri.
Astfel, dacă se admite împărțirea lumii vii numai în două regnuri –vegetal și animal- împărțire care nu mai satisface exigențele biologiei moderne, bacteriile ar trebui admise în lumea plantelor deși așa cum va rezulta din capitolul următor, celula bacteriană prezintă caractere care le deosebește de celula eucariotă vegetală.
Fig. 1 “Umbrela” microbiologiei în care sunt incluse disciplinele constituente
Admițând existența mai multor regnuri bacteriile alături, de algele albastre-verzi pot fi considerate ca regn aparte desemnat de-a lungul timpului sub diferite denumiri: PRIMIGENUM (HOG 1860) PROTISTA (HAECKEL 1866) PROCARYOTA (MURAY 1968). Determinatorul lui Bergey (1974) adoptă punctul de vedere însușit de MURAY și încadrează bacteriile în regnul PROCARYOTA.
Ciupercile (micetele) constituie un regn de sine stătător –regnul FUNGI (WHITTAKER 1969). Referitor la perioada
Virusologie generală
10
aproximativă în care microorganismele au apărut pe pământ după COPELAND (1956) bacteriile ar fi apărut cu 3.000-1.000 de milioane de ani anterior, în precambrianul timpuriu și mijlociu iar micetele cu 1.500–500 milioane de ani anterior, în precambrianul târziu și paleozaicul timpuriu, iar cu privire la virusuri sunt mai multe ipoteze care vor fi tratate la capitolul de virusologie.
1.3. RAMURILE MICROBIOLOGIEI ȘI CONTINGENȚELE EI CU ALTE RAMURI ALE BIOLOGIEI
Pe baza grupului de microorganisme care formează obiectul de studiu al unei ramuri, microbiologia se subdivide în: bacteriologie, virusologie și micologie (studiul micetelor). În funcție de caracterul fundamental sau aplicativ al studiului microorganismelor se pot deosebi:
- microbiologia generală – ramură fundamentală care studiază caracterele generale, structurale și fiziologice ale microorganismelor, indiferent de nișa lor ecologică sau domeniul pentru care prezintă interes și
- ramurile aplicative ale microbiologiei – medicală, medical-veterinară, industrială, marină, a alimentelor, a solului, a petrolului, a cosmosului, etc. – al căror obiect îl constituie studiul unui număr mai restrâns sau mai larg de specii microbiene, care prin activitatea lor biosintetică sau prin relațiile lor ecologice cu alte organisme exercită un efect util sau nociv în raport cu una sau alta din diferitele sfere ale activității umane.
Cunoașterea însușirilor biologice ale acestor microorganisme este menită să ducă fie la elaborarea unor metode de combatere a germenilor respectivi în vederea evitării sau îndepărtării efectului lor dăunător (în medicină, medicină veterinară, fitopatologie etc.), fie la folosirea lor pentru mărirea randamentului în diferite domenii productive (industria medicamentelor, industria alimentară, fertilizarea solului, producerea de petrol etc.).
Virusologie generală
11
Microbiologia are numeroase contingențe cu alte ramuri ale științelor biologice. Astfel, Imunologia, înainte de a deveni o știință de sine stătătoare, a luat naștere și s-a dezvoltat în cadrul Microbiologiei. Genetica moleculară modernă este în mare măsură tributară cercetărilor de microbiologie. În cadrul medicinei sau medicinei veterinare majoritatea patologiilor studiază un număr mai restrâns sau mai larg de îmbolnăviri, în care factorul etiologic primar, secundar sau asociat este de multe ori de natură microbiană. Toate domeniile patologiei, cât și controlul alimentelor sunt în acest fel într-o măsură mai mare sau mai mică beneficiare atât cunoștințelor de microbiologie generală, cât și microbiologiei medicale sau medical-veterinare, ca ramuri aplicative.
Microbiologia medical-veterinară, care studiază speciile microbiene ce prezintă un pericol pentru starea de sănătate a animalelor, are o serie de interferențe cu microbiologia medical-umană. Ele se datoresc în primul rând existenței unor microorganisme care în spectrul lor de patogenitate cuprind atât omul cât și una sau mai multe specii animale. Unele microorganisme se pot transmite de la animale la om; îmbolnăvirile produse de acestea se numesc zoonoze sau antropozoonoze. Igiena alimentelor de origine animală este un alt domeniu în care din punct de vedere microbiologic cele două domenii ale medicinei sunt cointeresate datorită implicațiilor pentru sănătatea omului, ale aspectelor cantitative și calitative ale microbismului acestora.
1.4. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI
Evoluția cunoștințelor despre microorganisme poate fi împărțită în patru etape mai importante:
etapa intuitivă, de admitere ipotetică a existenței microorganismelor;
etapa descoperirii microorganismelor, a studiului lor morfologic și a primelor încercări de diferențiere și clasificare a acestora;
etapa constituirii microbiologiei ca știință și a dezvoltării ei pe baze moderne;
Virusologie generală
12
etapa contemporană de dezvoltare a microbiologiei.
1.5. ETAPA INTUITIVĂ, DE ADMITERE IPOTETICĂ A EXISTENȚEI MICROORGANISMELOR
Această etapă se întinde din antichitate și până în a 2-a jumătate a secolului XIX. Ea este caracterizată prin elaborarea de către diferiți învățați a unor ipoteze sau teorii care încearcă să explice contagiozitatea unor îmbolnăviri, dintre care merită a fi reținute următoarele:
a)Teoria miasmatică a celebrului medic grec HIPPOCRAT din COS (460-380 î.e.n.) reprezintă prima teorie medicală de profunzime. Conform acestei teorii, bolile molipsitoare sunt produse de miasme vehiculate prin aer. Este însă admisă și posibilitatea transmiterii bolilor prin “ape alterate aduse de la distanță”. Astfel de considerațiuni teoretice sunt urmate și de recomandări practice, cum ar fi executarea de fumigații cu sulf sau esențe aromate și fierberea apei, în cazul apariției bolilor molipsitoare. HIPPOCRAT este primul care face observații privind existența unor cauze comune la bolnavii care prezintă aceleași manifestări de boală.
Tot în antichitate au mai fost admise puncte de vedere privind cauza transmiterii unor boli, de către unii istorici și scriitori:
- THUKIDIDE (465-388 î.e.n.) atribuie apariția epidemiilor unor factori de contagiune – contagium animatum. Renumitul istoric grec a făcut în același timp observații privind imunitatea, menționând în scrierile sale că după trecerea prin boală nu se produc îmbolnăviri a doua oară.
- MARCUS TERENTIUS VARO (116-27 î.e.n.) corelează apariția unor îmbolnăviri cu particularități zonale ale locului respectiv, ca de exemplu existența mlaștinilor. Filozoful roman admite ca probabilă prezența în regiunile palustre a unor animale minuscule –aniamlia minuta- ce plutesc în aer și cărora le revine responsabilitatea etiologică a îmbolnăvirilor.
Virusologie generală
13
Teoria miasmatică a fost însă cea mai bine consolidată, având valoarea unei teorii medicale. De aceea ea a persistat și în evul mediu, după ce a fost emisă teoria contagiunii, cu care a continuat să coexiste până în timpurile moderne.
b)Teoria contagiunii a medicului italian GIOROLAMO FRACASTORO (1478-1553), cunoscut și sub numele latinizat HYERONIMUS FRACASTORIUS, valorifică în bună măsură observațiile și experiența dobândite în decursul timpului privind bolile molipsitoare. În lucrarea sa “De contagionibus, de morbis contagios et eorum curatione”, FRACASTORO numește particulele responsabile de boli “seminaria” și le consideră entități vii, capabile de multiplicare. Natura contagioasă este deci vie, definită deseori pe parcursul lucrării și cu termenul “contagium vivum”. Lucrarea cuprinde și precizări asupra modurilor posibile de contagiune directă, indirectă, la distanță. Una din importantele idei noi, care apar în teoria lui FRACASTORO,este aceea a afinității elective a germenilor, care admite că aceștia pot avea afinitate numai pentru anumite specii animale sau pentru unele organe.
1.6. ETAPA DESCOPERIRII MICROORGANISMELOR, A STUDIULUI LOR MORFOLOGIC ȘI A PRIMELOR ÎNCERCĂRI DE DIFERENȚIERE ȘI CLASIFICARE A ACESTORA
Această perioadă începe odată cu ultimile decenii ale secolului al XVII-lea și se întinde până în a doua jumătate a secolului al XIX-lea. Ea este caracterizată prin cunoașterea nemijlocită a obiectului microbiologiei și este tributară progresului tehnic în plin avânt. a) Inventarea microscopului. Descoperirea
microorganismelor nu ar fi fost posibilă fără apariția instrumentelor de amplificare optică. Prima încercare de construcție a unui microscop se datorește lui ROGER BACON în secolul XIII urmat abia peste aproximativ două secole de frații ZACCHARIAS și HANS JENSEN (1590) și de GALILEO GALILEI (1610), ROBERT HOOKE (1665) aduce perfecționări microscopului și-l folosește pentru cercetarea
Virusologie generală
14
structurii organismelor vegetale. În aceași perioadă au apărut și alți constructori de microscoape, printre care se numără și LEUWENHOECK.
b) Descoperirea microorganismelor ANTONY VAN LEUWENHOECK (1632-1723) construiește un microscop care se pare că mărea de 300 ori, cu care face cercetări în salivă și puroi, examinează spermatoizii, solzi de fluturi etc. Fiind dotat cu un pătrunzător spirit de observație și capacitatea de sesizare a noului, LEUWENHOECK observă, descrie și desemnează (fig. 2) în lucrarea sa “Arcana naturae ope microscopiorum detecta”, microorganisme, astăzi omologabile cu bacteriile și ciupercile inferioare, pentru care folosește denumirea “animalcula”. Lucrarea este prezentată la Societatea Regală de Biologie din Londra în 1675, este tipărită la DELFT în 1695 și reprezintă certificatul de naștere al microbiologiei.
Secolul al XVIII-lea a marcat puține progrese în
cunoașterea lumii microbiene descoperite de LEUWENHOECK. Cercetările întreprinse s-au concretizat în acumulări de date cu caracter predominant empiric privind morfologia microorganismelor. c) Primele încercări de diferențiere și clasificare a
microorganismelor . LINNE (1707-1778) ține seama de
Fig. 2 Desenul lui LEUWENHOECK în care sunt redate bacteriile observate în salivă.
Virusologie generală
15
existența acestor viețuitoare și în lucrarea sa ‘Systema natura” apărută în 1735, le încadrează într-un singur gen, căruia îi dă numele de “chaos”, semnificativ pentru stadiul cunoștințelor despre microbi din acel timp.
FRIEDRICH MULLER între 1773-1786 este primul care subliniază faptul că nu toate microorganismele sunt identice și propune împărțirea lor în două genuri; Vibrio și Monas. Ulterior se fac și alte propuneri de noi genuri și specii. Apar primele sisteme de clasificare ale microorganismelor.
FERDINAND COHN în 1854 crează termenul de bacterie și împreună cu EHREHBERG desprind acest grup de microorganisme din regnul animal și argumentează încadrarea lui în regnul vegetal, pe baza prezenței peretelui celular. Astfel, în cadrul viețuitoarelor microscopice, bacteriile devin un grup de sine stătător, diferențiat, deocamdată pe baza criteriilor morfologice.
1.7. ETAPA CONSTITUIRII MICROBIOLOGIEI CA ȘTIINȚĂ ȘI A DEZVOLTĂRII EI PE BAZE MODERNE
Această etapă cuprinde a doua jumătate a secolului al XIX-lea. Ea este strâns legată de apariția a două personalități: -LOUIS PASTEUR și ROBERT KOCH, care prin contribuțiile lor și a școlilor pe care le-au creat, au fundamentat microbiologia ca știință și au declanșat dezvoltarea ei impetuasă.
Tot în această perioadă se situează și începuturile imunologiei, ramură a științelor biologice, astăzi de sine stătătoare, dar care își are originea și s-a dezvoltat până nu demult în strânsă conexiune cu microbiologia. a) Rolul lui LOUIS PASTEUR și a școlii sale în revoluționarea
microbiologiei. LOUIS PASTEUR (1822-1895) a fost un savant de larg
orizont și de o excepțională fecunditate, profunzime și probitate științifică. Cu toate că a fost chimist ca formație și că în primii săi ani de activitate a elaborat câteva valoroase lucrări de chimie, PASTEUR și-a dedicat întreaga sa activitate studiului microorganismelor. Mobilul schimbării domeniului său de cercetare l-a constituit studiul unor procese chimice pe care, în
Virusologie generală
16
final, PASTEUR le-a dovedit ca fiind produse de microorganisme. Pornind de aici, el și-a lărgit treptat sfera de investigații asupra microorganismelor. Astfel, s-a ajuns la depășirea etapei morfologice de studiu a microorganismelor în care se acordase o atenție precumpănitoare formei acestora și inaugurarea etapei fiziologice, în care pe prim plan trece investigarea activităților enzimatice microbiene, cu implicațiile acestora pentru diferite domenii ale activității umane.
Cele mai importante descoperiri ale lui PASTEUR în domeniul microbiologiei și a biologiei în general, au fost: Demonstrarea naturii microbiene a fermentațiilor.
Solicitat fiind să lămurească unele probleme ale procesului de vinificație, PASTEUR dovedește că orice fermentație este “un act relativ unui fenomen vital”. El infirmă teoria lui LEIBIG, conform căreia fermentațiile erau considerate rezultatul descompunerii microorganismelor. În 1865, PASTEUR descoperă fermentația butirică și bacteriile anaerobe.
Fundamentarea naturii microbiene a infecțiilor. PASTEUR stabilește relația cauzală microb-infecție pe care o verifică experimental. Pornind de la studiul unor boli ale larvelor fluturelui de mătase, PASTEUR și-a extins mai târziu studiile asupra unor infecții ale animalelor și omului. El demonstrează că prezența germenilor în organele oilor moarte de antrax nu este consecința bolii, ci cauza acesteia. În concluziile sale, PASTEUR pornește de la analogia existentă între fermenație și infecție, ambele procese fiind efectul activității biologice a bacteriilor.
Infirmarea definitivă a teoriei generației spontane. Actualizată în secolul al XIX-lea de FELIX-ARCHIMEDE POUCHET, teoria generației spontane constituie în acea perioadă o frână în dezvoltarea științelor biologice. Bazat pe descoperirile sale privind mecanismele fermentațiilor și a infecției, PASTEUR demonstrează fără echivoc că microorganismele nu apar spontan. Ele ajung în substraturile în care se multiplică din aer, de pe suprafața obiectelor care vin în contact cu aerul etc. Un substrat nutritiv sterilizat într-un recipient închis la flacără, rămâne practic steril la infinit. Aceste experințe au stat și la baza introducerii sterilizării în practica medicală.
Virusologie generală
17
Prepararea unor vaccinuri. Vaccinul contra holerei aviare a fost primul vaccin antibacterian bazat pe atenuarera germenilor în condiții de laborator. Această descoperire a fost consecința unei întâmplări. PASTEUR a uitat o tulpină de germeni la termostat și a constatat apoi că ea nu mai reproduce infecția la găini, iar găinile inoculate au devenit rezistente la inocularea cu o tulpină virulentă.
Inspirat din această întâmplare, PASTEUR a atenuat și bacilul cărbunelui. Pe baza unei experiențe științifice organizate după un protocol bine stabilit în 1881, în localitatea Pouilly le Fort, este spectaculos demonstrată eficacitatea vaccinului anticărbunos pasteurian pentru oaie.
Geniul lui PASTEUR este mai pregnant ilustrat prin prepararea vaccinului antirabic. Fără a cunoaște natura agentului etiologic al turbării, PASTEUR reușește în 1885 să obțină prin treceri succesive intracerebrale pe iepure, virus rabic fix, incapabil să reproducă turbarea pe cale subcutanată, dar cu proprietăți imunizante. Practica imunizării antirabice cu virusuri fixe s-a păstrat până în zilele noastre. Izolarea și identificarea agenților etiologici ai unor
infecții ale omului și animalelor. Lui PASTEUR îi revine meritul de a fi izolat și descris mai mulți germeni printre care Clostridium septicum (vibrionul septic al lui PASTEUR), stafilococii și streptococii.
PASTEUR a avut numeroși elevi, în jurul lui constituindu-se o școală la care s-au format o serie de eminenți microbiologi, din rândul cărora se cuvine a fi menționați:
- EMILE ROUX (1853-1933), alături de YERSIN, s-a distins, printre altele, în studiul toxinelor microbiene.
- EDMOND ISIDORE ETIENNE NOCARD (1850-1903) împreună cu ROUX izolează și identifică mai mulți germeni cunoscuți astăzi sub numele de micoplasme.
- CHARLES EDUARD CHAMBERLAND este autorul unor inovații tehnice deosebit de utile activității curente de laborator, ca de exemplu primul filtru bacteriologic și autoclavul.
Dintre discipolii lui PASTEUR se numără și VICTOR BABEȘ, fondatorul școlii românești de microbiologie.
Virusologie generală
18
Marile descoperiri ale lui PASTEUR n-au întârziat să-și găsească laturi aplicative și în alte domenii ale medicinei. Așa a fost cazul introducerii antisepsiei în chirurgie de către JOSEPH LISTER (1827-1917); primul antiseptic utilizat pentru pansamente și pulverizări în sălile de operații a fost fenolul. b) Rolul lui ROBERT KOCH și a școlii sale în dezvoltarea
microbiologiei. ROBERT KOCH (1843-1910), fără să fie dotat cu geniul lui PASTEUR dar animat de o neobosită sete de cunoaștere și o enormă putere de muncă, trebuie considerat al doilea fondator al microbiologiei științifice. Contribuțiile sale cele mai importante în acest sens au fost următoarele:
Stabilirea criteriilor la baza cărora un microorganism poate fi considerat agentul cauzal al unei boli. Aceste criterii sunt exprimate sub forma a trei condiții cunoscute sub numele de postulatele sau triada lui ROBERT KOCH. În conceperea și formularea lor, KOCH s-a inspirat din lucrările profesorului său JAKOB HENLE (1809-1885). Postulatele elaborate între anii 1878 și 1884 precizează că un microb poate fi considerat agentul cauzal al unei boli atunci când:
- se găsește la toți indivizii care au prezentat aceleași semne de boală;
- se izolează și se menține în culturi pure, care - inoculate, reproduc infecția experimental identică
sau asemănătoare cu infecția naturală. Cu toate că nu oglindesc toate fațetele procesului
complex al infecției microbiene, postulatele lui KOCH au contribuit substanțial la fundamentarea științifică a patologiei bolilor infecțioase.
Punerea la punct a tehnicii de izolare a bacteriilor în culturi pure. Obținerea culturilor pure a fost condiționată de introducerea în practica de laborator a mediilor de cultură solide pe care bacteriile se dezvoltă sub formă de colonii.
Posibilitatea izolării în culturi pure a marcat un important pas înainte în practica individualizării germenilor din punct de vedere taxonomic.
Semnalarea primului fenomen de alergie și prepararea primei substanțe revelatoare. KOCH observă o sensibilitate deosebită a cobailor inoculați cu bacilul tuberculozei, care în cazul unei reinoculări reacționează prin formarea unei inflamații urmate de un ulcer la locul inocularii. Această
Virusologie generală
19
reacție este cunoscută sub numele de fenomenul lui KOCH. Totodată, cu intenția inițială de a prepara un vaccin, ROBERT KOCH obține tuberculina care, cu unele perfecționări tehnice inerente procesului metodelor de extracție și purificare chimică, este folosită și astăzi ca preparat revelator pentru diagnosticul alergic al tuberculozei.
Izolarea și identificarea agenților etiologici a unor grave infecții ale omului și animalelor. KOCH a stabilit etiologia tuberculozei, obținând în culturi pure bacteria care produce această gravă îmbolnăvire. Și astăzi este uzual apelativul “Bacilul lui Koch” ca nume comun pentru bacilul tuberculozei. O altă bacterie izolată și descrisă de KOCH este agentul holerei umane.
Școala fondată de ROBERT KOCH a fost și ea ilustrată prin renumiți bacteriologi, printre care se impune a fi amintiți:
FRIEDRICH LOFFLER (1852-1915), izolează și descrie agenții etiologici ai morvei și rujetului, imaginează rețeta unor medii de cultură și a unor tehnici de colorare și împreună cu PAUL FROSCH (1860-1928) descoperă virusul febrei aftoase.
HANS CHRISTIAN GRAM (1853-1938) introduce în anul 1884 metoda de colorare care-i poartă numele, rămasă până astăzi tehnica de bază pentru examenele bacteriologice curente.
În perioada marilor descoperiri ale lui PASTEUR și KOCH este elucidată cauza a numeroase infecții, fiind identificați și descriși agenții etiologici ale acestora de către o serie de bacteriologi de renume: ESCHERICH, 1882 –Escherichia coli-, NICOLAIER și KITASATO, 1884 –Clostridium tetani-, BRUCE, 1887 –Brucella melitensis-, NOCARD și ROOX 1898 –Mycoplasma mycoides, etc. c) Descoperirea virusurilor. Cu toate că anterior descoperiri
lor se preparaseră vaccinuri contra unor boli virotice de către JENNER și PASTEUR, primul virus a fost pus în evidență abia în anul 1892.
DIMITRI IOSIFOVICI IVANOVSKI (1864-1919), un botanist rus, descoperă virusul mozaicului tutunului, precizând că această boală este produsă de un microb extrem de mic, invizibil la microscop, care traversează porii filtrelor bacteriologice. În anul 1898, LOFFLER și FROSCH descoperă primul microb filtrabil patogen pentru animale- virusul febrei aftoase, menționat anterior.
Virusologie generală
20
d) Începuturile imunologiei. Pe baza marilor descoperiri din domeniul microbiologiei și paralel cu această, ia naștere și se dezvoltă imunologia.
EDWARD JENNER (1749-1823), un medic englez, preparase încă cu aproximativ un secol în urmă (1798) vaccinul contra variolei umane din leziuni recoltate de pe ugerul vacilor; etimologic, cuvântul “vaccin” este corelat cu “vacă”.
Din lucrările lui JENNER se inspiră PASTEUR în prepararea vaccinurilor contra holerei aviare, a cărbunelui și turbării.
Aceste importante descoperiri destinate rezolvării unor probleme practice de mare stringență sunt urmate de cercetări privind mecanismele de apărare antimicrobiană ale organismului animal.
Cele mai importante probleme elucidate în ultimile decenii ale secolului al XIX-lea, care conferă suportul teoretic metodelor imunologice deja intrate în practica prevenirii bolilor microbiene, sunt:
- Stabilirea proprietăților antimicrobiene ale sângelui și tumorilor de către FODOR în 1887.
- Descoperirea fenomenului de fagocitoză de către ILIA MECINIKOV (1845-1916). Pornind de la studiul fenomenelor de digestie la steaua de mare, MECINIKOV demonstrează că în sângele omului unele globule albe sunt capabile să înglobeze particule străine, întocmai ca celulele din cavitatea generală a celenteratelor.
- Prepararea primelor seruri imune de către BABEȘ și LEPP în 1889 urmați de BEHRING și KITASATO în 1890.
- Investigarea mecanismelor unor reacții antigen-anticorp; precipitare –KRAUS, 1887; imunocitoliza –PFEIFFER și ISAEFF, 1894; fixarea complementului –BORDET, 1899.
HANS BUCHNER (1850-1902) și PAUL EHRLICH (1854-1915) sunt autorii primelor teorii privind modul de formare al cuplului antigen-anticorp. Teoria “catenelor laterale” a lui EHRLICH subliniază substratul chimic care stă la baza constituirii cuplului.
Virusologie generală
21
1.8. ETAPA CONTEMPORANĂ DE DEZVOLTARE A MICROBIOLOGIEI
Etapa pe care microbiologia o parcurge la momentul de față debutează cu începutul secolului XX. Ea este dominată de o serie de importante descoperiri, după cum și elaborarea și aprofundarea a numeroase probleme prin noi metode corespunzătoare progresului tehnico-științific din chimie, optică, electronică, etc. care a lărgit mult limitele procesului cunoașterii în toate domeniile științelor biologice. Cele mai de seamă cuceriri ale microbiologie contemporane pot fi considerate următoarele: introducerea substanțelor chimioterapice și antibiotice în tratamentul bolilor microbiene, cunoașterea detaliilor structurale și a proceselor fiziologice de finețe ale microorganismelor, începuturile, urmate de progresul rapid al studiilor de genetică microbiană, descoperirea ultrastructurii virusurilor și a mecanismelor infecției virale, dezvoltarea imunologiei și afirmarea ei ca ramură independentă a științelor biologice. a) Îmbogățirea arsenalului terapeutic antimicrobian. Până
în primele decenii ale secolului XX numeroase boli microbiene erau practic incurabile fapt care a determinat menținerea unui procent ridicat de mortalitate în cazul unor epidemii ca antraxul, pesta, holera etc.
Chimioterapeuticele au fost introduse în practica medicală de către PAUL EHRLICH care sintetizează salvarsanul, folosit cu succes în tratamentul sifilisului în jurul anului 1910. Chimioterapia și-a lărgit considerabil sfera de aplicații odată cu descoperirea sulfamidelor.Cu toate că ultima sulfamidă a fost preparată de PAUL GELMO încă din 1908, folosirea lor pe scară largă în tratamentul infecțiilor microbiene a început abia în anul 1932 când GERHARD DOMACK are inițiativa utilizării ca substanță chimioterapeutică a sulfamidei roșii (prontozilul) preparat de MIETSCH și KLARER.
Antibioticele au intrat în patrimoniul terapiei antimicrobiene în anul 1941 când ERNST CHAIN și HOWARD FLOREY tratează primii pacienți cu penicilina obținută încă din 1929 de către ALEXANDER FLEMING din culturile ciupercilor
Virusologie generală
22
genului Penicillium. Numărul antibioticelor sporește repede mai ales după identificarea actinomicetelor ca microorganisme secretoare de astfel de substanțe. WAKSMAN obține în 1944 streptomicina din Streptomyces griseus BURKHOLDER în 1947 cloromicetina, din Streptomyces venezuelae etc. Astăzi medicina dispune de foarte multe antibiotice de o mare varietate din punct de vedere al originii și al spectrului de activitate. b) Adâncirea studiului morfologiei și fiziologiei microorganismelor. Cunoașterea detaliilor de structură și a mecanismelor fiziologice de finețe au fost determinate de progresele din domeniul fizicii și chimiei contemporane.
Vizualizarea virusurilor și cunoașterea ultrastructurii microorganismelor a fost posibilă datorită inventării microscopului electronic. Primele microscoape electronice au fost construite în perioada 1930-1940 de către firma Siemens și aproximativ din aceași perioadă datează și primele cercetări electronooptice în domeniul microbiologiei.
Aprofundarea cunoașterii mecanismelor fiziologice ale microorganismelor este tributară dezvoltării biochimiei și introducerii în biologie a modului de lucru cu izotopi radioactivi. Devine astfel posibilă cunoașterea structurii chimice a microorganismelor, studiul activității lor enzimatice, stabilirea cu ajutorul atomilor marcați a soartei diferitelor substanțe din mediu în raport cu procesele vitale. c) Descoperirea determinanților genetici ai
microorganismelor și dezvoltarea geneticii microbiene. Primele observații care mai târziu au dus la elucidarea sediului informației genetice la microorganisme și în întreaga lume vie au fost făcute de GRIFFITH în 1928, care a constatat că pneumococii avirulenți aparținând tipului serologic II, se pot transforma în pneumococi virulenți aparținând tipului serologic III, dacă sunt inoculați la animale în amestec cu o suspensie de pneumococi de tip III omorâți prin căldură. În 1944, OSWALD AVERY stabilește că responsabilitatea transformării pneumococilor de tip II în pneumococi de tip III s-a datorat AND-ului eliberat de pneumococii de tip III omorâți prin căldură, care a pătruns în celulele pneumococilor de tip II aducând cu sine mesajul genetic care codifică însușirile caracteristice tipului III. Descoperirea lui AVERY stă la baza întregii genetici
Virusologie generală
23
moleculare moderne, ea dovedindu-și valabilitatea pentru toate viețuitoarele.
d) Noi descoperiri în domeniul virusologiei. Sfârșitul secolului al XIX-lea a marcat demonstrarea existenței virusurilor ca entități etiologice ale unor îmbolnăviri ale plantelor și animalelor, invizibile la microscopul fotonic și filtrabile. Acestor relativ sumare cunoștințe despre virusuri li se adaugă încă din primele decenii ale secolului XX, date noi care vor aduce treptat virusologia în stadiul actual de dezvoltare.
- Descoperirea bacteriofagilor, a virusurilor care parazitează bacteriile se datorește investigațiilor lui WILLIAM TWORT, care în 1915 izolează primul bacteriofag, activ față de stafilococ. El intuiește însă numai vag natura principiului care lizează stafilococii, folosind pentru acesta termenul “liză transmisibilă”. Este meritul lui FELIX d’HERELLE de a fi stabilit natura virală a factorului litic și de a fi creat termenul “bacteriofag” (1917). Importanța descoperirii bacteriofagilor și a fenomenului de bacteriofagie a constat mai ales în acea că a oferit un model și un instrument ușor de mânuit pentru aprofundarea mecanismelor generale ale infecției virale.
- Cultivarea virusurilor și menținerea lor în condiții de laborator reprezintă un alt pas înainte pentru studiul virusurilor. Marele virusolog român, CONSTANTIN LEVADITI folosește primul, în 1910, culturile celulare pentru cultivarea virusurilor. WOODROUF și GOODPASTURE, în 1931 introduc în practica virusologică cultivarea pe ouă embrionate, experimentată pentru prima oară în 1911 de MOURPHY.
- Cunoașterea ultrastructurii virusurilor a fost posibilă într-o primă etapă datorită studiilor lui BERNAL și FANKUCHEN (1941), pe baza difracției razelor X, iar mai târziu datorită extrem de numeroaselor cercetări de microscopie electronică deja menționate, care au dus la lămurirea celor mai fine detalii de structură ale particulei virale.
Virusologie generală
24
- Elucidarea mecanismului infecției virale reprezintă cel mai de seamă pas al evoluției cunoștințelor de virusologie, un adevărat salt calitativ marcat prin demonstrarea rolului esențial al acidului nucleic în infecția virală. HERSHEY și CHASE, în 1952 arată primii că la virusurile bacteriofagice numai acidul nucleic fagic pătrunde în celula bacteriană, nu și capsida, iar GIERER și SCHRAMM, 1956, concomitent cu FRAENKEL CONRAT demonstrează primii posibilitatea reproducerii experimentale a infecției cu acidul nucleic viral purificat.
e) Dezvoltarea imunologiei și afirmarea ei ca ramură independentă a științelor biologice. Studiul reacțiilor antigen-anticorp început la sfârșitul secolului trecut, capătă o amploare deosebită ajungând la cunoașterea intimă a structurii anticorpilor și la investigarea procesului de anticorpogeneză în esența lui. În paralel sunt lămurite aspecte noi ale imunologiei cum este cazul fenomenelor de alergie sau hipersensibilitate. În urma unor studii de profunzime sunt elucidate bazele celulare ale imunității. Se descoperă că numeroase stări normale și patologice încă neclarificate din punct de vedere etiopatogenetic, se realizează prin mecanisme imunologice. Implicațiile imunologiei se conturează pregnant și pentru alte domenii ale medicinei decât patologia infecțioasă, după cum și pentru alte ramuri ale științelor. De aceea, ea a devenit cu timpul o disciplină de graniță între microbiologie și alte discipline biologice și se poate aprecia că în momentul de față și-a dobândit un statut de ramură de sine stătătoare în vastul ansamblu al științelor biologice.
Concomitent cu detașarea imunologiei din cadrul microbiologiei au început să se contureze noi discipline de graniță între imunologie și alte ramuri de știință: imunochimia, imunogenetica, imunopatologia.
Pornind de la această atitudine față de imunologie, ea urmează să formeze obiectul unui curs aparte.
Virusologie generală
25
1.9. DEZVOLTAREA MICROBIOLOGIEI ÎN ROMÂNIA
Începuturile cercetării și practicii microbiologice în România se situează spre sfârșitul secolului al XIX-lea. a) Școala de microbiologie medicală VICROT BABEȘ (1854-
1925) a fost fondatorul școlii românești de microbiologie. Marele savant român s-a format lucrând în perioada 1881-1884 în laboratorul lui PASTEUR și în 1885 în laboratorul lui KOCH. BABEȘ a desfășurat o prodigioasă activitate științifică elaborând peste 1.000 lucrări, 25 monografii și primul tratat de bacteriologie în colaborare cu VICTOR CORNIL în 1883. Descoperirea în 1887 a incluziilor produse de virusul turbării în celulele piramidale din cornul lui Ammon, cunoscute sub numele “incluziile lui Babeș-Negri”, a serurilor imune (împreună cu LEPP în 1889), a paraziților din hematiile unor specii de animale, paternitatea acestei descoperiri fiind recunoscută prin crearea genului Babesia în care au fost încadrate microorganismele respective, reprezintă contribuțiile cele mai importante cu care VICTOR BABEȘ a îmbogățit tezaurul științei românești și universale. Alături de acestea trebuie menționate și numeroasele sale cercetări asupra antagonismului bacterian și descrierea granulelor metacromatice din citoplasma bacilului difteriei (corpusculii Babeș-Ernst).
Paralel cu activitatea științifică, VICTOR BABEȘ a dezvoltat și o bogată activitate didactică, organizatorică și obștească, conturându-se ca o figură luminoasă de savant patriot.
Savanții care ulterior au dezvoltat în mod strălucit școala de microbiologie medicală românească au fost: IOAN CANTACUZINO (1863-1934), CONSTANTIN IONESCU-MIHĂESTI (1883-1962), MIHAI CIUCA (1883-1969), DUMITRU COMBIESCU (1887-1961), iar în domeniul virusologiei CONSTANTIN LEVADITI (1874-1953) și ȘTEFAN S. NICOLAU (1896-1967). b) Școala de microbiologie veterinară PAUL RIEGLER (1867-
1938) a fost fondatorul școlii românești de microbiologie veterinară. Elev al lui VICTOR BABEȘ, el a introdus la noi în țară practica diagnosticului bacteriologic în medicina veterinară. În 1911 a fondat institutul de seruri și vaccinuri de uz veterinar (în acea perioadă, al treilea de acest fel în
Virusologie generală
26
lume), care în 1922 primește numele lui PASTEUR. În cadrul institutului organizează producția preparatelor imunoprofilactice. A desfășurat o susținută activitate științifică, remarcându-se prin lucrările sale privind bacilul morvei.
RIGLER a fost primul profesor de Microbiologie și Anatomie Patologică la școala de Medicină Veterinară din București. PAUL RIGLER a fost un savant erudit și a avut marele merit de a fi creat o școală în cadrul căreia s-au format personalități de seamă, care s-au distins pe plan național și internațional continuându-i opera.
ALEXANDRU VECHIU (1890-1954) s-a remarcat printr-o activitate multilaterală. El a condus, după RIGLER, Institutul Pasteur și Catedra de Microbiologie. VECHIU a fost printre primii cercetători care au reușit adaptarea virusului pestei porcine pe iepure.
ALEXANDRU CIUCA (1880-1972) a fost profesor de Boli Infecțioase la Facultatea de Medicină Veterinară din București. Prin activitatea sa științifică a adus contribuții importante în probleme ca : infecția experimentală cu bacilul morvei la taurine, tipizarea virusului febrei aftoase prin RFC, tratamentul durinei cu neosalvarsan etc.
CONSTANTIN CERNAT (1890-1972) s-a remarcat printr-un studiu asupra piroplasmelor și o îndelungată activitate ca director al Institutului Pasteur.
ILIE POPOVICI (1902-1982), personalitate fecundă și multilaterală, a adus printre altele contribuții deosebite în problema preparării de noi vaccinuri contra febrei aftoase, turbării, agalaxiei contagioase a oilor și caprelor și holerei aviare.
VLADIMIR WYNOHRADNIK (1902-1972) a adus o contribuție substanțială la dezvoltarea cercetării virusologice în medicina veterinară și a organizat producția biopreparatelor antipestoase porcine în cadrul Institutului Pasteur.
NICOLAE MUNTIU (1909-1977), după o serie de lucrări inedite privind bacilul morvei, a inițiat și organizat cercetarea și producția de biopreparate în domeniul febrei aftoase.
Se cuvine a fi menționată și activitatea altor personalități reprezentative, care au desfășurat o rodnică activitate pe tarâmul microbiologiei veterinare: - NICOLAE STAMATIN, profesor de Microbiologie la Facultatea de Medicină Veterinară din București,
Virusologie generală
27
continuând tradiția inaugurată de PAUL RIGLER contribuie la înflorirea școlii românești de Microbiologie Veterinară. Practica veterinară îi datorează, printre altele, două vaccinuri cu mare valoare profilactică: vaccinul anticărbunos preparat din tulpina acapsulogenă 1190 R și vaccinul antirujetic preparat din tulpina VR2, vaccinuri adoptate astăzi și în alte țări. Totodată, cercetările fundamentale întreprinse în domeniul biologiei sporogenezei, a antagonismului microbian, a bacteriofagilor speciilor din genul Bacillus, contribuțiile aduse în domeniul clasificării stafilococilor și pasteurelelor, completează palmaresul care îl situează pe NICOLAE STAMATIN printre reprezentanții de frunte ai bacteriologiei veterinare românești.
- ALEXANDRU POP, microbiolog, erudit a adus contribuții originale în domeniul brucelozei și al unor probleme de imunologie teoretică.
- CONSTANTIN SURDAN a elaborat numeroase lucrări privind pararickettsiile.
- VALENTIN VOLINTIR, pionier al unor domenii de cercetare, a diagnosticat și izolat, primul în țara noastră, agenți etiologici ca Listeria monocytogenes, Moraxella bovis etc.
- POPA OCTAVIAN, autor a unor lucrări privind salmonelozele animalelor și a unor cursuri de Microbiologie și Imunologie la F.M.V. Timișoara.
- ALEXANDRU GRECIANU, cercetător, microbiolog și cadru didactic de excelență la F.M.V. Iași, a adus contribuții originale la metodica identificării grupului E. coli izolat de la găină.
Institutul Pasteur, disciplinele de Microbiologie și Imunologie de la cele partu facultăți de Medicină Veterinară, laboratoarele centrale, rețeaua laboratoarelor județene și a laboratoarelor din întreprinderi de industrie alimentară, reprezintă astăzi cadrul care asigură dezvoltarea practicii și a cercetării în demeniul microbiologiei veterinare la noi în țară.
Virusologie generală
28
2. CARACTERIZAREA GENERALĂ A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME
Grupele de microorganisme incluse în lumea microbiană (prioni, viroizi, virusuri, bacterii și miceți) au următoarele caractere generale:
2.1. PRIONII Proteinele prionice reprezintă cele mai simple și mai inferioare forme de agenți patogeni infecțioși neconvenționali, fiind lipsite în totalitate de o informație genetică. Moleculele proteice din care sunt formate aceste particule se găsesc atât în creierul normal cât și în cel bolnav al omului și animalelor și au fost semnalate pentru prima dată de americanul STANLEY B. PRUSINER care în 10 oct. 1997 primește premiul NOBEL. Într-o perioadă de 7-8 ani PRUSINER a efectuat studii în care a analizat proteinele din creierul normal de hamster și cele din creierul ovinelor bolnave de scrapie. Inițial a demonstrat că la ovinele infectate există în creer o proteină specifică pe care a denumit-o “proteină prionică scrapie” (P.P.S.) iar ulterior a găsit și în creierul hamsterilor normali o proteină asemănătoare dar puțin diferită pe care a denumit-o “proteina prionică celulară” (P.P.C.). Principalele caracteristici ale celor două proteine sunt: P.P.C. - este o proteină normală prezentă în membrana pericarionilor mai concentrată la locul sinapselor;
- este sensibilă la acțiunea enzimelor proteolitice; - este degradată în timpul metabolismului celular; - este nepatogenă, neinfectantă, netransmisibilă; - are funcție neurotransmițătoare; - structura secundară este helicală;
P.P.S.: - este prezentă numai la animalele infectate; - este rezistentă la proteaze; - este termostabilă la 350OC;
Virusologie generală
29
- nu este degradată în cursul metabolismului celular, putându-se acumula în lizozomii din neuroni;
- este infecțioasă și transmisibilă; - structura secundară este ß lamelară; - secvența aminoacizilor este identică cu cea din
P.P.C., cu o singură diferență că leucina este înlocuită cu prolina, modificare determinată de o mutație punctiformă;
Investigațiile și cercetările efectuate de PRUSINER sunt susținute și de o serie de argumente de ordin experimental cum ar fi:
- îndepărtarea sau denaturarea acestei proteine P.P.S. determină suprimarea infecțiozității;
- introducerea prionilor P.P.S. în culturi celulare neuronale determină apariția leziunilor caracteristice;
- punerea în contact “in vitro” a proteinei normale P.P.C. cu cea patogenă de tip P.P.S. duce la transformarea celei normale în cea patogenă;
- gena mutantă care determină sinteza proteinei anormale implicată în apariția leziunilor de encefalopatie spongiformă este localizată la om pe brațul scurt al cromozomului 20.
PRUSINER a elaborat 2 ipoteze privind originea prionilor: originea endogenă și originea exogenă. 1. Originea endogenă arată că gena care codifică proteina de
tip P.P.C., gena care codifică sinteza, suferă o mutație punctiformă care duce la apariția proteinei de tip P.P.S. Inserția greșită a prolinei în locul leucinei duce la destabilizarea structurii helicale a acestei proteine și care capătă însușiri fizice, chimice și biologice deosebite.
2. Originea exogenă susține că prionii pot proveni și din exterior ca în sindromul “CREUTZFELDT – JOKOB” de la om.
În aceste cazuri proteina de tip P.P.S. acționează asupra proteinei normale de tip P.P.C. care suferă conversia de la helical la ß lamelar. Prin urmare nu are loc o sinteză propriuzisă a proteinelor după mecanismele genetice cunoscute, ci o sinteză amplificată prin conversie (celula sintetizează proteina normală care sub influența proteine prionice de tip P.P.S. își schimbă structura de la normal la patologic, astfel încât fiecare moleculă
Virusologie generală
30
de proteină normală PPC este convertită, după modelul “dominoului”, într-o moleculă PPS.
Bolile de origine prionică cunoscute până în prezent sunt: scrapia sau tramblanta ovinelor, “sindromul de vacă nebună” (vache folle), sindromul “CREUTZFELDT JAKOB”, KURU și boala lui ALZHEIMER la om.
2.2. VIROIZI
Viroizii reprezintă forme acelulare de viață, mai simple decât virusurile și de dimensiuni incomparabil mai mici decât acestea.
Primul viroid a fost descoperit de cercetătorul american T. O. DIENNER la BELTSVILLE (S.U.A.) în urma unor cercetări efectuate în perioada 1967-1971 la cartof.
Ei determină maladii la plante cum ar fi: boala stelării (deformării) tuberculilor de cartof, nanismul și pătarea clorotică a crizantemelor, cloroza castraveților, boala cadang-cadang a palmierilor de cocos, etc.
Caractere generale: 1. Sunt forme acelulare de viață alcătuite din
molecule de ARN de talie mică neprotejate de alte învelișuri externe.
2. Molecula de ARN are o structură circulară cu regiuni mono sau dublu catenare.
3. În general sunt localizați în nucleul celulelor unde se replică cu ajutorul unor enzime de tipul ARN replicazelor din celula gazdă.
4. Originea lor nu este prea bine cunoscută, dar se presupune că ar reprezenta introni nedegradați eliminați în procesul de activare al genelor.
5. Capacitatea lor patogenă se datorează interacțiunii lor cu genomul celulei gazdă și perturbării mecanismelor de reglaj genetic al celulei gazdă.
6. Viroizii reprezintă o nouă clasă de agenți patogeni subvirali care se află la limita inferioară a materiei vii și care posedă un program genetic redus la minim.
Virusologie generală
31
2.3. VIRUSURILE
1. Sunt considerate forme acelulare de viață fiind în afara
organismelor vii, lipsite de capacitatea de creștere și multiplicare. Ele sunt replicate (multiplicate) de celula gazdă pe care o parazitează.
2. Sunt lipsite de aparat enzimatic și metabolism propriu fiind obligator, parazite a celulelor animale, vegetale sau bacteriene.
3. Au o structură simplă, formate din genomul viral și un înveliș protector care se numește capsidă.
4. Genomul viral conține un singur acid nucleic ADN sau ARN și niciodată ambii acizi.
5. Virusurile care conțin ARN pot depozita și transmite informația genetică, caz unic în biologie, rolul de purtător al informației genetice fiind ADN, pentru restul viețuitoarelor.
6. În natură virusurile se găsesc sub trei forme biologice: - virus complet sau virion, dotat cu infecțiozitate și
capabil de a supraviețui un timp limitat în afara celulei gazdă;
- virus vegetativ prezent numai în celula parazitată și neinfecțios;
- virus integrat (provirus) integrat în genomul celulei gazdă unde rămâne un timp nelimitat replicându-se odată cu acesta. În esență virusurile sunt sisteme bioide care se comportă ca ființe vii în interiorul celulei parazitate și ca o substanță organică complexă în afara acesteia.
2.4. BACTERIILE
1. Sunt microorganisme unicelulare de tip procariot caracterizate prin absența structurilor intracelulare delimitate prin membrane, spre deosebire de tipul
Virusologie generală
32
eucariot la care nucleul și unele organite intracelulare, posedă membrane proprii.
2. Materialul genetic sau genomul bacterian este reprezentat de un cromozom, format dintr-o moleculă mare de ADN și unități ereditare extracromozomiale numite plasmide, constituite din molecule circulare de ADN mult mai mic (aproximativ 1%) din mărimea cromozomului. Bacteriile sunt lipsite de mitocondrii, aparat Golgi și reticul endoplasmatic.
3. Bacteriile au un aparat enzimatic și o activitate metabolică proprie iar nutriția este de tip absorbtiv. Sub aspectul asigurării energiei necesare proceselor nutritive, nutriția poate fi de tip chimiotrof, când energia rezultă din reacțiile chimice și de tip fototrof prin prezența unor pigmenți fotosintetizanți care permit utilizarea energiei solare.
4. Bacteriile se multiplică prin diviziune simplă binară (sciziparitate) și pot avea pe suprafața celulei bacteriene cili sau flageli ca organite de mișcare și pili sau fimbrii pentru aderență.
5. Unele specii bacteriene pot exista în natură sub două forme biologice:
- forma sporulată care este o formă de rezistență și de conservare a speciei;
- forma vegetativă care reprezintă celula bacteriană propriu-zisă.
2.5. MICEȚII (fungii, ciupercile)
1. Sunt organisme eucariote situate la granița dintre bacterii și organismele vegetale.
2. Ciupercile microscopice au aparat Golgi și reticul endoplasmatic.
3. Au echipament enzimatic complex, iar nutriția este de tip absorbtiv, chimiotrof.
4. Reproducerea la ciupercile microscopice este foarte diferențiată, putându-se realiza prin diviziune directă
Virusologie generală
33
prin creșterea în lungime a unor structuri plasmoidale și prin spor (sexuat sau asexuat).
Principalele caractere comparative sau diferențiale între cele cinci grupe de microorganisme care constituie obiectul de studiu al microbiologiei sunt redate în tabelul 1.
Virusologie generală
Tabelul 1
Principalele caractere diferențiale între micoroorganisme NR.
4. Echipamentul enzimatic și activitatea metabolică
proprie
Absente
Absente
Absente
Prezente
Prezente
5. Capacitatea de creștere Absentă Absentă Absentă Prezentă Prezentă 6. Modul de reproducere Sinteză amplificată
prin conversie Sunt sintetizați de celula gazdă
Sunt sintetizate de celula gazdă
Independent, mai des prin sciziparitate
Independent, prin forme variate asexuate sau sexuate
7. Capacitate de diferențiere Nu este cazul Nu este cazul Nu este cazul Absentă Absentă 8. Parazitism absolut Constant obligat Constant obligat Constant obligat Absent Absent 9. Forme biologice de
Miceliu sau pseudomiceliu -spor (forma de reproducere)
10. Poziția pe scara filogenetică
La granița dintre viu și neviu
Idem Idem Microorganisme vii cu organizare procariotă
Microorganisme vii cu organizare eucariotă
Virusologie generală
35
V I R U S O L O G I E G E N E R A L Ă
3.1. IPOTEZE PRIVIND ORIGINEA VIRUSURILOR
Momentul apariției și modul de formare al virusurilor pe pământ nu poate fi stabilit, datorită lipsei dovezilor paleontologice. Ipotezele emise cu privire la această problemă sunt următoarele:
a) Ipoteza formării virusurilor dintr-un “protovirus” preistoric, apărut ca primă manifestare de evoluție și organizare a materiei de la neviu către viu, susținută de biologii sovietici Oparin, Svet-Moldavski, Jdanov și alții; aceste forme primare precelulare de viață nu s-au mai putut dezvolta și evolua, fapt care le-a obligat să se adapteze unui parazitism obligatoriu și absolut. Verosimilitatea acestei ipoteze este diminuată de faptul că protovirusul ancestral ar fi trebuit totuși să se multiplice inițial pe seama substanțelor organice din oceanul primitiv într-un timp lung, ceea ce pare prea departe și diferit de caracteristicile virusurilor actuale, care se multiplică exclusiv în celulă și în timp scurt.
b) Ipoteza provenienței virusurilor din microorganisme cu o organizare mai complexă, capabile de o viață independentă, care au regresat și s-au simplificat în urma adaptării lor la parazitism, susținută de Green, Laidlaw, Boivin și alții; inerția metabolică a virusurilor se datorește, conform acestei ipoteze, pierderii în filogeneză a
Virusologie generală
36
echipamentului enzimatic și a capacității de biosinteză. Această ipoteză are un grad mai mare de veridicitate prin faptul că regresii de la saprofitism către un parazitism obligat intracelular, însoțite de simplificări structurale și biologice, au fost constatate și la unele bacterii actuale. Cu toate acestea, treptele intermediare ale involuției de la structura celulară către cea de particulă virală sunt greu de imaginat.
c) Ipoteza originii endogene a virusurilor, susținută de Bedson și Waterson, admite formarea virusurilor din fragmente de material genetic, desprinse din cromozomul celular, care au devenit cu timpul autonome, autoreplicându-se independent și devenind capabile de a pătrunde în celule noi. Treptat, genomurile devenind autonome au dobândit și capacitatea de a codifica în celulă sinteza unor învelișuri proteice, care să le protejeze, asigurându-le astfel posibilitatea unei existențe tranzitorii extracelulare. Argumentele favorabile acestei ipoteze constau în:
- posibilitatea reproducerii infecției cu acizi nucleici purificați;
- caracteristicile virusurilor integrate; - existența în celula bacteriană a plasmidelor,
ca unități genetice autoreplicante, independente de cromozom;
- posibilitatea trecerii unora dintre plasmide în forme epizomale mult asemănătoare cu genomurile virale integrate.
Aceste ipoteze își mențin o valabilitate teoretică fiindcă chiar dacă s-ar ajunge la confirmarea experimentală a vreuneia din ele, acestea n-ar fi încă o dovadă de netăgăduit că cu miliarde de ani în urmă fenomenele s-ar fi petrecut la fel. Nu se poate exclude nici posibilitatea ca pentru diferite grupe de virusuri să fie valabile și ipoteze diferite. Astfel, n-ar fi exclus ca virusurile mari și complexe să provină din involuția unor bacterii, iar virusurile cele mai mici și mai simple să aibe o origine endogenă.
Virusologie generală
37
Nici una din ipotezele menționate nu oferă însă nici măcar o sumară încercare de explicație a originii virusurilor ARN. Proprietățile și modul lor de dezvoltare nu au nici un corespondent în natură. De aceea, se impune admiterea unei origini aparte pentru aceste virusuri. Apariția lor a fost foarte probabil condiționată de o modalitate în care ARN (probabil ARNm) a putut deveni independent de ADN și autoreplicant, dobândind capacitatea de a codifica și chiar de a transcrie invers.
3.2. TEORII PRIVIND NATURA VIRUSURILOR
În ultimii ani, există în literatură o controversă teoretică asupra poziției virusurilor în raport cu conceptele de viu și neviu. Această dispută este complicată de lipsa unei unanimități asupra celor două concepte.
Încercări mai recente de stabilire a însușirilor esențiale, caracteristice sistemelor vii, aparținând unor biologi de mare renume, sunt:
Luria consideră ca indispensabile în definirea vieții următoarele proprietăți: capacitatea de a produce un anumit tip de organizare, specific, independent, autoreplicant. Prin aceste însușiri, structurile vii sunt caracterizate printr-o configurație specifică, care se păstrează după izolarea lor, capacitatea de reintegrare în circuitul lumii vii și proprietatea de a se transforma prin recombinări genetice.
Lwoff aceptă următoarele însușiri ca definitorii pentru organismele vii: structura celulară ca unitate minimă de integrare, cooperare și reproducere a unui asamblu de constituienți moleculari și continuitatea genetică.
Jacob susține caracterul integrativ al sistemelor de organizare ca primordial pentru un sistem viu, iar celula bacteriană un minimum vital sub al cărui nivel de organizare nu poate fi vorba de viață.
Monod atribuie sistemelor vii patru proprietăți esențiale:
- morfogeneza autonomă;
Virusologie generală
38
- reproducerea invariantă - capacitatea de a reproduce și transmite de la o generație la alta informația genetică corespunzând structurii proprii;
- emergența – capacitatea de a reproduce și multiplica structuri ordonate cu grad înalt de complexitate și de a creea evolutiv structuri de complexitate creascândă;
- teleonomia – proprietatea de a avea a structură și organizare definită capabilă de a asigura supraviețuirea individului și a speicei.
Szent-György recunoaște ca însușiri de bază ale sistemelor vii un grad înalt de organizare al moleculelor în sisteme ierarhizate la niveluri diferite, fiecare dintre ele fiind corelat și reacționând cu toate celelalte și cu ansamblul lor, la rândul lor corelat și reacționând cu fiecare dintre ele.
Amplasarea virusurilor între sistemele vii sau în cadrul materiei organice vii, depinde de punctul de vedere acceptat pentru definiția viului.
Admițând părerea lui Luria, virusurile întrunesc condițiile sistemelor vii; dacă se iau în considerare celelalte teorii citate, care leagă conceptul de viu de un număr mai mare de criterii, virusurile trebuie privite ca structuri organice complexe nevii.
Iftimovici (1978) adaugă criteriilor care pledează prntru includerea virusurilor în lumea vie, funcția lor antientropică (tendința de a se opune dezorganizării diferitelor structuri din nautră și uniformizării stărilor energetice). Totodată, susține părerea că viața ca fenomen a precedat apariția primului organism. Virusurile sunt privite ca biostructuri ancestrale, care realizează unitatea acizi nucleici-proteine într-o formă precelulară, reprezentând un prim pas spre viață.
Discuția asupra naturii vii sau nevii a virusurilor are un caracter teoretic speculativ, care permite o polemică la infinit, fără a se putea statua care din cele două puncte de vedere este mai valabil. Realitatea atestă faptul că virusurile au atât însușiri caracteristice sistemelor vii – continuitatea genetică, infecțiozitatea, funcția antientropică- cât și a materiei nevii – numărul fix de molecule, inerția metabolică, incapacitatea de reproducere prin mijloace proprii. De aceea, cea mai corectă poziție în problema naturii virusurilor este acceptarea lor ca
Virusologie generală
39
entități cu totul originale, constituind un unicat în natură, situate la granița între sistemele nevii și cele vii, între forma chimică și cea biologică, de mișcare a materiei, indiferent dacă apariția lor pe pământ a precedat organismele indiscutabil vii, sau dacă a fost mai târzie. Încercările de a decreta definitiv virusurile ca vii sau nevii nu pot avea decât un caracter forțat. Lwoff precizează cel mai bine acest punct de vedere: Categoria de virus este definită printr-un ansamblu de caractere originale. Aceste caractere permit distingerea virusurilor de nonvirusuri. Ele sunt acelea care conferă lumii virusurilor personalitate și realitate”, iar cu alt prilej, același eminent virusolog afirma, sub forma unei butade: “virusurile trebuie considerate ca virusuri, fiindcă virusurile sunt virusuri”.
3.3. FORMELE DE EXISTENȚĂ A VIRUSURILOR ÎN NATURĂ
Virusurile sunt entități etiologice cu o structură acelulară sau subcelulară, constituite dintr-un număr fix de molecule, lipsite de capacitate de creștere, metabolic inerte, care pot exista în natură sub trei forme biologice, fiecare din ele reprezentând în același timp câte o etapă distinctă din circuitul lor în natură. Aceste forme sunt:
Virusul complet, numit și virusul matur sau particulă virală, care posedă toate componentele structurale caracteristice virusului respectiv. El este capabil de o existență pe timp limitat în afara celulei sensibile și are ca principală însușire infecțiozitatea – posibilitatea de a pătrunde sau de a inocula acidul nucleic viral într-o celulă gazdă, receptivă, capabilă de a-l sintetiza.
Virusul vegetativ, care prezintă forma de viață intracelulară a virusului. În această stare virusul este lipsit de o structură proprie, materialul viral fiind dispersat în celula gazdă, inseparabil de conținutul celular. Conform informației genetice conținute în acidul nucleic viral, celula cu aparatul ei enzimatic sintetizează componentele virale. În interiorul
Virusologie generală
40
celulei virusul vegetativ se transformă, în final, din nou în virusul complet prin asamblarea componentelor virale. Virionii rezultați din procesele intracelulare de biosinteză sunt eliberați din celulă. După eliberarea lor, virionii, pătrunzând într-o nouă celulă gazdă, reiau circuitul care asigură conservarea virusurilor în natură. În faza de virus vegetativ, dependența virusului de celulă este totală, el fiind incapabil de a supraviețui în afara acesteia.
Virusul integrat sau provirusul, care este tot o formă intracelulară total dependentă de celula gazdă, ca și virusul vegetativ, cu deosebirea că sub această formă celula nu sintetizează material viral. Acidul nucleic viral se fixează în genomul celulei sensibile, unde se comportă ca un fragment de material genetic, propriu celulei. Această formă de existență este mai cunoscută la virusurile bacteriofagice și la virusurile tumorale. Genomul viral, ancorat în cromozomul celulei gazdă, conferă acesteia noi însușiri determinate de informația genetică pe care o conține. Virusul se comportă ca un component normal al celulei gazdă. El poate rămâne sub această formă un timp nedefinit. Virusul integrat se poate transforma în virus vegetativ, de obicei sub acțiunea unor factori stresanți pentru celulă, în care caz genomul viral se desprinde din cromozomul celulei și începe să codifice sinteză de material viral, trecând în forma de virus vegetativ.
Descrierea virusurilor, în continuare, se referă la forma de virus complet sau virion, întrucât aceasta este singura în care virusul are o structură proprie, celelalte două forme fiind indisolubil legate de celula gazdă.
Virusologie generală
41
3.4. CONSTANTELE VIRIONULUI
3.4.1.Forma
Virionii pot avea forme variate. La examenul cu un microscop electronic cu o mică putere de rezoluție, se pot distinge 3 tipuri principale de forme:
- alungită, - corpusculară, - spermatozoidică.
La examenul electronooptic, la un aparat cu mare putere de rezoluție, care permite observarea tuturor detaliilor ultrastructurale, virionii se pot înfățișa într-o gamă mai variată de forme, ca de exemplu:
pentru aceeași formă: cireașă cu coadă, ac cu gămălie mare, mormoloc).
Determinant pentru forma virionului la majoritatea virusurilor este tipul de simetrie al capsidei, iar la unele virusuri prezența învelișului pericapsidal.
3.4.2.Dimensiunile
Dimensiunile virusurilor variază între limite cuprinse între 8-10 nm(x) până la 300-350 nm. Virusurile cele mai mici, ca de exemplu Picorna și Parvovirusurile se aproprie de dimensiunile unor macromolecule organice, în timp ce virusurile cele mai mari, ca de exemplu Poxvirusurile, au dimensiuni identice cu cele mai mici bacterii. Volumul virusurilor reprezentative ale celor două extreme este de 0,00001 microni3 pentru virusul poliomielitei (un Picornavirus) și de 0,01 microni3 pentru Poxvirus. În următoarea figură (fig.
Virusologie generală
42
3) sunt redate schematic forma și raporturile dimensionale ale principalelor grupe (familii) de virusuri în comparație cu o celulă bacteriană de Escherichia coli.
Fig. 3 Reprezentarea schematică a formelor și dimensiunilor comparative ale principalelor grupe (familii) de virusuri în
Virionul este constituit dintr-un înveliș și un conținut. La toate virusurile învelișul este format din unități proteice, numite capsomere, așezate după un tip de simetrie bine definit, constituind în ansamblul lor pericapsida virală. La unele virusuri, exterior capsidei, se găsește un al doilea strat al învelișului, numit pericapsidă (anvelopă, peplos). Din punct de vedere al prezenței învelișului pericapsidal, virusurile se
Virusologie generală
43
împart în două categorii: nude și învelite în peplos. (fig. 10) Conținutul virionului este un genom format dintr-un singur tip de acid nucleic, fie ADN, fie ARN. Nici un virus nu conține ambii acizi nucleici. Unitatea constituită din genom + capsidă poartă și numele de nucleocapsidă.
3.5.1.Capsida virală
Termenul de capsidă derivă de la cuvântul grecesc “kapsa” = cutie. El desemnează învelișul extern al virionului, prezentat în forma sa cea mai simplă de un strat unic de unități identice, numitte capsomere (“meros” = parte), așezate în mod regulat după un tip de simetrie bine definit. Puține virusuri au capsida constituită din două sau mai multe straturi concentrice. Compoziția chimică a capsidei este exclusiv proteică. Proteinele constituente ale capsidei sunt antigenice, fiind responsabile pentru structura antigenică specifică fiecărui virus. La majoritatea virusurilor, cu excepția virusurilor helicoidale prevăzute cu înveliș pericapsidal, capsida este determinantă pentru forma virionului. Rolul capsidei este de a proteja genomul viral de acțiunea factorilor de mediu. La adăpostul capsidei, acidul nucleic viral este vehiculat de la o gazdă receptivă la alta. Cu toate că în condiții experimentale au putut fi reproduse numeroase infecții virale numai cu acizii nucleici ai virusurilor respective, nu s-a semnalat încă un fenomen similar în condiții naturale, protecția capsidei fiind indispensabilă conservării și circuitului virusurilor în natură. Subunitățile componente ale capsidei, capsomerele, sunt formate din una sau mai multe molecule proteice, constituite la rândul lor din lanțuri polipeptidice. În funcție de numărul moleculelor din care sunt formate, capsomerele pot fi de două feluri:
- monomere, constituite dintr-o singură moleculă proteică, având o masă moleculară în jurul a 20.000 - 30.000 daltoni; ele sunt caracteristice pentru virusurile de formă alungită, iar asamblarea lor în arhitectura capsidei este după tipul de simetrie helicoidal;
Virusologie generală
44
- oligomere, constituite din mai multe monomere, dispuse circular, formând un inel sau buton; oligomerele sunt aranjate în cadrul capsidei după tipul de simetrie icozaedral sau cubic. În funcție de numărul monomerelor componente, oligomerele sunt de două feluri:
- hexamere sau hexoni, formate din șase monomere; ele alcătuiesc fețele triunghiulare și laturile (muchiile) capsidelor icozaedrale;
- pentamere sau pentoni, formate din cinci monomere; ele sunt așezate la colțurile (vârfurile) capsidelor icozaedrale.
În figura 4 este redată schematic structura tipurilor de capsomere.
Fig. 4 Schema tipurilor structurale de capsomere: 1 și 2 = lanțuri peptidice; 3 = monomeră; 4 și 5 = oligomere; 4 = hexameră
(hexon); 5 = pentameră (penton). Literele reprezintă simbolic grupurile chimice de legătură între monomerele
constituiente ale oligomerelor, care sunt de același tip (A-a și B-b).
Numărul capsomerelor este constant pentru un virus, mai ales la virusurile icozaedrale. Simetria capsomerelor poate fi de trei feluri:icozaedrală sau cubică,helicoidală,binară sau dublă.
Virusologie generală
45
3.5.1.1.Capsida helicoidală Capsida helicoidală (helicală) are forma unui tub
cilindric. Unitățile ei structurale sunt molecule identice de formă ovoidă sau puțin alungită (fig. 5).
Aranjamentul lor este în formă de spirală helicoidală regulată, asemănătoare cu al unui resort în stare comprimată. Spirala capsomerelor delimitează pe fața internă a tubului un șanț în care este așezat, tot helicoidal, într-un perfect paralelism cu capsida, genomul (acidul nucleic) viral. Extremitățile interne ale capsomerelor nu se ating, fiind despărțite de fragmentul de acid nucleic care se interpune. Numărul capsomerelor variază în funcție de lungimea virionului. Capsidele helicoidale pot fi de două feluri: rigide și flexibile.
Capsida rigidă este de regulă caracteristică virusurilor fitopatogene. Un exemplu de virus care poate fi considerat de referință, fiind studiat în cele mai mici detalii, este virusul mozaicului tutunului. El se prezintă sub forma unui bastonaș rigid de 300 nm lungime, 17 nm lățime, cu un diametru interior de 4 nm. Genomul lui este constituit dintr-un filament de ARN, lung de 2 microni, având masa moleculară de 2 x 106 daltoni, așezat în șanțul delimitat de o spirală helicoidală formată din 130 capsomere. Fiecare capsomeră este o moleculă proteică, compusă din 158 de aminoacizi. Fiecare tur de spiră însumează de 16
Fig.5 Schema structurii
capsidei helicoidale a
virusului mozaicului
tutunului
Virusologie generală
46
1/3 capsomere, iar adiacent unei capsomere se găsesc trei nucleotide din lanțul de ARN.
Capsida flexibilă se întâlnește la unele virusuri zoopatogene. Forma ei este tot tubulară, dar se poate plia sub forma unui ghem. În aceasta stare se dispun nucleocapsidele helicoidale la interiorul învelișului pericapsidal, care are o formă aproximativ sferică. Exemple de virusuri pentru care este caracteristică o astfel de structură sunt Orthomyxovirusurile, din care fac parte virusurile influențelor și Paramyxovirusurile în care se încadrează virusul pesudopestei aviare. Ele au o formă sferică, cu un diametru de 80-120 nm. La interiorul unei pericapside groase de 8-10 nm se găsește nucleocapsida helicoidală, de lungimi variabile, cu diametrul transversal de 9-10 nm.
În figura 6 este redată schematic organizarea virionului unui virus gripal.
La Myxovirusuri nu există o corelație între forma globală a virionului (sfeerică) și cea a nucleocapsidei (alungită, filamentoasă). Determinată pentru tipul de simetrie al oricărui virus este însă nucleocapsida.
3.5.1.2.Capsida icozaedrală Capsida icozaedrală (izometrică, cu simetrie cubică) rezultă din asamblarea într-o formă geometrică regulată a unui
Fig. 6 Schema organiz\rii unui virus gripal. Nucleocapsida
helicoidal\ se g\se[te pliat\ sub form\ de ghem la interiorul pericapsidei.
Virusologie generală
47
număr fix de hexa și pentamere, care alternează după un plan de organizare foarte precis. Icozaedrul este un poliedru constituit din 20 de fețe, fiecare având forma unui triunghi echilateral. Ca orice structură geometrică regulată, el are trei tipuri de axe de simetrie (p), schematizate în figura 7.
O rotație 2 /p în jurul exei aduce structura respectivă într-o poziție identică cu cea inițială. Icozaedrul are: 12 vârfuri (unghiuri sau colțuri) și 6 axe de simetrie de tip 5, care traversează fiecare 2 unghiuri opuse; 20 de fețe și 10 axe de simetrie de tip 3, care trec prin punctele
centrale a 2 fețe triunghiulare opuse; 30 laturi și 15 axe de simetrie de tip 2, care unesc 2 laturi opuse exact la jumătatea acestora. Succesiunea capsomerelor în structura capsidei icozaedrale este următoarea: fețele și laturile sunt formate din hexamere, iar colțurile sau vârfurile din pentamere (fig. 8).
Alternanța suprafețelor hexagonale cu cele pentagonale într-o anumită succesiune în structura unei figuri geometrice care poate fi înscrisă într-o sferă este o condiție obligatorie pentru stabilirea acestei structuri. În domeniul arhitecturii, această regulă s-a confirmat prin construcția domului geodezic de către Fuller și, mai recent, a pavilionului american de la expoziția universală de la Montreal în 1967 (după Zarnea, 1974). Klug și Caspar (1962) explică primii structura capsidelor virale icozaedrale pe baza îndeplinirii aceluiași deziderat. În figura 9 este schematizată o secvență de fețe pentagonale și hexagonale în succesiunea lor caracteristică capsidelor icozaedrale.
Fig. 7 Tipurile de axe de simetrie ale icozaedrului: a. tipul 2; b. tipul 3; c. tipul 5.
Virusologie generală
48
Fig. 8 Modul de asamblare al capsomerelor într-o capsidă icozaedrală (după Davis și col., 1967). Modelul din schemă este constituit din 42 capsomere, din care 30 sunt hexamere și 12 pentamere. Numărul din centrul capsomerelor indică numărul monomerelor componente, iar literele (A, B, C, și D) simbolizează grupări chimice care leagă unitățile proteice între ele. Tipul legăturilor între monomerele unui oligomer (A, D) este diferit de cel care leagă oligomerele între ele (B, C).
Numărul total de capsomere (N) al unui virion icozaedral este dat de formula:
Fig. 9 Alternanța suprafețelor hexagonale și
pentagonale, analoage celei a hexamerelor și
pentamerelor din structura capsidelor
icozaedrale. O hexameră este încadrată de două
pentamere și patru hexamere așezate simteric
(după Lwoff)
Virusologie generală
49
N = 10 (n - 1)2 + 2 în care n este egal cu numărul de capsomere al unei laturi. În tabelul nr. 1 este redat numărul capsomerelor obținute pe baza acestei formule la 4 grupe de virusuri. În cazul unor virusuri foarte mici, ca de exemplu virusul poliomielitei în care n = 2 (o față triunghiulară este formată din laturi a câte 2 capsomere care încadrează o capsomeră centrală), formula se modifică, devenind:
N = 30 (n – 1)2 + 2 Capsida icozaedrală este forma cea mai economică de organizare arhitectonică a unor unități proteice identice prin care se asigură învelișul protector genomului viral.
Tabelul nr. 2 Numărul capsomerelor la 4 grupe de virusuri.
(după Hannoun, 1976)
Grupa n N
Bacteriofag mic 2 12
Reovirus 4 92
Herpesvirus 162
Adenovirus 252
Două virusuri având masele moleculare ale virionilor egale, dar cu tipuri diferite de simetrie a capsidelor, unul helicoidal și altul icozaedral, diferă sensibil și în ce privește numărul capsomerelor. Astfel, virusul mozaicului tutunului cu capsida helicoidală este format din 2180 molecule, în timp ce virusul mozaicului galben al napului, cu aceeași masă moleculară, dar cu capsida icozaedrală, este alcătuit din numai 180 molecule (după Zarnea G., 1974).
3.5.1.3.Capsida cu simetrie binară Capsida cu simetrie binară sau dublă este caracteristică bacteriofagilor cu cap și coadă. Capsida capului este de tip icozaedral, în timp ce capsida cozii este organizată după tipul de simetrie helicoidal. Ea va fi descrisă mai amănunțit la virusurile bacteriofagice.
3.5.2. Pericapsida (anvelopa, peplosul)
Virusologie generală
50
Pericapsida, pentru desemnarea căreia se folosesc la fel de frecvent și termenii de anvelopă sau peplos (manta în limba greacă), este un înveliș suplimentar, întâlnit numai la unele virusuri, așezat exterior capsidei. În funcție de prezența sau absența pericapsidei, corelată cu tipul de simetrie al pericapsidei, virionii sunt de 4 feluri (fig. 10):
- virion helicoidal nud, - virion icozaedral nud, - virion helicoidal învelit de pericapsidă, - virion icozaedral învelit de pericapsidă.
Virionii înveliți de pericapsidă au totdeauna o formă globuloasă, aproximativ sferică, indiferent de tipul de simetrie al nucleocapsidei (virionii helicoidali sunt pliați în interiorul pericapsidei sub frorma unui ghem).
Grosimea pericapsidei este în jur de 100-150 Å. Analog capsidei, ea este constituită din unități structurale numite peplomere (“peplos” = manta). Peplomerele sunt însă puțin conturate electronooptic, comparativ cu capsomerele și nu sunt aranjate după un tip precis de simetrie. Comparativ cu capsida, pericapsida este o formă mai puțin regulată, este mai puțin rigidă, având un anumit grad de flexibilitate și elasticitate. Pe suprafața pericapsidei se găsesc de obicei protuberanțe sub forma unor spiculi sau antene, de
Fig. 10 Prezentarea schematică a clasificării virusurilor în funcție de prezența sau absența pericapsidei corelată cu simetria nucleocapsidei. :1.capsidă; 2.pricapsidă; 3.genom viral; 4.virion helicoidal nud; 5.virion icozaedral nud; 6. virion helicoidal învelit de pericapsidă și 7.virion icozaedral învelit de pericapsidă.
Virusologie generală
51
aproximativ 100 Å lungime. Ele sunt așezate la distanțe de 70-80 Å una de alta. Compoziția chimică a pericapsidei, predominant proteică, este caracterizată și prin prezența altor compuși organici –glucide, dar mai ales lipide, care împreună cu proteinele formează complexe glico- sau lipidoproteice. Lipidele, compușii chimici ai pericapsidei, concură și ei la determinarea structurii antigenice a virusului. Originea componentelor pericapsidei poate fi proprie sau derivată din membrana celulei gazdă în care a fost sintetizat virionul. Partea proprie este numită și homeopeplos, iar cea provenită din componenții celulei gazdă heteropeplos.Acestea sunt considerate ca făcând parte din cadrul proprietăților virusurilor caracterizate ca induse de celula gazdă. Constituirea heteropeplosului are loc cu prilejul eliberării virionilor nou formați din celulă prin procesul de înmugurire (burjeonare).(Fig.21) Rol: pericapsida concură, împreună cu capsida, la protejarea genomului viral la factorii de mediu și asigură fixarea virionului pe celula gazdă. Prezența ei conferă însă virusurilor anumite însușiri, absente la virusurile nude. Acestea sunt: sensibilitatea la eter și cloroform, datorată componentelor lipidice din structura peplomerelor, capacitatea de absorbție pe diferite substraturi celulare și activitatea hemaglutinantă de care sunt responsabili spiculii (antenele) de pe suprafața capsidei, numiți de aceea hemaglutinine. La Myxovirusuri, pericapsida conține enzime, numite neuraminidaze, care înlesnesc pătrunderea virusului în celula sensibilă.
3.5.3. Genomul viral Genomul viral este reprezentat de acidul nucleic viral. Următoarele însușiri ale acidului nucleic trebuie considerate esențiale pentru caracterizarea unui virus: tipul de acid nucleic, structura, masa moleculară în strânsă relație cu capacitatea de codificare, proporția de acid nucleic raportat la masa virionului, compoziția în baze azotate, configurația și modul de dispunere în interiorul capsidei. Tipul de acid nucleic poate fi ARN sau ADN.
Virusologie generală
52
În funcție de natura acidului nucleic, virusurile se împart în ribovirusuri cu ARN și dezoxiribovirusuri cu ADN. La virusurile fitopatogene acidul nucleic este totdeauna ARN, în timp ce la virusurile zoopatogene și bacteriofagice, poate fi unul sau celălalt.
Structura acidului nucleic poate fi în funcție de numărul lanțurilor din care este constituită molecula –monocatenară sau dublucatenară.
Ca regulă generală, dezoxiribovirusurile au ADN dublu catenar, cu excepția parvovirusurilor și a fagului X 174, al căror ADN este monocatenar. Ribovirusurile au ARN monocatenar, cu excepția reovirusurilor, al căror ARN este dublu catenar.
Masa moleculară a acidului nucleic este corelată cu mărimea și masa virionului. Masa moleculară este în funcție de lungimea lanțurilor și implicit de numărul nucleotidelor componente, care la rândul lor sunt determinante pentru informația genetică, respectiv capacitatea de codificare a genomului. Cel mai mic genom este acela al virusului necrozei tutunului, format dintr-o moleculă de ARN constituită din aproximativ 1.000 de nucleotide, capabil să codifice sinteza unui singur tip de proteină. Simplitatea genomului acestui virus îi determină defectivitatea, sinteza lui nefiind posibilă în celula vegetală decât în prezența unui virus helper al cărui genom conține circa 6.000 de nucleotide. Genomul celui mai mic virus ADN (virusul poliomei) are masa moleculară de 3 x 106 și este format din aproximativ 5.000 perechi de nucleotide.
Masa moleculară a ARN constituent al genomului virusului febrei aftoase, cel mai mic virus zoopatogen, este de 2,4 x 106 daltoni. Masa moleculară maximă a proteinelor a căror sinteză este capabil s-o codifice acest genom este de 240.000 daltoni.
Virusurile complexe, ca de exemplu colifagul T4 au și genomul mult mai complex. În cazul bacteriofagului amintit, genomul are în structura sa în jurul a 100 de gene ale căror responsabilități sunt bine cunoscute în procesul complex de biosinteză și morfogeneză al acestui virus.
Proporția acidului nucleic raportat la masa virionului este un raport adoptat de mai mulți ani de Comitetul Internațional de Clasificare și Nomenclatură a Virusurilor ca criteriu taxonomic.
Virusologie generală
53
Masa moleculară a genomului este, în general, mult mai mică, reprezentând 5-30% din masa totală a virionului. Astfel, în cazul virusului febrei aftoase, masa genomului este de 2,4 x 106 daltoni, în timp ce aceea a întregului virion este de 7,2 x 106. În tabelul nr. 3 sunt prezentate cele două constante la alte câteva virusuri. Compoziția genomului în baze azotate. În cazul majorității virusurilor, acizii nucleici virali nu diferă biochimic de restul acizilor nucleici prezenți în celula animală sau vegetală. Unii bacteriofagi au însă în compoziția genomului viral o bază azotată -5 hidroximetilcitozina -, inexistentă în compoziția acizilor nucleici ai celulei bacteriene, vegetale sau animale.
Configurația (topologia) acizilor nucleici poate fi de trei feluri (fig. 11):
- lineară, întâlnită mai ales la acizii nucleici monocatenari și o parte din cei bicatenari;
- ciclică simplă sau circulară ciclică evidențiată la ADN constituient al unor Papovavirusuri (virusurile poliomei și ale papilomatozelor);
- ciclică superrăsucită (supercoiled), evidențiată tot la virusurile poliomei; această topologie rezultă din
împletirea între ele a două lanțuri dublu catenare de ADN.
Fig.11 Configurația genomului virusului poliomielitei în funcție de viteza de ultra-centrifugare: 1 și 2 = ciclică suprarăsucită; 3= ciclică simplă circulară și 4 = lineară.
Virusologie generală
54
Genomul virusului poliomei se poate de altfel prezenta în oricare din cele trei tipuri de configurație, în funcție de viteza de turație la ultracentrifugare. La 20 S ADN se depune prezentând o configurație ciclică superrăsucită, la 16 S una ciclică simplă, iar la 14 S una lineară. Acest mod de comportare al genomului virusului poliomei a determinat emiterea ipotezei, deocamdată nedemonstrată, a caracterului general al configurației ciclice a genomurilor virale, linearitatea fiind considerată rezultatul unui artefact.
Genomurile constituite din mai multe fragmente legate între ele prin punți de hidrogen au fost evidențiate mai ales la unele virusuri ARN, dar cu același grad de incertitudine privind realitatea acestui mod de existență.
Dispunerea acidului nucleic în interiorul capsidei diferă în funcție de simetria acesteia. La virusurile helicale există un pararelism perfect între spirala helicală a capsomerelor și dispunerea helicală între șirurile de nucleotide a lanțului de acid nucleic. La virusurile icozaedrale, acidul nucleic este pliat sub forma unui ghem. La aceste virusuri nu există un paralelism în raporturile dintre capsidă și acidul nucleic viral.
Proprietățile anitigenice ale acizilor nucleici sunt slabe în comparație cu proteinele; de aceea, genomul viral are un rol minor în determinismul structurii antigenice a virusurilor, comparativ cu capsida și peplosul.
Genomul viral este componenta esențială a virusului, care poartă informația genetică necesară devierii metabolismului celulei gazdă, în sensul sintezei constituienților virali. Ribovirusurile reprezintă un unicat în biologie, în ce privește posibilitatea păstrării informației genetice de către ARN.
Virusologie generală
55
Tabelul nr. 3 Greutățile moleculare ale unor virusuri și ale genomurilor
lor. (după Zarnea G., 1970)
Virusul
Greutatea moleculară
Virion
Greutatea moleculară
Genom
Virusuri
ADN
Fag 174 6,2 x 106 1,7 x 106
Poliom 40 x 106 3,5 x 106 Adenovirus 177 x 106 23 x 106
Herpes ? 60 x 106
Fag coli T2 300 x 106 31 x 106
Vaccinal 2.000 x 106 150 x 106
Virusuri
ARN
Fag ARN ? 1,3 x 106
Virus nanism tomate
11 x 106 1,7 x 106
Virus mozaic tutun
40 x106 2,1, x 106
Poliovirus 6,8 x106 2,2 x 106
Influenzavirus 280 x 106 2 x 106
Virusul Rous și virus ajutător
107 ?
3.6. PARTICULARITĂȚILE STRUCTURALE ALE UNOR VIRUSURI ZOOPATOGENE
COMPLEXE
Unele virusuri zoopatogene se abat de la modelul clasic descris anterior prin structura mai complexă a învelișului particulei virale. Poxvirusurile au următoarele componente structurale de la interior spre exterior (fig 12):
genomul viral (inima sau sâmburele) sub forma unui disc biconcav, în formă de haltere pe secțiune, este constituit din ADN cu o masă moleculară de 150 x 106/particulă;
o membrană proteică netedă cu grosimea de 50 Å;
Virusologie generală
56
un strat compus din unități proteice de formă cilindrică, de 50 Å lățime și 100 Å înălțime, analoage capsomerelor;
doi corpi proteici numiți și corpi laterali, cu diametrul de 600-800 Å, situați în depresiunile rezultate din forma biconcavă a sâmburelui;
o membrană externă formată dintr-o împletitură de structuri tubulare, asemănătoare cu niște capside helicoidale goale.
Rhabdovirusurile, având ca reprezentant de referință virusul stomatittei veziculoase, au o formă de ghiulea și următoarele componente structurale de la interior spre exterior (fig. 13):
genomul viral, constituit din ARN monocatenar, dispus helicoidal, diametrul spiralelor este de 150-180 Å;
o capsidă constituită din capsomere, dispuse în dublu strat helicoidal, cu diametrul spiralelor externe de 500 Å;
o membrană proteică netedă;
Fig. 12 Diagrama structurii unui
Poxvirus: 1.inima (sâmburele); 2.membrana internă netedă; 3.membrana externă formată din capsomere cilindrice; 4.înveliș extern constituit dintr-o împletitură de structuri;
5.corp lateral.
Virusologie generală
57
un peplos format din peplomere de 100Å, asimetrice, având o formă comparabilă cu un buton, pară sau bec, regulat așezate, cu extremitatea mai îngustă atașată de membrana netedă.
3.7. PARTICULARITĂȚI STRUCTURALE ALE BACTERIOFAGILOR
Bacteriofagii (virusuri parazite pentru bacterii) au genomul constituit în majoritatea cazurilor din ADN și mai rar din ARN. Genomul viral este dispus în interiorul capsidei ca la virusurile icozaedrale. Capsida virală poate avea diferite forme și grade de complexitate structurală. Majoritatea bacteriofagilor, la examenul electronooptic, cu o putere de rezoluție mai mică, au aspect de spermatozoid, cireașă cu coadă, mormoloc), distingându-se ca părți componente ale virionului un cap și o coadă. Studiile de finețe din ultimii ani, au permis observarea mai multor tipuri morfologice. BRADLEY (1971) deosebește 6 tipuri morfologice principale (fig. 14):
- fagi cu coada lungă și contractilă, - fagi cu coada lungă necontractilă, - fagi cu coada scurtă,
Fig.13 Diagrama structurii unui Rhabdovirus:
1. peplomere 2. 2.și 3 nucleocapsidă dublu
helicoidală
Virusologie generală
58
- fagi fără coadă, cu capsomere mari la colțuri, - fagi fără coadă, numai cu capsomere mici, la
colțuri, - fagi filamentoși, fără cap.
Fagii cu coadă lungă și contractilă reprezintă tipul cel mai complex, al cărui reprezentant cunoscut și descris în cele mai fine detalii este colifagul T2 (fig. 15). Părțile lui structurale sunt următoarele:
Fig. 14 Tipuri structurale de bacteriofagi (după Bradley, 1971): 1.fagi cu coada contractilă; 2.fagi cu coada lungă necontractilă; 3.fagi cu
coada scurtă; 4.fag fără coadă, cu capsomere mari la colțuri; 5.fag fără coadă, cu capsomere mici la colțuri; 6.fag filamentos.
capul fagului, constituit dintr-un poliedru hexagonal, bipiramidal, cu o lungime de 950-1.050 Å și o masă moleculară de 8,5 x106, este format din:
- genomul viral reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenar, cu masa moleculară de 120 x 106, format din 200 perechi de nucleotide, având o lungime de 49 4 microni;
- capsida capului este un icozaedru alungit, format din două piramide de câte 5 fețe triunghiulare, între care se interpun două benzi ecuatoriale, constituite fiecare din 10 fețe triunghiulare;
Virusologie generală
59
- structura capsomerelor nu diferă de cea a virusurilor icozaedrale zoopatogene;
coada fagului, formată la rândul ei din: - sâmburele cozii sau cilindrul axial cu o
compoziție proteică și diametrul de 70 Å; - teaca cozii formată dintr-un cilindru cu o
lungime de 800 Å, în stare necontractată; diametrul tecii este de 160 Å, iar masa moleculară de 7,8 x106 - 12 x 106; structura tecii cozii este identică cu cea a capsidelor helicoidale; în timpul contracției, coada se scurtează cu 50% prin alunecarea una peste alta a spiralelor constituiente ale capsidei helicoidale a acesteia;
- gulerul fagului, interpus între cap și coadă, de forma unui disc hexagonal subțire cu diametrul de 306 Å;
- placa terminală este un disc hexagonal similar gulerului la extremitatea cozii;
- croșetele sunt în număr de 6, așezate la unghiurile plăcii terminale;
Fig. 15 Structura bacteriofagului T2:
A.fag cu coadă relaxată; B.fag cu coadă contractată; 1. capsida capului conținând genomul; 2. genomul (ADN dublu caternar) 3.capsida capului nidat de genom după inocularea acestuia în celula bacteriană sensibilă (fag fantomă); 4.gulerul; 5.coada relaxată; 6.coada contractată; 7.placa termi-nală; 8.croșete; 9.proteine fibrilare.10.cilindru axial
Virusologie generală
60
- fibrilele cozii sunt formațiuni filamentoase proteice, cu lungimea de 1.300 Å, diametrul de 20 Å și masa moleculară 400.000, formând o rețea în jurul tecii cozii.
Placa terminală, împreună cu croșetele și fibrele cozii, formează aparatul de fixare al bacteriofagului, la nivelul căruia se găsește enzima numită lizozim fagic, capabilă să permeabilizeze peretele celulei gazdă.
4. TROPISMUL VIRUSURILOR
Tropismul virusurilor constă în afinitatea acestora față de gazdă, țesut, celulă.
Genotropismul sau afinitatea pentru specia biologică pe care o parazitează permite împărțirea virusurilor, în funcție de numărul speciilor receptive în monopatogene și patogene pentru 2,3 sau mai multe specii (virusuri cu spectru larg); după apartenența de regn a speciilor receptive, se împart în zoopatogene, fitopatogene și bacteriofagi și micofagi.
Histotropismul sau afinitatea pentru anumite țesuturi, permite împărțirea virusurilor în următoarele categorii:
virusuri epiteliotrope (dermotrope), cu afinitate pentru celulele epiteliale ale pielii și mucoaselor; ex.: virusurile din grupa Pox, virusul febrei aftoase etc.
virusuri neurotrope, cu afinitate pentru celula nervoasă; ex.: virusul rabic, virusul poliomielitei, alte virusuri encefalitice;
virusuri organotrope (viscerotrope), cu afinitate pentru anumite organe interne; la rândul lor, acestea pot fi clasificate, după organul afectat, în:
virusuri mezenchimotrope (pantrope) cu afinitate pentru celula mezenchimală, indiferent de locul ei în organism; ex.: virusurile pestelor la diferite specii animale.
Histotropismul nu se manifestă totdeauna foarte strict, unul și același virus având posibilitatea ca în decursul infecției să se localizeze în țesuturi diferite. în astfel de situații, se ia în considerare tropismul pentru țesutul în care virusul se localizează în faza inițială și din partea căruia se produc simptomele și leziunile cele mai caracteristice ale bolii.
Citotropismul reprezintă afinitatea virusurilor pentru anumite tipuri de celule din cadrul aceluiași țesut. Ex.: virusul rabic este neurotrop, dar se multiplică de preferință în celulele piramidale de tip Betz din coarnele lui Ammon; virusul poliomielitei, tot neurotrop, are afinitate pentru neuronii motori din coarnele anterioare ale măduvei.
Tropismul virusurilor este determinat pe de o parte de complementaritățile de ordin stereochimic, electronostatic și geometric dintre învelișul particulei virale și membrana celulei gazdă, complementarități datorită cărora are loc fixarea (adsorbția) virusului pe celulă, iar pe de altă parte de capacitatea genomului viral de a substitui informația genetică a genomului celular și de a determina astfel biosinteza de material viral în locul compușilor specifici celulei.
5. MULTIPLICAREA VIRUSURILOR
Pentru virusuri, termenul de multiplicare nu reflectă de fapt realitatea fenomenelor care au loc în celula gazdă, în interiorul căreia virusurile nu se multiplică, ci sunt sintetizate de celulă prin activitatea metablică a acesteia, deviată de la normal în urma substituirii informației genetice a celulei cu cea a virusului. Ținând seama de faptul că nu s-a găsit un termen cu o semnificație semantică mai adecvată pentru reflectarea realității fenomenelor care au loc în cursul producerii de către celulă a materialului viral, se menține deocamdată în uz termenul de multiplicare.
Multiplicarea virusurilor implică patru etape principale:
Virusologie generală
62
1. adsorbția sau fixarea virionului pe celula gazdă; 2. pătrunderea în celulă a virionului (la virusurile
zoopatogene) sau numai a genomului viral (la virusurile bacteriofagice);
3. multiplicarea intracelulară propriu-zisă a virusului, în cadrul căreia se pot deosebi trei categorii de procese;
4. eliberarea virionilor nou formați din celulă. în desfășurarea acestor etape se constată unele
diferențe între virusurile zoopatogene și bacteriofagi, care se referă mai ales la primele două și la ultima, multiplicarea intracelulară propriu-zisă realizându-se în esență identic la toate categoriile de virusuri.
5.1. MULTIPLICAREA VIRUSURILOR ZOOPATOGENE
5.1.1. Adsorbția sau fixarea virionilor pe celulă
Prima etapă a multipicării virusurilor se caractrizează printr-un grad relativ redus de specificitate. Responsabilitatea fixării o poartă complimentaritățile de tip stereo, de natură chimică, electrostatică și geometrică dintre capsida sau pericapsida virionului și membrana celulei gazdă. Grupările chimice de pe suprafața membranei celulare, care intervin în determinismul afinității dintre celulă și virion, poartă numele de receptori. în general, receptorii acționează complementar prin grupările lor fosfat, față de grupările aminice ale capsidei virale. La unele virusuri, ca de exemplu virusurile gripale, au fost identificate cu precizie proteinele receptor de pe suprafața celulelor. Acestea sunt de natură glicoproteică, complementare neuraminidazei – enzima din pericapsida virusurilor gripale care din punct de vedere al activității ei biologice este o glucidază.
Virusologie generală
63
Datorită specificității relativ reduse a atracției dintre majoritatea virusurilor zoopatogene și celulele animale, fixarea virionilor este de cele mai multe ori precedată de un număr mai mic sau mai mare de ciocniri întâmplătoare dintre virus și celulă. De aceea, dintr-o multitudine de particule virale care pătrund în organism, un număr mult mai redus ajung să se fixeze și apoi să străbată învelișul celulei gazdă. Rata de fixare a fost stabilită în cazul unor virusuri zoopatogene, ca fiind de 3-5 x 109.
5.1.2.Pătrunderea virionilor în celulă
în cazul virusurilor zoopatogene, spre deosebire de bacteriofagi, virionul pătrunde în întregime în celula sensibilă printr-un proces activ, întrucâtva asemănător cu fenomenele de fagocitoză sau pinocitoză. Membrana celulară se invaginează și se adâncește progresiv în dreptul virionului, până când acesta este complet înglobat în celulă. Fenomenul poartă și numele de viropexie. După înglobare, marginile opuse ale membranei celulare invaginate fuzionează, restabilindu-se astfel integritatea suprafeței celulare. Virusul pătruns în celulă este inclus într-o vacuolă ai cărei pereți se dezintegrează treptat.
5.1.3.Decapsidarea
Decapsidarea este un proces specific numai virusurilor zoo- și fitopatogene, absent la bacteriofagii a căror capsidă nu pătrunde în celulă. Ea constă în liza capsidei sub acțiunea enzimelor de tip lizozomal, numite decapsidaze, produse de celula gazdă. Pentru desemnarea fenomenului de decapsidare mai sunt utilizați și termenii deproteinare sau dezbrăcare, acesta din urmă împrumutat din literatura engleză de specialitate (uncoating). Sinteza decapsidazelor este sub determinismul genetic al genomului viral.
La poxvirusuri s-a emis ipoteza că ADN viral, chiar înainte de decapsidare, este capabil să codifice și să transcrie pe ARNm o secvență responsabilă de sinteza decapsidazei. Această ipoteză își găsește confirmarea într-o experiență cunoscută sub numele de fenomenul Berry-Dedrick:
Virusologie generală
64
în celulele infectate cu un poxvirus A încălzit la 560C nu are loc sinteza materialului viral; același lucru este valabil și pentru o populație de celule infectate cu un virus B iradiat cu ultraviolete; în celulele infectate însă, simultan cu virusul încălzit A și virusul iradiat B, se constată sinteza de material viral. Explicația fenomenului este următoarea: virusul A, a
cărui ARN polimerază este inactivată, nu este decapsidat, în timp ce genomul virusului B decapsidat nu se poate replica datorită alterărilor produse de radiațiile ultraviolete; dacă cele două virusuri se amestecă, ARN polimeraza eliberată din virusul B nealterată cu ultraviolete va determina sinteza ARNm precoce, din care un segment este responsabil de sinteza decapsidazei; aceasta va decapsida virusul B care se va replica declanșând multiplicarea normală a virusului.
Momentul decapsidării diferă la diferitele grupe de virusuri. în cazul virusurilor picorna, el începe din momentul contactului cu membrana celulară. La altele, decapsidarea poate să nu aibe loc, fără ca aceasta să împiedice replicarea acidului nucleic și transcrierea informației genetice.
Cu privire la dinamica procesului decapsidării s-a putut stabili, în cazul adenovirusurilor, că ruperea capsidei are loc la nivelul pentamerelor constituiente ale colțurilor icozaedrului, care reprezintă punctele cele mai fragile ale acestuia.
O dată cu decapsidarea, virusul pierde infectivitatea în condiții naturale și trece din forma de virion în cea de virus vegetativ, dependența sa de celulă devenind totală.
în fig. 16 sunt redate schematic primele trei etape ale multiplicării virusurilor.
Virusologie generală
65
Fig. 16 Schema primelor trei etape ale multiplicării virusurilor: 1.fixarea virionului pe celula sensibilă; 2.pătrunderea virionului în celulă
(viropexia); 3.decapsidarea
5.1.4.Multiplicarea propriu-zisă
Multiplicarea prorpiu-zisă este un proces complex bazat
pe substituirea informației genetice a genomului celular cu cea a genomului viral. Acesta prin mecanisme care încă nu sunt pe deplin clarificate, scoate din funcție ADN celular în momentul copierii informației de pe ADN pe ARNm. în celulă va apare ARNm de o calitate nouă transcris de pe genomul viral care va transmite la nivelul ribozomilor un mesaj genetic nou, care va obliga celula ca în locul enzimelor și a celorlalte proteine proprii să sintetizeze material viral (fig. 17).
Parelel cu replicarea acidului nucleic viral, are loc inhibarea sintezei proteinelor celulare. în cazul mai multor virusuri ARN se constată încetinirea sintezei proteinelor celulare în proporție de 70-90% încă din prima oră de la pătrunderea virusului în celulă. Un alt fenomen caracteristic celulelor infectate cu virus constă în înlocuirea treptată a poliribozomilor celulari de tip 200 S cu poliribozomi virali de tip 350 S.
Virusologie generală
66
Fig. 17 Schema substituirii informației genetice a genomului
celular cu cea a genomului viral: 1.celula înaintea pătrunderii virusului; 2. în celulă a pătruns un virus care în urma decapsidării a eliberat genomul viral și 3.genomul viral a substituit genomul celular și a început să
se replice transcriind informația sa genetică pe ARNm.
Aceștia din urmă sunt incapabili să recepționeze
informația genetică de la ARNm celulari, recepționând informația genetică numai de la ARN virali.
în transmiterea informației genetice înscrise în programul viral se pot deosebi mecanisme diferite determinate de acidul nucleic, constituent al genomului viral (ADN sau ARN), structura acestuia (mono sau dublu catenară), capacitatea și modul de codificare al diferiților acizi ribonucleici și de unele particularități ale complexului virus-celulă. în funcție de acești factori au putut fi identificate până în prezent, la virusurile animalelor, mai multe scheme sau strategii de multiplicare. Indiferent de detaliile aschemei de multiplicare, aceasta implică totodeauna trei procese:
5.1.4.1.Replicarea genomului viral Acest proces are loc în mod diferit, în funcție de structura mono sau bicatenară a acidului nucleic, după cum urmează:
ADN dublu catenar prezent la majoritatea virusurilor ADN se replică semiconservativ, cele două catene despletindu-se după modelul clasic al fermoarului (literei Y). La Adenovirusuri s-a demonstrat că replicarea începe de regulă la
Virusologie generală
67
extremitatea catenei care este mai bogată în perechi de baze Adenină-Tinină.
ADN monocatenar caracteristic Parvovirusurilor își construiește sub acțiunea unei enzime (replicază) lanțul complementar, devine astfel ADN dublu catenar replicativ, după care se replică conform modelului menționat mai sus, caracteristic pentru ADN dublu catenar. Unele Parvovirusuri sunt defective, genomul fiind incapabil de replicare. Ele se multiplică numai cu ajutorul unui Adenovirus helper al cărui genom este ADN dublu catenar, din replicarea căruia rezultă și lanțurile necesare Parvovirusurilor adeno-asociate.
ARN monocaternar, care constituie genomul majorității virusurilor ARN, determină prin enzime (replicaze) sinteza de noi lanțuri de ARN prin două feluri (tipuri) de mecanisme de replicare:
Tipul semiconservativ, precedat de transformarea ARN monocatenar în bicatenar, prin sinteza unei catene complementare. Transformat în bicatenar, ARN devine replicativ și se replică după modelul semiconservativ clasic prin despletirea celor două catene în formă de fermoar sau litera Y. Cele două catene fiice sunt una + și alte – (fig. 18).
Fig. 18 Tipul semiconservativ de replicare a ARN: prin
acțiunea unei replicaze, ARN viral monocatenar devine dublu catenar și replicativ; din replicarea semiconservativă rezultă o catenă + și alta - .
Tipul asimetric, caracterizat prin replicarea de pe aceeași catenă paralelă, devenită matrice, a mai multor catene complementare; catenelor noi care se
Virusologie generală
68
formează treptat, pe măsura deplasării catenei parentale, rămân atașate câtva timp de aceasta. în acest fel se formează o moleculă mare, numită intermediar de replicare, ramificată în formă de brad, cu un număr de ramuri care variază de la 1 la 7 și sunt catene +. Formarea intermediarilor de replicare este totdeauna precedată de replicarea de tip semiconservativ (fig. 19).
Fig. 19 Tipul asimetric de replicare: după replicarea semiconservativă se formează, de pe o catenă matrice, mai multe catene
laterale rezultând o moleculă ramificată (intermediarul de replicare).
Indiferent de tipul de replicare, catenele + devin viitoare genmuri virale sau dirijează în continuare sinteza de material virla, în timp ce catenele - după ce și-au îndeplinit rolul de suport (matrice) pentru procesul de replicare, se dezagregă.
ARN bicatenar constiuie o excepție în cadrul virusurilor ARN, fiind prezent numai la Reovirusuri. în celulele infectate cu Reovirusuri au putut fi evidențiate trei categorii de ARN monocatenari: mari de 24 S, mijlocii de 18 S și mici de 14 S. Fiecare ARN monocatenar este o copie fidel transcrisă de pe un ARN bicatenar. în multiplicarea reovirusurilor intervin două feluri de enzime: una responsabilă de transcrierea ARN monocatenar de pe ARN bicatenar, iar a doua responsabilă de replicarea ARN bicatenar. Prima este o proteină virus specifică, fiind identificată în interiorul capsidei virionilor. Această enzimă este activată în cursul decapsidării. în nucleocapsida Reovirusurilor au fost identificate și lanțuri de ARN
Virusologie generală
69
monocatenar, reprezentând a 10-a parte din genom, dar rolul acestuia n-a putut fi stabilit.
în cursul replicării semiconservative a acidului nucleic viral se produce substituirea totală sau parțială a ADN din genomul celular, începând transcrierea informației genetice înscrise în genomul viral de ARN mesager, care urmează să transmită informația pentru sinteza constituienților virali la nivelul ribozomilor celulei gazdă. în acest fel se inițiază cel de al doilea proces esențial al multiplicării virusurilor – biosinteza de material viral. (Exemplificări în fig. 32,33)
5.1.4.2.Biosinteza materialului viral în biosinteza materialului viral se disting două faze. Studiul acestora la virusurile ARN a permis stabilirea următoarei dinamici de desfășurare și a următoarelor caracteristici pentru fiecare fază:
Faza exponențială de sinteză începe la 30 minute de la pătrunderea virusului în celulă și durează 2,5-3 ore; timpul de dublare a cantității de ARN din celulă este de aproximativ 15 minute;
Faza lineară de sinteză se caracterizează printr-un ritm constant de acumulare de ARN viral; în celulă se sintetizează în jur de 3.000 molecule de ARN pe minut, menținându-se în stare activă 500-800 de matrice. O moleculă de ARN se sintetizează în 50 secunde, ritmul de polimerizare al nucleotidelor fiind de 130 pe secundă. în această fază începe și se desfășoară cu o viteză crescândă morfogeneza noilor virioni prin încapsidarea genomurilor.
Bosinteza materialului viral decurge la diferitele grupe de virusuri după următoarea schemă: Virusurile ADN sunt sintetizate de celula gazdă în două faze:
Faza precoce: ADN viral determină, în cursul replicării, prin intermediul unei ARN polimeraze ADN dependente sinteza unui ARNm precoce. Originea ARN polimerazelor variază de la o grupă (familie) de virusuri la alta. La unele grupe de virusuri ARN polimeraza preexistă în interiorul
Virusologie generală
70
virionului, fiind o proteină virus specifică. Majoritatea virusurilor ADN codifică însă utilizând ARN polimeraze celulare. în virionul Poxvirusurilor, pe lângă ARN polimerază, se găsește și o dezoxiribonuclează și o nucleotidfosfohidrolază. Acestea intervin în biosinteza materialului viral ca enzime tardive. ARNm precoce codifică sinteza de genomuri virale progene și de proteine virale precoce, majoritatea de natură enzimatică. Genomurile progene au aceeași capacitate de codificare ca genomul viral parental. Proteinele precoce produc inhibarea replicării ADN, ARN și a proteinelor specifice celulei gazdă și catalizează sinteza unor precursori ai proteinelor virale structurale.
Faza tardivă. în momentul când în urma replicării ADN viral s-a ajuns la un anumit număr de genomuri virale patogene, este inhibată sinteza proteinelor precoce, declanșându-se prin intermediul unui ARNm tardiv sinteza proteinelor tardive, în marea lor majoritate proteine structurale, virus specifice, care urmează să fie asamblate în procesul de morfogeneză a noilor virioni.
Echipamentul enzimatic evidențiat în celulele în care are loc biosinteza virusurilor ADN este reprezentat cu precădere de enzime corelate cu metabolismul ADN. Astfel, în celule care multiplică un Herpesvirus au fost identificate următoarele enzime: timidinkinaza, timidinmonofosfatkinaza, deoxiguanozinmono-fosfatkinaza deoxiadenozinmonofosfatkinaza, ADN polimeraza și deoxiribonucleaza. Timpul în care decurg cele două etape ale biosintezei este în funcție de grupa (familia) de virusuri. La Adenovirusuri, faza precoce durează 6-8 ore, sinteza proteinelor tardive începând din a 8-a oră.
Virusurile ARN determină biosinteza metabolismului viral de către celula gazdă prin mecanisme variate, dar încadrabile în trei scheme (strategii) mai importante:
a) ARN viral îndeplinește direct rolul de ARNm precoce și poate transmite informația genetică direct la nivelul ribozomilor printr-un proces de substituire
Virusologie generală
71
directă sau scurtcircuitare a ARNmcelular; acest mecanism este caracteristic pentru Picornavirusuri.
b) ARN viral nu poate fi citit la nivelul ribozomilor celulei și nu poate deci transmite direct informația înscrisă în genomul viral. De aceea, prin intermediul unei ARNm polimeraze ARN dependente, el va determina sinteza unui ARNm precoce de neoformație care va declanșa sinteza proteinelor virale precoce, după care procesul continuă ca la celelalte grupe de virusuri. Unele virusuri ARN care se multiplică în acest mod pot conține în virion transcriptaze structurale. După această schemă se sintetizează Mixo și Rhabdovirusurile.
c) ARN viral, printr-un proces de transcriere inversă cu ajutorul unor enzime numite invers sau reverstranscriptaze, determină formarea unui ADN proviral. Invers transcriptaza pare a nu fi o singură enzimă, ci un complex format din 3 enzime: o ADN polimerază ARN instruită, o ADN polimerază hibrid instruită și o ADN polimerază ADN instruită. Separarea celor trei enzime nu a reușit însă până în prezent. Transcrierea inversă este un fenomen unic în biologie. Prin acest proces enzimatic se formează un ADN proviral care preia conducerea sintezelor celulare după modelul descris la virusurile ADN. Prin intermediul unui ARN polimeraze ADN dependente el determină sinteză proteinelor virale precoce, restul proceselor fiind aproximativ identice cu ale celorlalte scheme de biosinteză. ADN proviral se poate, în unele cazuri, integra în genomul celular sub forma de provirus. Multiplicarea după acest mecanism a fost identificată la unele virusuri tumorale ARN.
în fig. 20 sunt redate schematic cele 3 strategii descrise mai sus.
Virusologie generală
72
Fig. 20 Strategii de transmitere a informației genetice
responsabile de codificarea biosintezei virusurilor ARN: 1.de pe ARN viral direct la ribozomi; 2.prin intermediul unui ARNm copiat de pe ARN
viral și 3. prin intermediul unui ADN proviral copiat prin transcriere inversă.
5.1.4.3.Asamblarea (morfogeneza) virionului La sfârșitul fazei de biosinteză, după ce în celulă s-au acumulat cantități mari de acid nucleic și proteine virale, are loc asamblarea noilor virioni. La virusurile mici, așezarea componentelor în jurul genomurilor virale, fenomen numit și încapsidare, se petrece spontan printr-un proces de autoasamblare. La cele mai multe virusuri, asamblarea implică însă intervenția unor enzime. La virusurile complexe intervin și gene morfogenetice, care codifică arhitectura proteinelor structurale ale virionului. încapsidarea se realizează prin asocierea unor proteine precursoare în unități formate mai întâi din 3 subunități, constituind o proteină 5 S, iar apoi din 5 subunități rezultând o pentameră 14 S.
Din asamblarea a 12 pentamere rezultă o procapsidă 80 S, constituită din 60 subunități aranjate după tipul de simetrie icozaedral. Asamblarea capsidelor are loc independent de prezența genomurilor virale, fenomenul demonstrat prin experiența lui Jacobson și Baltimore (1967) care, în urma inhibării replicării ARN a virusului poliomielitei în prezența guanidinei, au constatat acumularea în celulă de capside goale.
încorporarea acidului nucleic are loc prin sciziunea într-un anumit punct a unei proteine gigante precapsidale. Proteina gigant are masa moleculară 40 x 103 iar proteinele care rezultă
Virusologie generală
73
din scindarea ei, în momentul adiționării ARN au masele moleculare de 28 x 103 și respectiv 12 x 103.
Timpul de încapsidare a unui genom ARN este de două minute. între sinteza proteinelor capsidale și apariția lor în structura virionilor nou formați există însă un interval de 20 minutte. Aceasta pledează pentru admiterea formării unui depozit (“Pool”) intracelular de proteine capsidale, care crește cu timpul în volum, depozit din care emisia de proteine capsidale pare a avea loc la întâmplare, pe parcursul de morfogeneză a virionilor. Experinețele care pledează pentru acest mod de desfășurare al asamblării noilor particule virale sunt următoarele:
Mixajul fenotipic al proteinelor capsidale: Ledinko și Hirst (1961) au constatat, după o infecție mixtă cu 2 serotipuri distincte de virus al poliomielitei, apariția de virioni care au fost neutralizați de seruri specifice pentru ambele serotipuri, dovedind astfel originea dublă a proteinelor capsidale a virionilor nou formați. Camuflajul fenotipic sau mascarea genotipului: Fraenkel-Conrat și Singer (1957) au reprodus artificial virioni, constituiți din capsida unei tulpini și genomul alteia în cazul virusului mozaicului tutunului. Experiețe similare s-au efectuat și cu virusul poliomielitei. Morfogeneza, ca regulă generală, are loc pentru
virusurile ARN intracitoplasmatic, iar pentru virusurile ADN intranuclear. Materialul viral, după sinteza lui în citoplasmă, migrează în cazul virusurilor ADN în nucleul celulei gazdă, asmablându-se aici. Excepții de la această caracteristică generală o reprezintă poxvirusurile care, fiind virusuri ADN, se asamblează în citoplasmă și myxovirusurile care, fiind virusuri ARN, se încapsidează în nucleu. Diferențe între grupele (familiile) de virusuri există și în ce privește locul și structurile intracelulare din citoplasmă și nucleu unde are loc asamblarea lor. Astfel, poxvirusurile și picornavirusurile se pot asambla în diverse zone ale citoplasmei, rhabdovirusurile de obicei pe membranele marginale ale vacuolelor intracitoplasmatice, iar myxovirusurile după încapsidarea lor în nucleu își desăvârșesc faza de maturare la periferia celulei, limitrof membranei.
Virusologie generală
74
5.1.5.Eliberarea virionilor din celulă
Virionii nou formați pot fi eliberați din celulă prin mai multe procese, după cum urmează:
înmugurirea sau burjonarea este modul cel mai frecvent de eliberare a virusurilor din celulă. El a fost observat și studiat mai întâi la virusurile a căror maturare are loc curent în apropierea membranei celulare; mai târziu, s-a constatat că este în realitate mult mai extins.
Modelul general se caracterizează prin includerea într-o primă fază a virionilor nou asamblați în vezicule (cisterne), care se atașează de fața internă a membranei celulare, la suprafața căreia proemină și o bombează asemănătoar unor muguri. Apoi, aceștia se detașează de celulă prin mici aperturi care apar în membrană. (fig. 21).
Intensitatea fenomenului și aspectul mugurilor poate îmbrăca o gamă destul de variată de forme. Uneori, eliberarea virionilor are loc exploziv sub formă de vacuole care se degajă la suprafața celulei simultan și asincron (după Lwoff și Dulbecco, 1955, citați de Hannoun, 1976).
Alteori, la suprafața celulelor se formează niște
vilozități, iar virionii ies în mediul extracelular prin extremitățile acestora.
în urma procesului de înmugurire virusul păstrează în componența învelișului sau mai ales al pericapsidei anumiți compuși specifici celulei care l-a sintetizat, provenind din
Fig.21. Eliberarea virionilor din celula
gazd\ prin
`nmugurire
Virusologie generală
75
membrana internă a cisternei (veziculei) în care fusese inclus în cursul înmuguririi, fapt care determină prezența, la acești virioni, a două categorii de proteine:
proteine virus specifice, elaborate de celulă conform informației genetice a acidului nucleic viral;
proteine cu specificitate de gazdă, care fac parte din compușii obișnuiți ai celulei și care sunt antrenați în structura învelișului particulei virale (a pericapsidei), în cursul eliberării virusului din celulă.
Liza celulei gazdă sub acțiunea unor enzime produse în celulă în ultima fază a morfogenezei; acest mecanism, caracteristic bacteriofagilor, se întâlnește rar la virusurile animale.
Eliberarea virionilor consecutiv morții celulei și dezintegrării acesteia; aceste virusuri apar cel mai târziu, iar punerea lor în libertate se caracterizează printr-o frecvență moderată.
Trecerea virionilor direct la celula adiacentă celei în care a avut loc multiplicarea, prin porii membranei celulare.
6. DINAMICA CICLULUI DE MULTIPLICARE
Ciclul multiplicării unui virus sub diversele lui aspecte calitative și cantitative, precum și factorii care-l pot influența, a putut fi studiat la principalele grupe (familii) de virusuri “in vitro” în diferite sisteme celulare.
Fazele evoluției unui virus într-un sistem celular sunt: faza extracelulară, care precede pătrunderea
virionilor în celule, corespunzând fixării adsorbției, în care numărul virionilor este inițial egal, iar apoi din ce în ce mai mic față de cel însămânțat;
faza intracelulară, care durează din momentul pătrunderii unuia sau mai multor virioni în celulă, până la eliberarea virionilor nou sintetizați; această fază poate fi divizată în două subfaze:
Virusologie generală
76
- faza de eclipsă, când virusul nu este evidențiabil, corespunzând dispariției infectivității virale; virusul se găsește intracelular în diferite momente ale replicării acidului nucleic și ale biosintezei materialului viral;
- faza de maturare, în care consecutiv morfogenezei se acumulează intracelular cantități importante de noi virioni; în această fază virusul este evidnețiabil intracelular, dar nu și extracelular.
faza extracelulară finală, caracterizată prin prezența unui număr mare de noi virioni eliberați din celulele în care a avut loc multiplicarea.
Durata întregului ciclu și a fiecărei faze în parte, exemplificată pentru unele virusuri ARN în tabelul nr. 3, este în funcție de virus, cantitatea de virioni însămânțată, tipul de celulă, temperatură etc. Fazele ciclului de multiplicare sunt corelate cu modificările de proporție între diferiți compuși chimici proprii celulei gazdă și compușii chimici specifici virali. în fig. 22 este prezentat un grafic al ciclului de multiplicare al adenovirusurilor 2 și 5, cu implicațiile acestuia sub aspectul variațiilor calitative și cantitative ale unor compuși chimici celulari și virali.
Tabelul nr. 4 Ciclul de multiplicare a cinci virusuri ARN
(după Hannoun, 1976).
Virusul
Celula gazdă
Durata în ore
a fazei intracelulare
Elibera-
rea virioni-lor din celulă
Număr PFU
produse de o
celulă
Numă-rul
virioni-lor
produși pe
celulă
Eclipsă
Maturare
Virusul poliomielitei
HeLa 2,5 6 foarte lentă
2 x 105 500
2 x105
Virusologie generală
77
Arbovirus Sindbis
Fibroblaste de pasăre
4 16 rapidă, 30 min.
100
Reovirus L 3 15 incompletă 30%
1000 104
Paramyxo-virus (Newcastle)
Embrion de găină
3 10 rapidă 50
Leucovirus
Fibroblaste de pasăre
12 foarte rapidă (30 min. și continuă)
0,2/or
ă
200/or
ă
Fig. 22. Schema ciclului de multiplicare a adenovirusurilor 2 și 5 (cultură în suspensie) (după Warocquier, din Hannoun, 1976)
Virusologie generală
78
7. ASPECTE PARTICULARE ALE MULTIPLICĂRII VIRUSURILOR ZOOPATOGENE
7.1. INFECȚIA ENDOSIMBIOTICĂ Infecția endosimbiotică se caracterizează prin stabilirea unui echilibru între multiplicarea virusului și desfășurarea aproape normală a proceselor vitale în celula gazdă. O astfel de comportare s-a constatat la numeroase leucovirusuri, virusul sarcomului lui Rous și virusul S V 5. în celulă se elaborează concomitent atât compuși proprii celulei gazdă, cât și material viral, atât genomul viral cât și cel celular codificând sinteza de proteine fără a se exclude reciproc. Acest tip de infecție trebuie diferențiat de echilibrul fals (“carrier statte”), când populția celulară în care se multiplică virusul își păstrează numai aparent integritatea. în realitate, în cadrul populației respective marea majoritate a celulelor sunt indemne de virus, acesta multiplicându-se numai într-un număr foarte redus de celule, a căror moarte, însoțită sau nu de liză, trece neobservată.
7.2. INFECȚIA ABORTIVĂ Infecția abortivă se caracterizează prin nefinalizarea ciclului de multiplicare viral. Genomul viral se replică, are loc biosinteza noilor genomuri și a proteinelor virale, fără a se ajunge însă la asamblarea noilor virioni. Evoluții de acest gen au fost observate la virusul gripal în celule HeLa și la virusul pseudopestei aviare în celule L. Infecții de tip abortiv au mai fost descrise la adeno, herpes și papovavirusuri. La aceste virusuri infecția abortivă poate fi corelată cu efectul lor oncogen.
Virusologie generală
79
7.3. INFECȚIA SIMULTANĂ CU ASOCIAȚII VIRALE DE TIP COOPERANT
Infecțiile produse de două virusuri sunt de obicei rezultatul cooperării unui virus normal, capabil să inducă în celula gazdă un ciclu complet de multiplicare și un virus defectiv, față de care virusul normal îndeplinește rolul de “helper” (ajutător). Defectivitatea virală constă în incapacitatea unor virusuri de a se multiplica prin mijloace proprii, informația genetică din acidul lor nucleic fiind insuficientă pentru a codifica un ciclu complet, finalizat prin formarea de noi virioni infectanți. Literatura folosește uneori pentru desemnarea virusurilor defective termenii de “viroizi” sau “virusuri satelit”. Virusurile helper, multiplicându-se în celulă concomitent cu virusurile defective, sunt capabile să suplinească lacunele de informație genetică ale acestora prin codificarea sintezei acelor proteine a căror biosinteză virusurile defective n-o pot induce singure. Astfel, virionii rezultați cu concursul unui virus helper sunt în realitate niște hibrizi, ei conținând proteine specifice proprii, cât și proteine specifice helperului. Acest proces de hibridare implică fenomenele de mixaj și camuflaj fenotipic al virusului defectiv. Fenomeul prin care în cursul hibridării intervirale apar în capsida unui virus proteinele specifice virusului helper coinfectant poartă numele de transcapsidare.
Virusurile defective pot fi, în funcție de persistența, modul și condițiile de manifestare a acestei însușiri, de mai multe feluri:
virusuri constant defective, indiferent de sistemul celular și condițiile de mediu în care se desfășoară ciclul de multiplicare al celor două virusuri asociate
virusuri condiționat defective, la care manifestarea caracterului defectiv este dependent de sistemul celular sau de alt factor de mediu; un exemplu în acest sens îl constituie particulele virale autointerferente studiate mai des la myxovirusuri; mecanismul producerii acestora, numit și fenomenul lui Von Magnus.
Virusologie generală
80
Defectivitatea poate afecta mai multe însușiri ale virusurilor:
Defectivitatea în capacitatea de replicare, care afectează obligatoriu și biosinteza; un asemenea fenomen a fost bine studiat la virusurile oncogene aviare și mai ales la virusul sarcomului lui Rous (VSR). Una din mutantele acestuia, VSR beta, nu se multiplică decât în cazul coinfecției cu virusul limfomatozei RAV (Rous associated virus). Acesta codifică sinteza uneia sau mai multor proteine, care vor intra în compoziția VSR beta. Un virus astfel “îmbrăcat” cu proteina specifică altui virus reprezintă un “pseudotip” (după Hannoun, 1976). Alte mutante ale virusului sarcomului lui Rous sunt defective din punct de vedere al mai multor însușiri. Astfel, mutanta VSR alfa este dublu defectivă, fiind incapabilă să-și codifice sinteza proteinei de înveliș și în același timp lipsită de invers trasncriptază.
Un tip interesant de asociație virală este cea observată între virusul SV 40 și un adenovirus. După mai multe treceri ale unei tulpini de adenovirus 7 pe celule renale de maimuță, un genom defectiv SV 40 contaminează și se asociază particulei virale de adenovirus 7. Acest genom defectiv a fost denumit component PARA (particule aiding replication of adenovirus).
Defectivitatea în capacitatea de a induce un anumit efect asupra celulei gazdă. Astfel, în cazul virusului sarcomului lui Rous, care are în mod obișnuit un efect transformant oncogen asupra celulei gazdă, s-au putut obține mutante induse prin factori mutageni (ultraviolete, hidroxilamină), lipsite de efect oncogen.
Genomurile se pot integra și rămâne uneori mai multă vreme în celule fără a se multiplica. Ele pot fi însă recuperate din celule prin suprainfecția cu un virus helper. Un asemenea fenomen s-a constatat în celulele de hamster, transformate tumoral de virusul sarcomului murin. Acesta nu se multiplică în celulele respective. Recuperarea lui este posibilă cu ajutorul unui helper leucemogen, rezultând un hibrid care are genomul virusului sarcomului murin și învelișul virusului leucomogen.
Virusologie generală
81
Virusurile defective nu trebuie confundate cu alte componente virale produse în celulă în cursul ciclului de multiplicare al unor virusuri. Astfel, în celulele infectate cu virusul plyomei se pot găsi capside și chiar fragmente de ADN celular învelite în proteină virală, numite și “pseudovirioni”.
Asociația virală de tip “helper-virus defectiv”, cu toată diversitatea aspectelor ei, trebuie considerată ca o relație cooperantă de potențare reciprocă intervirală.
7.4.INFECȚIA CU VIRUSURI INTERFERENTE
Infecția cu un virus poate fi în unele cazuri defavorabilă
infecției simultane sau suprainfecției cu un al doilea virus. Acest tip de relație între două virusuri se numește interferență. întrucât mecanismul interferenței este într-o mai mare măsură dependent de reacțiile celulare determinate de prezența virusului decât de activitatea autoreplicantă și codificantă a acestuia, descrierea detaliată a fenomeului de interferență virală se va face în cadrul capitolelor care tratează efectele virusurilor asupra celulei gazdă.
7.5. INFECȚIA CU ACIZI NUCLEICI PURIFICAȚI (TRANSFECȚIA)
Infecția cu acizi nucleici virali purificați, numită și
transfecție, este posibilă numai în condiții experimentale. Primul experiment de transfecție a fost realizat cu ARN
al virusului mozaicului tutunului de Gierer și Schramm (1956) concomitent cu Fraenkel Conrat, după ce în prealabil Hershey și Chase demonstrează că la bacteriofagi acidul nucleic pătrunde singur în celulă, capsida rămânând în afara celulei gazdă.
Semnificația teoretică a acestor descoperiri pentru dezvoltarea ulterioară a virusologiei a fost decisivă, demonstrându-se astfel rolul esențial al acidului nucleic în infecția virală.
Transfecția are următoarele caracteristici, comparativ cu infecția produsă de particulele virale intacte:
Virusologie generală
82
eficiență mult mai scăzută; spectrul de patogenitate mult mai larg.
Explicația lărgirii spectrului de patogenitate în cazul infecției experimentale cu acizi nucleici purificați rezidă în suprimarea complementarităților stereochimice obligatorii și determinante pentru citotropismul virusurilor, relevându-se capacitatea acizilor nucleici de a substitui informația genetică a unui sortiment mult mai larg de celule, decât cel pe care virusurile se pot fixa și apoi pătrunde în condiții naturale.
Transfecția nu este posibilă în cazul tuturor virusurilor, întrucât la unele virusuri acizii nucleici își păstrează infecțiozitatea după purificare, în timp ce la altele și-o pierd. în tabelul nr. 4 sunt prezentate principalele grupe de virusuri al căror genom este constituit din acizi nucleici infecțioși după purificare.
în unele cazuri s-au putut reproduce cu acizi nucleici purificați și unele modificări celulare caracteristice anumitor virusuri, ca de exemplu transformarea tumorală la virusul polyomei.
Imposibilitatea reproducerii transfecției la mai multe grupe de virusuri (pox, herpes, adeno etc.) poate fi atribuită mai multor cauze, cum ar fi:
dificultățile tehnice în purificarea acizilor nucleici;
prezența în genomul viral a unei proteine (transcriptaze) legate de ADN care intervine sau ajută transcrierea informației genetice;
existența unui anumit situs intracelular care determină o topografie precisă, corelată cu capacitatea de substituire a genomului celular cu cel viral.
Lărgirea spectrului de infecțiozitate al acizilor nucleici
consecutiv purificării, deschide noi perspective biologiei și medicinei viitorului datorită creerii posibilităților de vindecare a unor leziuni metabolice și genetice prin materialul genetic necesar remedierii cu ajutorul ADN al unui fag transductor.
Virusologie generală
83
Tabelul nr. 5 Virusuri cu acizi nucleici infecțioși.
(după Fenner și col., 1974)
Familia sau genul
Condițiile de realizare a transfecției
Virusuri ADN: Parvovirus Papovaviridea
Adenovirus
Rezultate pozitive în celule preinfectate cu un adenovirus helper
Rezultate pozitive certe; scindarea în forma monocatenară nu reduce infecțiozitatea
Rezultate pozitive s-au obținut cu unele adenovirusuri simiene și umane
Virusuri ARN: Picornaviridae
Togaviridae
Virusul dehidrogenazei lactice
Reproducerea sigură; atât forma monocatenară cât și cea dublu catenară replicativă sunt infecțioase
Reproducerea sigură; infecțiozitatea ARN este un caracter distructiv pentru familie
Reproducerea sigură
8. MULTIPLICAREA BACTERIOFAGILOR
Bacteriofagii se multiplică în condiții naturale numai în celula bacteriană. în condiții experimentale au putut fi infectate cu bacteriofagi și celule animale, fără a avea însă ca efect multiplicarea acestora.
Ciclul de multiplicare, care se finalizează cu eliberarea unei cantități mari de noi virioni, este denumit curent și ciclul litic sau productiv. Aceste apelative subliniază particularitățile specifice multiplicării bacteriofagilor: litic – deoarece
Virusologie generală
84
eliberarea virionilor se face totdeauna prin liza celulelor gazdă și productiv – deoarece pe de o parte ciclul se finalizează cu o “producție” mare de noi particule virale, iar pe de altă parte pentru a face o demarcare netă față de ciclul reductiv sau lizogenizant, în care virusul se integrează în genomul celulei gazdă și nu are loc formarea de noi virioni. Alternanțele între multiplicare și integrare sau altfel spus, trecerile de la ciclul litic productiv la cel lizogenizant reductiv și invers, sunt mult mai frecvente la bacteriofagi, comparativ cu virusurile zoopatogene.
Etapele multilicării bacteriofagilor și dinamica ciclului de multiplicare (fig. 23) sunt în general aceleași ca la virusurile zoopatogene, cu unele deosebiri caracteristice fiecărei etape:
Adsorbția sau fixarea virionilor pe celulă are un grad
mult mai ridicat de specificitate, comparativ cu virusurile zoopatogene.
Responsabilitatea fixării o poartă complementaritățile stereochimice dintre receptorii din peretele celular al bacteriei și compușii chimici din aparatulde fixare situat în vârful cozii bacteriofagului.
Un rol important în mecanismul fixării îl au proteinele fibrilare și croșetele plăcii terminale. Bacteriofagii cu cap și coadă se fixează totdeauna cu vârful cozii pe celula bacteriană. Bacteriofagii fără coadă se fixează totdeauna fie printr-o
Fig. 23 Fazele multiplicării bacteriofagului:
1.fixarea pe celula bacteriană; 2.inocularea genomului fagic; 3.replicarea genomului și sinteza de ARN mesageri; 4.sinteza componentelor viitorilor virioni: precapete, cozi, plăci terminale, proteine fibrilare; 5.morfogeneza:încapsidarea genomurilor și atașarea cozilor cu aparatele de fixare; 6.liza (după A. Steven [i M. Wurtz, 1977)
Virusologie generală
85
capsomeră mare fie, în cazul absenței acesteia, printr-un unghi (colț) al capsidei icozaedrale a capului. Lizozimul fagic contribuie de asemenea într-o măsură însemnată la chimiotactismul dintre bacterie și fag. Pe o celulă bacteriană se pot adsorbii un număr imens de fagi, ceea ce conferă bacteriei aspectul unei perinițe pline cu ace cu gămălie mare. Timpul de adsorbție este foarte scurt -–câteva secunde de la însămânțarea fagului. Complementaritățile fag-bacterie responsabile pentru adsorbția fagului au și principalul rol în determinismul spectrului de activitate al fiecărui fag, al specificității de specie sau lizotip al acestuia. Un grup aparte de bacteriofagi îl constituie fagii sexuați numniți așa fiindcă nu se adsorb decât pe pilii sexuali. Receptorii complementari compușilor chimici din capsida fagului responsabili de adsorbție se găsesc numai pe acești pili și nu și pe alte structuri de pe suprafața bacteriei. Fagii sexuali sunt mici și lipsiți de coadă. Ei pot fi utilizați pentru identificarea populațiilor bacteriene F+ (fig. 24).
Infectarea celulei sensibile are loc printr-un mecanism diferit de al virusurilor zoopatogene. în timp ce virusurile zoopatogene pătrund în întregime în celulă, la bacteriofagi capsida rămâne înafara celulei, în care este introdus numai genomul. La fagii cu cap și coadă introducerea genomului este asemănătoare cu o injecție în care seringa este reprezentată de capul fagului, iar acul de coadă. Acidul nucleic se deplasează din interiorul capsidei capului prin lumenul delimitat de canalul cozii. La fagii a căror coadă este contractilă, contracția cozii pare a avea principalul rol în mecanismul injectării în celula
Fig. 24 Adsorbția fagilor sexuali.
Virusologie generală
86
bacteriană a genomului viral. în ipoteza că sâmburele (cilindrul axial) constituient al lumenului cozii ar avea o stare de agregare solidă sau de gel, acesta se fluidifică în timpul injectării genomului. Peretele celular al bacteriei poate fi traversat de genomul viral, datorită permeabilității sale prealabile prin acțiunea lizozimului fagic. Sub aspectul activității enzimatice, lizozimul fagic este o glucidază, asemănătoare cu lizozimul din diferitele umori ale organismului animal. Efectul oricărui lizozim, indiferent de originea sa, se exercită asupra mucopeptidei (mureinei) din peretele celular. După injectarea genomului, capsida fagului poate rămâne un timp nedefinit atașată de peretele celular, fără să aibe o influență asupra complexului fag-bacterie. La examenul electronooptic, capsidele goale ale capetelor bacteriofagilor din care au fost expulzate genomurile, devin transparente față de electroni, ceea ce a inspirat desemnarea lor sub numele de “fagi fantomă”. Multiplicarea intracelulară se desfășoară asemănător cu a virusurilor zoopatogene. Majoritatea bacteriofagilor au genomul constituit din ADN bicatenar, care se replică semiconservativ. în timpul replicării se sintetizează sub acțiunea unei ARN polimeraze ADN dependente un ARNm precoce viral, care transmite la nivelul ribozomilor celulei bacteriene informația genetică pentru sinteza proteinelor precoce. Celelalte faze – biosinteza și morfogeneza – au de asemenea similitudini cu fazele omoloage descrise la virusurile zoopatogene ADN. Bacteriofagii cu cap și coadă, având o structură complexă, se caracterizează și printr-o organizare mai complexă a genomului, în cadrul căruia se disting grupe de gene care intervin în codificarea sintezei diferitelor componente ale virionului și mai ales în morfogeneza acestuia. Etapele morfogenezei, codificate fiecare de gene diferite și catalizate de unele procese enzimatice, se succed astfel:
a) asamblarea precapetelor, respectiv a capsidelor icozaedrale ale acestora;
b) introducerea genomurilor virale în interiorul precapetelor; proteine cu rol regulator determină lungimea exactă a lanțurilor de ADN ce pătrund în capsidă; punctul de acces al genomului este acel colț
Virusologie generală
87
(unghi) al icozaedrului, unde mai târziu se va atașa coada;
c) asamblarea capsidelor icozaedrale ale cozilor; d) asamblarea aparatelor de fixare din plăcile terminale
prevăzute cu croșete și fibrile proteice; e) atașarea aparatelor de fixare de extremitățile cozilor; f) atașarea cozilor de capate;
Cu toată complexitatea morfogenezei (unele din etapele
menționate se desfășoară aparoape concomitent), întregul proces nu durează mai mult de câteva minute. în fig. 25 sunt reprezentate schematic etapele asamblării colifagului (unul din cei mai complecși fagi), cu precizarea genelor care codifică fiecare etapă.
Fig. 25 Morfogeneza fagului (după A. Steven și M. Wurtz, 1977). Etapele relativ bine demonstrate sunt marcate cu săgeți groase, iar
cele ipotetice cu săgeți subțiri.
Eliberarea virionilor din celula bacteriană se produce prin liza acesteia. Sub acțiunea informației genetice virale apar în celulă enzime, numite endolizine sau virolizine, care lizează învelișul celulei bacteriene, virionii maturi ieșind în mediul extracelular.
Virusologie generală
88
9. INTEGRAREA VIRUSURILOR
Pătrunderea unui virus în celulă nu este totdeauna urmată de multiplicarea acestuia prin mecanismele descrise anterior. în unele situații, genomul viral se atașează de genomul celulei, unde rămâne și se comportă în continuare ca component propriu al acestuia. Acest fenomen se numește integrare, iar genomul viral integrat mai este denumit și provirus. Fenomenul a fost observat prima dată de Bordet și Ciucă (1921) la un colifag. Mecanismele integrării au fost mai întâi studiate la bacteriofagi, mai târziu și la virusurile zoopatogene.
9.1. INTEGRAREA BACTERIOFAGILOR (LIZOGENIA)
La bacteriofagi integrarea este un fenomen
frecvent, iar evoluția intracelulară a fagului în acest mod este denumită curent ciclu reductiv sau lizogenizant reductiv – fiindcă virusul nu se multiplică și uneori nici nu își manifestă evident prezența; lizogenizant – fiindcă populațiile bacteriene care conțin virus integrat sunt capabile să genereze liza la alte populații neinfectate cu fag. Procesul de integrare a fagului într-o populație bacteriană se mai numește lizogenizare, iar culturile sau tulpinile care conțin fag integrat mai sunt denumite și lizogene. Culturile lizogene, în condiții obișnuite, nu sunt niciodată lizate de fag. Capacitatea lor de a genera liză la populațiile sensibile nu se datorește capacității litice a fagului integrat, ci faptului că într-o proporție foarte redusă, în celulele unei populații lizogene (10-2 – 10-7) fagul se multiplică desfășurând un ciclu litic. Această proporție foarte redusă de virioni nu este evidențiabilă în cultura lizogenă, dar devine imediat evidentă într-o cultură bacteriană sensibilă, pe care o infectează producând liza ei masivă. Modelele de integrare ale genomului fagic (fig. 24) în cromozomul celulei bacteriene sunt:
Virusologie generală
89
agățarea (modelul lui Jacob și Wollman) – acidul nucleic viral este agățat sub forma unui cârlig de lanțul de ADN al cromozomului bacterian, într-o anumită zonă a acestuia;
inserția (modelul lui Campbell) – genomul viral se încorporează în continuarea cromozomului bacterian, după ce acesta se rupe într-un anumit punct iar extremitățile rămase libere se cuplează cu extremitățile genomului viral.
Cele două modele sunt însă discutate, neexistând o certitudine absolută cu privire la mecanismul integrării. Ca orice fenomen de recombinare genetică, integrarea este însă condiționată de unele similitudini de structură la nivelul nucleotidelor dintre genomul viral și cromozomul celular, în zona de cuplare a celor două materiale genetice.
Condițiile lizogenizării sunt reprezentate de anumite însușiri ale bacteriofagului, ale tulpinii bacteriene, după cum și de anumiți factori de mediu. Astfel, fagii care se integrează au în general un grad redus de virulență, fiind numiți fagi temperați. Tulpinile bacteriene, pentru a se lizogeniza, trebuie să fie inițial lizosensibile. Factorul de mediu care influențează cel mai frecvent integrarea este temperatura: temperatura de 200C, este de regulă favorabilă integrarii, în timp ce temperaturile mai ridicate (400C) sunt favorabile ciclului litic.
Proprietățile tulpinilor bacteriene lizogene sunt: Imunitatea față de suprainfecția cu fagul omolog.
Mecanismul imunității antifag a tulpinilor lizogene rezidă în incapacitatea unui nou genom viral omolog de a mai substitui informația gentică a bacteriei și de a declanșa astfel sinteza de material viral. în cazul unei suprainfecții, bacteriofagul se fixează pe celula bacteriană, își introduce genomul în celulă, dar ajuns aici nu este capabil să codifice. Se pare că fagul integrat ar induce sinteza unei substanțe specifice, asemănătoare cu represorii, iar aceasta blochează reacțiile prin care genomul fagic nou venit ar putea iniția ciclul productiv.
Conversia Este fenomenul prin care populația bacteriană care conține fagul integrat dobândește
Virusologie generală
90
noi caractere. Acestea se pot referi la structura antigenică, toxinogeneza, sinteza de noi enzime etc. Un exemplu clasic de conversie îl reprezintă toxinogeneza la specia Corynebacterium diphteriae; numai tulpinile lizogene sunt toxigene, în timp ce tulpinile care nu conțin fag integrat sunt netoxigene.
Proprietățile noi, rezultate prin conversie, sunt determinate de informația gentică adusă în celulă prin integrarea genomului fagic, care se comportă în întreaga perioadă cât cultura rămâne lizogenă, ca material propriu.
Reversibilitatea ciclului reductiv se referă la posibilitatea reluării ciclului productiv, a desprinderii genomului fagic din cromozomul bacterian și a reactivării lui (fig. 26).
Trecerea profagului în starea de fag vegetativ are loc, așa cum s-a amintit anterior, și în mod spontan cu o frecvență foarte mică.
în general, însă, acest fenomen se obține sub acțiunea unor agenți inductori. Aceștia pot fi de natură fizică - radiațiile ultraviolete și X – sau chimică - peroxizi, iperita azotată etc. în urma inducției prin asemenea factori, fiecare bacterie lizogenă indusă eliberează în jur de 100 virioni. Relația fag integrat – bacterie este o relație de tip simbiotic caracterizată printr-un perfect echilibru între cei doi parteneri.
Virusologie generală
91
Fig. 26 Relația reversibilă dintre ciclul productiv și cel reductiv
al bacteriofagilor. Agenții inductori menționați care au de obicei și un efect mutagen acționează în cazul de față prin suprimarea sintezei substanței tip represor responsabilă pentru inhibarea funcționalității genetice a genomului viral. Trecerea de la ciclu reductiv la cel productiv implică uneori și alte fenomene cum sunt:
- virionii nou formați pot îndeplini rolul de fagi transductori în cazul când în urma desprinderii genomului fagic din cromozomul bacterian acesta antrenează cu sine și unele gene din cromozomul bacterian, limitrofe de zona unde fusese integrat.
- sinteza unor virioni defectivi în locul celor normali.
Defectivitatea la bacteriofagi se poate manifesta în incapacitatea de sinteză a unor componente ale virionului sau de inducere a unui ciclu productiv finalizat prin eliberarea de virioni neinfectanți. Din această categorie fac parte diferiți factori litici capabili să inducă liza populațiilor bacteriene sensibile neurmată de eliberarea în etapa finală de noi fagi. Acești factori litici se aseamănă în mare măsură cu bacteriocinele.
Virusologie generală
92
9.2. INTEGRAREA VIRUSURILOR ZOOPATOGENE
La virusurile zoopatogene integrarea genomurilor virale
este de regulă urmată de transformarea tumorală a celulelor. Procesul integrării are unele particularități în funcție de
tipul de acid nucleic constituient al genomului viral. Integrarea virusurilor ADN studiată mai ales la grupele
Papovaviridae, Adenoviridae Herpesviridae se realizează printr-un proces de hibridare a genomului viral cu genomul celular într-un anumit segment al unui cromozom în care există similitudini în compoziția de baze azotate a celor doi acizi nucleici.
Integrarea virusurilor ARN este mai complicată în sensul că genomul viral nu se integrează el însuși. Materialul genetic integrat este în acest caz ADN previral sintetizat în celulă după informația transcrisă invers de pe ARN viral.
în ambele cazuri integrarea ADN viral sau previral produce efectul transformant oncogen ca rezultat al informației genetice cuprinse în segmentul de ADN integrat. Transformarea oncogenă poate fi însoțită sau nu de producție de virus. EFectul exclusiv oncogen cu absența virogeniei presupune o evoluție a genomului viral asemănătoare cu profagul. Efectul oncogen și virogen este rezultatul codificării de către ADN-ul viral integrat a două informații genetice diferite: pe de o parte, cea responsabilă de transformarea malignă a celulei, iar pe de altă parte cea responsabilă de sinteza de noi virioni.
Proporția informației genetice responsabilă de virogenie este însă mult mai redusă comparativ cu cea dintr-un genom viral, în care se desfășoară un ciclu productiv normal de multiplicare a unui virus. în cazul unor adenovirusuri s-a demonstrat că genomul viral se exprimă numai în proporție de numai 5-10%. O dovadă a acestei stări de lucruri este și masa moleculară mare de ARN din celulele transformate (peste 30 S în nucleu și 28-30 S în citoplasmă), ceea ce presupune sinteza de ARN policistronic de tip “ viral-celular” ( după Hannoun, 1976). Studiul virusurilor murine, din grupa leucemie- sarcom, a permis elaborarea unor modele teoretice privind efectul
Virusologie generală
93
oncogen al virusurilor și evnetualitatea unor arii mult mai largi de răspândire a tumorilor cu etiologie virală: Modelul lui Huebner – virogen și oncogen. Bazat pe o vastă anchetă serologică și biochimică, Huebner susține uibcvitatea genomurilor virusului oncogen murin, de tip C într-un număr mare de celule normale, somatice și germinale, la păsări și șoareci și poate chiar la toate vertebratele. Aceste genomuri integrate sunt transmise vertical de la părinți la descendenți. Manifestarea lor fenotipică prin t ransformarea malignă a celulelor în care se găsesc, este inhibată de sisteme represoare activabile sub acțiunea a numeroși factori de mediu (raza X, substanțe chimice cancerigene, etc.). Modelele lui Temin- provirus și protovirus.
- Provirusul reprezintă un model analog profagului, celula infectată cu un virus de tip C devenind purtătoare a informației virale. Acest model nu explică suficient modul în care celula primește un nou virus în cazul infecției orizontale și nici relațiile care se stabilesc între genele virale vechi și noi.
- Protovirusul reprezintă un virus potențial, a cărei
apariție este posibilă în oricare celulă normală, prin transcrierea inversă de pe ARN celular. Protovirusurile sunt deci niște fragmente de ADN de neoformație a căror sinteză este întâmplătoare și care sunt capabile să se integreze în genomurile celulelor în care s-au format sau în celule vecine. Temin atribuie acestui mecanism un rol deosebit de important în fenomenele de amplificare genomică și de diferențiere. El admite totodată că în acest mod poate fi generată orice informație genetică necesară virogeniei și oncogeniei virusului de tip C.
Exceptând integrarea genomurilor virale în celulele care
obișnuit sunt gazde ale multiplicării virusului respectiv, în condiții experimentale fenomenul s-a dovedit a fi posibil și în celule nereceptive, situate uneori pe o treaptă filogenetică foarte îndepărtată de a speciei receptive. Astfel, genomuri fagice au putut fi integrate în celule animale; și în acest caz,
Virusologie generală
94
efectul informației genetice virale este de cele mai multe ori tot de transformare tumorală.
ADN proviral al unor virusuri oncogene aviare poate persista în celulă, transmițându-se vertical fără a se integra în genomul celular. Persistența lui se datorează unei replicări coordonate cu cea a genomului celular. Acest mod de compertare a fost numit integrare funcțională.
10. CARACTERIZAREA TIPURILOR DE COMPLEX VIRUS CELULĂ
Din toate posibilitățile de interacțiune virus celulă prezentate anterior rezultă următoarele tipuri de stări sau complexe virus celulă.
Starea independentă (complex virus-celulă independent), care corespunde situației în care virusul se multiplică rezultând în final noi virioni (ciclul productiv). Termenul de “independent” nu reflectă întocmai realitatea întrucât însăși existența virusurilor este indisolubil legată de dependența acestora de celula vie. El corespunde realității numai în sensul că pentru un timp limitat virusul poate fi conservat și vehiculat înafara celulei, până în momentul când reușește să infecteze o nouă celulă sensibilă. Starea independentă poate fi la rândul ei de două feluri, în funcție de procesele pe care le suferă celula gazdă:
- starea independentă cu efect citocid, caracterizată prin moartea celulei, consecutiv producerii virusului; în acest caz biosinteza de material viral duce la blocarea totală a sintezei proteinelor celulare;
- starea independentă echilibrată, corespunzând infecției endosimbiotice în care procesele de biosinteză a materialului viral nu deranjează sintezele compușilor celulari proprii iar producția și eliberarea noilor
Virusologie generală
95
virioni este compatibilă cu continuarea vieții celulei gazde.
Stare dependentă (complexul dependent) care corespunde formei de virus integrat (ciclul reductiv).
în funcție de starea virusului din celulă, celulele se împart în două categorii:
- celule permisive, în care se desfășoară ciclul productiv finalizat prin eliberarea de noi virioni;
- celule nepermisive în care nu are loc producția de noi virioni (ciclul reductiv).
10.1. MODIFICĂRILE MORFOLOGICE ALE CELULELOR
INFECTATE CU VIRUSURI
Multiplicarea virusurilor într-o celulă provoacă o gamă largă de modificări morfologice și fiziologice ale acesteia.
10.1.1.Efectul citopatic
Termenul de efect citopatic este utilizat în virusologie cu două semnificații semantice:
în sens larg, efectul citopatic este orice modificare morfologică a unei celule, datorită prezenței unui virus;
într-un sens mai îngust, care vizează în mod concret practica cultivării virusurilor în culturi celulare, prin efect citopatic se înțelege dezorganizarea și modificarea morfologică pe care o suferă celulele dintr-o cultură, consecutiv multiplicării virusului. Efectul citopatic este cel mai ușor de observat în cazul cultivării virusurilor prin tehnica Dulbecco a monostratului (monolayer). în cazul relației virus-celulă cu efect citopatic, se constată de obicei pierderea continuității monostratului, tendința celulelor de a devia de la forma lor normală spre forme sferice, ștergerea treptată a desenului celular, celulele
Virusologie generală
96
transformându-se treptat în mase amorfe. în unele cazuri, efectul citopatic este caracteristic pentru un virus într-o cultură cu un anumit tip de celule și poate constitui un criteriu pentru identificarea virusului respectiv. Potențarea efectului citopatic constă în apariția mai
rapidă și mai accentuată a efectului citopatic în cazul unor asociații virale. De exemplu, virusul pseudopestei aviare produce efect citopatic în 5-6 zile, virusul pestei porcine nu produce efect citopatic. Dacă o cultură celulară cu virusul pestei porcine se suprainfectează cu virusul pseudopestei aviare, efectul citopatic apare mult mai rapid.
EFECTUL LITIC Este o formă particulară a efectului citopatic caracterizat
prin liza celulelor. Zonele de liză produse de virusurile zoopatogene în monostraturile de celule animale, cât și cele produse de bacteriofagi în culturi bacteriene pe medii solide poartă numele de plaje. Ele nu au formă circulară regulată, iar diametrul lor este în funcție de virus și de tipul de celule. în condițiile cultivării unei cantități mari de virus cu efect litic, plajele sunt foarte dese, se întrepătrund, rezultând o liză confluentă.
La virusurile animale producătoare de plaje în monostraturi și la bacteriofagi se pot face aprecieri cantitative asupra numărului de virioni dintr-un material ce conține virus pe baza determinării unităților formatoare de plaje, notate prescutrat PFU (plaque forming units). întrucâtva, analog cu numărătoarea coloniilor bacteriene, determinarea cantitativă a virionilor pe baza numărului de PFU se bazează pe premiza că o plaje este generată de prezența inițială a unui singur virion.
10.1.2.Fuziunea celulară
Unele paramyxovirusuri produc în culturile celulare în care se cultivă sinciții rezultate din fuzionarea celulelor care conțin virusul. Fuziunea poate avea loc între celule de același fel și în unele cazuri și între celule din țesuturi cu origini diferite (heterocarioni). Astfel, în urma cultivării virusului parainfluenței, s-a putut determina apariția unor sinciții
Virusologie generală
97
hibride rezultate din fuzionarea de celule umane cu celule de șoarece.
Fuziunea celulară poate fi provocată și cu virusuri iradiate (ex. virusul Sendai).
Mecanismul fuziunii pare a se realiza sub acțiunea concomitentă a neuraminidazei aceluiași virion fixat la nivelul zonei de contact între două celule alăturate, creându-se astfel o punte celulară între ele.
Fuziunea celulară sub acțiunea virusurilor este utilă experimentelor de biologie celulară, oferind posibilitatea unor studii de hibridare intracelulară în cele mai diverse combinații.
10.1.3.Hemaglutinarea și hemadsorbția
Unele virusuri, mai ales cele învelite de pericapsidă, au capacitatea de a aglutina globulele roșii ale diferitelor specii animale. Acest fenomen a fost observat prima oară de HIRST (1940) și îi poartă numele. Acțiunea hemaglutinantă este condiționată de prezența pe suprafața virionului a unor protuberanțe cu aspect de spiculi sau antene numite hemaglutinine.
Hemaglutinarea este consecința adsorbției virionilor pe suprafața hematiilor sau a eritorcitelor la nivelul căreia produc modificări de natură electrostatică.
Proprietățile hemaglutinante constituie un criteriu de evidențiere a virusurilor. Hemaglutinarea nu este un fenomen specific, neexistând deosebiri nici de aspect al reacției și nici de mecanism între diferitele virusuri hemaglutinante.
Reacția poate fi utilizată în schimb pentru determinarea cantitativă a concentrației de virioni dintr-un material prin executarea ei în diluții seriate în tuburi sau plăci cu godeuri. Concentrația de virus se deduce după diluția maximă la care are loc hemaglutinarea.
Hemaglutinarea poate fi utilizată ca reacție indicatoare în cadrul unei reacții serologice cu grad înalt de specificitate și anume inhibarea hemaglutinării. Aceasta se bazează pe pierderea capacității hemaglutinante a virusului după neutralizarea acestuia cu anticorpi specifici. Anticorpii fixați pe virioni împiedică adsorbția acestora pe suprafața globulelor roșii.
Virusologie generală
98
Hemadsorbția este o variantă a hemaglutinării aplicată în cazul cultivării virusurilor în monostraturi celulare. Ea se bazează pe aglutinarea și adsorbția hematiilor sau eritrocitelor pe suprafața celulelor din monostrat, în care s-a multiplicat virusul.
10.1.4.Efectul incluziogen
în celulele în care se multiplică virusul, apar frecvent structuri corpusculare de dimensiuni variabile, între 1-30 microni diametru, cu afinități tinctoriale, în majoritatea cazurilor, oxifile, numite incluzii virale.
Ca leziune microscopică, incluziile au fost descrise cu mult timp înainte de descoperirea virusurilor. Ele poartă numele diferiților autori care le-au observat și descris pentru prima oară. De exemplu, incluziile Babeș-Negri, în turbare; Bollinger, în variola aviară; Guarnieri, în infecțiile cu virusul vaccinal, etc. Mult mai târziu s-a stabilit relația constantă între prezența acestor leziuni celulare microscopice și infecția virală.
Sediul incluziilor este în general în citoplasmă, în cazul virusurilor ARN și în nucleu, în cazul virusurilor ADN. Poxvirusurile constituie o excepție, în sensul localizării în citoplasmă a incluziilor Bollinger.
Incluziile la diferi te virusuri pot avea o natură și un mecanism de formare
diferit: la adenovirusuri, incluziile sunt constituite din
material viral în diferite faze ale procesului de biosinteză sau morfogeneză;
la reovirusuri, sunt modificări la nivelul unor organite celulare provocate de multiplicare a virusului;
la herpesvirusuri, ele reprezintă locul unde a fost sintetizat materialul viral, înlocuit ulterior cu o substanță oxifilă.
Incluziile virale pot fi puse în evidență în amprente sau secțiuni histologice prin diferite metode, dintre care cele mai importante sunt:
Virusologie generală
99
colorarea prin metode speciale (Sellers pentru amprente, Mann, Lentz pentru secțiuni etc.);
imunoflorescența cu seruri specifice față de virusul respectiv, marcate cu substanțe fluorocrome;
autoradiografia cu izotopi radioactivi.
Punerea în evidență a incluziilor reprezintă o metodă frecvent utilizată în practica diagnosticului într-un număr mare de viroze. Specificitatea lor pentru un anumit virus este determinată de prezența lor în țesutul pentru care virusul manifestă histotropism și de poziția lor în celulă -în citoplasmă sau nucleu. La noi în țară, la nivelul laboratoarelor veterinare județene, evidențierea incluziilor Babeș-Negri în neuronii piramidali din cornul lui Ammon, constituie o metodă curentă pentru diagnosticul turbării.
10.1.5 Producerea de aberații cromozomiale
Diferite virusuri din grupele paramyxo, adeno, papova etc., sunt capabile să producă, în celulele în care se multiplică, aberații cromozomiale. Acestea pot fi: fragmentări de
Fig. 27 Diferite tipuri de incluzii virale.
A-incluzii intracitoplasmatice Guarnieri produse de virusul vaccinal; B-incluzii intranucleare produse de virusul Herpes simplex; C-incluzii intracitoplasmatice perinucleare caracteristice reovirusurilor; D-incluzii intranucleare caracteristice adenovirusurilor; E-incluzii Babeș-Negri produse de virusul turbării; F-incluzii intranucleare și intracitoplasmatice produse de virusul pojarului; L și F-efectul incluziogen este însoțit de formarea de sinciții consecutiv fuziunii celulare (după FENNER, 1974)
Virusologie generală
100
cromozomi ajungând uneori la pulverizării, translocări (mutarea unor segmente de ADN de pe un cromozom pe altul) și fuzionări de cromozomi.
Consecințele cele mai grave ale acestor efecte ale virusurilor se manifestă la femelele gestante, cu urmări pentru viitorii produși. Asemenea situații fac ca întreruperea sarcinii să fie permisă la femei care în cursul gravidității au suferit de unele viroze.
10.1.6.Efectul transformant (oncogen)
Din aproximativ 600 virusuri identificate până în prezent la animale, la aproximativ ¼ (150) s-a demonstrat un potențial oncogen.
Transformarea tumorală este caracteristică pentru unele virusuri la specia natural receptivă în condițiile infecției naturale. Prezența tumorilor este, în astfel de cazuri, și principala manifestare anatomoclinică din virozele respective. Așa este cazul leucozelor aviare, a leucozei taurinelor, al sarcomului lui Rous la păsări, a poliomei șoarecelui etc.
O altă categorie de virusuri nu produce transformarea tumorală la speciile natural receptive, ci numai în condițiile experimentale pe animale de laborator; așa este cazul virusului SV 40 (Simian vacuolizant 40) care, în condiții naturale se găsește în stare latentă în rinichiul de maimuță, unde nu produce nici o infecție aparentă, dar inoculat la hamster are proprietăți oncogene.
10.1.7.Mecanismele oncogenezei virale
Pot fi diferite. în majoritatea cazurilor, transformarea malignă este consecința integrării virusului. Genomul viral integrat constituie un supliment de material genetic capabil să determine o transformare profundă a particularităților normale ale celulei, ducând în final la proliferarea ei anarhică. în mecanismul oncogenezei virale virusurile acționează diferit, în funcție de tipul de acid nucleic din care este constituit genomul: Virusuri ADN (grupele adeno, papova, herpes) induc
transformarea prin integrarea genomului viral în genomul
Virusologie generală
101
celular. Experimental, hibridând ADN din celule tumorale cu ARN marcat, sintetizat “in vitro” pe o matrice de ADN viral, cu ajutorul polimerazei de E. coli, s-a observat apariția în genomul celulei a unui număr mare de genomuri virale integrate, care a variat între 14 și 97, în funcție de tipul de adenovirus. Alte metode experimentale au contrazis aceste rezultate, demonstrând integrarea unui singur genom.
Prin experimentele de izolare și funcționare a cromozomilor celulelor transformate tumoral s-a constat că nu există deosebiri între diferitele clase de cromozomi privind conținutul lor în ADN viral.
La adenovirusuri s-a putut stabili o corelație între capacitatea de transformare oncogenă și conținutul în baze azotate al genomului, în sensul că proporția de G + C din genomul viral se apropie de cea din celula gazdă. Virusurile ARN pentru care virusul sarcomului lui Rous a
servit ca principal model, induc transformarea tumorală cu o frecvență în general mai mare decât virusurile ADN. Mecanismul efectului lor transformant este corelat cu integrarea ADN previral de neoformație rezultat din transcrierea inversă. Informația transformantă a genomului virusului sarcomului lui Rous (VSR) este localizată într-o subunitate a genomului, reprezentând aproximativ un sfert din molecula de ARN viral. Datele privind responsabilitatea genetică a diferitelor subunități ale genomului în determinismul efectului oncogen, sunt reduse. Unele fracțiuni au fost identificate ca responsabile pentru modificările din membrana celulară, altele pentru forma celulei. Prin studiul mutantelor transmisibile s-a stabilit că exprimarea fenotipică a efectului transformant depinde de cel puțin două proteine.
La VSR au fost descrise atât virusuri normale, cât și mutante defective. Efectul transformant pare a fi mai puternic la mutantele defective.
Relația între oncogenie și virogenie poate fi de două feluri:
virogenia este însoțită de virogenie; oncogenia nu este însoțită de virogenie, genomul
viral manifestându-și evident prezența.
Virusologie generală
102
Virogenia este în unele cazuri inductibilă, prin activarea (inducția) genomului viral, fie prin metodele clasice deja descrise pentru reactivarea virusurilor integrate, fie prin suprainfecții cu alte virusuri, care de regulă îndeplinesc rolul de helper. Mecanismul prin care virusurile supraadăugate deprimă genomurile integrate, nu este însă prea bine cunoscut.
Ținând seama de cele două tipuri de relații între virogenie și oncogenie menționate, demonstrarea etiologiei virale a unor tumori maligne, consecutiv fenomenului de integrare, se poate realiza prin:
recuperarea virusului transformant; decelarea diferitelor secvențe de ARNm hibrid, care
conțin atât secvențe copiate după genomul viral, cât și după genomul celular.
în cazul integrării complete, prezența genomului nu poate fi totdeauna demonstrată. Imposibilitatea evidențierii, în toate cazurile, a prezenței genomului integrat, a determinat pe unii oncologi să emită ipoteza etiologie virale a tumorilor maligne.
10.1.7.1.Modificările celulelor transformate Reproducerea “in vitro” a efectului oncogen a permis un
studiu aprofundat al însușirilor celulelor transformate care, comparativ cu celulele normale neinfectate cu virusuri oncogene, au următoarele caracteristici:
modificări de formă, evidențiate mai ales la celulele de formă alungită (fibroblaste); celulele tumorale au în general o tendință spre formele sferice;
pierderea nevoii de fixare (ancorare) pe suporturi solide; liniile celulare tumorale se multiplică foarte bine în geluri semisolide de agar sau agaroză;
dispariția inhibiției de contact în dezvoltarea monostraturilor, celulele devenind capabile de a se multiplica supraetajat, rezultând tumori miniaturale,chiar în culturi celulare;
modificări de structură ale membranei se referă mai ales la o creștere cantitativă a glicoproteinelor în compoziția cărora intră fucoza;
accelerarea ritmului de multiplicare;
Virusologie generală
103
modificările de cariotip, de obicei mai accentuate la virusurile ARN, sunt următoarele: heteroploidie mergând până la hipotetraploidie, apariția cromozomilor inelari etc.;
modificările metabolismului celular care constau în: o producție crescută de acid hialuronic, pierderea capacității de sinteză a unor compuși chimici specifici (ex.: producția de pigment din irisul păsărilor infectate cu virusul sarcomului lui Rous), incapacitatea sintezei de molecule mari glicolipidice (sintezele se opresc la nivelul precursorilor sialosilglicolipidici);
Fig. 28 Schema amplasării genelor virale în genomul unei celule transformate. (după Hannoun, 1976)
Virusologie generală
104
apariția de antigeni specifici, cum este cazul antigenului T, prezent la toate celulele transformate; VS 40 determină apariția a trei antigeni noi: T, TSTA și S;
aglutinarea sub acțiunea lectinelor de tipul concanavalinei A; aceasta reacționează cu N-acetilglucozamina prezentă pe suprafața membranelor celulare, mascată la celulele normale și descoperită la cele transformate.
10.1.7.2.Reversia (detransformarea) Efectului transformant este posibilă în anumite condiții.
Astfel, în cazul virusului sarcomului lui Rous, efectul transformant dispare la temperaturi superioare celei de 360C. în celulele transformate de VS 40 s-a constatat apariția de clone cu un mod de dezvoltare în culturi identic cu al celulelor normale. Mecanismul ipotetic al unui astfel de fenomen ar consta în participarea a două categorii de gene virale în producerea transformării tumorale: unele determină “fixarea”, altele “menținerea” efectului transformant; absența genelor de menținere determină astfel detransformarea (după HANNOUN, 1976).
10.1.8.Efectul oncolitic
Unele virusuri, consecutiv multiplicării lor în celulele tumorale, sunt capabile să oprească evoluția sau chiar să provoace regresul și liza tumorii. Efectul oncolitic s-ar explica prin necesitatea, pentru biosinteza virală a unor compuși celulari, indispensabili în același timp și pentru dezvoltarea celulelor tumorale. Degradarea celulelor tumorale le face accesibile fagocitozei, ceea ce crează premizele ramolismentului tumorii.
Utilizarea virusurilor oncolitice în terapia anticanceroasă nu s-a putut realiza datorită faptului că aceste virusuri, pe lângă efectul lor antitumoral, au și o acțiune nocivă pentru sistemul nervos.
Virusologie generală
105
10.1.9.Interferența virală
Organismele sau celulele infectate cu un virus manifestă uneori rezistență față de o infecție simultană sau succesivă cu un alt virus. Acest fenomen poartă numele de interferență. Cele două virusuri interferente sunt:
virusul inductor, care realizează primul infecția și provoacă interferența;
virusul revelator, care se suprapune primului și permite aprecierea efectului interferent al acestuia.
Din punct de vedere al naturii celor două virusuri, interferența poate fi omoloagă, heteroloagă și autointerferență.
în funcție de efectul virusului inductor asupra virusului revelator, interferența poate fi stimulatoare și inhibitoare. Cel de al doile tip este mai frecvent și mai bine studiat.
Primele observații de interferență virală datează din 1935 și se datoresc lui Magrassi și apoi Hoskins, care au constatat că o variantă neencefalitogenă de virus Herpes simplex induce interferența față de varietatea encefalitogenă a aceluiași virus. Observații asemănătoare au fost făcute ulterior de Findlay și Mac Callum (1937). între două mutante, una neurotropă și alta viscerotropă de virus al febrei galbene; Andrews (1942) între două variante, una virulentă și alta nevirulentă de virus al influenței.
Interferența poate fi indusă de un virus viu, cât și de un virus inactivat.
Timpul de inducție al interferenței este foarte scurt, de 1-2 minute în cazul interferenței omologe și mai lung, de 4-5 ore, în cazul interferenței heterologe.
Durata acțiunii interferente depinde și ea de natura celor două virusuri, fiind mai scurtă (26-60 ore) în cazul interferenței omologe și mult mai lungă în cazul celei heterologe.
Gradul de rezistență al virusurilor revelatoare poate fi diferit față de efectul inhibitor al aceluiași virus inductor.
10.1.9.1.Mecanismele interferenței Interferența între două virusuri recunoaște mai multe
feluri de mecanisme:
Virusologie generală
106
Excluderea mutuală în faza de adsorbție: virusul inductor împiedică accesul în celulă al virusului revelator. Acest mecanism a fost demonstrat în unele cazuri de interferență omoloagă între myxovirusuri, la care neuraminidaza din pericapsida virusului inductor distruge receptorii necesari fixării virusului revelator de pe membrana celulei gazdă. Rezistența celulelor față de virusul revelator dispare însă după 26-60 ore, timp în care receptorii se regenerează.
Fenomenul lui Von Magnus descris în 1951, explică
autointerferența în cazul virusului influenței. Von Magnus a constatat că în ouăle embrionate inoculate cu cantități mari de virus al influenței se sintetizează, alături de virionii compleți, și particule defective autointerferența cu virusul complet. Explicația fenomenului pare să rezide în suprasolicitarea dispozitivelor de biosinteză ale celulei care nu mai reușește să traducă integral informația genetică a virusului.
Blocarea replicării intracelulare, în cazul virusurilor
interferente, heterologe, a fost constatată de Lévine (1958) între virusul de Newcastle și virusul WEE și de Chany (1959) între virusul parainfluenței III și virusul poliomielitei. în aceste cazuri, ca și în cazul fenomenului lui Von Magnus, pătrunderea în celulă a virusului revelator nu este împiedicată, dar virusul inductor inhibă replicarea și biosinteza intracelulară a acestuia.
Interferența prin interferoni este mecanismul cel
mai bine studiat și mai răspândit, având la bază sinteza de către celula infectată sub acțiunea virusului inductor a unor substanțe numite interferoni.
10.1.9.2.Interferonii Existența unor substanțe cu efect antiviral, prezente în
celulele infectate, a fost admisă ipotetic înaintea identificării interferonului, încă din 1944, de Garde, în celulele nervoase ale șoarecilor infectați cu virusul encefalomielitei; de Lennette și Koprowski (1946) în culturile celulare infectate cu virusul febrei galbene; de Magamo și Kojimo (1954) în celulele infectate cu virusul vaccinal.
Virusologie generală
107
Isaacs și Lindemann (1957) identifică, fizico-chimic și biologic, substanța mediatoare a interferenței și o numesc interferon.
Compoziția chimică: interferonii sunt glicoproteine macromoleculare, constituite din unități proteice cuplate cu lanțuri polizaharidice, cu grupări terminale de acizi sialici. Masa moleculară depinde de celula producătoare de interferon, variind între 25.000-160.000 daltoni. Uneori, chiar același tip de celule, ca de exemplu globulele albe umane, pot sintetiza interferoni cu mase moleculare foarte diferite. Carter explică variațiile de masă moleculară pornind de la premiza unei unități monomere de 12.000 daltoni, din polimeraza căreia rezultă diferiți interferoni. Coppey presupune că variațiile de masă moleculară se datoresc asocierii întâmplătoare de molecule active cu molecule inactive.
Interferonii grei sunt antigenic distincți de cei ușori. Sensibilitatea interferonilor față de factorii de mediu
este asemănătoare cu cea a celorlalte proteine. Ei sunt distruși prin încălzire la 600C timp de aproximativ o oră și rezistă la variații de pH între limite foarte largi, de la 2 la 10.
Extracția din celulă și purificarea interferonilor este foarte dificilă.
Inducția sintezei de interferon este condiționată de pătrunderea virusului în celulă, indiferent dacă acesta este viu sau inactivat, fapt care atestă inexistența unei corelații între funcția infecțioasă și cea inductoare a virusului. Responsabilitatea inductoare directă pentru sinteza interferonilor revine acizilor virali și mai ales acizilor ribonucleici, ARN bicatenar al reovirusurilor și formele replicative de ARN, nou formate după replicarea genomurilor virale din ARN monocatenar, au o acțiune inductoare deosebit de eficace. Acizii ribonucleici monocatenari sunt în general slab inductori.
Ulterior s-a demonstrat posibilitatea inducției de interferon și cu acizi ribonucleici de origine nevirală cum sunt cei extrași din celule heterologe. Field și col. (1967) au reușit să inducă interferoni cu acizii nucleici de sinteză, cum sunt complexul bicatenar de homocopolimere de acid riboinozinic și acid ribocitidilic.
Virusologie generală
108
Inducția de interferoni sau de inhibitori cu acțiune analoagă poate fi și rezultatul acțiunii unui sortiment variat de substanțe chimice (fitohemaglutinina, statolonul, helenina, ciclohexamida, polimerii anionici sintetici, kanamicina, endotoxinele bacteriene), microorganisme (rickettsiile, micoplasmele, alte bacterii) și paraziți (toxoplasmele).
Mecanismul de acțiune al interferonilor se realizează prin fixarea acestora pe receptorii prezenți la suprafața celulelor. Interferonii se adsorb pe receptori indiferent de temperatură, dar acționează numai la 370C. Interferonii nu acționează asupre virusurilor direct, ci printr-un mecanism cooperant între receptori și un sistem activator, care declanșează sinteza unei proteine antivirale. Acest mecanism de activare nu implică pătrunderea interferonilor în interiorul celulei, fiind suficient numai contactul lor cu receptorii. în celulele tratate cu interferon, proteina antivirală apare în aproximativ 4 ore. Acțiunea acestei proteine se exercită asupra sintezei proteinelor virale precoce, mai ales asupra celor enzimatice, respectiv ARN polimeraze, în cazul virusurilor ARN și a ADN polimerazelor, în cazul virusurilor ADN.
Interferonii sunt lipsiți de specificitate față de un anumit virus, având în general specificitate de celulă și de specie animală, dar și aceasta este relativă. Astfel, s-a constatat că în unele cazuri interferonii produși de celulele unei specii, pot fi activi în celulele altei specii: de exemplu, interferonii elaborați de globulele albe umane pot avea efect și asupra celulelor de maimuță; cei produși de fibroblaste embrionare umane acționează cu un efect chiar mai mare în celulele heterologe de rinichi de iepure etc. în ultimul timp s-a constatat că efectele inhibitorii ale interferonilor asupra sintezei de proteine nu se rezumă numai la cele virale, extinzându-se și asupra proteinelor celulare, fapt care determină la rândul lui diminuarea capacității de multiplicare a celulelor, în special a celor canceroase.
Fournier și col. (1968) au pus în evidență un factor tisular antagonist față de interferon, extras din țesutul corioamniotic uman.
Unele substanțe ca actinomicina D, potențează acțiunea antivirală a interferonilor, mărind-o de 10-100 ori. în același timp, ea este capabilă să anihileze complet efectul
Virusologie generală
109
antiinterferon al factorului tisular menționat. Potențarea acțiunii interferonului pare a fi corelată cu blocarea sintezei unei proteine, care la rândul ei controlează sinteza proteinei antivirale.
Acțiunea interferonului “in vitro” este diferită ca durată și intensitate, de cea “in vivo”. în timp ce în organism efectul antiviral este trecător, în culturi celulare este durabil, transmițându-se la 5-6 generații consecutive.
Determinismul și reglarea genetică a producției și acțiunii interferonilor. Sinteza de interferoni este determinată genetic de secvențe ale genomului celular. Pe baza experiențelor executate de Cassingena și col. (1970), citați de Hannoun (1976), aceste secvențe sunt concentrate într-un mic cromozom subtelocentric. Acesta codifică sinteza interferonului, neavând însă nici o responsabilitate în determinismul rezistenței antivirale, ceea ce constituie un argument în plus pentru independența sintezei interferonului față de infecția virală.
Informația genetică responsabilă de sinteza proteinei antivirale este situată pe un cromozom diferit de cel care codifică sinteza interferonului.
Reglarea sintezei interferonului pare a fi realizată prin 4 mecanisme (după Hannoun, 1976):
acțiunea unor represori (“blocker”, “depresor”), care intervin ca mecanisme de control precoce și tardiv;
retroinhibiția proteinei antivirale asupra genei responsabile de sinteza interferonului;
acțiunea directă a preteinei antivirale asupra acidului nucleic inductor;
acțiunea cooperantă a celor trei mecanisme mai sus citate.
Posibilități de utilizare a interferonilor în profilaxia și terapia infecțiilor virale. Speranțele puse inițial în aplicabilitatea interferonilor, ca mijloc profilactic și terapeutic antiviral, au fost doar parțial satisfăcute, principalele cauze fiind: dificultățile în extracție și purificare, specificitatea de specie și celulă, eliminarea rapidă prin excreții, fragilitatea la acțiunea factorilor de mediu în special la enzime.
Virusologie generală
110
Utilizările cu o oarecare perspectivă sunt orientate în două direcții:
Stimularea producției de interferon endogen prin inocularea de virusuri inactivate ori temperate, a acizilor nucleici de sinteză (acid ribocitidilic) sau a altor substanțe inductoare (statolon). Vaccinarea cu virusuri vii și atenuate, mai ales în cazul unor virusuri ARN, ca de exemplu virusul pestei porcine, produce, pe lângă imunizarea activă și inducția de interferon, efectul profilactic al vaccinului aplicându-se prin cooperarea ambelor mecanisme antivirale.
Administrarea de interferon pe cale intravenoasă, extras pe cât posibil din celule provenind de la specia omoloagă, metodă care a dat rezultate bune mai ales în cazul unor virusuri oncogene.
11. COMPORTAREA VIRUSURILOR
FAȚĂ DE FACTORII DE MEDIU
Sensibilitatea virusurilor față de factorii de mediu, se aseamănă în general cu cea a bacteriilor, cu unele deosebiri determinate de particularitățile morfochimice ale acestui grup de agenți. 11.1. COMPORTAREA VIRUSURILOR FAȚĂ DE FACTORII
FIZICI
Temperatura Inactivarea virusurilor are loc în majoritatea cazurilor la
560C în 30 minute, iar la 1000C în câteva secunde. Mecanismul inactivării constă în denaturarea proteinei virale.
Temperaturile joase au un efect conservant. Pentru păstrarea virusurilor în colecții se utilizează refrigerarea între -400C și –1960C. Virusurile din unele grupe (poxvirusurile, enterovirusurile) se conservă mai bine la temperatura camerei.
Virusologie generală
111
Temperatura optimă pentru multiplicarea virusurilor coincide, în marea majoritate a cazurilor, cu temperatura optimă pentru celula gazdă. în unele cazuri se constată însă un grad de independență relativă între limitele de temperatură favorabile multiplicării și desfășurării celorlalte procese virale ale celulei și limitele de temperatură favorabile multiplicării și producerii unor efecte specifice asupra celulei gazdă ale virusului. Astfel, la bacteriofagii psihrofili, limitele inferioare de temperatură pentru multiplicarea celulelor gazdă nu sunt totdeauna defavorabile multiplicării virusului, în timp ce limitele superioare pot fi favorabile multiplicării celulelor, fără a mai permite multiplicarea virusului.
O comportare asemănătoare se constată la unele mutante termosensibile ale unor virusuri zoopatogene capabile de a se multiplica până la o limită de temperatură situată sub cea favorabilă pentru celula gazdă. Astfel, mutantele termosensibile ale virusului sarcomului lui Rous se multiplică și induc transformarea tumorală la 360, pierzând ambele proprietăți la 40,50C. Această temperatură este nepermisivă și restrictivă față de mutantele respective.în cazul altor mutante ale aceluiași virus, temperatura poate să nu afecteze multiplicare, inhibând însă efectul transformant.
Reacția febrilă a organismului în cursul infecției, trebuie considerată ca un mijloc eficace de apărare antivirală, nivelurile de temperatură realizate prin hipertermie fiind de cele mai multe ori defavorabile multiplicării virusului, fără a fi nocive celulei gazdă.
Variațiile de pH Limitele de pH în care majoritatea virusurilor își mențin
viabilitatea se situează între 5-9. Unele virusuri sunt însă capabile să reziste la valori scăzute ale pH-ului în zona acidă. Astfel, rhinovirusurile sunt distruse abia la pH 5,3 iar enterovirusurile își păstrează infecțiozitatea și la pH 2,2, (după Buxton și Fraser, 1977). Rezistența la pH 3 constituie, pentru unele virusuri, un criteriu taxonomic.
Energia radiantă Radiațiile cele mai active față de virusuri sunt
ultravioletele. în doze mari, ele au un efect virulicid atât asupra acizilor nucleici, cât și asupra proteinelor virale. Lumina ultravioletă cea mai activă este cea cu lungimea de undă cea
Virusologie generală
112
mai mică, între 2600 și 2350 Å. De aceea, pentru sterilizarea camerelor de lucru se preferă lămpile de ultraviolete cu vapori de mercur, care emit radiații de 2537 Å. Efectul ultravioletelor asupra virusurilor incluse în materiale celulare, este diminuat, particulele virale fiind protejate de substanța organică care le acoperă.
Iradierea cu ultraviolete în doze mici a populațiilor celulare care conțin virusuri sub formă integrată, determină reversia virusului integrat și trecerea lui la forma de virus vegetativ cu reluarea ciclului productiv. Acest efect este utilizat curent în practica de laborator pentru recuperarea bacteriofagilor din culturile lizogene. 11.2. COMPORTAREA VIRUSURILOR FAȚĂ DE FACTORII
dezinfectanți cu efect antiviral, mai ales în stare firbinte. Agenții oxidanți cu acțiune antiseptică (permanganatul
de potasiu, peroxidul de hidrogen) și dezinfectantă (varul cloros, cloramina), pot fi utilizați în același scop cu bune rezultate.
Amestecul de 10% oxid de etilenă și bioxid de carbon reprezintă un dezinfectant gazos foarte eficace.
Formaldehida este activă, dar acțiunea ei antivirală este mai lentă. Ea se utilizează însă curent la prepararea vaccinurilor inactivate, concentrațiile reduse nealterând proprietățile antigenice și imunogene ale virusurilor. Efectul antiviral al formaldehidei este mai puternic asupra ARN monocatenar și ceva mai redus față de acizii dublu catenari.
Fenolul și crezolii au o slabă acțiune antivirală. Solvenții lipidelor Sensibilitatea la eter și cloroform
reprezintă un important criteriu taxonomic pentru virusuri. Acțiunea antivirală a eterului și cloroformului, după cum și cea a fosfolipazei și a deoxicolatului de sodiu, se exercită asupra
Virusologie generală
113
complexului glicoproteic din pericapsidă. Virusurile nude sunt de obicei insensibile la acțiunea solvenților lipidelor.
Glicerina Spre deosebire de bacterii, la care glicerina acționează constant antibacterian față de celulele vegetative și conservant față de spor, virusurile au o comportare diferențiată. Pentru marea majoritate a virusurilor și mai ales a poxvirusurilor, glicerina este un bun conservant, o soluție salină de glicerină 50% asigurând supraviețuirea virionilor pe timp de mai multe luni și chiar ani. Un număr redus de virusuri, ca de exemplu virusul pestei bovine, sunt sensibile la glicerină.
11.3. SUBSTANȚE CHIMIOTERAPEUTICE ȘI ANTIBIOTICE
Substanțele de uz curent pentru terapia antibacteriană (sulfamidele, penicilina, streptomicina, tetraciclinele etc.) sunt inactive față de virusuri. Ele se utilizează de obicei pentru aseptizarea materialelor virale și intră în compoziția mediilor pentru culturile celulare în scopul evitării contaminării bacteriene. Cu toate că nici o substanță chimioterapeutică sau antibiotică n-a intrat până în prezent în practica largă a terapiei antivirale, s-au studiat în ultimii ani numeroase substanțe care acționează prin diferite mecanisme asupra ciclului de multiplicare al virusurilor, dintre care unele cu perspective de introducere în terapie. Acestea se pot clasifica, pe baza mecanismului lor de acțiune, în trei categorii mai importante: inhibitori ai pătrunderii virusurilor în celulă, inhibitori ai replicării sau biosintezei și inductori de interferoni.
11.4 INHIBITORI AI PĂTRUNDERII VIRUSULUI îN CELULĂ
Izochinolinele acționează prin efectul lor
antineuraminidazic. Ele sunt active mai ales supra myxovirusurilor, la care viropexia este facilitată de neuraminidaza din compoziția pericapsidei. Se pare că efectul antineuraminidazic, evident “in vitro”, nu se corelează cu
Virusologie generală
114
acțiunea antivirală “in vivo”, unde izochinolinele intervin prin blocarea decapsidării.
Amantadina este o amină triciclică, care acționează prin blocare sau interferare a procesului de pătrundere a virusului în celulă, la nivelul membranei celulare. Kato și Eggers, citați de Fenner, 1974, susțin că amantadina blochează decapsidarea. Ea este activă mai ales față de orthomyxovirusuri, majoritatea paramyxovirusurilor fiind rezistente. Experiențele pe animale de laborator și pe voluntari umani au dovedit un oarecare efect “in vivo” față de virusul gripal, prin reducerea sensibilă a procentului de morbiditate.
Ciclooctilamina hidroclorică are un efect similar amantadinei și este activă față de un număr mare de virusuri ARN.
11.5. INHIBITORI AI REPLICĂRII SAU BIOSINTEZEI
Substanțele din această categorie pot acționa la rândul
lor prin mai multe feluri de mecanisme, printre care cele mai importante sunt: acțiunea antagonică față de bazele azotate și inhibarea transcrierii informației genetice sau a traducerii ei în sinteza proteinelor.
A. Substanțe cu acțiune antagonică față de bazele
azotate Derivații halogenați ai deoxiuridinei din care fac
parte iododeoxiuridina (IUDR), fluorina, bromina etc. Aceste substanțe intervin în momentul replicării ADN, fie împiedicând transcrierea timinei pe lanțul complementar, fie substituindu-se acesteia în catena nou transcrisă. Un alt mod de acțiune poate fi inhibarea acțiunii ARN polimerazei ADN dependente, ceea ce împiedică sinteza ARNm viral.
Efectul antiviral al acestor substanțe s-a confirmat în prezent experimental în cazul unor herpesvirusuri.
B. Substanțele inhibitoare ale transcrierii sau
traducerii informației genetice Chimioterapice
Virusologie generală
115
Tiosemicarbazonele, utilizate și ca tuberculostatice, par să acționeze în timpul traducerii informației în faza de biosinteză a proteinelor tardive, împiedicând constituirea poliribozomilor. în culturi celulare, efectul antiviral s-a manifestat numai față de orthomyxovirusuri.
Guanidina acționează numai “in vitro” prin inhibarea codificării ARN monocatenar la picornavirusuri.
Hidroxibenzilbenzimidazolul are un mod de acțiune identic cu al guanidinei.
Ambele substanțe sunt total lipsite de toxicitate pentru celula animală, dar perspectivele introducerii lor în terapia antivirală sunt limitate de ușurința cu care virusurile dau nuanțe rezistente.
Arabinofuranozilnucleozizii activi mai ales față de herpesvirusuri, dar și față de alte virusuri cu efect transformant oncogen, au un mecanism insuficient lămurit. Perspectiva introducerii lor în practică este relativ redusă, datorită faptului că au și un efect citotoxic.
Antibiotice Rifampicina este o hidrolizină a rifampicinei B extrasă
din Streptomyces mediterranei, care blochează acțiunea ARN polimerazei ADN dependente. în prezent, se experimentează posibilitatea utilizării acestui antibiotic în tratamentul leucemiei și al altor boli tumorale cu etiologie virotică.
Aranotina extrasă din ciuperca Arachniotus aureus, acționează asupra picornavirusurilor, inhibând sinteza ARN polimerazei ARN dependente. ARN polimerazele ADN dependente sunt insensibile la aranotină.
LL – S88 este un metabolit extras din tulpini de Aspergillus terreus și are o acțiune asemănătoare cu aranotina, inhibând multiplicarea în culturi celulare a unor picorna și myxovirusuri.
11.6. INDUCTORI DE INTERFERONI
Substanțele inductoare de interferoni pot substitui virusurile care îndeplinesc același rol. Inducția sintezei de
Virusologie generală
116
interferon, cu ajutorul unor substanțe chimice, chiar la organismele sau celulele infectate, s-a dovedit mult mai rentabilă decât extracția și purificarea interferonilor din celule.
Substanțele cele mai eficace ca inductori de interferoni sunt polinucleotidele sintetice (analogi ai acizilor nucleici), diferite substanțe chimice de sinteză și unele antibiotice.
a) Polinucleotide sintetice Acidul poliriboinozinic și acidul poliribocitidilic (poli I
– poli C). Cele mai sensibile față de interferoni induși de analogii sintetici ai acizilor nucleici sunt virusurile ARN. La om s-au obținut rezultatele bune prin administrarea pe cale intranazală în cazul unor rhinovirusuri. în condiții experimentale, pe cale intramusculară, s-a obținut protecția iepurilor față de virusul rabic. în cazul unor virusuri cu efect transformant, administrarea de poli I – poli C a adus la inhibarea procesului oncogen. Pe lângă acțiunea lor antivirală, aceste substanțe s-au dovedit a avea și un efect supresiv față de dezvoltarea unor tumori cu etiologie nevirală, după cum și unele proprietăți antibacteriene.
b) Compușii chimici de sinteză Tilorona este un inductor de interferon cu masă
moleculară redusă, administrabil oral. La șoareci, în condiții experimentale, conferă protecție față de mai multe virusuri, dar are un grad de toxicitate față de sistemul hematopoetic și cel reticuloendotelial. “in vitro” este inactiv.
c) Antibiotice Statolonul este un extract din Penicillium stoloniferum.
Ciuperca s-a dovedit însă a fi infectată cu un mycofag al cărui genom este constituit din ARN dublu catenar, iar acestuia i se atribuie principala responsabilitate în inducția interferonului. Spectrul de activitate al statolonului este foarte larg, cuprinzând virusuri ARN, cât și ADN.
Helenina este extrasă din Penicillium funiculosum și are un efect asemănător cu statolonul.
Imposibilitatea reproducerii transfecției la mai multe grupe de virusuri (pox, herpes, adeno etc.) poate fi atribuită mai multor cauze, cum ar fi:
dificultățile tehnice în purificarea acizilor nucleici;
Virusologie generală
117
prezența în genomul viral a unei proteine (transcriptaze) legate de ADN care intervine sau ajută transcrierea informației genetice;
existența unui anumit situs intracelular care determină o topografie precisă, corelată cu capacitatea de substituire a genomului celular cu cel viral.
Lărgirea spectrului de infecțiozitate al acizilor nucleici consecutiv purificării, deschide noi perspective biologiei și medicinei viitorului datorită crerii posibilităților de vindecare a unor leziuni metabolice și genetice prin materialul genetic necesar remedierii cu ajutorul ADN al unui fag transductor.
Virusologie generală
118
V I R U S O L O G I E S P E C I A L Ă
12. CLASIFICAREA VIRUSURILOR
12.1. PRINCIPII DE CLASIFICARE Problema clasificării virusurilor este încă nerezolvată; ea formează obiectul de studiu al unui comitet internațional, care în 1976 a făcut o prezentare a stadiului la care s-a ajuns cu privire la stabilirea criteriilor taxonomice și alegerea unei nomenclaturi adecvate. Principalele concluzii formulate sunt:
codul de clasificare și nomeclatură folosite la bacterii nu poate fi aplicat la virusuri;
adoptarea unei nomenclaturi internaționale latine este absolut necesară;
nume de persoane nu vor fi admise în nomenclatura taxonilor;
numere, litere sau combinații de numere cu litere se vor accepta în componența taxonilor;
specia tip este studiată complet din punct de vedere genetic și grupează virusurile cu caractere identice;
genul cuprinde specia tip specii cu un anumit număr de caractere comune, iar în compoziția apelativului fiecărui gen intră sufixul “virus” (ex.: genul Aphtovirus);
familia grupează genuri cu caractere comune, iar denumirea ei se termină totdeauna cu sufixul “viridae” (ex.: familia Picornaviridae).
Unele familii grupează subfamilii cu caractere comune, iar denumirea lor se termină totdeauna cu sufixul “virinae” (ex. familia Paramyxoviridae, subfamilia Pneumovirinae și Rhabdovirinae).
Virusologie generală
119
12.2.CRITERIILE TAXONOMICE APLICATE LA VIRUSURI
Familiile (grupele), subfamiliile, genurile și speciile tip au la bază următoarele criterii taxonomice:
felul acidului nucleic constituient al genomului viral: ADN sau ARN;
structura acidului nucleic: monocatenar sau dublu catenar;
masa moleculară a acidului nucleic și proporția exprimată procentual a masei acidului nucleic raportată la masa totală a virionului;
proporția G + C% raportată la masa genomului; forma și sturctura învelișului particulei virale:
- prezența sau absența învelișului pericapsidal; - tipul de simetrie al capsidei: helical,
icozaedral, binal, complex; - numărul capsomerelor;
gazda receptivă și modul de transmitere al virusului.
La aceste criterii de bază, în definirea taxonilor la virusuri, se mai pot adăuga și altele, utile mai ales în practica curentă a diagnosticului virusologic și anume:
proprietăți antigenice; proprietățile hemaglutinante sau
hemadsorbante; caracterul leziunilor din infecția naturală: cele
produse la animalele de laborator infectate experimental și la embrioni de găină; aspectele citologice în culturi celulare;
sensibilitatea față de unii factori fzici și chimici: temperatura de 600C, pH 5, eter, cloroform.
Pe baza criteriilor de mai sus, virusurile au fost încadrate în phylum “Vira” împărțit în două subphyla pe baza naturii chimice a genomului viral:
- Dezoxivira, - Ribovira.
Virusologie generală
120
În funcție de simetria capsidei - helicoidală sau cubică, virusurile se grupează în clase: - dezoxihelica și dezoxicubica,
- ribohelica și ribocubica. În continuare clasificarea actuală se limitează la
definirea familiilor, subfamiliilor și genurilor virale, speciilor tip și speciilor cu caractere comune la acestea. S-a stabilit un consens privind acceptarea unei nomenclaturi latine cu terminațiile:
- viridae pentru familii; - virinae pentru subfamilii; - virus pentru gen; Exemplu: - familia Coronaviridae genul Coronavirus sau
- familia Parvoviridae genul Prvovirus. Conform criteriilor de clasificare taxonomică
enumerate anterior și în funcție de gazdă, virusurile au fost clasificate în 5 grupe:
virusuri parazite pentru nevertebrate; virusuri parazite pentru bacterii; virusuri parazite pentru alge, fungi și protozoare; virusuri parazite pentru vertebrate; virusuri parazite pentru plante.
În tabelul nr.5 sunt prezentate, virusurile parazite pentru animale și entitățile morbide pe care le determină. Acest grup (tabelul 5) cuprinde 19 familii, fiecare la rândul ei incluzând genuri de virusuri care produc îmbolnăviri la animale:
Specia tip a genului -Parvoviroza canină -Parvoviroza porcină -Panleucopenia felină -Parvoviroza canină -Enterita virală a nurcilor -Boala de Aleutină -Boala lui Derzsy
Specia tip a genului Circoviroza aviară -Circoviroza porcină -Boala penajului și ciocului la psittacine
15
PAPOVAVIRIDAE
Papy-lomavirus
Virusul papilomatozei iepurelui V.papylomatozei
Specia tip a genului Papilomatoza bovină
Polyomavirus
V.Simian 40 Specia tip a genului
16
ADENO-VIRIDAE
Mastadenovirus
Adenovirusul uman C Adenovirusuri mamifere V. hepatitei V. traheo-bronșitei
Specia tip a genului -Pneumoarterita cu adenovirus la bovine -Infecții cu adeno-virusuri la cabali-ne, ovine, porcine -Hepatita infecțioasă canină -Traheobronșita infecțioasă canină
Virusologie generală
137
Nr crt
Familia
Sub-
familia
Genul
Specia
Entitatea produsă
Aviadenovirus
Adenovirusul A aviar Adenovirusuri aviare 1-11
Specia tip a genului
-Sindromul EDS’76 -Hepatita cu incluzii -Splenomegalia puilor-Enterita hemoragică a curcilor
V. sheeppox V. goatppox V. lumpy skin disease V.bolii lui Auzduk
Specia tip a genului -Variola caprelor -Variola oilor -Dermatita virală nodulară -Ectima contagioasă a cămilei
Suipoxvirus
V. swinepox Specia tip a genului -Variola suină
Virusologie generală
141
Nr crt
Familia
Sub-
familia
Genul
Specia
Entitatea produsă
Leporipoxvirus
V. mixoma V. fibromului Shope
Specia tip a genului -Mixomatoza iepurilor -Fibromatoza iepurilor
Avipoxvirus
V. fowlpox Specia tip a genului -Variola aviară -Variola porumbeilor
Molluscipoxvirus
V.contagios al moluștelor
Specia tip a genului
Yatapoxvirus
V.tumorii maimuțelor
Specia tip a genului
Nr crt
Familia
Sub-
familia
Genul
Specia
Entitatea produsă
0 1 2 3 4 5
20
IRIDOVIRIDAE
Ranavirus
V.3 al broaștelor
Specia tip a genului
Lymphocystivirus
V.1 al limfocitozei
Specia tip a genului
21
ASFARVI RIDAE
Asfivi-rus
V.pestei porcine africane
Specia tip a genului
22
BORNA- VIRIDAE
Borna-virus
V. bolii Borna
Specia tip a genului -Boala de Borna -
23
FILOVIRIDAE
Magburg-like viruses
“Magburg virus”
Specia tip a genului
Virusologie generală
142
Nr crt
Familia
Sub-
familia
Genul
Specia
Entitatea produsă
“Ebola-like viruses”
“Zaire Ebola virus”
Specia tip a genului
24
ARENAVIRIDAE
Arenavirus
V. coriomeni-ngitei limfocitare
Specia tip a genului
Arteri-virus
V.arteritei ecvine
V.sindro-mului respirator și de infertilitate
Specia tip a genului -Arterita ecvină -Sindromul
respirator și de infertilitate porcin
25
ASTROVIRIDAE
Astrovirus
Astrovirusul uman 1
Specia tip a genului
26
NODAVI-RIDAE
Betanodavi-rus
V. necrozei țesutului nervos
Specia tip a genului
AGENȚI SUBVIRALI
Viroizii
Sateliți dc AND Satelit sc ARN Satelit
Agenți ai Encegalopatiei spongiforme
Specia tip: agentul scrapiei
Rubricile hașurate reprezintă modificările taxonomice realizate conform celui de-al VII-lea Raport al Comitetului Internațional de Taxonomie Virală. Rubricile cu săgeată reprezintă modificările taxonomice realizate conformul ultimului Raport al Comitetului Internațional de Taxonomie Virală.
Prezentarea în continuare a familiilor, subfamiliilor și a genurilor virale patogene pentru animale, se va face după natura genomului viral, în sensul că, întâi vor fi prezentate dezoxiribovirusurile și apoi ribovirusurile.
Virusologie generală
143
CLASA DEZOXIVIRA
Familia POXVIRIDAE
Numele taxonului derivă din cuvântul “poc (pocc)” care, în engleza veche, înseamnă pustulă, ulcer, leziune caracteristică infecțiilor cu aceste virusuri.
Poxvirusurile au genomul constituit din ADN dublu catenar, cu masa moleculară de 130-240 x 106, reprezentând 5-7,5% din masa virionului; proporția G + C este de 33-40% la genurile parazite pentru vertebrate și 26% la cele patogene pentru insecte.
Dimensiunile virionilor sunt de 300-450/170-260 nm. Poxvirusurile sunt cele mai mari virusuri.
Genurile și speciile conțin în jur de 10 antigeni majori, prezența unora la mai multe specii permițând reacții încrucișate între majoritatea poxvirusurilor parazite pentru vertebrate.
Cu toate că genomul lor este ADN, poxvirusurile se asamblează în citoplasmă, unde produc incluzii. Eliberarea virionilor din celulele gazdă are lor fie prin intermediul unor microvili, fie consecutiv morții și descompunerii celulei.
Activitatea hemaglutinantă și sensibilitatea față de solvenții lipidelor este în funcție de gen (subgrupă).În cadrul familiei Poxviridae se disting 2 subfamilii:
Chordopoxvirinae, cuprinzând virusurile vertebratelor și
Entomopoxvirinae, cele ale insectelor. Subfamilia Chordopoxvirinae include 6 genuri sau subgrupe:
Subfamilia CHORDOPOXVIRINAE Genul ORTHOPOXVIRUS (subgrupa Vaccinia) Virusurile din acest gen sunt rezistente la eter și produc,
în celulele infectate, o hemaglutinină antigenică, sub forma unei particule bogată în lipide, cu diametrul de 50-65 nm, separată de virion. Celelalte caractere se identifică cu cele ale familiei.
Orthopoxvirusurile produc variola la una sau mai multe specii de vertebrate; ele sunt înrudite antigenic, iar între ele sunt posibile recombinări genetice.
Principalele specii sunt: Virusul variole umane (Smallpox). Variola umană avea în trecut o răspândire foarte largă datorită difuziunii epidemice. Astăzi aria ei geografică s-a restrâns foarte mult datorită eficacității vaccinului. În leziunile naturale și experimentale, virusul formează incluzii intracitoplasmatice numite corpusculii lui Guarnieri. Virusul variolei bovine (Cowpox) Nediferențiat până la mijlocul secolului XIX de virusul vaccinal, produce și astăzi, în condiții naturale, variola la vaci, a cărei arie geografică s-a limitat foarte mult în ultimii ani. Morfologic, biochimic și antigenic este foarte apropiat de virusul vaccinal, de care se deosebește prin următoarele caractere:
- pustulele produse în membrana corioalantoidiană sunt mai mici,
- incluziile intracitoplasmatice sunt mai mari și mai intens acidofile,
- necroza epitelială este mai rapidă și tendința de invazie a țesutului mezodermic, inclusiv a endoteliilor capilare, este mai accentuată.
Virusologie generală
145
Virusul vaccinal (Poxvirus officinale) Este un virus de laborator utilizat în vaccinarea antivariolică la om. Asupra originii lui există unele îndoieli, dacă provine din virusul variolei bovine sau dacă este un recombinant genetic între acesta și virusul variolei umane. Antigenic, el este mai apropiat de virusul variolei umane decât de cel al variolei bovine. Virusul vaccinal își are originea în primul vaccin preparat de Jenner în 1796. În prezent el nu mai are nici un corespondent identic în stare sălbatică. Tulpinile de virus vaccinal sunt încadrabile în două variante:
- una dermotropă, care produce o pustulă la iepure în cazul inoculării intradermice, pe cale intracerebrală este nepatogenă,
- una neuroptopă, care inoculată intracerebral la iepure produce o encefalită.
În celulele infectate se găsesc incluzii intracitoplasmatice iar în limfa veziculelor poate fi observat chiar virusul în frotiuri colorate prin metoda Giemsa, sub formă de corpusculi elementari Paschen.
Hemaglutininele prezente la suprafața virionului sunt termostabile, de natură lipoproteică, produc aglutinarea eritrocitelor de curcan și în proporție de aproximativ 50% a celor de găină.
Cultivarea se realizează în bune condiții pe ouă embrionate, în care apar leziuni caracteristice în membrana corioalantoidiană; virusul se dezvoltă la fel de bine într-un variat sortiment de culturi și linii celulare.
Antigenic, este strâns înrudit cu virusurile variolei umane, variolei bovine și ectromeliei.
Infecții cu virusul vaccinal sunt semnalate în următoarele împrejurări: la lucrătorii din laboratoarele în care este manipulat virusul, la copii consecutiv vaccinării antivariolice și la vaci prin contaminare de la mulgătorii recent vaccinați. Virusul ectromeliei (Mousepox) Produce în crescătoriile de șoareci o infecție caracterizată prin formarea de tumefacții edematoase, urmate de necroze la nivel cutanat (mai ales la extremități) și în organele interne. Morfologic,
Virusologie generală
146
cultural și antigenic, virusul electromeliei este foarte apropiat de virusul vaccinal cu care de altfel șoarecii pot fi imunizați prin scarificre. Alte specii din genul Orthopoxvirus sunt virusurile care produc infecțiile variolice la bivol, cămilă, maimuță și iepure. Genul AVIPOXVIRUS (subgr. virusurilor variolelor aviare) Genul cuprinde mai multe specii înrudite, este nehemaglutinant și eterrezistent. Incluzii citoplasmatice bogate în lipide (incluziile Bollinger) sunt prezente în celulele epiteliale infectate. În leziuni se găsesc corpusculi elementari evidențiabili prin metoda Giemsa, de 330/280 nm, corpusculi Borrel.
Virusurile variolelor aviare se cultivă în ouă embrionate, multiplicându-se mai ales în epiteliul membranei corioalantoidiene. Frecvent, produc și leziuni macroscopice ale membranei, constând în apariția unor zone de opacitate sau chiar a unor mici noduli proliferativi. La examenul electronomicroscopic se evidențiază leziuni celulare caracteristice, cum ar fi: prezența virusurilor în fagozomi existența unor zone de replicare si morfogeneză virala si existenta incluziilor Bollinger. (M.Carp-Cărare , 1994) Virusuri variolice aviare au fost descrise până în prezent cu specificitate pentru următoarele gazde: găină, porumbel, curcă, canar, vrabie, prepeliță, graur; primele patru sunt mai răspândite și mai bine studiate. Avipoxvirusurile sunt înrudite antigenic între ele și distincte de celelalte virusuri variolice.
Virusurile variolice au valoare imunogenă și se pretează pentru prepararea unor vaccinuri eficiente atât sub formă vie și atenuată, cât și sub formă inactivată. Ca tulpini vaccinale se pot folosi atât virusuri homoloage, cât și virusuri heterologe. Astfel, pentru vaccinarea găinelor se poate utiliza un vaccin galinar, dar și unul columbar. Vaccinarea porumbeilor se face cu virusul de curcă. În ultimii ani a existat tendința de introducere în practica imunizării antivariolice aviare a vaccinării colective
Virusologie generală
147
prin aerosoli solizi, materialul viral fiind amestecat cu pulberi inerte, ca de exemplu bentonita. O astfel de metodă a fost experimentată la noi în țară de Carol-Dumitriu Emilia și col. (1978). Genul CAPRIPOXVIRUS
(subgr. virusului variolei ovine) Din această subgrupă fac parte virusul variolei ovine și cel al variolei caprine. Virionii sunt mai alungiți comparativ cu celelalte virusuri variolice, nu conțin hemaglutinine și sunt entersensibili. Transmisia se realizează frecvent prin artropode, care îndeplinesc însă rolul de vectori mecanici. Virusul variolei ovine numit în literatura franceză și clavelee, produce infecții foarte grave, cu evoluție epizootică. În limfa variolică sunt prezenți corpusculi elementari de 200/115 nm. Virusul se poate cultiva în culturi celulare renale de oaie și capră, producând în 4-6 zile un efect citopatic care se limitează de obicei la 50% din monostrat. Pe fibroblaste testiculare de oaie se obține un titru mai ridicat, iar efectul citopatic este mai rapid și mai intens.
Virusul variolei ovine este bine individualizat antigenic, datele privind posibilele înrudiri antigenice cu virusul variolei caprelor și virusul Orf fiind controversate; ele par a fi valabile în funcție de zona geografică, apropierea focarelor și alți factori.
Virusul este imunogen și se pretează la prepararea de vaccinuri. Imunizarea prin practica empirică a variolizărilor este semnalată ca una din cele mai vechi, dacă nu chiar prima metodă de imunizare activă printr-o infecție dirijată, fiind aplicată de ciobani încă din antichitate.
Astăzi se folosesc vaccinuri vii, atenuate sau inactivate. Vaccinurile vii conferă stări de imunitate mai solide. În unele țări (U.R.S.S., China) s-au obținut rezultate bune cu tulpini avianizate. Substanțe adjuvante adecvate, mai ales în cazul vaccinurilor inactivate, sunt hidroxidul de aluminiu și betapropiolactona. La noi în țară s-a folosit un vaccin inactivat
Virusologie generală
148
și adsorbit pe hidroxid de aluminiu (Stamatin, 1954); de mai mulți ani, țara noasrtă este indemnă de variolă ovină.
Virusul variolei caprine produce la această specie o
formă de variolă benignă, cu un grad de incidență mai redus. Virusul exantemului nodular sau dermatitei nodulare
(Lumpy skin) a bovinelor este asemănător cu virusul vaccinal, dar distinct antigenic de acesta și produce erupții nodulare cutanate cu tendință spre necroză.
Genul LEPORIPOXVIRUS (subgr. mixomatozei)
Genul cuprinde mai multe specii patogene pentru iepure și veveriță, dintre care mai importante sunt virusul mixomatozei și cel al fibromului lui Shope.
Virusul mixomatozei, asemănător cu virusul vaccinal,
are dimensiunile de 280/230 nm, se cultivă în culturi de celule de șobolan, hmaster, iepure, pasăre, om. În celulele renale produce un efect citopatic caracterizat prin leziuni vacuolizante ale nucleilor și incluzii mari intracitoplasmatice. Cultivat în ouă embrionate, produce leziuni distincte în membrana corioalantoidiană cu diametrul de 0,5-1 mm.
Infecția naturală (mixomatoza), specifică iepurilor este originală din Uruguay și Brazilia, unde a fost semnalată prima oară la specia Sylvilagus brasiliensis. Virusul a difuzat ulterior în Europa și alte continente. Anatomoclinic, infecția se caracterizează prin tumori cutanate moi, cu prezența unui exudat mucos, localizate predominant în regiunea capului. Virusul este transmisibil prin contact și prin insecte, mai ales tânțari, în organismul cărora virusul poate fi purtat până la 7 luni.
Virusologie generală
149
Genul PARAPOXVIRUS Virionii au o structură foarte asemănătoare cu cea a
virusului vaccinal, dar sunt mai mici, având 290/160 nm. Virusurile din acest grup sunt: virusul Orf, virusul pseudovariolei bovine și virusul stomatitei papulare bovine.
Virusul Orf este agentul unei dermatite infecțioase a oilor, localizată la nivelul buzelor, cunoscută sub denumirile de: ectima contagioasă, dermatita pustuloasă contagioasă, Scabby mouth.
Virusul are o formă ovală și se cultivă cu ușurință în ouă embrionate și în culturi celulare embrionare, cutanate și renale ovine, celule testiculare ovine și bovine etc., producând un efect citopatic evident. În condiții experimentale este inconstant patogen pentru iepure.
Ectima contagioasă are un caracter enzootic, benign, fiind ușor diagnosticabilă și tratabilă. Imunizarea activă cu un vaccin viu, preparat din cruste uscate și suspendate 1% în soluție fiziologică glicerinată 50%.
Genul SUIPOXVIRUS
Virusul variolei porcine produce infecții mai ales la
tineret. Virionul, asemănător cu cel al virusului vaccinal, este însă mai mare, având dimensiunile de 320/280 nm. Cu toate că inumodifuzia relevă existența unei fracțiuni antigenice comune cu virusul vaccinal, nici unul din cele două virusuri nu imunizează față de celălalt. Cultivarea nu este posibilă pe embrioni de găină, realizându-se cu destulă dificultate numai pe celule embrionare renale, testiculare, pulmonare etc. ale speciei naturale respective.
Poxvirusuruile neclasificate sunt cele care produc Molluscum contagiosum o infecție la om caracterizată prin formarea de tumorete moi la nivelul pielii, virusul Yaba, agentul unor tumori subcutanate la maimuță, virusul variolei equine și Tanapoxvirusul, patogen pentru maimuță și om.
Virusologie generală
150
Familia HERPESVIRIDAE
Particulele virale sunt constituite dintr-o nucleocapsidă cu diametru de 120-150 nm, învelită de un peplos lipoproteic. Capsida icozaedrală, formată din 162 capsomere. Genomul este format din ADN dublu catenar, iar proporția G + C este 33-74%. Masa moleculară a genomului este de 92-102 x 106. Multiplicarea herpesvirusurilor începe în nucleu și se completează cu compușii glico-lipoproteici în timpul trecerii virusului prin stratul intern al membranei nucleare spre reticulul endoplasmatic. Incluziile intranucleare sunt prezente la majoritatea cazurilor. Majoritatea herpesvirusurilor sunt lipsite de proprietăți hemaglutinante. Genul HERPESVIRUS Din această familie face parte un singur gen –Herpesvirus-, care cuprinde mai multe specii patogene pentru om și animale. Numele familiei și genul provine de la numele leziunii (herpes) produsă de specia reprezentativă a acestor taxoni.
HERPESVIRUSURI PATOGENE PENTRU MAMIFERE
Virusul Herpes simplex – varicella – zoster Virusul este patogen pentru om la care produce trei afecțiuni:
herpesul, o infecție benignă localizată cel mai frecvent la buze;
varicella, o boală eruptivă cutanată întâlnită mai ales la copii;
Virusologie generală
151
zona-Zoster, o erupție cutanată dureroasă localizată pe traiectul unui nerv intercostal.
Morfologic, virionul are caracterele specifice familiei și genului. Se cultivă cu ușurință pe membrana corioalantoidiană a
embrionului de găină, în grosimea căreia produce leziuni mici proliferative, în diferite culturi și linii celulare (HeLa, BHK-21).
Virusul bolii lui Aujeszky
Istoric Existența virusului a fost demonstrată în 1902 de către Aujeszky, care a transmis boala prin inoculare de material patologic de la bovine și carnasiere la iepure. La noi în țară, primele cercetări s-au efectuat în perioada 1914-1920 de către Riegler cu diferiți colaboratori. Datorită extinderii virusului, mai ales la specia porcină, cercetările au avut în ultimile decenii o amploare deosebită, contribuții mai importante aducându-și, printre alții, Vechiu A, Jivoin P., Berbinschi C., Popovici I., Bran L., Cure C., etc.
Structura virionului Forma particulei virale este sferică, cu diametrul de 110-150. S-au evidențiat însă și particule mai mari, ajungând la 230 nm. Nucleocapsida singură are aproximativ 100 nm. ADN dublu catenar are masa moleculară de 68-70 x 106 daltoni. Capsida este icozaedrală și compusă din 162 capsomere, din care 150 hexoni și 12 pentoni. Capsomerele au o formă alungită, 12 nm lungime și 9 nm lățime și delimitează un lumen central de 4 nm.
Nucleocapsida poate fi învelită de o pericapsidă, în care caz diametrul întregului virion ajunge la 180 nm. Proeminențele de la nivelul vârfurilor au 8-10 nm lungime.
Cultivabilitate Comparativ cu alte virusuri, este mai ușor cultivabil atât în ouă embrionate cât și pe diferite culturi celulare. Pe embrion necesită o prealabilă adaptare, după care se multiplică bine mai ales în celulele membranei corioalantoidiene. Mai ușor se izolează virusul în culturi de celule renale, testiculare de porc, producând constant efect citopatic. Prin treceri pe culturi celulare și pe embrioni, virusul se atenuează.
Efectul citopatic poate fi de două tipuri: 1. unul caracteristic prin apariția de granule în
citoplasmă urmat de transformarea celulelor
Virusologie generală
152
în forme sferice, refringente, grupate în pachete;
2. altul în care predomină formele de fuziune celulară cu formarea de sinciții (polikarioni).
În monostraturi acoperite cu agar după adsorbția virusului se pot forma, după aproximativ 4-6 zile de incubație, plaje.
Efectul incluziogen Similar altor herpesviride, virusul bolii lui Aujeszky formează incluzii intranucleare. O singură incluzie mare ocupă aproape tot nucleul, cromatina fiind împinsă la periferie unde formează un inel marginal. Incluziile cu acest aspect reprezintă tipul Cowdry A și sunt deosebite de tipul Cowdry B, tot intranucleare, dar mai mici și în număr variabil. Incluziile constituite de herpesvirusuri nu conțin material viral; ele sunt în realitate artefacte, adică locul gol rămas după migrarea virusului în afara nucleului.
Sensibilitatea față de factorii ecologici Virusul este sensibil la eter, cloroform, pH 3 și căldură. Se conservă bine între limite de pH 6-9. Comparativ cu alte virusuri, este mai rezistent la factorii de mediu. Temperatura optimă pentru conservare este de –700C. Pe suprafața obiectelor din grajduri rezistă 18-37 zile, în carnea congelată 60 de zile, în diferite furaje 5-46 zile, iar în platformele de gunoi 5-15 zile. Substanțele dezinfectante cele mai active sunt soda caustică, laptele de var și varul cloros. Substanțele conservante pentru virus sunt glicerina și soluțiile concentrate de NaCl. Tripsina și alte enzime inactivează virusul fără să distrugă capsida.
Infecția naturală Spectrul de patogenitate al virusului este foarte larg, receptive fiind suinele, bovinele, carnasierele, cabalinele, etc. Omul este practic nereceptiv, cu toate că în literatură există unele semnalări privind boala lui Aujeszky la om. Aceste date sunt însă discutabile și neconcludente. Păsările au un grad de receptivitate foarte redus. Rezervorul natural de virus îl constituie rozătoarele sălbatice, mai ales șobolanul, care este factorul principal prin care epizootiile se mențin timp îndelungat în efectivele de animale, în special la porcine.
Infecția are caracterul unei boli generale, asociată cel mai frecvent cu tulburările manifestate sub formă de prurit, la toate speciile, cu excepția porcului, la care pareza sau paralizia trenului posterior este semnul caracteristic. Porcul este, de
Virusologie generală
153
altfel, singura specie la care se întâlnește mai frecvent difuziunea enzootică a bolii, cu importante implicații economice. În orașe apar uneori enzootii la pisici, datorită consumului de carne și mai ales pulmon de porc bolnav sau purtător de virus.
Datorită asemănării tabloului anatomo-clinic, mai ales la carnasiere, cu cel din turbare, multă vreme și uneori chiar în prezent se folosește pentru desemnarea bolii, numele de pseudoturbare. Între agenții etiologici și patogeneza celor două infecții nu există însă asemănări esențiale, exceptând prezența virusului bolii lui Aujeszky în țesutul nervos. Spre deosebire de virusul turbării, el este însă prezent în numeroase alte țesuturi și organe.
Infecția experimentală Iepurele este animalul de laborator cel mai sensibil. În urma inoculării intramusculare sau subcutanate, iepurele face un tablou anatomo-clinic caracterizat printr-un prurit demențial la locul de inoculare, ajungându-se la automutilare. Alte specii de laborator sensibile sunt șoarecele, cobaiul și hamsterul
Proprietăți antigenice și imunogene Virusul este omogen din punct de vedere antigenic, nefiind descrise tipuri antigenic distincte.
Valoarea imunogenă a tulpinilor permite obținerea de vaccinuri capabile să confere stări de imunitate satisfăcătoare. Vaccinurile contra bolii lui Aujeszky sunt de două feluri:
vaccinuri vii și atenuate, care pot fi preparate din culturi celulare sau din embrioni; la noi în țară se folosește o tulpină atenuată prin pasaje pe embrioni (avianizată), introdusă în producție de Bran și col. (1963); acest vaccin a fost adoptat și de alte țări, unde tulpina vaccinală este cunoscută sub simbolul “Buk” (București);
vaccinuri inactivate, care se prepară din tulpini virulente în culturi celulare, inactivate apoi cu saponină și adsorbite pe hidroxid de aluminiu, după o rețetă preconizată de Berbinschi și col. (1964).
Virusologie generală
154
Vaccinul viu avianizat se utilizează curent pentru imunizarea suinelor, iar vaccinul inactivat la alte specii în caz de nevoie (bovine, ovine, câini, vulpi, etc.).
Virionul este asemănător morfologic cu cel al virusului bolii lui Aujeszky, având diametrul de 130-180 nm. Genomul este însă constituit dintr-o cantitate mai mare de ADN, masa moleculară fiind de 84 x 106 daltoni.
Sensibil la eter, acetonă, alcool, pH-ul 4, 5-5 și iradiere cu ultraviolete, virusul se conservă optim în condiții de pH 6-9, la temperatura de –600C.
Cultivarea este posibilă într-o gamă destul de largă de sisteme celulare, printre care cele de rinichi de vițel, cal, porc, oaie, alte diverse celule de origine bovină (testiculare, pulmonare, cutanate), celule splenice de iepure linia HeLa; în unele din aceste sisteme se multiplică de la izolare, în altele după o prealabilă adaptare. Efectul devine evident după 1-2 zile. Embrionii de găină nu multiplică virusul.
Omogen antigenic, distinct de celelalte herpesviride, virusul rinotraheitei bovine este înrudit antigenic cu cel al rinotraheitei equine.
Rezultate bune dau, în scop de diagnostic, testul de seroneutralizare și hemaglutinare indirectă cu hematii de oaie tanate.
În condiții naturale este patogen numai pentru bovine, la care produce două entități morbide:
rinotraheita infecțioasă, o afecțiune respiratorie acută în care predomină simptomele de rinită, sinuzită, dispnee și febră;
vulvovaginita pustuloasă infecțioasă, denumită și exantem veziculos genital sau exantem coital, caracterizată prin inflamația mucopurulentă și necrotică a căilor genitale femele, fiind posibile și avorturi, mai ales la primipare.
Virusologie generală
155
În celulele epiteliale ale mucoaselor inflamate se găsesc incluzii intranucleare de tip Cowdry A.
Imunizarea activă față de IBR-IPV este posibilă cu vaccinuri vii și atenuate sau cu vaccinuri inactivate. Atenuarea se realizează prin treceri în serie pe culturi celulare de porc. Virusul IBR-IPV poate fi combinat cu alte virusuri în cadrul unor vaccinuri polivalente (de obicei virusurile VD-MD și parainfluență-3).
Virusul febrei catarale maligne
Agentul etiologic al febrei catarale maligne, numit și herpesvirus bovin, este foarte fragil, sensibil la eter, cloroform, procese de putrefacție.
Izolarea este posibilă pe diferite celule de origine bovină, mai ales renale, suprarenale și tiroidiene, în care produce efecte de fuziune celulară și incluzii de tip Cowdry A. Cultivarea pe embrioni de găină nu a reușit până în prezent.
Tulpinile par să fie antigenic identice. În condiții naturale sunt receptive bovine și bubaline.
Ovinele și unele specii sălbatice de rumegătoare nu fac forme clinice de boală, dar pot fi purtătoare de virus. Febra catarală malignă, numită și coriza gangrenoasă a bovinelor, este o boală acută sau subacută, caracterizată prin febră, inflamație catarală și mucopurulentă a mucoaselor (bucală, nazală, conjunctivală), leziuni congestive, hemoragice și necrotice în diferite țesuturi și organe, mai ales în tubul digestiv, ganglionii limfatici, sistemul nervos central, etc. În condiții experimentale este sensibil iepurele. Cobaiul este rezistent.
Virusul nu este imunogen. Infecția se poate însă trata cu hormoni corticosteroizi. Pop M. (1972) a obținut bune rezultate cu ACTH.
Virusul rinopneumoniei equine – avortului viral al
iepelor Cunoscut și sub numele de herpersvirus equin 1, acest
agent nu se deosebește morfologic de celelalte herpetoviride. În imaginile electronooptice virionii au o formă aproximativ sferică, iar genomul are un aspect de stea sau cruce. masa moleculară a ADN este de 92 x 106 daltoni. Pericapsida conține
Virusologie generală
156
o hemaglutinină, labilă la 560C, activ față de hematiile de cal și cobai.
Virusul se cultivă mai greu pe ouă embrionate, necesitând o prealabilă adaptare. Pentru izolare se pretează cel mai bine culturi de celule, mai ales embrionare. O multiplicare satisfăcătoare se obține pe celule renale de hamster, țesuturi embrionare de cal, bou, porc, pisică, celule amniotice umane, linia Hela, etc. Efectul citopatic se caracterizează prin apariția formelor sferice sau fuzionarea celulelor în sinciții, în care se observă incluzii intranucleare.
Antigenic este înrudit cu virusul rinotraheitei infecțioase bovine. Herpesvirusurile de origine equină au fost împărțite în 3 specii sau tipuri antigenic distincte:
tipul 1 patogen, izolat cel mai frecvent din cazuri de rinopneumonie-avort viral;
tipul 2, numit și citomegalovirus equin, prezent mai ales la tineretul cabalin, probabil nepatogen;
tipul 3 sau virusul exantemului coital, agent al unor infecții genitale asociate cu localizări respiratorii inaparente sau benigne.
Rinopneumonia equină este o infecție foarte contagioasă, care afectează numai cabalinele și evoluează mai grav la tineret. Avortul viral (forma abortigenă a aceleiași entități etiologice) se produce de regulă în a 2-a jumătate a gestației, în lunile 8-10.
În condiții experimentale sunt sensibili hamsterul și șoarecele sugar, la care virusul produce grave leziuni hepatice și cobăițe gestante, care avortează.
Imunizarea activă s-a practicat inițial cu vaccinuri inactivate preparate din avortoni. Întrucât acestea provocau o boală hemoragică la mânji, ele au fost înlocuite cu vaccinuri vii atenuate prin adaptare pe hamster și șoarece.
Alte herpesvirusuri, patogene pentru mamifere,
semnalate în literatură, sunt următoarele: Virusul mamitei ulcerative a bovinelor (Herpesvirus
mammilitis) este constituit dintr-o nucleocapsidă de 80 nm învelită de un peplos, virionul având în ansamblu lui un diametru de 250 nm; se cultivă într-o mare varietate de celule,
Virusologie generală
157
producând sinciții ce pot conține până la 40 de nuclei și incluzii de tip Cowdry A. Infecția naturală afectează sfârcurile ugerului și se caracterizează prin tumefacția și cianoza acestora, urmată de formarea de vezicule, ulcere și cruste. Vindecarea este spontană și se produce într-un interval care variază între 10 zile – mai multe săptămâni.
Virusul Allerton (Herpesvirus bovin 2) este morfologic
identic cu celelalte herpesviride; virionul are 130-150; se cultivă în diverse sisteme celulare și este antigenic identic cu virusul mamitei ulcerative. La bovine produce o infecție a straturilor superficiale ale dermului, caracterizată prin îngroșări cu aspect nodular, localizate mai frecvent în regiunile facială, dorsală și perineală. Pot fi prinși și ganglionii, care prezintă leziuni de limfadenită, uneori generalizată.
Herpesvirusul canin 1 se aseamănă morfologic cu
virusul rinopneumoniei bovine, mai ales prin imaginea electronooptică în formă de stea sau cruce a genomului viral. Virionul este de 115-175 nm, iar nucleocapsida de 90-100 nm. Izolarea reușește cel mai bine în culturi de celule renale de câine, iar efectul citopatic apare la 2-3 zile. Infecția naturală se întâlnește la căței sub 4 săptămâni și are caracterul unei boli febrile generale; leziuni hemoragice și necrotice se găsesc în ficat, rinichi, pulmon și alte organe.
Virusul rinotraheitei feline (Herpesvirus felin 1) nu
are nici o particularitate morfologică deosebită de celelalte herpesvirusuri; se cultivă în celule renale, testiculare și pulmonare de pisică, în care produce efect citopatic. Virusul este monopatogen pentru pisică, la care produce o infecție acută, febrilă în care predomină simptome și leziuni ale căilor respirotorii anterioare. Procentul de mortalitate este ridicat mai ales la tineret. Citomegalovirusurile Aceste virusuri constituie un grup heterogen sub aspect ecologic și al potențialului patogen, având însă mai multe caractere comune și anume:
Virusologie generală
158
afinitate deosebită pentru celulele glandelor salivare și cele renale.
un tip endosimbiotic de evoluție în celulele gazdă, asemănător întrucâtva celui întâlnit la virusurile orfane; în rarele cazuri în care produc îmbolnăviri, acestea au caracterul unor infecții latente sau cronice;
celulele infectate sunt adesea mărite în volum, modificare histopatologică care a inspirat numele “citomegalo”.
Morfologic, aceste virusuri nu pot fi deosebite de alte herpesvirusuri. ADN viral are masa moleculară de 4 x 107 daltoni.
Cultivarea reușește numai în celulele provenind de la specia animală gazdă. Fibroblastele oferă “in vitro” condiții mai bune de multiplicare comparativ cu epiteliile, invers decât “in vivo”.
În celulele infectate se găsesc atât incluzii intranucleare cu diametrul de 15 microni, cât și incluzii intracitoplasmatice mai mici de 2-4 microni, situate de regulă limitrof nucleului.
Purtătorii de citomegalovirusuri sunt foarte frecvenți atât la om, cât și la numeroase specii animale, printre care porcul, oaia, câinele, maimuța, hamsterul, șoarecele, etc. În rare cazuri citomegalovirusurile produc forme clinice de boală. La om au fost descrise infecții neonatale, care evoluează mortal în primele 6 luni de la naștere.
În Africa de Sud au fost identificate citomegalovirusuri ca agenți etiologici ai unor infecții genitale, care pot fi însoțite de sterilitate, la bovine.
O infecție mai bine conturată ca entitate nosologică este rinita cu incluzii a suinelor. Virusul rinitei cu incluzii Considerat ca citomegalovirus, numit și Herpesvirus porcin 2, are caracterele specifice genului. Virionii se evidențiază electronooptic în secțiunile ultrafine din mucoasa nazală a animalelor infectate; se observă atât nucleocapside cu dimensiuni de 45-65 nm sau 90-100, cât
Virusologie generală
159
și particule virale învelite de pericapsidă cu diametrul de 120-150 nm. Virusul poate fi cultivat în culturi de celule obținute din mucoasa nazală,din glandele salivare, celule renale, testiculare de origine porcină recoltate de la purcei infectați experimental; s-au reușit, de asemena, treceri în serie pe celule pulmonare de porc. Interesantă este constatarea că virusul poate fi izolat din țesutul renal de la porci aparent sănătoși, dar nu și din mucoasa nazală ale acelorași animale. Efectul incluziogen “in vivo” sau “in vitro” se caracterizează prin prezența de incluzii mari rezultate din agregarea unor formații granulare ovale sau sferice localizate în nucleoplasmă. În interiorul unor nuclei se observă mase reticulare de material incluzional, care se presupune a reprezenta stadiul final al ciclului infecțios din celulă. Infecția naturală se întâlnește la purceii de 2 până la maximum 4 luni. Între aceleași limite de vârstă este posibilă și transmisia experimentală a bolii. procentul de mortalitate este relativ redus, depășind rareori 20%. Vindecarea survine spontan în 3-4 săptămâni. Virusul rinitei cu incluzii a fost incriminat și ca agent posibil al complexului etiologic al rinitei atrofice (boala râtului strâmb). În ultimul timp se înclină însă din ce în ce mai mult spre a considera, ca agent principal al acestui sindrom, specia bacteriană Bordetella bronchiseptica și endotoxinele speciei Pasterurella multocida. Virusul adenomatozei pulmonare a ovinelor (Jaagsiekte) Adenomatoza pulmonară a ovinelor este o boală tumorală semnalată prima oară spre sfârșitul secolului al XVIII-lea - începutul secolului al XIX-lea în mai multe țări din Europa și în Africa de Sud. În ultimele decenii s-a constatat că boala are o arie geografică foarte largă, în care se include și țara noastră. Cercetările pentru stabilirea etiologiei bolii au dus la evidențierea în macrofagele cultivate din pulmonii oilor cu leziuni a incluziilor caracteristice herpesvirusurilor. Ulterior, s-a demonstrat prin examene electronooptice și prezența intracelulară a virionilor de formă hexagonală, cu diametrul de
Virusologie generală
160
95-115 nm. Unele particule virale erau învelite în pericapsidă. Alte detalii ultrastructurale ale virusului, care au putut fi observate sunt următoarele:
forma alungită a capsomerelor, dimensiunile genomului viral –de 50-65 nm, prezența ocazională a unor structuri
filamentoase paracristaline asociate cu conglomerate de particule virale mici, cu diametrul de 30 nm (după Buxton și Fraser, 1977).
Pe baza acestor însușiri, agentul adenomatozei pulmonare a fost inclus în grupa herpes, fiind numit și herpesvirus bovin 4.
Infecția naturală se întâlnește la oi în vârstă de peste 3 ani și se caracterizează prin prezența de focare nodulare de culoare roșiatică, uneori confluente, în interiorul cărora examenul histologic relevă acumulări masive de mononucleare și leziuni hiperplazice ale celulelor pereților alveolari și bronșici. Procesul tumoral are un caracter progresiv-malign și tendința de metastazare.
HERPESVIRUSURI PATOGENE PENTRU PĂSĂRI Virusul bolii lui Marek Virusul bolii lui Marek, denumită astfel după autorul care, în 1907, în Ungaria o descrie primul, a fost relativ târziu încadrat printre herpesvirusuri, el fiind multă vreme situat alături de virusul leucozelor aviare. Asocierea dintre virus și celula gazdă este foarte strânsă, izolarea și separarea virusului în stare pură fiind mai dificilă, comparativ cu alte virusuri. Virionii evidențiați electronooptic în secțiuni ultrafine au o formă hexagonală, dimensiunile întregii particule virale sunt de 150-170 nm, iar al nucleocapsidei de 85-100 nm.
Cultivarea reușește pe ouă embrionate în care virusul se multiplică în sacul vitelin și în membrana corioalantoidiană, în grosimea căreia se formează uneori discrete leziuni proliferative. După ecloziune puii proveniți din ouă inoculate
Virusologie generală
161
fac boala în câteva săptămâni. Unele tulpini au reușit să fie cultivate și în culturi celulare. – pe fibroblaste de embrioni de găină, unde au produs efect citopatic. În celulele infectate se observă incluzii de tip Cowdry A. În condiții naturale și experimentale, virusul determină apariția de anticorpi precipitanți; prin imunodifuzie și imunoflorescență au fost identificate trei fracțiuni antigenice notate A, B și C. Antigenii B și C sunt cei mai persistenți, fracțiunea A pierzându-se prin treceri repetate. Înrudiri antigenice există între virusul bolii lui Marek și alte numeroase herpesvirusuri, printre care virusul herpes simplex, al bolii lui Aujeszky, etc. Virusul este patogen pentru galinacee și în mai rare cazuri pentru alte specii de păsări. Infecția naturală, cunoscută și sub numele mai vechi de neurolimfomatoză, se caracterizează cel mai frecvent printr-o inflamație cronică a nervilor periferici, pe traiectul cărora apar infiltrații limfocitare, edeme și uneori leziuni cu caracter neoplazic sub forma unor nodozități. În afara formei clasice sau neurale, boala poate evolua și în alte forme: oculară, viscerală. Imunizări active față de virusul bolii lui Marek se pot realiza prin vaccinare cu tulpini atenuate sau înrudite antigenic, ca virusul herpetic de curcă (HVT = herpes virus turkey) care conține 2 antigeni A și mai mulți antigeni comuni cu virusul Marek. Prepararea vaccinului HVT și introducerea lui în unitățile aviare de creștere industrială, inițiată la noi în țară de Pătrașcu I., s-a aplicat cu rezultate mulțumitoare. Virusul laringotraheitei infecțioase a găinilor Virusul are caracterele generale ale familiei, virionii icozaedrali având diametrul de 100-110 nm. Cultivarea este posibilă pe ouă embrionate de 10 zile și în culturi de celule renale de găină. Embrionii mor în proporție de 50% prezentând hemoragii, edeme și necroze, mai ales pe membrana corioalantoidiană, în al cărei epiteliu se găsesc și incluzii intranucleare de tip Cowdry A. Tulpinile sunt omogene din punct de vedere antigenic. Patogen pentru păsări și fazani, virusul produce o laringotraheită contagioasă cu putere de difuziune enzootică, caracterizată printr-un tablou clinic în care predomină
Virusologie generală
162
dificultățile respiratorii și leziuni laringotraheale de tip hemoragic, edematos sau difteroid, în funcție de forma de evoluție a bolii. Imunitatea activă este posibilă cu vaccinuri vii și virulente sau atenuate. Alte herpesvirusuri aviare Herpesvirusul columbar 1 este agentul unei infecții a
porumbeilor, cunoscută și sub numele de “boala cu incluzii a porumbeilor”. Asemănător morfologic cu virusul laringotraheitei infecțioase a găinilor, este antigenic diferit de acesta; se multiplică în celule renale și hepatice de embrioni de găină. Patogen exclusiv pentru porumbei, produce mai ales la tineret o infecție în care predomină leziuni ale căilor respiratorii anterioare, ale tractusului digestiv; se găsesc aproape constant focare necrotice în ficat și mai rar în rinichi.
Virusul pestei rațelor având morfologia caracteristică
celorlalte herpesvirusuri, este cultivabil în ouă embrionate de rață de 9-12 zile și produce la diferite specii de palmipede o infecție generală, asemănătoare în linii mari cu bolile numite “pestă”, contagiozitatea și procentul de mortalitate sunt ridicate. Mai sensibili sunt bobocii de rață. Leziunile hemoragice domină tabloul morfopatologic.
Familia HEPADNAVIRIDAE
Familia Hepadnaviridae cuprinde două genuri: - genul Orthohepadnavirus – virusul B al hepatitei
umane (HBV) - genul Avihepadnavirus – virusul hepatitei B la
palmipede (DHBV) Genul Avihepadnavirus Virionul are o formă sferică cu diametrul de 20-40 nm
prezentând un genom alcătuit din ADN cu o structură
Virusologie generală
163
particulară (circular și parțial bicatenar), o capsidă cu o simetrie icozaedrală alcătuită din 180 capsomere și o anvelopă de natură lipoproteică. La particula virală completă se mai găsește o proteină virală solubilă numită antigen(-e) (DHBe) prezentă în serul bobocilor de rață și gâscă.
Cultivarea virusului este posibilă pe embrioni de găină și de rață și în culturi celulare. Prin pasaje repetate pe embrioni, capacitatea infectantă se atenuează iar pe culturi celulare nu produce efect citopatic.
Toate tulpinile sunt rezistente la eter, cloroform, tripsină și pH 3.
Virusul are proprietăți hemaglutinante iar antigenic se disting două serotipuri.
În condiții naturale produce hepatita la bobocii de rață în vârstă de 1-30 zile și la bobocii de gâscă de 2-4 zile.
Infecția evoluează în focare enzootice fără manifestări clinice semnificative. Bobocii infectați natural sau experimental dezvoltă un răspuns imun prin anticorpi anti-DHBV iar cei infectati congenital devin imunotoleranți , nu dezvoltă un răspuns imun și devin purtători și eliminatori de virus.
Pentru diagnosticul etiologic se recomandă izolarea și identificarea virusului, reproducerea infecției experimentale și reacții serologice dintre care cele mai sensibile sunt; seroneutralizarea virusului, reacția ELISA și imunodifuzia, folosind seruri mono- sau policlonale.
Virusul are proprietăți imunogene, iar prin vaccinare pe cale orală sau intramusculară, se obțin stări de imunitate relativ solide, transmisibile prin ou.
Familia ADENOVIRIDAE Adenovirusurile au o structură icozaedrală, sunt nude,
au diametrul de 70-90 nm. Capsida este constituită din 250 capsomere cu diametrul de 7-9 nm fiecare.Capsomerele din vârfuri sunt antigenic distincte de celelalte; la nivelul lor au în punctul de emergență câte 1 sau 2 expansiuni filamentoase de 10-25 nm lungime, și 2 nm diametru.
Virusologie generală
164
Genomul este format dintr-o singură moleculă ADN dublu catenar, masa de 20-30 x 106, proporția de G + C este 48-61%.
Sediul biosintezei și ansamblării virionilor este nucleul. Unele adenovirusuri aglutinează globulele roșii ale
diferitelor specii animale. Sediul adenovirusurilor îl constituie țesuturile adenoide,
mai ales amigdalele celelalte compartimente ale inelului luiWaldeyer, sediu care a inspirat și denumirea taxonului. La acest nivel, ele duc în majoritatea cazurilor o existență biofită, dezvoltând infecții latente sau inaparente. Puține adenovirusuri produc boli cu caracter de entități nosologice bine conturate. În unele condiții determină un efect transformant oncogen. În infecții mixte cu parvovirusuri îndeplinesc rolul de virusuri ajutătoare (helper).
Tulpinile mamiferelor sunt antigenic distincte de cele aviare, fapt care a dus la crearea a două genuri în cadrul familiei. Genul MASTADENOVIRUS
În acest taxon sunt încadrate adenovirusurile izolate de la mamifere. Speciile animale de la care pot fi izolate astfel de virusuri sunt foarte numeroase: bovine, ovine, suine equine, canine etc.; nu au fost identificate până în prezent adenovirusuri la pisică.
Rolul lor în afecțiunile din care se izolează nu poate fi totdeauna stabilit cu certitudine. Ele sunt de obicei condiționat patogene, producând infecții în condiții de dezechilibru fiziologic sau infecții secundare.
Adenovirusuri bovine Adenovirusurile bovine sunt considerate ca agenți
potențiali ai unor infecții respiratorii, mai frecvente la tineret; mai rar au fost izolate tulpini din pneumonii, enterite și poliartrite. Infecțiile produse de adenovirusuri apar la taurine în condiții întrucâtva similare cu cele produse de virusurile ECBO. Coman (1972), cercetând la noi în țară frecvența celor
Virusologie generală
165
două categorii de agenți, izolează mult mai rar adenovirusuri comparativ cu virusurile ECBO.
Cultivarea reușește cel mai bine pe celulele renale și testiculare bovine, iar aspectul citopatic este asemănător cu cel produs de alte adenovirusuri, fiind caracterizat prin rotunjirea celulelor și apariția de incluzii mari intranucleare bazofile sau acidofile; nu se multiplică pe ouă embrionate. Hemaglutinarea este pozitivă pe globulele roșii de șobolan. Animalele de laborator sunt în general nereceptive, unele tulpini producând însă tumori la hamster. Antigenic au fost identificate trei serotipuri.
Adenovirusuri suine Se izolează pe culturi de celule renale de porc, din tubul
digestiv al animalelor aparent sănătoase sau cu tulburări digestive. Ca o raritate, o tulpină a fost izolată și din creerul unui purcel mort cu simptome de encefalită. Antigenic se disting patru serotipuri.
Adenovirusuri canine Se izolează din boli bine definite ca entități nosologice.
Acestea sunt hepatita infecțioasă a câinilor și encefalita vulpilor, două boli diferite produse de același agent etiologic și laringotraheita câinilor.
Virusul hepatitei infecțioase a câinilor – encefalitei
vulpilor (Rubarth) Virionul icozaedral are diametrul în jurul a 55-80 nm;
este rezistent la căldură, la pH acid, la eter și cloroform. Produce hemaglutinarea hematiilor de om de grup O și a celor de cobai.
În culturi celulare renale și testiculare de câine, dihor, bursuc porc, cobai, virusul se multiplică și produce efectul citopatic caracteristic adenovirusurilor. Cultivarea este posibilă și pe embrioni de găină. Virusul produce un efect incluziogen cu valoare diagnostică, mai ales în infecția naturală. Incluziile sunt situate intranuclear.
Antigenic nu se constată fenomenul de pluralitate întâlnit la celelalte adenovirusuri. În serul animalelor bolnave sunt prezenți anticorpi precipitanți și fixatori de complement.
Virusologie generală
166
Virusul produce două boli contagioase distincte: hepatita infecțioasă a câinilor, care poate
afecta și lupii, față de care receptivitatea maximă o manifestă tineretul în vârstă de 2-6 luni, caracterizată prin febră, icter, tulburări digestive, rareori nervoase;
encefalita vulpilor în care predomină tulburările respiratorii și mai ales cele nervoase.
Imunizarea activă este posibilă cu vaccinuri preparate din suspensii de organe recoltate de la cățeii infectați experimental, inactivate prin formol și căldură. Virusul laringotraheitei infecțioase
Este asemănător cu virusul bolii lui Rubarth de care este apropiat și antigenic, înrudire evidențiabilă prin RFC. Seroneutralizarea și inhibarea hemaglutinării permit însă diferențierea celor două virusuri. Tot diferit de virusul lui Rubarth este și absența acținunii hemaglutinante față de hematiile de cobai.
Virusul produce la câine o infecție subacută sau cronică prin tulburări ale căilor respiratorii anterioare (laringită, traheită, bronșită).
Imunizarea este posibilă cu vaccinuri inactivate. În ultimii ani se preconizează utilizarea unor vaccinări
combinate antihepatită-laringotraheită infecțioasă și antileptospirică.
Familia IRIDOVIRIDAE Familia cuprinde trei genuri: Iridovirus, Ronavirus și
Lymphocystivirus. Din genul Iridovirus fac parte numeroase specii patogene pentru insecte iar din celelalte două genuri virusuri parazite pentru vertebrate și amfibii.
Numele familiei și al genului este inspirat de “Iris”, zeitate greacă a curcubeului, din cauza faptului că unele materiale bogate în masă virală au un aspect irizat.
Virusologie generală
167
Genomul este constituit din ADN dublu catenar cu masa moleculară 130-160 x 106, reprezentând 12-16% din particula virală; proporția G + C este de 30-58%. Capsida este icozaedrală, formată din aproximativ 1.500 capsomere. Dimensiunile particulei virale sunt de 130-300 nm. Unele specii prezintă uneori înveliș pericapsidal și compuși lipidici până la 14%.
Familia ASFAVIRIDAE
Genul ASFIVIRUS Virusul pestei porcine africane.Virionii au aproximativ 175-220 nm diametru, iar genomul viral, plasat sub forma unui ghem în centrul capsidei icozaedrale, este de 70-90 nm. Numărul probabil de capsomere este de 812 și eventual mai mare.
Virionii sunt inactivați la 550C în 30 minute și la 600C în 10 minute.
Virusul se cultivă pe embrioni de găină și în culturi de celule, de măduvă osoasă, de leucocite și de celule renale de porc. Embrionii inoculați mor în 6-7 zile, dacă în prealabil virusul a fost pasat de mai multe ori alternativ pe porc și iepure. În culturi celulare are efect hemadsorbant față de hematiile de porc, hemadsorbția fiind utilizată în scop de diagnostic.
Studiul proprietăților antigenice a permis identificarea a 20 variante imunologice distincte.
Virionii au un grad însemnat de rezistență față de factorii ecologici, mai ales incluși în sângele animalelor bolnave și al cadavrelor, rezistând sub această formă, chiar în stare uscată, pe suprafața obiectelor până la 70 zile, iar în sol o perioadă și mai lungă. În carne și preparate de carne virusul a fost pus în evidență la intervale de 15 săptămâni în carcase refrigerate, 5 luni în șuncă, 6 luni în măduva osoasă.
Virusul este monopatogen pentru porcine, în cursul infecției având loc o multiplicare abundentă însoțită de difuzarea virusului prin sânge, la nivelul tuturor organelor.
Virusologie generală
168
Concentrația de virus în sângele porcilor bolnavi poate ajunge atât de mare, încât doza minimă infectantă să fie de 10-11 ml.
Virusul se poate multiplica și în organismul unor căpuși din genul Ornithodorus, care au un rol important în menținerea focarelor.
Pentru diagnosticul etiologic al bolii se pot utiliza testul de hemadsorbție și reacțiile serologice de imunodifuzie în gel de agar și imunoflorescență, alături de încercări de izolare a virusului în culturi celulare.
Virusul nu se pretează pentru prepararea unui vaccin eficient, având o capacitate imunogenă relativ redusă. Chiar dacă capacitatea imunogenă a virusului este bună, perioada de înjumătățire a titrului de anticorpi este scurtă de aproximativ 30-45 zile. Acest aspect ar impune o repetare a vaccinării la intervale prea scurte de timp.
Familia PAPOVAVIRIDAE Numele familiei derivă din ansamblarea silabelor inițiale a celor 3 cuvinte care desemnează categorii de boli, leziuni sau agenți în care sunt implicate virusurile din această familie:
PApilomatoză, POlioma, agent VAcuolizant.
Virusurile sunt nude, de dimensiuni mici, 45-50 nm, de formă icozaedrală, uneori și filamentoasă. Capsida este constituită din 72 capsomere. Genomul este o singură moleculă de ADN dublu catenar cu masa moleculară de 3-5 x 106, iar proporția de G + C este 41-49%.
Sediul multiplicării este nucleul. Majoritatea speciilor sunt în mod curent efectiv sau potențial oncogene. Interacțiunea virus-celulă poate fi la papovirusuri de două feluri:
a) virusul evoluează intracelular determinând un ciclu productiv urmat de obicei de un efect litic sau,
b) infecția are un caracter abortiv. În celulele transformate genomul viral codifică sinteza a
2 antigeni: unul tumoral (T) și altul de transplantare. Primul
Virusologie generală
169
este prezent mai ales în nucleu, iar al doilea în membrana celulară. Responsabilitatea pentru sinteza acestor antigeni revine ADN viral integrat, incapabil să determine sinteza de noi virioni. Reversia genomului integrat poate fi provocată prin iradiere cu ultraviolete sau fuziune între celule permisive cu celule nepermisive prin co-cultivarea lor în prezența virusului Sandai inactivat.
Unele papovavirusuri sunt hemaglutinante. Toate speciilr sunt rezistente la eter, acizi și cădură.
În cadrul familiei se deosebesc două genuri: Papillomavirus și Polyomavirus, cunoscute și sub denumirile de papovavirus-A și papovavirus-B.După al VII-lea Raport al Comitetului Internațional de Taxonomie virală (vezi tabelul 5), familia Papovaviridae nu mai apare ca atare divizându-se în două familii care o compuneau de fapt, și anume familia Papillomaviridae și familia Polyomaviridae.
Familia PAPILLOMAVIRIDAE Genul PAPILLOMAVIRUS
Virusurile din acest taxon sunt mai mari comparativ cu genul Polyomavirus; au diametrul de 55 nm, iar masa moleculară a genomului este de 5 x 106. Genul cuprinde:
- virusul papilomului lui Shope și - virusurile care produc papilomatoza la
diferite specii: bou, cal câine și mai rar capră, oaie, hamster, om.
Papilomatozele se caracterizează la toate speciile prin formarea de tumorete sesile sau pediculate, relativ benigne la nivelul pielii și uneoari al mucoasei bucale (cal, câine). Virusul papilomului lui Shope
Se prezintă sub formă icozaedrală, uneori filamentoasă și produce la o specie sălbatică de iepure –Sylvilagus floridanus- papilomatoză cu localizare exclusiv cutanată. Nu se cunosc localizări bucale. La iepurele de casă (Oryctolagus) virusul poate fi transmis experimental prin scarificare, dar tumorile
Virusologie generală
170
regresează spontan.La iepurele de casă virusul pare a se comporta ca un virus defectiv sau mascat, în celulele tumorale fiind posibilă evidențierea de genomuri virale și a unor enzime noi (arginază),dar nu și de virus infecțios.
Virusul papilomatozei bucale a iepurelui
Este diferit de virusurl lui Shope și produce mici tumorete benigne, cu diametrul până la 5 nm pe gingii sau pe fața inferioară a limbii.
Virusul papilomatozei bovine
Cel mai important pentru patologia veterinară din cadrul genului, a fost studiat electronooptic în secțiuni ultrafine, dovedindu-se a avea o formă icozaedrală, diametrul de 43-53 nm, capsida constituită din 72 capsomere alungite de 7,5 nm lungime și 5-6 nm lățime.
Multiplicarea virusului n-a reușit până în prezent nici în ouă embrionate, nici în culturi celulare, dar s-au realizat infecții neproductive a unor culturi celulare. Virusul se integrează și este capabil să determine în 6-8 săptămâni efectul transformant “in vitro” al unei game destul de variate de celule (celule embrionare de bou, hamster și șoarece).
În condiții naturale virusul poate afecta taurinele de toate vârstele. Papiloamele de mărimi și forme variate de la mici formațiuni nodulare până la tumori mari conopidiforme, pot fi localizate pe mameloane, la nivelul buzelor, în jurul ochilor, urechilor, la ceafă etc. Un studiu amplu al transmiterii experimentale a bolii în cadrul speciei natural receptive a fost executat de Vlăduțiu și col. (1964). Aplicând excizia papiloamelor, autorii constată că în paralel cu operația chirurgicală are loc și un fenomen de autoimunizare activă antivirală. Mai recent s-a demonstrat receptivitatea în condiții experimentale a hamsterului sugar și a unor linii de șoareci (C3H/eB). În aproximativ 100 de zile de la inoculare se formează noduli fără tendința de metastazare, care persistă timp de 4-6 luni.
Virusul papilomatozei equine afectează mai des caii
între 1 și 3 ani, producând tumorete caracteristice de 2-10 nm în număr variabil, localizate mai ales pe botul animalului și în
Virusologie generală
171
jurul buzelor, care persistă timp de aproximativ 18 luni. La examenul histopatologic se observă incluzii intranucleare.
Virusul papilomatozei canine Determină formarea de papiloame cu localizare
exclusivă la nivelul buzelor și pe mucoasa bucală (gingii, limbă, vălul palatin, farinx). infecția este mai frecventă la tineret.
Familia POLYOMAVIRIDAE
Genul POLYOMAVIRUS
Poliomavirusurile sunt mai mici decât virusurile papilomatozelor, au diametrul de 54 nm și un genom cu masa moleculară de 3 x 106 daltoni. Un fenomen interesant observat la unele din aceste virusuri îl constituie faptul că efectul transformant este absent la gazda natural receptivă, dar prezent la alte specii infectate experimental sau în culturi celulare. Relativ constant efectul oncogen se manifestă la hamsteri nou născuți cu stări de deficit imunologic. Transformarea malignă se datorește integrării genomului viral în cromozomul celulei gazdă.
Virusul polyomei se încadrează morfologic în caracterele specifice genului: are proprietăți hemaglutinante. Prezent sub formă biofită la șoarecii sălbatici, produce rareori tumori maligne la specia care-i servește ca biotop. “In vitro” poate fi izolat în culturi celulare primare și secundare de șoarece, șobolan și hamster, producând plaje în celulele permisive și efect oncogen în cele nepermisive.
Virusul SV40 (Simian vacuolating virus 40) s-a izolat în 1960 din celule renale normale de maimuță. În culturi celulare produce leziuni vacuolizante în citoplasmă. În celule nepermisive determină efect oncogen.
Alte specii identificate în cadrul genului Polyomavirus sunt:
Virusologie generală
172
virusul K (al pneumoniei șoarecelui), agentul unor leziuni pulmonare sau hepatice la șoarece, capabil de efect oncogen numai în culturi celulare;
virusul tumorilor renale, cu efect oncogen asupra țesutului renal în condiții naturale la diferiți pești de aquarium (Pristella riddlei, Labistes reticulatis etc.);
virusul vacuolant al țesutului renal de iepure, asemănător morfologic cu virusul SV40, hemaglutinant pentru globulele roșii de cobai, agentul unor infecții latente la unele specii de iepure la care produce efectul vacuolant caracteristic.
Familia PARVOVIRIDAE Subfamilia PARVOVIRINAE Parvo sau picodnavirusurile constituie un grup restrâns
de virusuri, caracterizat prin dimensiuni foarte mici, de 18-26 nm diametru, cu capsida icozaedrală compusă din 32 capsomere și diametrul de 3-4 nm.
Genomul este constituit dintr-o moleculă de ADN monocatenar, cu masa moleculară de 1,5-2,2 x 106; proporția G + C este de 41-53%.
Numele de parvovirusuri este inspirat de dimensiunile foarte mici (parvus = mic), iar cel de picodnavirusuri de dimensiuni mici, plus natura genomului (pico = mic; dna = DNA).
Virusul este rezistent la eter și termostabil. Multiplicarea are loc în nucleu și este condiționată de
anumite activități ale celulei gazdă sau de intervenția unor virusuri ajutătoare (helper).
Parvoviridele se împart în trei genuri: - Parvovirus;
Include parvovirusurile capabile de autoreplicare prin mijloace proprii: din această categorie fac parte:
virusul latent al șobolanului (Kilham); virusurile osteolitice H ale hamsterului; virusul leucopeniei infecțioase a pisicilor; virusul hepatitei bobocilor de gâscă și unele parvovirusuri bovine și suine.
Virusul panleucopeniei pisicilor Virionii corespund morfologic caracterelor genului și
familiei. Dimensiunile lor sunt de 20-25 nm; capsida este icozaedrală, pericapsida absentă, iar genomul constituit din ADN dublu catenar este principalul argument pentru încadrarea acestui virus în grupa parvo; este rezistent la eter, cloroform și tripsină; conține o hemaglutinină, legată de capsidă și activă față de globulele roșii de porc.
Virusul se cultivă în celule renale de pisică, în care produce efect citopatic vizibil numai după colorarea monostratului; nu se cultivă pe ouă embrionate.
În condiții naturale, virusul este patogen pentru pisici, la care produce o infecție cunoscută sub denumirile: panleucopenie, enterită infecțioasă, agranulocitoză, jigodia pisicilor și pentru vidre, la care produce o enterită infecțioasă. Aceste boli sunt caracterizate printr-o capacitate mare de difuziune, un procent ridicat de mortalitate și un tablou clinic în care principalele simptome sunt anorexia, vomismentele, febra mare și leucopenia. La nevoie se pot prepara vaccinuri inactivate din organe și țesuturi ale pisicilor infectate experimental, cu adaos de adjuvant sau vaccinuri vi atenuate pe culturi de celule renale de pisică.
Virusologie generală
174
Virusul parvovirozei canine Virionul are o structură izomerică, fără înveliș pericapsidal, cu dimensiuni de 18-26 nm și o simetrie icosaedrică. Inițial a fost izolat de Binn în 1970 denumit și CV-1 (Canin Parvovirus tip 1) ulterior de Eugster și colab. fiind denumit CPV –2 (Canin Parvovirus tip 2). Parrish și colab. în SUA descriu două variante ale virusului CPV-2 denumite CPV-2 a și CPV-2b. Tipul CPV-2 este considerat agentul etiologic al gastroenteritei hemoragice a carnasierelor și este înrudit antigenic cu virusul panleucopeniei infecțioase feline. Parvovirusurile porcine izolate prima oară în 1967, sunt mici, icozaedrale, având caractere identice cu celelalte parvovirusuri. Nepatogene pentru embrion, sunt cultivabile pe celule renale de porc.
Patogene mai ales pentru embrioni, aceste virusuri se izolează în special din avortoni, mucus vaginal și spermă, atribuindu-se un rol etiologic în unele stări de sterilitate la suine.
Din acest gen mai fac parte virusul enteritei virotice a nurcilor, virusul plasmocitozei nurcilor (Boala de Aleutine) și virusul bolii lui Derszy.
Genul DEPENDOVIRUS Cuprinde Parvovirusurile adeno-asociate, considerate în
ultimul timp ca gen aparte și numite așa, din cauza caracterului lor defectiv care le face dependente de un hepter care, în majoritatea cazurilor, este un adenovirus.
Parvovirusuri adeno-asociate au fost identificate la om (trei tipuri), bovine, câine și păsări. În condiții de laborator aceste virusuri sunt cultivabile în culturi celulare, tot numai în asociație cu helperul.
Virusologie generală
175
CLASA RIBOVIRA
Familia CORONAVIRIDAE
Membrii acestei familii sunt polimorfi, cu un diametru de 100 nm și prezintă la exterior un peplos format din peplomere uniforme cu aspect de măciucă, care proemină la suprafața particulei virale.
Genomul este format dintr-o singură moleculă de ARN monocatenar cu masa +de 9 x 106.
Multiplicarea are loc în citoplasmă, iar eliberarea virusului din celula gazdă are loc prin înmugurire.
Familia cuprinde un singur gen- Coronavirus. Prefixul familiei și genul vine de la “corona” = în limba
latină coroană, corelat cu aspectul morfologic rezultat din forma și modul de așezare al peplomerelor. Familia cuprinde două genuri: Coronavirus și Torovirus Genul CORONAVIRUS
Caracterele genului se identifică cu ale familiei. El
cuprinde mai multe specii patogene pentru mamifere sau păsări. Mai importante pentru medicina veterinară sunt: virusul bronșitei infecțioase a puilor de găină;virusul diareei epizootice porcine, virusurile encefalomielitei porcine, virusul gastroenteritei infecțioase a porcului, Coronavirus bovin, ecvin, canin, felin și a curcilor.
Virusul bronșitei infecțioase a puilor de găină Structural, virusul corespunde caracterelor generale ale
familiei. Virionii au 80-120 nm în diametru și sunt deseori polimorfi, fiind semnalată și prezența unor forme pedunculate sau măciucate. Pe suprafața peplosului sunt prezente expansiuni lungi de 20 nm, asemănătoare cu cele ale myxovirusurilor.
Virusologie generală
176
Cultivarea se realizează pe embrioni de 9-12 zile inoculați pe membrana corioalantoidiană sau intraamniotic. Virusul necesită o etapă de adaptare, dar după 5-10 treceri oarbe, embrionii încep să prezinte leziuni caracteristice (se micșorează, se ratatinează) și mor într-o proporție până la 50%. După un număr mai mare de treceri pe embrioni, virusul se atenuează fără a-și modifica proprietățile antigenice. Unele tulpini au fost cultivate în celule embrionare de găină, iar altele și în celule renale de maimuță. Tulpina Beaudette adaptată pe ouă embrionate a produs sinciții din fuziunea celulelor renale de găină, fenomen urmat de formarea de plaje.
În condiții variate “in vivo” și “in vitro”, virusul bronșitei infecțioase se interferează cu virusul de Newcastle, fenomen care și-a găsit în ultimul timp și o aplicație în scop de diagnostic (testul de interferență).
Antigenic au fost descrise 6 tipuri, mai răspândite și mai cunoscute fiind tipul Connecticut și Massachusetts.
Virusul este sensibil față de factorii fizici și chimici. Prin încălzire se inactivează în 15 minute la 500C. Soluțiile dezinfectante distrug virusul în concentrații uzuale. Sub formă congelată, într-o soluție de glucoză 10%, virusul rezistă în embrioni timp de ani de zile.
Infecția naturală se întâlnește la găini, cu o simptomatologie și evoluție în funcție de vârstă. Formele cele mai grave cu evoluție enzootică și procent ridicat de mortalitate sunt caracteristice puilor. Tabloul anatomo-patologic se caracterizează prin semne și leziuni inflamatorii la nivelul mucoaselor respiratorii, nazală, traheală, bronșică, a sinusurilor și a sacilor aerieni. La găinile adulte, infecția evoluează deseori inaparent sau prin tulburări ale ouatului, consecutiv localizării virusului în organele de reproducere (Taga și col., 1965).
Seroneutralizarea, imunodifuzia și imunoflorescența directă sunt reacții deosebit de sensibile utilizabile în sero-diagnostic.
Vaccinarea se poate face atât cu vaccinuri inactivate, cât și cu vaccinuri vii atenuate prin treceri repetate pe embrioni. S-au experimentat cu succes și vaccinuri vi atenuate mixte în care virusul bronșitei infecțioase este asociat cu un virus de Newcastle. La noi în țară se folosește un vaccin viu atenuat sub
Virusologie generală
177
formă liofilizată, preparat dintr-o tulpină de tip Massachusetts. Vaccinurile inactivate dau în general rezultate slabe, cu excepția celor cu betapropiolactonă.
Virusul gastroenteritei infecțioase a porcului
Structura virionului este icozaedrală, diametrul de 90-200 nm, iar capsida este formată din 252 capsomere. Expansiunile măciucate de pe suprafața pericapsidei au 18-24 nm, iar dilatațiile distale ale acestora au 10 nm în diametru. Virusul este sensibil la eter, cloroform, acizi și dezoxicolat de sodiu.
Cultivarea este posibilă în culturi celulare embrionare sau adulte de porc în care majoritatea tulpinilor, cu excepția unora, se multiplică fără a produce efect citopatic. Prin treceri pe culturi celulare, virusul se atenuează și poate fi folosit pentru prepararea de vaccinuri. Cultivarea pe embrioni nu a reușit până în prezent.
Unele tulpini interferează în culturi celulare cu virusul bolii lui Aujeszky și cu virusul bolii mucoaselor. Interferența cu acesta din urmă și-a găsit o utilizare în identificarea tulpinilor necitocide de virus al gastroenteritei transmisibile.
Virusul este sensibil față de factorii de mediu și se conservă cel mai bine la temperatura de –200C.
Infecția naturală afectează numai porcinele și se caracterizează prin leziuni edematoase, hemoragice și necrotice în stomac și intestin și modificări degenerative în rinichi. Boala evoluează mai grav, cu un procent de mortalitate de 100% la purceii sugari, în primele zile după fătare. La porcii adulți, infecția evoluează benign sau inaparent.
Reacțiile serologice pot fi utilizate pentru diagnosticul etiologic al bolii; cea mai sensibilă este seroneutralizarea în culturi celulare a unui virus citopatogen de referință cu seruri de la animale trecute prin boală. Prin imunoflurescență, antigenul viral poate fi pus în evidență în amprente din organele mai bogate în virus – amigdale, intestin, ganglioni.
Imunizarea activă este posibilă cu vaccinuri preparate din tulpini vii și atenuate. Vaccinurile inactivate au un grad de eficiență mai redus.
Virusologie generală
178
Virusul diareei epizootice porcine se deosebește antigenic de virus gastroenteritei transmisibile cât și de alte coronavirusuri ( citat de Penaezt și col., 1978). El se găsește constant în conținutul intestinal al purceilor bolnavi și în citoplasma celulelor epiteliale.
Virusul encefalomielitei de Ontario Semnalat în mai multe țări din America de Nord și în
Anglia, este agentul unei boli a purceilor, caracterizată prin vomismente violente, slăbire și emanciere progresivă urmată de o encefalomielită cu evoluție fatală. Virusul are 150 nm, iar expansiunile de pe suprafața pericapsidei sunt lungi de 20 nm; se cultivă în celule renale de porc determinând formarea de sinciții. Coronavirusurile bovin, ecvin, canin și a curcilor sunt implicate în enteritele tineretului în primele 3 săptămâni de viață. Virusul peritonitei infecțioase feline este antigenic înrudit cu virusul gastroenteritei transmisibile a porcului și coronavirusul canin. În structura virusului s-au identificat 3 tipuri de antigene: P (proteine din peplomere), M ( proteine din înveliș) și N (proteine capsidale). Între tulpinile de Coronavirus felin există diferențe de antigenitate și patogenitate. Astfel, unele tulpini determină o formă mortală de peritonită infecțioasă felină, dar cu o frecvență sporadică, iar altele determină o enterită benignă sau mai frecvent o infecție asimptomatică (Eliot, 1994) citat de Perianu T., 1997. Genul TOROVIRUS În acest gen sunt încadrate Torovirusul ecvin (specia tip a genului) și virusul Breda care determină enterita cu virusul Breda la viței. Virusul Breda s-a izolat în 1974 în timpul unui episod de diaree neonatală la viței în Jawa ( Woode și col. 1974). S-a constatat că diferă antigenic de celelalte virusuri bovine cunoscute și în special de coronavirusuri. Prin testele de hemaglutinare, inhibarea hemaglutinării, E.L.I.S.A. și
Virusologie generală
179
imunoelectronomicroscopie s-au evidențiat două serotipuri, serotipul 1 (Jawa) și serotipul 2 (Ohio), care este înrudit antigenic cu virusul Berne, izolat în Elveția de la un cal în 1972. Virusul Berne, are structura morfologică și chimică apropiate de virusul Breda ceea ce a permis încadrarea lor în genul Torovirus.
Familia PARAMYXOVIRIDAE
Prima parte a prefixului “para’ are în limba greacă
semnificația de “alături de”, în sensul sublinierii existenței unor abateri de la însușirea tipică (orthos) a entității respective.
Virusurile din această familie au un grad mai accentuat de polimorfism și sunt mai mari ca orthomyxovirusurile. Virionii au de obicei forma sferică sau neregulat globuloasă, cu diametrul de 150-250 nm. Nucleocapsida este filamentoasă, are structura helicală-flexibilă, este mai groasă comparativ cu cea a orthomyxovirusurilor, având diametrul de 17-18 nm. Lungimea variază între 500-1.000 nm.
Fiecărei spirale a helixului îi corespunde aproximativ 15 capsomere, numărul lor total fiind în funcție de lungime.
Din structura învelișului face parte constant un peplos lipoproteic, dublu stratificat, cu proeminențe la suprafață, care învelește nucleocapsida helicală pliată sub forma unui ghem. Pe suprafața sa se găsesc hemaglutininele de natură glicoproteică și unități de neuraminidază.
Genomul viral, constituit dintr-o singură piesă este o moleculă de ARN monocatenar cu masa moleculară de 5-8 x 106.
Biosinteza virusurilor în celula gazdă se realizează prin transcrierea de pe genomul viral a informației genetice printr-o ARN polimerază ARN dependentă pe un ARNm complementar.
Analiza chimică cantitativă a paramyxovirusurilor a demonstrat că proteinele reprezintă 70% din masa totală virală, lipidele 20-40%, iar ARN aproximativ 0,9%.
Activitatea hemaglutinantă la paramyxovirusuri se transformă în timp spre deosebire de orthomyxovirusuri într-una hemolitică.
Virusologie generală
180
Eterul, cloroformul și pH 3 le inactivează, iar temperatura de 370C nu le asigură un grad suficient de stabilitate; sunt sensibile la acțiunea actinomicinei D. La –700C se pot conserva timp de mai mulți ani, adăugarea de ser de bou 0,5% are un efect stabilizant.
Majoritatea paramyxovirusurilor se multiplică în ou embrionat de găină după cum și în diferite celule și produc incluzii oxifile intraplasmatice și în unele cazuri, intranucleare.
Recombinările genetice între specii sunt extrem de rare. Paramyxovirusurile sunt antigenic stabile. Familia cuprinde două subfamilii și zece taxoni de
rangul genului și anume: Paramyxovirus, Morbilivirus, Rubulavirus,
Respirovirus; Subfamilia Pneumovirinae cu genurile: Pneumovirus,
Metopneumovirus; Subfamilia Rhabdovirinae cu genurile: Veziculovirus,
Lyssavirus, Ephemerovirus, Novirhabdovirus.
Genul RUBULAVIRUS Virusul pseudopestei aviare (Newcastle) Istoric. Primele semnalări datează din 1926 –Kraneveld
în Djawa și Doyle în Newcastle; Burnet și Fevry (1934) reușesc primii să cultive virusul.
La noi în țară diagnosticul și prima descoperire, sub numele de “boala de Filaret” aparține lui Pop și col., 1943.
Structura și proprietățile virionului. Virionul are în ansamblul lui o formă globuloasă, de 100-250 nm. Nucleocapsida este helicală, cu diametrul transversal de 17 nm. Genomul este constituit dintr-un lanț de ARN lung de 1 micron. Pericapsida prezintă pe suprafață expansiuni lungi de 8 nm. Prin tratare cu eter se produce dezagregarea virusului, rezultnd rozete mai mari și mai neregulate ca în cazul virusului pestei clasice, cu diamtrul de 35-65 nm.
Datorită componentelor lipidice ale pericapsidei, virusul este sensibil la eter și cloroform.
Cultivabilitate. Multiplicarea este abundentă atât în ouă embrionate cât și în culturi celulare embrionare de pasăre.
Virusologie generală
181
Vârsta optimă a embrionilor este de 3-14 zile. După inoculare, ei mor în 24-48 ore cu leziuni hemoragice la nivelul mebranei corioalantoidiene și pe suprafața embrionului, mai ales în regiunea capului și gâtului. Deseori, pe membrana corioalantoidiană apar și zone de opacifiere în care, histologic, se observă stratificarea epiteliului însoțit de degenerarea balonizantă a acestuia și prezența de incluzii oxifile. În componentele embrionului și mai ales în lichidul alantoamniotic virusul este prezent în cantități foarte mari, titrul hemaglutinant și infectant al lichidului ajungând la 10-10. Multiplicarea virusului este posibilă și în embrioni ai unor specii mai puțin receptive –rață, gâscă.
Virusul se multiplică în diferite sisteme celulare. Condițiile cele mai bune le oferă în acest scop celulele embrionare de găină; pot fi însă utilizate și diferite celule mamifere, ca cele de iepure, vițel, porc, maimuță, rinichi de hamster sugar (BHK), linia HeLa. Titrul obținut în culturi celulare este însă cu un logaritm mai mic coparativ cu cel din compartimentele menționate ale embrionului de găină. Efectul asupra celulelor se reflectă în formarea de sinciții, apariția incluziilor intracitoplasmatice, efect citopatic. Uneori culturile celulare fac infecții cronice, producând virus, fără apariția efectului citopatic. Evidențierea virusului în oul embrionat și în culturi celulare este ușor posibilă prin reacțiile de hemaglutinare și hemadsorbție.
Proprietăți hemaglutinante. Materialul viral aglutinează chiar în concentrații foarte mici eritrocitele de pasăre. Dintre hematiile mamiferelor cel mai bine sunt aglutinate cele de cobai și de om de grup “O”. Efectul hemaglutinant se manifestă și față de globulele roșii de oaie și bou. Hematiile de cal sunt aglutinate numai de tulpinile lentogene. În concentrații mari, virusul are chiar un efect hemolitic față de globulele roșii de pasăre, oaie și om.. Titrul hemaglutinant variază de la tulpină la tulpină, între limite largi, 1/160-1/5.000.
Proprietăți antigenice. Prin tratare cu eter pot fi separate 2 feluri de antigeni virali: antigenul V reprezentat de rozetele de hemaglutinine și antigenul S constituit din nucleoproteină. Ei sunt identici la toate tulpinile, virusul caracterizându-se prin omogenitate antigenică; n-au fost
Virusologie generală
182
descrise până în prezent tipuri imunologic distincte. În serul păsărilor bolnave sau trecute prin boală se decelează anticorpi specifici al căror titru variază între 1/10 la 1/200 și chiar mai mult. Reacțiile cele mai sensibile pentru evidențierea anticorpilor sunt inhibarea hemaglutinării și seroneutralizarea “in vitro”pe un virus cunoscut, verificată apoi prin inoculare pe embrioni.
Sensibilitatea față de factorii ecologici. Comparativ cu alte virusuri rezistența virusului de Newcastle față de factorii naturali ai mediului exterior este relativ mai mare. În stare uscată virusul se conservă la –200C timp de 1-3 ani, în carcase congelate timp de 134-180 zile, în cadavre îngropate până la 30 zile. În apă virusul rămâne viu timp de 2 săptămâni. Saramurarea și afumarea nu afectează viabilitatea virusului. Sub acțiunea factorilor artificiali - încălzire, dezinfecție, virusul este distrus relativ ușor. La 550C este inactivat în 45 de minute, iar substanțele ca hidroxid de sodiu 2%, clorura de var 5%, sublimatul 1% etc. îl distrug în câteva minute. Lizolul, fenolul și crezolul în concentrații de 2-3 % au același efect în 5 minute. Acțiunea formolului este dependentă de temperatură. În incubatoare efectul sterilizant sub formă de vapori este asigurat de o concentrație de 0,1% într-un interval de 6 ore. În soluție, adăugat în proporție de 1/5.000, inactivează virusul purificat într-o oră.
Patogenitatea. Se manifestă în condiții naturale față de păsări și numai în condiții excepționale față de om sau alte mamifere. La om au fost semnalate conjunctivite din care s-a izolat virusul. În condiții experimentale, este nepatogen pentru șoarece și alte mamifere, cu excepția hamsterului.
Tulpinile izolate din cazuri de boală naturală pot prezenta grade diferite de patogenitate, pe baza acestui criteriu deosebindu-se trei tipuri:
tipul velogen, care cuprinde tulpinile cu virulență plină. Acestea sunt egal patogene, atât pentru păsările adulte cât și pentru pui. Ele produc epizootii în care procentul de mortalitate și morbiditate este foarte ridicat în cazul neaplicării măsurilor adecvate de profilaxie și combatere.
tipul mezogen, care cuprinde tulpinile de virulență mijlocie, patogene pentru pui până la aproximativ 2
Virusologie generală
183
luni, dar nepatogene pentru păsările adulte. Tulpinile pot fi folosite ca vaccinuri la păsările adulte.
tipul lentogen, care cuprinde tulpini total atenuate, incapabile să infecteze în condiții naturale și nici experimentale puii după ecoloziune. Ele își păstrează patogenitatea numai pentru embrioni și sunt utilizate pentru vaccinarea puilor. Criteriile accesibile examenului de laborator, pe baza cărora se poate stabili dacă o tulpină este velo, mezo sau lentogenă, sunt următoarele:
- intervalul de timp în care tulpina produce maortea embrionilor în vârstă de 10 zile;
- patogenitatea pentru puii de o zi inoculați intracerebral;
Factorii de care depind diferențele de patogenitate n-au putut fi stabiliți cu precizie. Bercea și col. (1977), încercând să stabilească o eventuală corelație între patogenitate și compoziția în aminoacizi a tulpinii, ajung la concluzia că cele trei tipuri de virus Newcastle conțin aceiași aminoacizi în proporții apropiate și emit ipoteza existenței unor eventuale diferențe în secvența aminoacizilor din lanțurile polipeptidice componente ale proteinei virale.
Proprietăți imunogene. Virusul de Newcastle este imunogen și conferă stări de imunitate solide care depind de patogenitatea tulpinii, cantitatea de virus și calea de administrare. În practică imunoprofilaxiei pseudopestei aviare, se aplică imunizarea activă; în acest scop poate fi utilizată o gamă largă de vaccinuri, după cum urmează:
vaccinuri vii și atenuate vaccinurile preparate din virusuri lentogene, cum
sunt: tulpina B1 izolată de Hitchner și Johnson (1948); tulpina F de Aspin, (1952) și LaSota de Winterfield și col. (1957); aceasta din urmă este utilizată în momentul de față la noi în țară; pentru imunizarea activă a puilor se aplică metode de vaccinare colectivă, virusurile mai sus menționate fiind administrate prin aerosoli sau în apa de băut.;
vaccinuri preparate din virusuri mezogene, cum sunt: tulpinile MK (Mukteswar), 107 (Lederle),
Virusologie generală
184
Roakin, Komorov și H (Hertfordshire); aceasta din urmă s-a folosit cel mai mult la noi în țară pentru vaccinarea păsărilor adulte și a puilor peste 2 luni; se exploatează în prezent și posibilitatea utilizării în același scop a tulpinilor Roakin;
vaccinuri inactivate, preparate din embrioni infectați cu o tulpină velogenă, în care inactivarea virusului se face cu formol, după care se adaugă ca adjuvant hidroxid de aluminiu după tehnica preconizată de Traub și modificată la noi în țară de Suhaci și col.
Imunitatea pasivă cu seruri antipseudopestoase aviare este posibilă întrucât titrul protector al serului păsărilor hiperimunizate ajunge la valori superioare, dar nu se aplică în teren din motive economice. Din genul Rubulavirus mai face parte virusul Oreionului, care determină parotidita epidemică (oreionul) la om. Are fore sferice cu diametru de 90-180 nm. Virusul urlian poate fi izolat din salivă, sânge și lapte de femei și se cultivă cu ușurință pe sacul amniotic al ouălor embrionate pe celulele HeLa unde produce și efecte citopatice vizibile.
Genul PARAMYXOVIRUS
Virusurile parainfluențelor Pe baza structurii antigenice, a specificității de gazdă și a
patogenității se deosebesc 4 biotipuri: - tipul 1 patogen pentru om și șoarece, - tipul 2 pentru om, maimuță, câine și păsări, - tipul 3 pentru om, cal și bou, - tipul 4 pentru om.
Morfologic, ele nu se deosebesc de celelalte paramyxovirusuri.
Cultivarea este posibilă în diferite sisteme celulare. Efectul citopatic este relativ șters, dar prezența virusurilore este decelabilă prin imunoforescență și hemadsorbție (monostratul în care s-a multiplicat virusul adsoarbe globulele roșii de cobai). Tipurile 1 și 3 determină formarea de incluzii oxifile intranucleare în celulele infectate. Tipurile 1-3 pot fi
Virusologie generală
185
adaptate pe ouă embrionate prin treceri în serie. Tipul 4 n-a reușit să fie adaptat pe embrion.
Virusul parainfluenței 1 Cuprinde un tip uman caracterizat printr-o
hemaglutinină distinctă (HA-2). Cultivarea este posibilă în ouă embrionate și în diferite
sisteme celulare cu particularitățile deja menționate în caracterizarea generală a virusurilor parainfluențelor.
Tipul HA-2 uman este implicat, singur sau asociat cu alți agenți, ca factor etiologic în lariongotraheite și alte afecțiuni respiratorii la copii și mai rar la adulți. Mai recent, virusul a fost izolat din creier de la bolnavi de scleroză, fără a i se putea atribui un anumit rol etiologic.
Virusul parainfluenței 2 Este înrudit cu virusurile simiene SV5 și SV41 și cu
virusul pojarului, dar distinct antigenic de alte myxovirusuri. Cultivarea reușește ușor în ouă embrionate, dar titrul hemaglutinant al lichidului alantoamniotic este redus; în culturi celulare de om, maimuță și câine se multiplică producând efect citopatic în 3-4 zile, cu formarea de sinciții și incluzii intracitoplasmatice.
În condiții naturale, virusul produce o laringo-traheo-bronșită acută la copii.
Majoritatea tulpinilor sunt patogene experimental pentru cobai și hamster pe cale intranazală.
Virusul parainfluenței 3 (PI 3) Este cel mai important pentru medicina veterinară. El
are o nucleocapsidă helicală cu diametrul de 110-240 nm, învelit de peplos. Diametrul întregii particule virale poate ajunge la 300 nm.
În diferite sisteme celulare produce celule gigante multinucleate sau sinciții. Tulpinile bovine se multiplică cel mai bine în celule de vițel, bivol, capră, cal și în celule renale de porc, după cum și pe liniile HeLa și HEp 2. În celulele infectate se formează incluzii intracitoplasmatice și intranucleare. Tulpinile umane nu produc incluzii intranucleare în celulele HEp 2.
Virusologie generală
186
Tulpinile adaptate în culturi celulare se dezvoltă bine și în ouă embrionate în care sunt evidențiabile hemaglutininele.
Virusurile de origine equină se izolaează mai greu, necesitând o prealabilă adaptare, virusul parainfluenței 3 potențează în unele sisteme celulare virusul de Newcastle, acțiunea celor două virusuri fiind sinergică.
Virusul parainfluenței 3 prezintă trei subtipuri, înrudite antigenic, cu celelalte paramyxovirusuri, dar distincte de orthomyxovirusuri.
Subtipul uman este agentul unor afecțiuni la copii; el poate fi diferențiat serologic de celelalte două subtipuri prin RFC, seroneutralizare și inhibarea hemaglutinării și prin absența incluziilor.
Subtipul bovin, cel mai important pentru patologia veterinară, produce în condiții de stres (transporturi, aglomerări, temperaturi scăzute etc.) afecțiuni respiratorii. Boala este cunoscută sub numele de parainfluență, febră de transport sau boala de Umea (numele unei localități din SUA).
Virusul parainfluneței 3 este nepatogen pentru animalele de laborator.
Deseori virusul acționează sinergic cu alte virusuri cum este virusul VD-MD, cel al rinotraheitei infecțioase sau cu bacterii din genul Pasteurella.
În practică se folosește un vaccin inactivat care poate fi aplicat singur sau simultan cu alte vaccinuri.
Subtipul equin produce afecțiuni respiratorii la cabaline și este mai frecvent în Canada și SUA.
Virusul parainfluenței 4 A fost izolat de la copii cu infecții respiratorii; se cultivă
pe celule renale de maimuță; cuprinde două subtipuri notate cu A și B; este înrudit antigenic cu virusul pojarului. Genul RESPIROVIRUS Virusul Sendai se găsește de obicei într-o formă latentă la șoarece, dar prin treceri pe cale intranazală își exaltă
Virusologie generală
187
patogenitatea și produce pneumonii asemănătoare cu cele caracteristice virusului gripal.
Genul MORBILIVIRUS Virusurile aparținând acestui gen sunt învelite de
peplos, care conține hemaglutinine, dar spere deosebire de genul Paramyxovirus, nu conțin neuraminidază. Nucleocapsida este helicală cu diametrul de 18 nm. Genul cuprinde trei specii foarte diferite sub aspectul spectrului de patogenitate și al caracterului infecțiilor pe care le produce, dar foarte apropiate antigenic; acestea sunt: virusul pojarului, virusul pestei bovine și virusul jigodiei.
Virusul pojarului Specie patogenă exclusiv pentru om; produce pojarul la
copii, boală caracterizată curent prin febră și erupție cutanată și mai rar prin inflamația catarală a mucoaselor și encefalomielită. Virusul se cultivă pe celule de om și maimuță în care formează celule sincițiale gigante cu incluzii intranucleare. Efectul citopatic apare mai rapid și este mai caracteristic după o prealabilă adaptare prin mai multe treceri. Virusul reacționează încrucișat prin imunoflorescență și RFC cu virusul pestei bovine și al jigodiei (bolii lui Carré).
Vaccinarea contra pojarului este posibilă cu virusuri inactivate sau atenuate. Rezultatele bune s-au obținut cu tulpina avianizată Edmonston, cultivată pe embrioni de găină sau celule renale de câine.
Virusul pestei bovine Virusul are caracterele generale ale genului. Virionul are
o formă corpusculară și diametrul de 90-250 nm. Filamentele nnucleocapsidei pot ajunge la 500-1.000 nm lungime. Diametrul dublu al helixului este de 18 nm. Cultivarea lui este posibilă în culturi celulare și pe embrioni de găină. În diferite sisteme celulare produce sinciții cu incluzii mai oxifile în citoplasmă și uneori altele mai mici intranucleare. Față de factorii fizici și chimici uzuali este mai sensibil comparativ cu
Virusologie generală
188
alte virusuri; se conservă un timp mai îndelungat –câteva luni- în carnea congelată, imediat după sacrificare.
Virusul este patogen pentru diferite specii de rumegătoare domestice și sălbatice, dar mai ales pentru taurine.
Pesta bovină este o infecție gravă caracterizată prin leziuni catarale și necrotice ale mucoaselor, mai ales a mucoasei intestinale, cu un grad ridicat de contagiozitate și un procent mare de mortalitate și morbiditate.
În condiții experimentale, virusul poate fi adaptat pe oaie, capră, iepure, hamster și șoarece. În organismul hamsterului interferează cu virusul febrei văii lui Rift; tulpinile virulente pot interfera cu cele atenuate, fenomen care alături de răspunsul imun concură la efectul vaccinurilor atenuate.
Proprietățile imunogene ale virusului au determinat prepararea și experimentarea mai multor feluri de vaccinuri. Tulpinile vaccinale se obțin prin adaptarea virusului pe specii nereceptive în condiții naturale. Prin adaptarea pe capră s-a obținut vaccinul caprinizat, pe iepure vaccinul lapinizat și pe embrioni de găină vaccinul avianizat. Țara noastră este, până în prezent, indemnă de pestă bovină.
Virusul jigodiei (bolii lui Carré) Structura și proprietățile virionului sunt cele
caracteristice genului. Dimensiunile particulei virale sunt de 90-250 nm.
Cultivarea reușește în bune condiții în culturi celulare renale de câine și dihor. Efectul se caracterizează prin formarea de celule gigante și prezența incluziilor intracitoplasmatice. Cultivarea pe embrioni de găină se realizează mai greu, necesitând mai multe treceri oarbe prealabile. Efectul hemaglutinant este mai slab și mai inconstant decât la alte myxovirusuri. Tulpinile avianizate în condițiile unei concentrații ridicate de virus produc aglutinarea hematiilor de pasăre și cobai. Date incerte există și cu privire la aglutinarea globulelor roșii de om și broască. Virusul este sensibil față de factorii de mediu.
Virusul este omogen din punct de vedere antigenic și înrudidt cu celelalte două specii din genul Morbilivirus. Relațiile
Virusologie generală
189
antigenice sunt ilustrate prin următoarele fenomene și reacții imunologice încrucișate:
- câinii și dihorii vaccinați cu virusul pojarului se imunizează contra jigodie;
- în serul câinilor trecuți prin jigodie se găsesc anticorpi față de virusul pojarului, iar în serul oamenilor vindecați de pojar se găsesc anticorpi neutralizanți față de virusul jigodiei;
- virusul pestei bovine produce un grad de imunitate față de virusul jigodiei;
- serul bovinelor cu imunitate antipestoasă conțin anticorpi neutralizanți față de virusul pojarului.
Virusul este patogen pentru canide (câine, vulpe, lup etc.), mustelide (dihor, vidră, nurcă, nevăstuică etc.) și procyonide (bursuc etc.). În faza incipientă, virusul manifestă un pneumotropism evident, primele simptome fiind respiratorii. Ulterior sunt afectate și alte aparate și sisteme, mai ales când evoluția bolii este mai lungă. În astfel de cazuri pot apare modificări anatomo-clinice digestive, nervose, cutanate etc.
Pentru diagnosticul etiologic al bolii se poate utiliza, în vederea pentru evidențierea virusului în amprente din diferite organe –pulmon, creier, stomac, mucoasă palpebrală, vezică urinară etc. –reacția de imunoflorescență, imunodifuzie și RFC.
Infecția experimentală poate fi reprodusă pe dihor, nevăstuică sau căței. Dihorul este cel mai sensibil, folosirea lui pentru bioprobă fiind considerată ca un test de certitudine. Inocularea se face cu suspensii de splină, pulmon și creier, recoltate de la cadavre sau cu sânge de la animale bolnave.
În imunoprofilaxia jigodiei se poate aplica atât imunizarea activă cu diferite vaccinuri, cât și cea pasivă cu ser antijigodios. Vaccinurile se prepară din embrioni de găină sau culturi celulare în care s-au multiplicat tulpini avianizate sau lapinizate. Datorită strânsei înrudiri antigenice cu virusul pojarului, acesta poate fi utilizat ca vaccin antijigodios. Vaccinul aplicat la noi în țară se prepară din tulpina avianizată Onderspoort-Haig. La efectul vaccinurilor atenuate concură, pe lângă acțiunea imunizantă și interferența dintre tulpinile atenuate și cele virulente.
Virusologie generală
190
Subfamilia PNEUMOVIRINAE
Genul PNEUMOVIRUS
Genul Pneumovirus se deosebește de genurile Paramyxovirus și Morbillivirus prin absența hemaglutininei și a neuraminidazei din peplos. Nucleocapsida este helicală și are un diametru de 14 nm. Virusurile din acest gen se cultivă relativ ușor în culturi celulare provenite de la specii natural receptive, unde produc efect sincițial. Sincițiile prezintă numeroși nuclei și incluzii mici intracitoplasmatice.
Culturile în care s-a multiplicat virusul sunt lipsite de proprietăți hemaglutinante și hemadsorbante.
În cadrul unor clasificări încă în circulație aceste virusuri sunt reunite în grupa metamyxovirusurilor, fiind considerate ca o grupă aparte, separată de orto și paramyxovirusuri.
Virusul sincițial respirator Izolat pentru prima oară de la cimpanzeu, este specia
reprezentativă a genului Pneumovirus. Virusul are 90-120 nm. Nucleocapsida are diametrul
transversal de 12 nm; expansiunile de pe suprafața pericapsidei au 10-14 nm.
Virusul se cultivă în diferite sisteme celulare, în funcție de originea tulpinii.
Tulpinile umane se cultivă de preferință pe linii celulare HeLa, KB, Ep 2 etc.; tulpinile bovine în culturi renale, testiculare și pulmonare bovine. Dovada multiplicării virusului îl constituie formarea sincițiilor și prezența incluziilor. Efectele hemaglutinant, hemadsorbant și hemolitic sunt absente; lipsește de asemenea neuraminidaza.
Virusul produce infecții respiratorii la om, maimuță și bou.
La bovine boala are un caracter acut, febril, căile respiratorii fiind afectate cu precădere. Infecția este mai severă la animalele adulte decât la tineret.
Virusologie generală
191
Reacțiile serologice cu cea mai mare valoare diagnostică pentru evidențierea anticorpilor față de virusul sincițial respirator sunt seroneutralizarea și reacția imunoenzimatică ELISA..
Un alt agent încadrat în genul Pneumovirus este virusul pneumoniei șoarecelui.
Subfamilia RHABDOVIRINAE
Virusurile din această subfamilie se caracterizează printr-o formă alungită (rhabdos = băț, baghetă, în limba greacă), cu diametrul circular, având o extremitate tăiată drept și una rotunjită, virionul caracterizându-se printr-un aspect asemănător cu o ghiulea. Lungimea rhabdovirusurilor variază între limite largi; cel mai mic reprezentant al familiei –virusul Kern-Canyon- are 130 nm, iar cel mai mare –virusulMarburg- poate ajunge la 2.600 nm. Diametrul transversal este cuprins între 65-90 nm. Structura virusului este complexă. La exterior prezintă un înveliș pericapsidal de natură lipoproteică, constituit din peplomere virus specifice, uniforme și dispuse regulat. La interiorul peplosului se găsește nucleocapsida, de formă tubulară, cu o simetrie helicală. Virionii conțin 5 proteine majore printre care se găsește o ARN polimerază ARN dependentă. Genomul viral este constituit dintr-o singură moleculă de ARN monocatenar cu masa moleculară de 3,5-4,6 x 106.
Virusurile din subfamilia Rhabdovirinae se multiplică în gazde diferite: unele sunt parazite pentru vertebrate, unele pentru insecte, altele pentru plante. Unele rhabdovirusuri pot parazita mai multe categorii de gazde. Subamilia este compusă din 4 genuri:
Genul VEZICULOVIRUS Din acest gen fac parte mai multe virusuri patogene pentru vertebrate sau vertebrate și insecte. Specia reprezentativă, importantă și pentru medicina veterinară, este virusul stomatitei veziculoase. Virusul stomatitei veziculoase
Virionul are formă de ghiulea, o lungime de 150-180 nm și un diametru transversal de 50-70 nm. Peplomerele, uniform distribuite la suprafața virionului, au 10 nm. În preparatele electronooptice au fost observate două feluri de virioni, unii mai lungi –particule B (bullet-shaped = în formă de ghiulea) și altele scurte –particule T (truncated = trunchiate).
Cultivarea sa este posibilă pe embrioni de găină și în culturi celulare. Embrionii mor în 1-2 zile și pot prezenta leziuni ale membranei corioalantoidiene asemănătoare cu cele determinate de poxvirusuri. În culturi celulare virusul produce un efect citopatic evident, care îmbracă forma plajelor în monostraturile de celule renale.Din punct de vedere antigenic au fost descrise două tipuri imunologic distincte: tipul Indiana și tipul New-Jersey.
Speciile receptive sunt cabalinele, bovinele și porcinele, la care boala se manifestă asemănător cu febra aftoasă prin formarea de vezicule pe mucoasa bucală, la nivelul gladei mamare și în regiunea plantară. Infecția are un înalt grad de contagiozitate și evoluează de regulă benign. Ovinele și caprinele sunt refractare în condiții naturale.
Diagnosticul etiologic al bolii și diferențierea virusului de alte virusuri care produc tablouri de boală asemănătoare (virusul febrei aftoase, al exantemului veziculos și al bolii veziculoase) se face serologic prin RFC, seroneutralizare sau imunodifuzie.
În țările în care boala are o extindere mare, se utilizează un vaccin preparat pe baza acelorași principii și metode ca vaccinul antiaftos.
Virusologie generală
193
Genul LYSSAVIRUS
Genul cuprinde mai multe specii patogene pentru
vertebrate și insecte. Cea mai importantă specie pentru medicina umană și veterinară este virusul turbării. În genul Lyssavirus se cunosc 4 serotipuri: virusul adevărat al rabiei ( serotipul 1), virusul Lagos al liliecilor (serotipul 2), rabdovirusul Mokola (serotipul 3) și rabdovirusul Duvenhage (serotipul 4). În cadrul fiecărui serotip au fost descrise numeroase serotipuri.(Perianu, 1997)
Virusul turbării
Istoric. Efectele acestui virus pot fi recunoscute din cele mai vechi documente. Descrieri aproape fidele ale turbării se întâlnesc în operele lui Homer, Aristotel, Democrit etc. În 1804 Zinke reușește transmiterea bolii prin saliva animalelor bolnave. Pasteur (1884) demonstrează infecțiozitatea substanței nervoase, transformă virusul de stradă în virus fix prin treceri seriate pe iepure prin inoculări intracerebrale, prepară cu virusul fix primul vaccin antirabic și intuiește natura agentului etiologic ca fiind un microb foarte mic, inaccesibil mijloacelor optice de amplificare din acea vreme.
Remlinger demonstrează în 1903 filtrabilitatea agentului etiologic. În același an, Negri descrie incluziile intracitoplasmatice specifice, a căror prezență în neuronii din cornul lui Ammon fusese însă semnalată de Victor Babeș încă din 1888. Prioritatea românească de necontestat îndreptățește pe deplin apelativul “Babeș-Negri” pentru desemnarea acestor incluzii și nu numai “Negri” cum se mai poate întâlni prin unele manuale străine. Tot Babeș organizeză la noi în țară institutul antirabic (al doilea de acest fel din lume). Tot la noi în țară s-a inițiat, de către Popovici și Stamatin Ludmila (1957), prepararea unui vaccin eficace din virusul fix adsorbit pe hidroxid de aluminiu destinat imunizării animalelor.
Structura virionului. Morfologic, virusul turbării se aseamănă în mare parte cu virusul stomatitei veziculoase. Virionul are o formă de clopot sau ghiulea cu lungimea medie de 180-250 nm și diametrul de 75 nm. Capsomerele de la
Virusologie generală
194
suprafața virionului prezintă la examenul electronnooptic aspectul unor hexamere. Protuberanțele exterioare, asemănătoare cu cele ale myxovirusurilor, au 6-7 nm lungime. În structura capsidei intră două fracțiuni proteice specifice. Nucleocapsida dublu helicală formează aproximativ 30 de spirale. Acidul ribonucleic viral este monocatenar.
Proprietăți hemaglutinante. Virusul cultivat pe celule renale de pui de hamster BHK-21 (baby hamstr kidney) produce în anumite condiții de pH (6,2) și temperatură (0-40C) hemaglutinarea eritrocitelor de pasăre, în special a celor de gâscă.
Cultivabilitate. Virusul este neurotrop, multiplicându-se cel mai bine în neuroni. De aceea, cultivarea pe embrioni sau în culturi celulare s-a realizat mai târziu și mai greu decât la alte virusuri. Culturi pozitive s-au obținut inițial în suspensii de creier de embrion de iepure, șoarece, șobolan sau găină. O multiplicare mai slabă a fost posibilă și pe celule renale de câine, pisică, cobai și porc.
Rezultatele din ce în ce mai bune s-au obținut în cultivarea virusului pe celule renale de hamster și șoarece și pe fibroblaste de șoarece. Mai eficientă s-a dovedit utilizarea anumitor linii celulare ca de exemplu tulpina WI-26 de celule umane diploide și celule renale de pui de hamster BHK 21 clona 13. În cazul acestor linii, celulele în proporție de 100% au multiplicat virusul, care a produs efecte citopatice evidente. Pe celule de pui de hamster titrul maxim de virus se obține în 6-7 zile, în condiții de incubare la 33-350C. Concentrația de virus obținută a permis chiar abordarea preparării de vaccinuri din virusul produs în culturi celulare.
Începând din 1938 s-au făcut primii pași în adaptarea virusului pe embrioni de găină. Leach (1939) adaptează pe puii de o zi o tulpină de virus rabic izolată de la o fetiță de 14 ani numită Flury. Koprowsky și Cox (1958), prin 126 de treceri pe pui, reușește să adapteze tulpina Flury pe embrioni de 7 zile. După încă 40-50 de treceri, tulpina inoculată intramuscular la câine s-a dovedit incapabilă de a mai produce turbarea dar imunizantă; în această variantă tulpina Flury (este cunoscută sub simbolul Flury) LEP (low-egg-passage). După încă 180 treceri tulpina s-a atenuat și mai mult, fiind notată Flury HEP (high-egg-passage). Aceste experimente au deschis perspectiva
Virusologie generală
195
preparării de vaccinuri antirabice din tulpini avianizate, varianta HEP putând fi utilizată ca vaccin și la om. O tulpină avianizată cu proprietăți asemănătoare, numită Kelev, a fost obținută în 1953 de Komarov și Hornstein.
Rezistența față de factorii ecologici. Virusul este sensibil față de factorii fizici și chimici. La 1000C este distrus în 2 minute, iar la 560C rezistă timp de 15-30 minute; radiațiile ultraviolete, formolul 1%, crezolul 3% și sublimatul 0,1% îl inactivează până în maximum 15 minute. Fenolul, cloroformul și eterul 20% acționează și ele virulicid, dar mai lent. Efectul betapropiolactonei 1/6.000, care inactivează virusul în 2 ore, este valorificat în ultimii ani în tehnologia preparării vaccinurilor. Glicerina 50% constituie un bun conservant, asigurând persistența virusului în țesutul neros timp de mai multe luni. În cadavre virusul poate supraviețui timp de 45 zile, iar în mediul ambiant, sub formă uscată, rezistă 10-14 zile. Structura antigenică. La virusul rabic s-au descris antigene solubile, puse în evidență în lichidul de cultură a celulelor infectate și antigene legate de particula virală. Virusul prezintă două antigene majore: antigene de suprafață, reprezentate de proteinele de înveliș, ce induc anticorpii neutralizantă, protectori și hemaglutinoinhibanți și antigene nucleoproteice reprezentate de nucleocapsidă, care induc anticorpi fixatori de complement, precipitanți pentru imunofluorescență. Analizele efectuate cu ajutorul anticorpilor monoclonali a pus în evidență deosebiri antigenice între tulpinile de virus rabic sălbatic izolate din diferite zone ale globului. Aceste diferențe antigenice ridică problema selectării tulpinilor virale pentru prepararea vaccinului antirabic în funcție de zona geografică. Diferențe antigenice au fost semnalate și la tulpinile de virus rabic folosite la preparearea vaccinurilor.
Infecția naturală. Virusul rabic are un spectru de patogenitate foarte larg. Practic sunt receptive toate mamiferele iar uneori chiar păsările. Rezervorul natural de virus îl constituie însă câinii vagabonzi, carnasierele sălbatice, mai ales vulpile și în unele țări diferite specii de lilieci hematofagi (vampiri). Virusul fiind neurotrop, întregul tablou anatomo-clinic se caracterizează prin semne și leziuni nervoase. Mecanismul patogenetic al infecției rabice constă în
Virusologie generală
196
capacitatea virusului de a se propaga centripet pe calea filetelor nervoase de la periferie spre neuronii din sistemul nervos central. Această însușire a fost numită de virusologul român {tefan S. Nicolau neuroprobazie. Viteza de înaintare a virusului de-a lungul axonilor este de 3 mm pe oră. Leziunea specifică pentru virusul rabic o constituie incluziile Babeș-Negri, din neuronii piramidali de tip Betz, din coarnele lui Ammon, evidențiabili în amprente sau secțiuni histologice prin metode speciale de colorare sau prin imunoflorescență. Incluziile nu sunt însă constant prezente, formarea lor depinzând de gradul de virulență al tulpinii infectante. Efectul incluziogen este de regulă o caracteristică a tulpinilor cu un grad mai redus de virulență, care produc infecții cu o evoluție mai lentă. Între indivizii speciilor receptive virusul se transmite prin mușcătură, fiind prezent în saliva animalelor bolnave cu 14 zile înainte de moarte; mult mai rară este infecția consecutivă traversării de către virus a mucoaselor infectate ori prin aerosoli. Un caz clasic în care virusul a produs infecția pe calea mucoaselor este cel al fetiței Flury, menționat anterior, de la care s-a izolat prima tulpină adaptată pe embrioni de găină. Transmiterea prin aerosoli este posibilă mai ales în peșterile în care-și are sediul un număr mare de lilieci hematogafi infectați.
Infecția experimentală. Virusul rabic este patogen pentru numeroase specii de animale de laborator, cele mai receptive fiind șoarecele, hamsterul, cobaiul, șobolanul și iepurele. Căile de inoculare cele mai severe sunt calea intracerebrală și inocularea în camera anterioară a ochiului. Animalele infectate experimental fac de obicei forma de turbare paralitică. Uniform sensibili sunt șoarecii în vârstă de 3-6 săptămâni din linia Swiss Albino, după cum și hamsterii tineri, la care perioada de incubație este de 5-7 zile. Evoluția bolii experimentale durează de obicei în jur de 17 zile.
Virusurile rabice fixe, sunt tulpini de laborator obținute după modelul pesteurian de treceri intracerebrale repetate pe specii de animale sensibile. Virusurile fixe clasice se obțin pe iepure. Virusurile fixe nu au un grad redus de patogenitate comparativ cu virusurile sălbatice sau “de stradă”, dimpotrivă, ele sunt mai virulente în special pentru specia animală pe care au fost fixate. Spre deosebire de virusurile de stradă, ele au pierdut însă capacitatea de a înainta pe calea
Virusologie generală
197
nervilor periferici spre centrii nervoși (neuroprobazia). De aceea, virusurile fixe sunt patogene numai în condiții experimentale și inoculate numai intracerebral, când produc infecții grave și cu o evoluție mai rapidă; inoculate însă subcutanat, sunt nepatogene. Termenul “virus fix” (virus fixé) a fost inspirat de perioada fixă de incubare, de 4-9 zile la iepure a acestor tulpini, spre deosebire de virusurile de stradă a căror perioadă de incubație variază între limite largi.
Alte caracteristici ale virusurilor fixe sunt următoarele: - produc numai forma clinică paralitică; - titrul infectant pentru șoarece pe cale intracerebrală
se situează la o diluție mai mare cu 2-5 x 101; - efectul incluziogen este absent; - virusul nu ajunge în gladele salivare și este rareori
prezent în nervii periferici. Proprietăți imunogene și metode de imunizare. De la
primul vaccin aplicat de Pasteur, în 1885, prepararea vaccinurilor antirabice a înregistrat o mare diversitate de variante metodologice.
În funcție de substrat, vaccinurile antirabice pot fi împărțite, după Toma (1970), în următoarele categorii: Vaccinuri preparate din țesut nervos: la rândul lor
acestea se pot clasifica în: - vaccinuri vii obținute din virusuri fixe, cum este cel
folosit pentru imunizarea animalelor la noi în țară, după rețeta preconizată de Popovici I. și Stamatin Ludmila (1957), constituit din substanța celulară de oaie adsorbită pe hidroxid de aluminiu, care conține virusul fix, tulpina Babeș;
- vaccinuri inactivate; de-a lungul timpului au fost experimentați numeroși agenți inactivanți fizici (căldura, razele ultraviolete) și chimici (fenolul, glicerina fenolată, eterul, cloroformul, formolul și, mai recent, etilen-imina, betapropiolactona și fuenzalida). Vaccinuri inactivate calitativ superioare, cu valoare imunogenă apropiată de a celor vii, s-au obținut din creier de șoarece nou născut.
Vaccinuri avianizate preparate pe embrioni de găină cu virus viu aparținând tulpinilor Flury (LEP și HEP), Kelev sau pe embrioni de rață cu virus inactivat.
Virusologie generală
198
Vaccinuri vii sau inactivate, preparate din culturi celulare cu diverse virusuri adaptate la diferite sisteme de celule ca cele renale de câine sau porc, celule diploide umane sau linii celulare (NIL2, de fibroblaste de hamster).
Serul antirabic, de fapt primul ser imun preparat de Babeș și Lepp (1889), nu și-a găsit o aplicație imunoprofilactică. Serurile imune marcate cu substanțe fluorocrome și-au găsit însă în ultimii ani o sferă largă de utilizare în diagnosticul curent al turbării. Genul EPHEMEROVIRUS
Virusul febrei efemere bovine (febrei de trei zile), are forma caracteristică de ghiulea, dimensiunile de 120-140/80 nm, este cultivabil pe linia celulară BHK-21 și pe celule de maimuță. Singura specie natural receptivă o reprezintă bovinele, la care produce o maladie de scurtă durată, caracterizată prin febră, pareze și rigiditate musculară. Boala evoluează enzootic, cu un procent redus de morbiditate (5%) în Africa, Asia și unele regiuni din Australia. Virusul se transmite prin artropode.
Genul NOVIRHABDOVIRUS (Rhabdovirusuri patogene pentru pești)
Au fost identificați ca agenți etiologici ai unor entități
nosologice bine definite, după cum urmează: Agentul septicemiei hemoragice virotice cunoscut
și sub numele de virusul Egtved, după o localitate din Danemarca unde boala a fost diagnosticată pentru prima oară, produce la păstrăvi și alte salmonide în vârstă până la 2 ani o infecție subcutanată, cu capacitate de difuziune enzootică mai frecventă în anotimpurile reci.
Virusologie generală
199
Agentul viremiei de primăvară a crapului producE o infecție contagioasă acută la crapi, caracterizată prin hidropizia cavității abdominale și inflamația veziculelor înnotătoare (aerocistită).
Virusul necrozei infecțioase a sistemului
hematopoetic este agentul etiologic al unei boli a salmonidelor în care predomină leziunile histologice ale țesutului hematopoetic.
Famila BUNYAVIRIDAE
Această familie cuprinde virioni de 90-100 nm, cu
capsida probabil helicală și un înveliș pericapsidal care conține un glicopeptid specific.
Genomul este format din ARN monocatenar, construit din 3 segmente.
Virusul se multiplică în citoplasmă și este eliberat din celula gazdă prin înmugurire în vezicula din apropierea aparatului Golgi.
Familia are patru genuri : Phlebovirus, Noirovirus, Bunyavirus și Montavirus.
Numele familiei și al genului Bunyavirus au fost date după localitatea Bunyamwera, din Uganda, unde a fost izolată specia considerată ca reprezentativă pentru acești taxoni.
Genurile și speciile cele mai importante, patogene pentru vertebrate sunt cele care produc boala de Nairobi și febra văii Rift.
Genul NAIROVIRUS Virusul bolii de Nairobi este agentul unei boli
infecțioase a ovinelor și caprinelor, caracterizată printr-o puternică reacție febrilă și gastoroenterită hemoragică. Boala a fost deiagnosticată prima oară în 1910 în apropiere de localitatea Nairobi din Africa de Est.
Virusologie generală
200
Virionul poate fi sferic, cu diametrul de 70 nm sau alungit, având 500 nm lungime și 60 nm diametrul transversal. Cultivarea reușește cel mai bine în celule renale de pui de hamster. Virusul a fost inițial încadrat în genul Flavivirus din familia Togaviridae. Transmiterea virusului are loc curent prin căpuși, mai ales cele din genul Rhipicephalus. La căpuși virusul se transmite la descendenți, fiind evidențiabil atât la formele adulte cât și în larve și nimfe. Datorită acestui mod de transmitere, agentul bolii de Nairobi este considerat un arbovirus.
Genul PHLEBOVIRUS Virusul febrei văii Rift sau al hepatitei enzootice, este
agentul unei infecții la ovine, bovine și alte specii, caracterizată de regulă prin avorturi ale femelelor gestante, tulburări generale, necroze hepatice și un procent ridicat de mortalitate la tineret. Boala a fost diagnosticată în 1912 în valea Rift din Kenya, iar virusul a fost izolat în 1931.
Virionii au diametrul de 60-75 nm, iar pe suprafața lor se găsesc numeroși spiculi de formă cilindrică. Virusul este hemaglutinant față de globulele roșii de pasăre, șoarece, cobai și cele de om din grupa A. Cultivarea reușește bine în ouă embrionate și culturi celulare renale de miel, după cum și în celule de pasăre, șoarece, hamster și alte specii. Virusul se transmite în condiții naturale prin țânțari și pe cale digestivă în condiții de coabitare. Genul BUNYAVIRUS Virusul Akabane a fost izolat de la țânțari și alte insecte hematofage (Culicoides brevitaris și Culicoides nebeculosis), în organismul cărora se replică (Jennings și col., 1989). Determină boala de Akabane sau Arthrogryposă și Hydroencephalia enzootică bovină, caracterizată prin afecțiuni congenitale (rigiditate articulară, congenitală, hidroencephalie), avorturi și mortalitate neonatală. La infecție sunt receptive bovinele, ovinele și caprinele, cabalinele și bubalinele care fac infecții
Virusologie generală
201
asimptomatice. Testul ELISA s-a folosit cu bune rezultate în diagnosticul serologic al infecțiilor (Iale și col., 1989).
Familia ORTHOMYXOVIRIDAE Prefixul taxonului de la cuvintele grecești “orthos” = drept, corect și “myxa” = mucus. El se corelează cu afinitatea acestor virusuri pentru mucusul căilor respiratorii. Această familie cuprinde virusurile care produc influența la om și diferite specii animale. Virionii sunt polimorfi, prezentându-se sub forme sferice sau alungite. Virionul în întregime (inclusiv pericapsida) are o formă aproximativ sferică, cu diametrul variind între 80-120 nm. Nucleocapsida se găsește pliată sub forma unui ghem la interiorul pericapsidei. Ea are o simetrie helicoidală; eliberată din peplos prin tratare cu eter sau eter în amestec cu Tween 80 și depliată are o formă filamentoasă. Pericapsida este constituită din peplomere de 10-14 nm lungime, cu diametrul de 4 nm; în compoziția lor chimică intră proteine, glucide și lipide. Expansiunile de pe suprafața pericapsidei sunt de două feluri atât ca aspect morfologic cât și al funcției lor biologice.
Hemaglutininele (HA), în formă de bastonașe de 10-14/4 nm, triunghiulare pe suprafața de secțiune; separate de restul componentelor virale din faza apoasă a suspensiilor de virus tratate cu eter și purificate prin adsorbții și eluări succesive pe globule roșii, HA se prezintă în mici agregate radiare având aspectul unor rozete cu diametrul de 30-40 nm. HA sunt antigenice și reacționează cu anticorpii specifici în reacții de seroneutralizare și inhibarea hemaglutinării.
Unitățile de neuraminidază (NA) sunt mai scurte și mai subțiri comparativ cu HA; au 9 nm lungime și diametrul de 5 nm; suprafața lor de secțiune este circulară. NA sunt și ele antigenice. Rolul lor în mecanismul infecției virale este controversat. Ele acționează asupra membranei celulei gazdă, după
Virusologie generală
202
unele păreri înlesnind pătrunderea virusului, după altele, fiind responsabile de eliberarea virionului din celulă.
Nucleocapsida sau ribonucleoproteina are o formă filamentoasă, este flexibilă și are structura helicoidală. Diametrul ei este de 10 nm, iar lungimea variază între limite destul de largi. De regulă este de aproximativ 600 nm, dar s-au evidențiat și forme filametoase care ajung până la 4.000 nm.
Antigenic, ribonucleoproteina carespunde antigenului “g” (gebundenes Antigen = antigen legat), care împreună cu antigenii solubili formează un antigen mixt desemnat cu simbolul “S”.
Genomul viral este reprezentat de ARN monocatenar, constituit din 7 piese (segmente) cu masa moleculară totală de 4 x 106. Între membrii familiei Orthomyxoviridae sunt posibile recombinări genetice, absente la Paramyxoviridae.
Virionul conține o enzimă virus-specifică, care intervine în replicarea genomului viral și anume o ARN polimerază ARN dependentă.
Principalele proprietăți fizico-chimice ale acestui grup de virusuri constau în: stabilitate maximă la –700C și la condiții de pH 7-8; sensibilitate la eter, cloroform și pH 3; formolul, săpunurile și detergenții au acțiune inactivantă.
Toate orthomyxovirusurile au proprietăți hemaglutinante, datorate adeziunii virionilor pe suprafața eritrocitelor prin afinitatea chimiotactică între receptorii mucoproteici de pe suprafața globulelor roșii și hemaglutininele din structura pericapsidei virionilor.
Cultivarea este ușor realizabilă în cavitatea amnitotică și alantoidiană a ouălor embrionate de găină cu excepția virusurilor gripale de tip C care nu se multiplică decât în cavitatea amniotică. Majoritatea othomyxovirusurilor se multiplică și în diferite culturi celulare.
Efectul incluziogen este absent. Cu rare excepții, aproape toți membrii taxonului se
caracterizează prin tropismul lor pentru căile respiratorii pe tractul cărora produc leziuni de tip inflamator.
Familia cuprinde patru genuri: Influenzavirus A., Influenzavirus B., Influenzavirus C. și Thogavirus.
Virusologie generală
203
Genul INFLUENZAVIRUS
Prefixul “influenza” este un cuvânt italian care-și are
originea în cel latin “influentia” – influență cu semnificație de epidemie în ideea că epidemiile erau considerate în antichitate ca fiind rezultatul unor “influențe” astrologice sau oculte.
Din genul Influezavirus fac parte mai multe virusuri care produc infecțiile gripale (influențele) la om și diferite specii animale. Ele se clasifică pe baza mai multor criteriiși anume:
Pe baza acestor criterii, virusurile gripale au fost împărțite în trei seruri: Influenzavirus A., Influenzavirus B și Influenzavirus C.
Genul INFLUENZAVIRUS A
Conține NP și M identice și specifice. HA și NA sunt și ele specifice, dar pe baza lor se pot distinge mai multe variante sau subtipuri, după cum urmează:
- variantele HA (H) în număr de 15, notate astfel: HO sau H 3 – umană,H sw 1 – suină, H eq 1 și H eq 2 – ecvină, H av 1 – H av 8 – aviare;
- variantele NA (N) în număr de 9, notate astfel: N1 și N2 – umane, N eq 1 și N eq 2 – equine, N av 1 – N av 5 – aviare.
Virusurile influențelor se caracterizează în general print-o mare labilitate antigenică și mai ales imunogenică, asemănătoare întrucâtva celei menționate la virusul febrei aftoase, care duce la apariția de noi variante antigenice pe parcursul aceleiași epizootii. Această stare de lucruri crează mari dificultăți în imunizarea antigripală.
Infecțiile gripale au deseori un caracter epidemic sau chiar pandemic la om și epizootic, uneori panzootic la animale, calea curentă de transmitere fiind cea aerogenă. Cele mai
Virusologie generală
204
importante și mai frecvente infecții gripale ale animalelor sunt influența suinelor, cea a ecvinelor și diferite infecții ale păsărilor dintre care cea mai importantă este pesta aviară clasică.
Orthomyxovirusuri ale mamiferelor, aparținând în majoritatea cazurilor genului Influenzavirus A sunt: Virusul influenței suinelor se izolează ușor pe ouă embrionate, este patogen pentru șoarecele tânăr pe cale intranazală, producând o pneumonie caracteristică, aglutinează globulele roșii și poate fi identificat prin reacții serologice ca inhibarea hemaglutinării și RFC. Acțiunea patogenă a virusului influenței în infecția naturală la porc este potențată prin asocierea sa cu specia bacteriană Haemophilus influenzae-suis, iar transmiterea sa de la un individ la altul se realizează, pe lângă calea aerogenă și prin metastrongili. Transmiterea la om sau alte specii animale este puțin probabilă cel puțin în ultimele decenii, cu toate că anticorpii specifici virusului influenței suine au fost decelați în seruri de om, iar pandemia de gripă din 1918-1919 s-a dovedit a fi de origine suină. Prezența anticorpilor în serul de om poate fi corelată cu starea de purtător. Virusul influenței ecvine (tusei de Hoppegarten) are diametrul de 100 nm și se aseamănă din punct de vedere al comportării pe embrionul de găină și al patogenității pe cale intranazală pentru șoarece cu virusul influenței suine. El este însă mai apropiat de virusul influenței umane din punct de vedere antigenic și al patogenității. Apariția unor îmbolnăviri la om, în timpul unor enzootii de influență ecvină au fost corelate cu patogenitatea acestuia pentru om, experiențele pe voluntari care au acceptat injectarea experimentală cu virusul influenței ecvine și care au făcut forme clinice de boală, însoțite de răspunsul imunologic specific, au demonstrat în mod convingător patogenitatea pentru om a virusului ecvin. La virusul influenței ecvine au fost identificate două tipuri antigenice: equi 1/Praga/56 și equi 2/Miami/63. În cazul preparării unor vaccinuri se recomandă ca ele să fie preparate din ambele tipuri. Vaccinarea n-a intrat încă, în practica largă, mai ales că în timpul epizootiilor au loc variații antigenice
Virusologie generală
205
episodice. Mardari (1975), cercetând o epizootie pe teritoriiul Moldovei, constată prezența inițială a tipului clasic A/Equi 1/Praga/56, care după ce a afectat întregul efectiv de cabaline imunizându-l, este dezlocuit de o nouă variantă panepizootogenă A/Equi/Iași/1/68. Virusul influenței umane, asemănător cu virusurile animale, prezintă mari varietăți privind patogenitatea. Tulpinile cu virulență plină au însă o capacitate foarte mare de difuziune, gripa umană evoluând uneori pandemic și chiar cu cazuri mortale (virusul de tip asiatic). Virusul influenței umane poate fi patogen în unele cazuri pentru cabaline. În Europa și America de Nord au fost descrise mai multe enzootii de influență ecvină, produse de virusul uman. Experimental, sunt foarte sensibili șoarecele tânăr și dihorul. Antigenic, toate tulpinile au un antigen fixator de complement comun și se caracterizează printr-o mare variabilitate antigenică a hemaglutininelor. Vaccinuri antigripale au fost preparate și experimentate în multe țări; ele se administrează intranazal subacut sau intramuscular și produc o imunitate activă de scurtă durată; eficacitatea lor este condiționată de menținerea aceleași variante antigenice pe parcursul epidemiei. Orthomyxovirusuri aviare încadrate în genul Influenzavirus A.. Din infecțiile respiratorii ale păsărilor au fost izolate mai multe virusuri identice morfologic și având antigeni comuni cu virusurile influențelor de tip A. Studiul serologic al acestora a permis împărțirea lor în 5 tipuri antigenic distincte și anume:
tipul 1, reprezentat de virusul pestei aviare clasice; tipul 2, în care se încadrează tulpini izolate de la rață
în Cehoslovacia și Anglia; tipul 3, identificat tot la rață în Anglia, distinct de
tipul 2; tipul 4, izolat din enfecții asemănătoare cu pesta
clasică de la puii de găină, în Scoția și în Africa de Sud;
Virusologie generală
206
tipul 5, cunoscut sub numele de virusul Wilmot, identificat ca agent al unei infecții respiratorii benigne la curci în Canada.
Tipul cel mai bine cunoscut și mai important pentru patologia aviară este tipul 1, respectiv virusul pestei aviare clasice.
Virusul pestei aviare, a fost multă vreme așezat și tratat
comparativ cu virusul pseudopestei aviare (Newcastle), trecut acum în familia Paramyxoviridae, genul Rubulovirus.
Pesta aviară a fost descrisă în 1878 de Perroncito și a produs timp de mulți ani importante pagube economice. În ultimele decenii aria ei geografică s-a limitat considerabil, mai ales în Europa.
Virusul pestei aviare este mic, diametrul virionului fiind de 80-100 nm.
Cultivarea se realizează ușor pe ouă embrionate, pe culturi celulare embrionare de origine aviară sau mamiferă (celule de iepure, bou, om), pe celule HeLa.
Antigenic, virusul pestei aviare reacționează încrucișat prin RFC cu celelalte virusuri ale influenței de tip A; prin reacția de inhibare a hemaglutinării nu dă insă decât slabe reacții încrucișate cu virusul influelței equine. Tot pe baza inhibării aglutinării s-a reușit identificarea în cadrul speciei a cinci tipuri antigenice. Pe baza antigenelor pericapsidale, hemaglutinine (H) și neuroaminidaze (N) la virusul pestei aviare s-au descris 14 subtipuri antigenice H (H1 – H14) și 9 subtipuri N (N1- N9). Toate tulpinile virulente izolate au fost încadrate în subtipurile H5 și H7 (Perianu, 1997).
Speciile sensibile în condiții naturale sunt găinile și curcile, mai rar rațele și gâștele; sunt receptive și diferite specii de păsări sălbatice.
În condiții experimentale pot fi însă infectate, mai ales pe cale intracerebrală și diferite specii de mamifere –șoarecele, dihorul, iepurele, pisica etc. Porumbelul pare a fi, dintre păsări, singura specie nereceptivă.
Virusul influenței rațelor, a fost identificat în
Cehoslovacia și Anglia ca agent al unei infecții enzootice
Virusologie generală
207
caracterizate prin inflamația sinusurilor infraorbitare. Serologic, s-a demonstrat că el posedă antigenul fixator specific pentru tipul A, dar prin reacția de inhibare a hemaglutinării n-a reacționat încrucișat cu virusul pestei aviare. Cultivarea se realizează ușor în culturi celulare pe embrion de găină, rață, vițel etc.
Alte orthomyxovirusuri având antigenul fixator de complement A descrise ca agenți ai unor infecții la păsări sunt: un virus izolat de la pui în Scoția și în Africa de Sud, care produce un tablou anatomo-clinic asemănător cu pesta aviară, dar este distinct antigenic de acesta; virusul Wilmot înrudit antigenic cu tipul Miami/63 al virusului influenței equine și virusul influenței rațelor, agentul unei boli benigne la curcani în Canada și virusul N izolat în Germania de la pui dintr-un focar cu evoluție asemănătoare pestei.
Genul INFLUENZAVIRUS B
Genul Influenzavirus B conține NP și M specifice și
analog tipului A, poate fi împărțit în mai multe variante antigenice pe baza HA și NA. Virusurile gripale de tip B sunt patogene pentru om, la care produc o infecție gripală asemănătoare cu virusul de tip A, dar puterea de difuziune este mai redusă, evoluția bolii mai beningă și se întâlnește mai rar. Totuși, în prepararea vaccinurilor antigripale umane se include de regulă și virus de tip B. Semnalările de infecții cu tipul B la animale sunt o raritate. Takatsy (1967, citat de Volintir, 1975) descrie o epizootie cu virusul B la porc. Genul INFLUENZAVIRUS C Genul Influenzavirus C conține polipeptide structurale asemănătoare cu ale tipurilor A și B. NP sunt însă antigenic specifice. În culturi celulare, virusurile C produc deseori efectul de fuziune celulară. În unele sisteme celulare interferează cu virusul de tip B și cu virusul de Newcastle, iar în organismul șoarecelui infectat experimental interferează și cu virusul de vest al encefalomielitei infecțioase a calului.
Virusologie generală
208
În condiții naturale produce sporadic infecții benigne la om și este nepatogen pentru animale. Familia ARENAVIRIDAE Virionii au 50-300 nm diametru, sunt polimorfi, predominând formele sferice. Structura virionilor este asemănătoare în unele privințe cu cea a virusurilor variolice. Învelișul este constituit dintr-o membrană lipidică bistratificată. În componența proteinelor virale au fost identificate 2 glicopeptide și 2 polipeptide. Genomul este constituit din mai multe segmente de ARN monocatenar, din care 4 mari și 1-3 mici. Prefixul taxonului este inspirat din cuvântul latin “arenosus” = nisipos, coresponzând aspectului particulelor virale la examenul electronooptic. Familia cuprinde un singur gen: Arenavirus, din care fac parte diferite specii, majoritatea patogene numai pentru rozotoare, la care produc viremie și/sau virurie. Merită a fi menționate din acest grup virusul coriomeningitei limfocitare a șoarecelui, care a servit ca model pentru lămurirea mecanismului toleranței imunologice și virusul Lassa patogen pentru om. Virusul coriomeningitei limfocitare are dimensiuni variabile (50-200 nm); ARN are masa moleculară de 3,5 x 106daltoni. Simetria capsidei nu este bine precizată. Virusul se multiplică în membrana corioalantoidiană a embrionului de găină fară să producă leziuni evidente și în diferite sisteme celulare, în care produce de regulă efect citopatic numai după o prealabilă adaptare. {oarecele ete gazda la care virusul se găsește cel mai frecvent sub formă endosimbiotică; mai poate fi izolat de la cobai, câine, porc etc. Tulpinile diferă ca virulență. Infecțiile clinice îmbracă forme variate printre care predomină pneumoniile și encefalitele. Mecanismul patogenetic este deosebit de interesant. De la părinți cu infecții inaparente, virusul se transmite transplacentar la descendenți, la care
Virusologie generală
209
dezvoltă în timpul vieții embrionare o stare de toleranță imunologică. La vârsta de aproximativ 10 luni șoarecii fac o encefalită progresivă, în creer găsindu-se o cantitate considerabilă de virus. Totodată se produc leziuni de glomerulo-nefrită asemănătoare cu cele din boala nurcii Aleutine. Virusul febrei Lassa produce o boală gravă, de obicei fatală la om, în unele zone din Africa. Se presupune că rezervorul natural este reprezentat tot de rozătoare. Virusul este înrudit antigenic cu agentul coriomeningitei limfocitare.
Genul ARTERIVIRUS În acest gen sunt încadrate virusurile arteritei ecvine și a sindromului respirator și de reproducție la suine, alături de virusul dehidrogenezeiu lactice și a febrei hemoragice simiene (Benfield și col. 1992). Virusul arteritei ecvine are dimensiunile cuprinse între 50-70 nm/ 30-40 nm, conține ARN și este sensibil la eter și cloroform. Virusul este cultivabil pe culturi celulare renale de mânz, hamster și iepure pe care produce un efect citopatic în 24 – 48 h. Este sensibil la variațiile de pH și la temperaturi de peste 560C. Arterita ecvină sau febra tifoidă a calului este o boală contagioasă specifică solipedelor, caracterizată clinic prin febră, abatere, catar oculo-nazal, edeme subcutanate, icter și avort. Virusul sindromului respirator și de reproducție la porcine (virusul Lelystad) a fost izolat de la porcii mistreți în Olanda. Este un virus mic (45-55 nm) care conține ARN și se cultivă preferențial pe macrofage alveolare de purcel (Wensvoort și col., 1991). Infecția naturală este o boală mai nouă, caracterizată prin tulburări de reproducție la scroafe și respiratorii la purcei.
Virusologie generală
210
Familia TOGAVIRIDAE Denumirea taxonului derivă de la “toga” în baza
analogiei dintre mantia romană și pericapsida virală prezentă la membrii acestei familii. O parte din togavirusuri sunt membrii vechii grupe a arbovirusurilor (ARthropod-BOrne-purtat de artropode).
Virionii au o formă icozaedrală și sunt înveliți de o pericapsidă lipoproteică. Praticula virală în întregime are o formă sferică și un diametru de 40-70 nm. În structura peplosului intră o glicopeptidă virus specifică.
Genomul este constituit dintr-o singură moleculă de ARN monocatenar cu masa de 4 x 106.
Virusurile se multiplică în citoplasmă și sunt eliberate din celulă prin înmugurire.
Din această familie fac parte 2 genuri: Alphavirus și Rubivirus
Genul ALPHAVIRUS În acest gen sunt încadrate virusurile constituente ale
vechii grupe A de arbovirusuri. Virionii sunt mici, nedepășind 40-80 nm; genomul viral are diametrul de 20-50 nm și este acoperit de o capsidă formată de 32 capsomere inelare. ARN viral are masa moleculară de 3 x 106 daltoni. Pericapsida prezintă pe suprafața ei hemaglutinine sub forma unor proemineanțe. Toate speciile sunt înrudite antigenic.
Virusul encefalomielitei infecțioase americane a
calului Encefalomielita infecțioasă americană poate fi produsă
de trei virusuri apropiate, dar totuși distincte și anume: virusul de vest sau californian, mai frecvent în
California, Canada și Argentina; virusul de est sau de Virginia, răspândit în SUA,
Canada, Mexic, Cuba, Brazilia, mai patogen comparativ cu virusul de vest;
Virusologie generală
211
virusul venezuelian, prezent mai ales în Venezuela și Columbia mai rar în Florida și Mexic; sub aspectul patogenității este mai apropiat de virusul de vest.
Toate cele trei virusuri se cultivă pe ouă embrionate de 9-11 zile , producând leziuni hemoragice și moartea embrionilor în 24-48 ore, după cum și în culturi celulare de șoarece, hamster, embrioni de găină și alte specii , determinând un marcant efect citopatic. Efectul hemaglutinant se manifestă cel mai bine la pH 6,1.
Reacțiile de seroneutralizare și RFC sunt foarte sensibile pentru identificarea anticorpilor specifici în ser, chiar și după o singură inoculare.
Natural receptive sunt în primul rând cabalinele, urmate de om și păsări. Anatomo-clinic, boala se manifestă prin simptome de excitație sau paralizie și leziuni de encefalită în diferite compartimente ale sistemului nervos central. Agenții transmițători sunt țânțarii și căpușile. În condiții experimentale sunt receptive mult mai numeroase specii de animale. Pentru stabilirea diagnosticului de laborator sunt de regulă utilizați șoarecele, iepurele și cobaiul. În condiții naturale, cel mai patogen este virusul de est, iar experimental pentru animalele de laborator, virusul venezuelian.
Genul RUBIVIRUS
Caracteristicele acestui gen sunt: dimensiunile de –100
nm în diametru, netransmisibilitatea prin artropode și proprietățile hemaglutinante datorate prezenței pe suprafața pericapsidei a proeminențelor asemănătoare cu cele ale alpha și flavivirusurilor. În genul Rubivirus se încadrează agentul rubeolei, o boală specifică omului, caracterizată printr-o erupție cutanată asemănătoare pojarului, dar mai benignă.
Familia FLAVIVIRIDAE
Flavivirusurile au dimensiuni de 45-50 nm, sunt învelite cu dubla membrană lipidoproteică, prevăzută cu emargențe
Virusologie generală
212
polipeptidice de 45 nm lungime. Ele conțin ARN iar nucleocapsida are o simetrie cubică. Replicarea are loc în citoplasmă iar maturarea la nivelul membranei celulare. Gazdele naturale sunt reprezentate de vertebrate și unele nevertebrate (insecte, artropode). La om provoacă infecții inaparente sau boli mortale cum ar fi encefalita de căpuși și febra galbenă. Pentru animale, cele mai semnificative entități morbide provocate de asemenea virusuri sunt encefalita ecvină japoneză, looping IPP (encefalomielita infecțioasă ovină) și meningoencefalita curcilor. Familia cuprinde 3 genuri: Flavivirus, Pestivirus și Hepacivirus Genul Flavivirus
Virusurile din acest gen au aproximativ aceeași structură ca alphavirusurile, dar sunt mai mici, având diametrul de 20-50 nm. Vectorii pentru unele flavivirusuri sunt țânțarii,iar pentru altele căpușile. Virusul febrei galbene considerat ca specie tip a genului Flavivirus, virionul are structura și celelalte componente morfologice caracteristice acestui gen. Cultivarea este posibilă pe diferite culturi de celule în care produce efect citopatic și în ouă embrionate, după o prealabilă adaptare pe șoarece sau pe culturi celulare. Febra galbenă este o antropozoonoză. Rezervorul natural îl constituie diferite specii de maimuțe de la care virusul se transmite la om prin țânțari. Aria geografică a bolii este zona tropicală a Africii și Americii de Sud. Procentul de mortalitate este de 5-10%. Tabloul anatomo-clinic se caracterizează prin necroze ale parenchimului hepatic, care determină un icter accentuat și gastroenterită hemoragică. Parenchimul hepatic necrozat confluează formând mase hialine cunoscute sub numele de corpusculii lui Council – man. Virusul produce incluzii intranucleare limitrof nucleolilor (incluziile Torres).
Virusologie generală
213
Pentru imunizarea activă contra febrei galbene se utilizează un vaccin viu atenuat preparat din tulpina 17 D pe embrioni de găină.
Complexul virusurilor encefalitelor de căpușe În acest grup sunt cuprinse virusurile vehiculate prin căpuși, care produc encefalite diverse, din care cele mai cunoscute sunt: febra hemoragică de Omask, encefalitele rusești de primăvară-vară și din estul îndepărtat, encefalita din Europa Centrală, Negishi, Langat, Powassan, boala de Kyasanur și Louping-ill, care este cea mai imporantă din punct de vedere al frecvenței și al implicațiilor economice potențiale. Virusul Louping-ill Structura și constantele fizico-chimice ale virionului sunt cele comune tuturor flavivirusurilor. Proprietățile hemaglutinante se evidențiază mai ales față de eritrocitele de gâscă. Cultivarea este posibilă în ouă embrionate intravitelin sau pe membrana corioalantoidiană în grosimea căreia virusul produce leziuni proliferative discrete. În culturi celulare ovine, bovine, umane, în celule HeLa și alte linii celulare virusul se multiplică determinând un marcant efect citopatic. În monostrat de celule renale de porc formează plaje. Antigenic este înrudit cu alte flavivirusuri, fiind cel mai apropiat de virusul encefalitei din Europa Centrală. Infecția naturală, caracteristică ovinelor, este cunoscută sub mai multe denumiri, din care, cu o circulație mai largă sunt: Luoping-ill, encefalomielita infecțioasă a oilor, encefalomielita scoțiană. Cuvântul “louping” are într-un vechi dialect scoțian semnificația de salturi și se referă la unul din simptome. Alte manifestări clinice ale bolii constau în ataxie, tremurături, torticolis, pareze și paralizii, consecință a leziunilor meningoencefalitice care domină în tabloul histopatologic. În afara ovinelor mai sunt receptive taurinele, rareori caninele și cabalinele. Vectorul este căpușa Ixodes ricinus. Virusul este imunogen pretându-se la prepararea de vaccinuri vii atenuate sau inactivate capabile să confere animalelor vaccinate o stare de imunitate satisfăcătoare, transmisibilă pasiv de la oile mame la miei.
Virusologie generală
214
Genul PESTIVIRUS Pestivirusurile au pericapsida netedă și de aceea sunt lipsite de proprietăți hemaglutinante. Genul cuprinde specii înrudite antigenic, unele de importanță majoră pentru patologia veterinară, care urmează a fi tratate în continuare pe larg. Virusul bolii mucoaselor – diareii virotice a bovinelor (VD-MD = virotic diarrhea – mucosal disease) Virusul are caracteristicele generale ale flavivirusurilor. Virionul are o formă sferică cu diametrul de 45-65 nm, cu un sâmbure central (inima virusului) de 24-30 nm. Studii electronooptice mai recente au permis evidențierea a trei tipuri de particule virale distincte din punct de vedere al dimensiunilor: particule mari, de 80-100 nm, polimorfe, corespunzând virusului matur; mijlocii, de 30-50 nm și mici de 15-20 nm, considerate ca particule precursoare și fiind formate probabil din ribozomi. Se presupune că posibilitatea existenței sub forma unor fragmente cu potențial infecțios, diferite ca dimensiuni, ar fi o însușire generală a nonarboflavivirusurilor. Virusul este sensibil la eter, cloroform, la pH 3 și la încălzire la 560C. Prin liofilizare și la –700C poate fi conservat mai mulți ani. Virusul este cultivabil în culturi celulare renale embrionare bovine, unde produce efect citopatic. Pe embrioni de găină, virusul se adaptează mai greu, producând uneori leziuni pe membrana corioalantoidiană. Virusul este neuniform antigenic; au fost identificate 7 serotipuri, între care există însă și diferite grade de înrudiri antigenice. Pe baza reacțiilor de seroneutralizare și imunoflorescență s-a demonstrat că tulpinile cu un grad mai redus de patogenitate sunt mai apropiate între ele din punct de vedere antigenic. Virusul VD-MD este înrudit antigenic cu virusul pestei porcine, în sensul că porcii imunizați cu virusul VD-MD devin rezistenți față de virusul pestei porcine. Bovinele inoculate cu virusul pestei porcine nu se imunizează însă față de virusulVD-MD. Infecția naturală se caracterizează printr-un accentuat polimorfism anatomo-clinic, fapt care a determinat inițial pe
Virusologie generală
215
infecționiști să considere fiecare formă clinică o boală virotică distinctă. Ulterior, s-a demonstrat că nu este vorba de boli diferite ci de o afecțiune complexă din punct de vedere morfopatologic și clinic, produsă de un agent etiologic unic. Principalele localizări și manifestări ale bolii sunt însă din partea aparatului digestiv.Animalul de laborator cel mai sensibil este iepurele, dar inocularea virusului trebuie precedată de o prealabilă injectare de cortizon. În diagnosticul etiologic al bolii se pot utiliza metode serologice ca: imunodifuzie, imunoflorescență și mai ales seroneutralizarea virusului cu seruri de la animale trecute prin boală. În scopuri imunoprofilactice se pot folosi vaccinuri preparate cu virus VD-MD sau vaccinuri polivalente în care virusul VD-MD se poate asocia cu virusul parainfluenței III și virusul rinotraheitei. Uneori vaccinarea antivirotică cu acest complex antigenic se poate asocia cu vaccinarea antipasteurelică. Pe baza acelorași principii se preconizează astăzi prepararea serului antiviral (VD-MD, parainfluență III, rinotraheită) care poate fi administrat singur sau împreună cu serul antipasteurelic. Virusul pestei porcine Istoric. Inițial s-a crezut că pesta porcină este o bacterioză în urma izolării în 1885-1886 de către Salmon și Smith a unei bacterii pe care autorii au numit-o B. suipestifer. Mai târziu s-a dovedit că bacteria este un agent de infecție secundar, ea fiind omologată în genul Salmonella (după Salmon). În 1903, Schweinitz și Dorset demonstrează etiologia virotică a bolii pe baza transmiterii ei în serie prin inocularea de filtrate. Structura virionului. Particula virală are o formă sferică și un diametru de 40 nm, cu un sâmbure (inimă) de 20-30 nm. Pericapsida are o grosime de 6 nm. Restul caracterelor sunt comune cu ale celorlalte nonarbo-flavivirusuri. Proprietăți fizico-chimice. Virusul este etr și cloroform sensibil și moderat sensibil la trispsină; pH 4,8-5,5 are asupra virusului un efect conservant superior celui neutru; are un
Virusologie generală
216
important grad de termostabilitate fiind inactivat în 30 de minute la 690C și în 60 minute la 660C. Cultivabilitate. Timp de mulți ani virusul pestei porcine a putut fi întreținut numai pe specia natural receptivă prin inoculări la purcei. În 1939, Alexandru Vechiu adaptează virusul pestei porcine pe iepure, obținând primul virus lapinizat. Mai târziu virusurile lapinizate și-au găsit o largă utilizare în prepararea vaccinurilor antipestoase. Din 1959 s-a reușit adaptarea virusului în culturi celulare, rezultatele cele mai bune obținându-se pe țesuturi de porc bogate în celule ale sistemului reticulo-histiocitar – măduvă osoasă, splină, leucocite, țesut hepatic. Virusul a mai putut fi cultivat și pe celule testiculare de iepure tânăr. Multiplicarea este abundentă în culturi celulare, dar efectul citopatic este slab sau absent. Cultivat împreună cu virusul de Newcastle, se constată o potențare a efectului citopatic. Unele tulpini au putut fi adaptate pe embrioni de rață și de găină.
Proprietăți antigenice. Virusul este înrudit antigenic cu virusul VD-MD. Variante antigenice au fost semnalate fără a se ajunge la crearea unor tipuri imunologic distincte. Rezistența față de factorii ecologici. Virusul are un însemnat grad de rezistență față de factorii ecologici, care este în general mai mare când virusul este înglobat în materialul organic. La procesul de putrefacție rezistă 3-4 zile. În măduva osoasă își păstrează infecțiozitatea timp de 15 zile. Frigul are un efect conservant, virusul putând supraviețui în carnea congelată până la 4 ani. Comparativ cu alte virusuri, ceilalți factori fizici –uscăciunea, lumina solară etc.- sunt și ei mai puțin activi față de virusul pestei porcine. Sensibilitatea față de factorii chimici este de aproximativ 2-6 ori mai redusă față de alte virusuri. Infecția naturală. Virusul este monopatogen pentru specia porcină. Pesta porcină este o infecție gravă, caracterizată prin leziuni hemoragice, inflamatorii și în final necrotice la nivelul intestinului și pulmonului, în procesele de necroză intervenind ca agenți secundari Pasteurella multocida și Salmonella cholerae suis. Boala este contagioasă, cu capacitate de difuziune epizootică și un procent ridicat de morbiditate și mortalitate. Trecerea prin boală poate crea purtători.
Virusologie generală
217
Infecția experimentală. Se practică pe purcei din rase ameliorate. Bioproba se aplică de obicei ca ultimă probă în cazul când celelalte metode de evidențiere a virusului n-au fost suficient de concludente. Tehnici de diagnostic etiologic. În cazurile atipice, când examenul clinic și mai ales cel morfopatologic nu sunt suficiente pentru stabilirea diagnosticului, se impune aplicarea diferitelor metode de evidențiere directă sau indirectă a virusului.printre care cele mai importante sunt:
seroprecipitarea în gel de agar, după tehnica Ouchterlony, care are un înalt grad de specificitate, dar nu este suficient, fiind pozitivă în aproximativ 50% din cazuri;
imunoelectroprecipitarea cantitativă prin care se evidențiază cantitatea de globulină alfa2 care crește aproape întotdeauna la porcii bolnavi (Popa M. și col., 1973);
medulograma este o metodă foarte sensibilă preconizată de Manolescu și col. (1975), care constă în evidențierea metaplaziei paralimfoblastice la nivelul măduvei hematopoetice a porcilor bolnavi;
imunoflorescența este o tehnică sensibilă, permițând evidențierea prezenței virusului în țesuturi, chiar în fazele incipiente ale infecției; cele mai bune rezultate se obțin prin metoda directă aplicată pe medulogramă sau concentrat leucocitar (Popa M. și col. 1979).
Alte teste de laborator experimentate –cu rezultate variabile- sunt: seroneutralizarea, RFC, hemaglutinarea pasivă, conglutinarea, potențarea efectului citopatic a virusului de Newcastle (Kumagai, 1958) sau a virusului bolii de Teschen (Bool și Ressang, 1966), interferența cu virusul encefalitei equine (Shimizu și col., 1965), testul Taylor, bazat pe capacitatea virusului pestos de a inhiba amilaza pancreatică.
Bioproba pe purcei își menține valabilitatea de test de certă valoare diagnostică.
Imunizarea antipestoasă. Este realizabilă atât activ cât și pasiv.
Virusologie generală
218
Pentru imunizarea activă poate fi folosită o gamă largă de vaccinuri, unele vii și atenuate preparate fie cu virusuri lapinizate, fie cu tulpini adaptate pe culturi celulare, altele inactivate. a) Vaccinuri preparate cu tulpini lapinizate:
- vaccinul “C”, importat din China care poate fi administrat printr-o singură inoculare, datorită valorii sale imunogene ridicate și nu necesită asocierea cu serul antipestos tulpina vaccinală fiind total atenuată;
- vaccinurile Hudson și Koprowsky păstrează un grad de virulență; administrarea lor necestiă asocierea cu ser antipestos; operația se numește serovirulizare sau serolapinizare și se practică în plin focar în scopul opririi energice a extinderii epizootice a bolii; cele două tulpini sunt foarte asemănătoare din punct de vedere al gradului de virulență și al valorii imunogene; în prezent la noi în țară se folosește tulpina Hudson.
b) Vaccinuri preparate din culturi celulare; Unele tulpini au fost adaptate direct în diferite sisteme
celulare, altele abia după o prealabilă adaptare pe iepure. În cazul ambelor conduite tulpinile s-au atenuat parțial sau total.
- vaccinul “Celvivac”, obținut dintr-o tulpină atenuată și adaptată pe culturi celulare, a început să fie preparat și aplicat la noi în țară paralel cu vaccinul “C”.
c) Vaccinurile inactivate Preparate din sânge și triturate de organe, la care se adaugă
o substanță inactivantă și una adjuvantă; din această categorie s-au utilizat la noi în țară de mai mulți ani două vaccinuri.
- vaccinul formolat 0,1% și adsorbit pe hidroxid de aluminiu, după o rețetă preconizată de Wynohradnyk (1947);
- vaccinul cu cristal violet 2,5% cu adaus de glicerină și fenol.
Pentru imunizarea pasivă se poate utiliza serul antipestos omolog. În practică, serul nu se utilizează însă singur, ci numai asociat cu un virus lapinizat de tipul Hudson sau Koprowsky.
Virusologie generală
219
Alte flavivirusuri descrise în literatură sunt: Virusul bolii de graniță (Border disease) a mieilor
este de dimensiuni mici, în jur de 27 nm, este cultivabil în celule de origine ovină și produce, în Australia și Noua Zeelandă, o boală congenitală la miei, caracterizată printr-o supraproducție capilară în momentul fătării, subdezvoltare și semne nervoase care dispar treptat la numărul redus de animale care nu mor înainte de înțărcare.
Virusul bolii de Wesselsbron. Particula virală are
diametrul în jurul a 30 nm; cultivarea este posibilă în ouă embrionate, fără a omorâ însă cu regularitate embrionii și în culturi celulare de rinichi de miel, în care determină formarea de incluzii intracitoplasmatice. Gazdele cel mai frecvent afectate sunt oile într-un stadiu avansat de gestație, mieii și rareori taurinele. La cabaline și suine infecția este inaparentă. Lucrătorii din laboratoarele în care se lucrează cu acest virus fac uneori o infecție asemănătoare clinic cu influența. Artropodele care îndeplinesc rolul de vectori sunt țânțarii din genul Aëdes.
Virusul dehidrogenazei lactice (LDH-V, virusul
Riley) a fost izolat din salivă, fecale urină de la șoareci fără semne aparente de boală. Numeroasele studii executate pe acest virus se datoresc interesului pe care-l prezintă din punct de vedere biologic general. El constituie exepmlul calsic al unui agent persistent și tolerat și un caz singular în care prezența unui virus determină intensificarea unor activități enzimatice în organismul infectat.
Familia RETROVIRIDAE Familia cuprinde virusurile tumorale cu ARN. Prefixul “retro” în limba latină “invers, înapoi” se referă la proprietatea acestor virusuri de a transcrie invers informația
Virusologie generală
220
genetică. Alte denumiri în circulație pentru desemnarea lor sunt:
- Leucovirusuri = majoritatea speciilor produc leucoze,
- Oncornavirusuri = virusuri oncogene al căror genom este ARN. Prin simetrie cu prefixul oncorna se utilizează și cel de Oncodna pentru virusurile cu ADN capabile să producă efectul transformant.
În categoria Oncornavirusurilor se încadrează familiile Adeno, Herpet, Papova și Polyomaviridae descrise anterior.
Virionii retroviridelor sunt constituiți dintr-o nucleocapsidă helicală constituind inima sau sâmburele virusului, învelită de un peplos lipoproteic. Diametrul particulei virale este în medie de aproximativ 100 nm, cu posibilități de variație între 70-110 nm, ajungând în rare cazuri la 200 nm.
Genomul este format dintr-o singură moleculă de ARN monocatenar cu masa moleculară de 7-10 x 106, ușor disociabilă în 2-3 fragmente.
În celula gazdă informația genetică este transcrisă de pe ARN viral într-o dublă catenă de ADN previral de neoformație printr-un fenomen de transcriere inversă cu ajutorul unei invers transcriptaze, care este o ADN polimerază ARN dependentă (antigenică la virusurile leucozelor aviare). Transcrierea inversă este sensibilă la factorii inhibitori ai sintezei ADN în primele 6 ore de la infecție și permanent față de actinomicina D. ADN previral integrat în genomul celulei gazdă poartă responsabilitatea efectului oncogen. Extras din celula gazdă, este lipsit de infecțiozitate.
Maturarea și eliberarea virionilor din celula gazdă are loc prin înmugurire.
Retroviridele au o capacitate antigenică și imunogenă relativ redusă, dar în serurile animalelor bolnave pot fi decelați anticorpi fixatori de complement, neutralizanți și precipitanți. Principalii determinanți antigenici sunt trei polipeptide, din care două sunt glicopeptide componente ale pericapsidei.
În cadrul familiei Retroviridae au fost încadrate următoarele genuri: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gamaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Soumavirus și Lentivirus. Încadrarea ulterioară a retroviridelor se oprea la
Virusologie generală
221
trei subfamilii: Oncovirinae, Spumavirinae și Lentivirinae. În continuare, pentru a fi mai pragmatici, vom folosi ambele încadrări taxonomice.
Subfamilia ONCOVIRINAE Prefixul derivă de la cuvântul grecesc “onkos” = tumoră. Particula virală este constituită dintr-un peplos, un
sâmbure sau o inimă delimitată de un înveliș propriu și din nucleocapsida propriu-zisă dispuse concentric.
Electronooptic pot fi deosebite trei tipuri morfologice: tipul A, cel mai mic, de aproximativ 75 nm, cu aspect
de gogoașă; intracelular este localizat cel mai frecvent în vecinătatea aparatului Golgi;
tipul B, cel mai mare, formele mature extracelulare ajungând la 200 nm și învelișul constituit din două straturi;
tipul C, mijlociu, de 85-110 nm, având centrul cu un grad de electronoopacitate mai mare comparativ cu tipul B și învelișul format dintr-un singur strat.
Agenții etiologici ai bolilor leucozice la animale aparțin tipurilor B și C; infecțiozitatea particulelor este incertă.
Virionul conține șase tipuri de proteine , inclusiv glicoproteinele antigenice de origine pericapsidală.
Genomul viral este ARN cu masa moleculară de 7 x 106, ușor disocialbilă în două segmente cu însușirile a două genomuri complete, identice. ARN-ul oncovirusurilor prezintă similitudini de structură cu ADN-ul celulelor gazdă.
Din subfamilia Oncovirinae fac parte numeroase genuri caracterizate printr-o mare complexitate și diversitate. Majoritatea acestora produc boli cu caracter neoplazic, mai ales leucemii sau sarcoame la numeroase specii de mamifere și păsări. Multe celule normale, la diverse specii animale, conțin integrate în genomul lor, sub formă de provirus, copii ale genomurilor diferitelor oncovirusuri. Acestea nu-și exprimă totdeauna fenotipic mesajul oncogenetic, rămânerea lor în celula gazdă fiind posibilă, sub această formă, un timp nedefinit.
Virusologie generală
222
Genomurile previrale pot fi însă reactivate prin agenți fizici și chimici sau prin suprainfecții cu alte oncovirusuri, consecutiv activării, exprimându-se fenotipic efectul lor transformant. La oncovirusuri se întâlnește relativ frecvent fenomenul de defectivitate virală suplinit prin intervenția complementară a diferitelor virusuri helper.
GRUPA ONCOVIRUS TIP C
Oncovirusurile de tip C se caracterizează prin prezența
unui înveliș unistratificat al inimii virusului. Compoziția proteinelor acestui înveliș a determinat împărțirea oncovirusurilor C în două subgenuri: primul cuprinzând oncovirusurile patogene pentru mamifere, caracterizate prin prezența proteinei p 30 și la doilea,din care fac parte oncovirusurile aviare, caracterizate prin prezența proteinei p 27.
Toate oncovirusurile de tip C, indiferent de originea lor, mamiferă sau aviară, conțin trei polipeptide structurale majore și două glicopeptide derivate din peplos. Ele implică trei categorii de antigene specifice:”gs-a”caracteristic oncovirusurilor aviare, “gs-1” marker antigenic al speciei gazdă (pasăre, șoarece etc.) și “gs-3” prezent la toate virusurile mamifere.
Oncovirusurile de tip C patogene pentru mamifere. În cadrul acestei grupe au fost descrise numeroase
genurii care produc boli tumorale la bovine, suine, feline, murine etc. Criteriul de bază al grupării acestor virusuri în același taxon este prezența proteinei p 30 cu proprietăți antigenice specifice. Specia cea mai importantă în momentul de față, pentru medicina veterinară, este virusul leucozei enzootice a bovinelor.
Virusologie generală
223
Genul DELTARETROVIRUS Virusul leucozei bovine Istoric. Boala produsă de acest virus a fost
diagnosticată și descrisă de către Leisering (1858). Etiologia ei a fost lămurită mult mai târziu, transmiterea experimentală fiind realizată abia în 1960 de către Vasiliev. Primele încercări de izolare a virusului au fost făcute de Montemagno Papparella și Catallani (1957) pe embrioni de găină. Miller (1969) cultivă primul virusul în limfocite recoltate de la taurine bolnave.
Structura virionului. La examenul electronooptic virionii au aspectul unor corpusculi sferici cu diametrul de 130 nm și cu tendința de grupare în rozete.
Cultivabilitate. Virusul poate fi cultivat în culturi celulare renale de vițel, în culturi de leucocite, producând efect citopatic la aproximativ 4 zile după inoculare. Cu lichidul de cultură pot fi apoi infectați embrioni de găină.
Sensibilitatea față de factorii de mediu. Virusul este sensibil la eter și cloroform și are un grad relativ ridicat de rezistență la temperatură; rezistă la 560C, fiind inactivat abia la 600C prin încălzire timp de 30 minute. Temperaturile scăzute, până la –370C, au un efect conservant asupra virusului.
Patogenitate. Infecția naturală întâlnită la bovine se caracterizează prin procese neoplazice în organele hematopoetice, modificări numerice și morfologice ale unor celule din seria albă, urmate deseori de procese metaplazice în organele parenchimatoase. Infecția are o evoluție cronică și capacitate de difuziune enzootică. Transmiterea bolii la alte specii, în condiții naturale, n-a fost semnalată până în prezent. Böhrer (1972) a reușit transmiterea experimentală a leucozei bovine la oi.
Diagnosticul infecției. S-a bazat mulți ani și se practică și în prezent, în majoritatea laboratoarelor, pe numărarea leucocitelor și limfocitelor, interpretată după diferite chei leucozice, a lui Goetze, Bendixen etc. În ultimii ani a apărut tendința, pe plan mondial și în țara noastră, de înlocuire a examenului hematologic cu reacții serologice cu un grad mult mai ridicat de specificitate. Imunoflorescența a fost experimentată cu rezultate promițătoare, dar mai de perspectivă pare a fi imunodifuzia. În prezent,în laboratoarele
Virusologie generală
224
veterinare centrale și județene, se utilizează pentru diagnosticul serologic al L.E.B., imunodifuzia orizontală dublă (Ouchterlany) și reacția imunoenzimatică E.L.I.S.A., ultima având un grad ridicat de sensibilitate și specificitate.
Alte virusuri leucozice la mamifere sunt: Virusul leucozei porcine este mai puțin cunoscut iar
incidența bolii este redusă. Diagnosticul se stabilește cu precădere pe baza examenului morfopatologic macro și microscopic și hematologic. Boala a fost semanalată la noi în țară de Sîrbu și col. (1963), Adameșteanu I. și Adameșteanu Constanța (1966).
Virusul leucozei feline produce, de obicei, forme cu
caracter de limfosarcoame localizate în timus sau în limfonozii mezenterici. Imaginile electronomicroscopice ale celulelor canceroase relevă prezența virionilor de formă rotundă sau ovală cu diametrul de 100-110 nm. Sâmburele central de 50-65 nm. “In vitro” izolarea este posibilă pe diferite sisteme celulare de origine felină, canină, porcină și umană.
Sarcomul venerian al câinelui cunoscut și sub
denumirea de sarcomul lui Sticker, este o tumoră care evoluează de cele mai multe ori benign și se transmite prin contact sexual.Electronooptic s-au evidențiat în celulele tumorale particule virale de tip C. Vlăduțiu și col. (1960, 1969, 1970), Vlăduțiu și Ciurea (1961), au realizat un studiu complex al acestei tumori, dezvoltat de Pașca Doina (1971) care experimentează cu bune rezultate o metodă de imunoterapie activă prin transplante de tumoră iradiată cu 800 R.
Alte infecții cu caracter leucemic produse de
oncovirusuri de tip C se întâlnesc la om, șoarece (mai multe virusuri) cobai, maimuță etc.
Virusologie generală
225
Genul ALPHARETROVIRUS Virusurile leucozelor aviare Istoric. Boala a fost semnalată prima oară de Roloff
(1869) și transmisă experimental cu filtrate din materialul infecțios de Ellermann și Bang (1908). Izolarea virusurilor s-a realizat de Beard (1956) din leucoza mieloidă și Burmester și col. (1954-1957) din leucoza limfoidă.
Proprietățile virionilor. Aspectul electronooptic al particulelor virale este asemănător cu al myxovirusurilor, argument care a determinat mentinerea lor timp de mulți ani clasificate în acest grup. Diametrul virionilor este de 80-110 nm cu sâmbure central de 45 nm.
Genomul, reprezentat de ARN monocatenar, are masa moleculară neobișnuit de mare, de 1,3 x 107 daltoni.
Virusurile sunt sensibile; la 560C sunt inactivate în 30 de minute; comparativ cu alte virusuri oncogene aviare, sunt mai rezistente la ultraviolete.
Cultivabilitate. Virusurile pot fi cultivate atât pe embrioni de găină cât și în culturi celulare. Embrionii inoculați nu mor decât în proporții foarte reduse. Puii eclozionați din ouăle inoculate se îmbolnăvesc aproape cu regularitate în timpul vieții. Celulele cele mai adecvate pentru multiplicarea virusului sunt cele hepatice, în care virusurile sunt sintetizate fără să producă efect citopatic. Rezultate la fel de bune se obțin și pe fibroblaste embrionare de găină. Cu toate că nu produc efect citopatic virusurile leucozelor aviare pot fi puse în evidență și identificate în culturi de fibroblaste pe baza capacității lor de a interfera cu alte virusuri sau serologic.
Interferența. cu virusul sarcomului lui Rous descoperită de Rubin (1960) a dus la imaginarea testului RIF care a intrat în practica diagnosticului de laborator al leucozelor aviare.
Testul RIF (resistance inducing factor) constă în suprainfectarea culturilor de fibroblaste embrionare de găină, infectate inițial cu un virus leucozic, cu virusul sarcomului Rous. Acest virus produce cu regularitate efect citopatic în culturi de fibroblaste. Celulele care conțin însă virusul leucozic nu mai sunt receptive și nu se mai modifică sub acțiunea virusului Rous. Absența efectului citopatic constituie prin
Virusologie generală
226
urmare, în cazul testului RIF, o dovadă indirectă a prezenței în celulă a unui virus leucozic aviar.
Proprietăți antigenice. Virusurile leucozice sunt înrudite antigenic între ele după cum și cu virusul sarcomului lui Rous, care face parte din același gen. Prin reacții încrucișate de seroneutralizare și imunoflorescență au fost identificate două grupe serologice notate cu A și B; se preconizează, în timpul din urmă și admiterea unui al treilea grup. Înrudirea antigenică între virusurile leucozelor aviare cu virusul sarcomului lui Rous a dus la punerea la punct a unui test serologic foarte sensibil pentru identificarea virusurilor leucozice, cunoscut sub denumirea de testul COFAL, bazat pe observațiile lui Sarma, Turner și Huebner (1964).
Testul COFAL (complement fixation avian leucosis) constă în utilizarea de seruri recoltate de la mamifere (hamster, cobai) infectate experimental cu virusul Rous (tulpina Schmidt-Ruppin). Anticorpii din serurile respective fixează însă complementul nu numai cu antigenul Rous, dar și cu unele virusuri leucozice aviare, mai ales cele ale leucozei mieloide și eritroide.
Rezistența față de factorii de mediu. Virusurile leucozelor aviare au un grad mai mare de rezistență față de factorii naturali de mediu, comparativ cu alte virusuri. Sub formă uscată rezistă uneori chiar până la un an. Temperaturile scăzute au un efect conservant.
Patogenitate. Bolile produse de aceste virusuri afectează mai ales galinaceele și se caracterizează fie prin modificări numerice și calitative ale elementelor figurate ale sângelui (forme leucemice), fie prin apariția de tumori în diferite țesuturi și organe (forme aleucemice). În funcție de categoria elementelor albe afectate, leucozele pot fi: eritroidă, mieloidă sau limfoidă. Boala lui Marek și agentul ei etiologic, situată multă vreme alături de leucoze, este considerată astăzi ca entitate etipatogenetică total distinctă de ele.
După Părtașcu (1979), testele COFAL, RFC, imunodifuzie, imunoflorescență și seroneutralizare pot fi utilizate cu bune rezultate pentru identificarea și studiul virusurilor tumorale aviare.
Virusurile leucozelor fiind slab imunogene, nu se pretează pentru prepararea de vaccinuri.
Virusologie generală
227
Pentru profilaxia leucozelor aviare se merge pe metoda selecției de linii genetic nereceptive, față de aceste virusuri.
Virusul sarcomului lui Rous Tumora numită astăzi sarcomul lui Rous este primul
proces neoplazic căruia i s-a demonstrat, de către Peyton Rous, în 1910, etiologia virotică.
Morfologic este identic cu virusurile leucozelor aviare; masa moleculară a genomului este de 9,6 x 106. În structura virionului a fost identificată revers-transcriptaza ca proteină virus specifică componentă structurală a nucleocapsidei.
Foarte sensibil la temperatură, virusul este inactivat în 15 minute la 550C, prezintă în schimb un remarcabil grad de rezistență față de razele X și ultraviolete. Antigenic se constată o pluralitate, trei dintre serotipuri fiind considerate clasice; ele sunt reprezentate de tulpinile Schmidt-Ruppin, Praga și Carr-Zibler. Tulpina Schmidt-Ruppin este înrudită antigenic cu virusurile leucozelor aviare.
Cultivarea se realizează ușor pe membrana corioalantoidiană a embrionului de găină, în grosimea căruia se formează focare proliferative și în culturi de fibroblaste de pasăre.
Infecția naturală se întâlnește numai la păsări și are un caracter sporadic. Tumorile pot avea diferite localizări, iar caracterul lor este malign. În condiții experimentale, transmiterea bolii este posibilă și la mamifere.
GRUPA ONCOVIRUSURILOR TIP B Grupa B cuprinde un număr restrâns de virusuri, de mai
mică importanță pentru practica veterinară, care produc tumori mamare la șoarece, cobai și posibil și la alte specii.
Genul BETARETROVIRUS Virusul tumorii mamare a șoarecelui (Bittner) Este cel mai bine studiat; în imaginile electronooptice
ale celulelor infectate se găsesc atât particule A de 70 nm
Virusologie generală
228
situate exclusiv intracelular, cât și forme B mature de 100-110 nm cu dublu înveliș, prezente și extracelular.Efectul cancerigen al virusului transmisibil prin lapte se dezvoltă și se exercită exclusiv la nivelul țesutului mamar.
SUBFAMILIA SPUMAVIRINAE Genul SPUMAVIRUS Virusurile din acest gen nu se deosebesc morfochimic de
celelalte retroviride, dar sunt lipsite de efect transformant tumoral. Ele produc la diferite specii –om, maimuță, bou, pisică, hamster etc,- infecții persistente asimptomatice, fără importanță deosebită pentru patologie. În culturi celulare determină aproape constant formarea de sinciții. Unele specii sunt cunoscute și sub numele de virusuri spumoase, de unde a derivat numele taxonului.
SUBFAMILIA LENTIVIRINAE
Genul LENTIVIRUS Lentivirinele au caracterele generale morfologice și
chimice ale familiei Retroviridae, dar la fel ca spumavirinele, nu au efect oncogen. Virionii sunt lipsiți de a doua membrană internă a sâmburelui viral. Infecțiile pe care le produc au un caracter lent sau cronic, însușire după care lentivirinele și-au primit numele.
Virusul Visna Maedi este agentul a două boli specifice
ovinelor, diferite sub aspectul lor anatomo-clinic, descrise în 1930 în Islanda sub denumirile de Visna și Maedi, produse însă de același factor etiologic. Mai târziu au fost omologate în cadrul aceleași entități etiologice și alte boli, descrise în diverse țări sub diferite denumiri (Zwoegerziekte în Olanda, la Bonhite în Franța, boala pulmonară de Lekipia în Kenya etc.).
Virusologie generală
229
Virionii au formă aproximativ sferică, cu diametrul de 80-120 nm. Pe suprafața particulei virale se găsesc expansiuni lungi de 8-10 nm. Nucleocapsida helicoidală are diametrul de 7-8 nm.
Virusul este sensibil la eter, cloroform, pH 4,2; la 500 C este inactivat în 30 minute; este lipsit de proprietăți hemaglutinante și hemadsorbante.
Cultivat în celulele renale, de plex coroidian și glande salivare de oaie, produce constant efect citopatic, cu formare de sinciții. Poate fi multiplicat și în celule de cerebel de șoarece, celule traheale de embrion de vacă și celule renale embrionare de porc. Tulpinile Visna se multiplică mai lent decât Maedi.
Infecțiile naturale au următoarele trăsături caracteristice:
visna este o encefalomielită demielinizantă afebrilă, cu simptome nervoase care ajung progresiv la paraplegii, paralizii și moartea animalului, iar
maedi este o pneumonie progresivă, simptomul predominant fiind dispneea (maedi), urmată de debilitare treptată și același sfârșit fatal.
Seroneutralizarea și RFC sunt reacții cu un înalt grad de specificitate, care permit identificarea virusului și diagnosticul etiologic al infecțiilor.
Virusul anemieie infecțioase a calului Structura virionului nu diferă de alte lentivirine, forma
este sferică, iar dimensiunile aproximative de 90-140 nm. Sâmburele are diametrul de 40-63 nm. Exterior se găsește un înveliș pericapsidal de 9 nm grosime.
Natura genomului a fost stabilită pe baza absenței efectului inhibant al IUDR (5-iodo-2-deoxiuridinei) și acesta este reprezentat de ARN. Totodată, ținând seama de sinteza de ADN care are loc în celulele infectate în scurt timp de la infecție s-a admis acțiunea invers transcriptazei.
Cultivarea se realizează relativ greu și numai în cazul unor tulpini, în culturi celulare de cal. Începând din 1960-1961 s-au obținut rezultate mai bune pe monostraturi de celule de măduvă osoasă și pe limfocite de cal. În ambele sisteme celulare virusul a produs efect citopatic. Fotografiile electronooptice au relevat prezența virusurilor în curs de
Virusologie generală
230
eliberare din celule sub forma unor muguri de 90-150 nm pe suprafața limfocitelor.
Virusul se caracterizează printr-o deosebită rezistență față de factorii fizici și chimici. Temperatura de 57-600C îl distruge abia într-o oră. La lumina solară directă rezistă până la 2 ore, în gunoiul de grajd timp de 2-3 luni, iar în stare uscată, inclusiv în ser sau alt material organic, până la 7 luni. Eterul, cloroformul și glicerina sunt inactive față de virusul anemiei infecțioase. Comparativ cu alte virusuri, dezinfectantele uzuale îl distrug în concentrații mai ridicate sau într-un timp mai îndelungat. Virusul anemiei infecțioase ecvine are 6 structuri antigenice, din care 4 sunt de natură polipeptidică, incluzând și revers transcriptaza (p9, p11, p.15, p26), iar altele două de natură glicoproteică (gp45, gp90), (Karek, 1990). Antigenul G, descris anterior, corespunde proteiunei p26. Fiind descris la toate tulpinile virale mai este denumit și antigen “comun”, având drept caracteristică rezistența la eter (Coggins și colab., 1971)
Virusul este patogen pentru cabaline, la care produce o boală cronică contagioasă caracterizată rpin modificări hematologice, mai ales prin distrugerea masivă a hematiilor. Patogenitatea pentru alte specii este discutabilă. Porcul, chiar dacă nu face forme anatomo-clinice evidente, poate fi purtător și diseminator al virusului.
Infecția experimentală se face pe mânji sub vârsta de 6 luni și constituie o probă de diagnostic concludentă.
Alte teste de diagnostic etiologic în anemia infecțioasă sunt:
imunodifuzia în gel de agar, prin care pot fi detectați anticorpii specifici din ser, folosind ca antigen un extract preparat după tehnica preconizată de Coggins, a cărui preparare a fost inițiată recent și la noi în țară în cadrul INMV Pasteur; imunodifuzia are un înalt grad de specificitate și sub aspect economic este avantajoasă față de bioprobă; anticorpii fixatori de complement apar în ser la 2-4 săptămâni de la infecție, dar titrul lor este prea redus pentru a putea utiliza RFC în scop de diagnostic.
Virusologie generală
231
reacția imunoenzimatică E.L.I.S.A. și imunofluorescența;
examenul leucoconcetratului, preconizat de Manolescu N. (1976), care se bazează pe modificările din formula leucocitară, foarte caracteristice, fără a fi însă strict specifice pentru acest virus. Acest test are în schimb avantajul de a fi cel mai simplu, mai rapid și mai ușor de executat.
Virusul este lipsit de proprietăți imunogene, din care cazuă nu se pretează pentru prepararea de seruri și vaccinuri.
În familia Retroviridae, genul Lentivirus mai sunt încadrate și alte virusuri cum ar fi: virusul CAEC ( complexul arterită- encefalită caprină), virusul imunodeficienței bovine (BIV); virusul imunodeficienței feline (FIV); virusul imunodeficienței umane (HIV) și virusurile imunodeficienței canine și păsărilor.
FAMILIA REOVIRIDAE
Reovirusurile sau diplornavirusurile au o capsidă icozaedrală cu diametrul de 60-80 nm, sunt lipsite de obicei de înveliș pericapsidal, dar în jurul virionilor se observă uneori pseudomembrane, probabil dependente de celula gazdă. Genomul viral este constituit din ARN dublu catenar format din 10-12 fragmente; greutatea moleculară totală este de10-16 x 106, iar proporția de G + C este de 42-44%. Virionii conțin o ARN polimerază ARN dependentă. Numele de retrovirusuri rezultă din asamblarea a trei inițiale REO (r = respirator; e = enteric; o = orfan), adică virusuri respiratorii enterice orfane, iar cel de diplornavirusuri derivă din structura dublu catenară a ARN constituient al genomului (diplo = dublu; rna = ARN). Comparativ cu virusurile enterocitopatogene orfane (ECHO), reovirusurile sunt mai mari, au altă structură a genomului, produc alt tip de efect citopatic și au un antigen fixator de complement diferit. Reovirusurile se împart în patru genuri:
Genul Reovirus se diferențiază de Orbivirus prin prezența unei capside duble și prin categorii de gazde pe care le parazitează. Capsida are 92 de capsomere așeazate în dublu strat. Reovirusurile își au sediul în organismul a numeroase specii de mamifere și păsări, în organismul cărora duc o existență endosimbiotică, iar incosntant, condiționat de anumiți factori de mediu, provoacă și infecții clinice. Între reovirusurile diferitelor specii nu există diferențe morfologice. Majoritatea reovirusurilor se dezvoltă bine în ouă embrionate, celule HeLa și alte linii celulare. Efectul citopatic apare la 7-14 zile de la însămânțare.
Antigenic se constată o pluralitate corelată cu specificitatea de gazdă. Astfel, reovirusurile mamiferelor se împart în trei tipuri serologice (1, 2 și 3), evidențiabile prin reacțiile de seroneutralizare și inhibare a hemaglutinării. Toate trei tipurile au fost izolate de la om și bovine. Unul sau altul din tipuri au fost izolate de la câine, pisică, porc, oaie și alte specii. La păsări au fost identificate 11 serotipuri.
Proprietățile hemaglutinante față de globulele roșii ale diferitelor specii animale sunt corelate cu serotipul.
Infecțiile naturale nu sunt entități etiologice precis definite. Reovirusurile se izolează din procese pneumonice, sindroame hepatice, gastroenterice și nervoase de la speciile amintite, dar mai frecvent de la taurine. Infecțiile cu reovirusuri la păsări sunt larg răspândite, ele fiind izolate din infecții respiratorii cronice (Petek, 1957), artrite și tenosinovite (Olson, 1957), enterite, pericardite, perihepatote, etc. Deși sunt foarte răspândite până în prezent la puii de găină a fost descrisă o singură entitate morbidă produsă de reovirusuri și anume artrita virală.
Virusologie generală
233
Genul ORBIVIRUS
Principala deosebire față de reovirusuri constă în structura capsidei, formată dintr-un singur strat de 32 capsomere. Speciile cele mai importante sunt virusul limbii albastre și al pestei ecvine.
Virusul limbii albastre (Blue-tongue) Este agentul unei infecții la oi, transmisibilă prin
artropode, caracterizată prin inflamația mucoasei bucale și gastrointestinale. Virionul are diametrul de 53-60 nm; este lipsit de proprietăți hemaglutinante și hemadsorbante. Cultivarea este posibilă pe ouă embrionate a căror moarte o produce în 4-8 zile cu leziuni hemoragice extinse. În culturi celulare se multiplică cel mai bine în monostraturi primare de celule renale de miel. Efectul citopatic apare în 24-72 ore. Experimental, virusul poate fi adaptat pe șoarece și hamster, pe cale intracerebrală.
Imunizarea activă a oilor se realizează prin vaccinuri preparate din virusuri vii și atenuate, prin pasaje pe oi sau prin avianizare.
Virusul pestei ecvine este asemănător cu cel al limbii albastre, are diametrul de 55 nm și prezintă la exterior un fel de pericapsidă, constituită din proteine specifice de gazdă. Prin RFC se evidențiază prezența unor antigeni comuni de grup, dar inhibarea hemaglutinării și seroneutralizarea sunt strict specifice; au fost identificate 9 serotipuri. Virusul se cultivă pe celule renale de pui de hamster și pe unele linii celulare. În condiții experimentale este patogen pentru șoarece , șobolan, cobai.
Infecția naturală, răspândită mai ales în Africa și în Asia de Sud, afectează cabalinele și se caracterizează prin febră, leziuni edematoase subcutanate și pulmonare, hemoragii în organele interne și acumulări de lichide seroase în cavități.
Virusologie generală
234
Încadrați provizoriu printre reovirusuri, sunt agenții care produc boala crestei albastre, bursita infecțioasă și pancreatita infecțioasă necrotică a păstrăvilor.
Virusul bolii crestei albastre (Blue comb)
Cu privire la etiologia acestei infecții, numită și monocitoza aviară, care afectează mai ales găinile și curcile în perioada începerii ouatului, planează încă unele incertitudini datorită faptului că alături de tulpini cu însușiri morfochimice caracteristice reovirusurilor, se izolează uneori de la păsările bolnave și alte virusuri.
Genul ROTAVIRUS
Virusul diareei neonatale a vițeilor, purceilor, mânjilor, iepurilor, câinilor, la diferite specii de păsări și la copii sunt implicate în apariția unor sindroame gastroenterice cu evoluție acută.
Prezintă unele diferențe în structura capsidei, comparativ cu genurile Reo și Orbivirus. Virionul, cu diametrul de 60-66 nm, are un sâmbure (genom) format din ARN dublu catenar, cu diametrul de 36-38 nm. Înconjurat de o membrană pe care sunt așezate radiar capsomerele de formă cilindrică în dublu strat. Asemănarea virionului cu o roată a inspirat numele genului. În fecalele copiilor nou-născuți au fost identificate rotavirusuri identice morfologic cu cele ale vițeilor. În prezent, pe baza anticorpilor neutralizanți ai glicoproteinelor capsidale (VP-6), rotavirusurile mamifere sunt împărțite în patru grupe (Bridger și col., 1982) notate cu literele mari ale alfabetului (A,B,C,D). În serogrupul A sunt încadrate rotavirusurile tipice deoarece posedă un antigen comun, care le deosebesc de rotavirusurile atipice. Rotavirusurile atipice au fost împărțite ulterior în 7 serotipuri antigenice distincte (Oedles și col., 1983)
Virusologie generală
235
Familia BIRNAVIRIDAE Familia Birnaviridae cuprinde două genuri: Avibirnavirus și Aquabirnavirus Genul AVIBIRNAVIRUS
Virusul bursitei infecțioase (Gumbaro) Afectează cu precădere tineretul aviar, producând
leziuni de tip limfoproliferativ edematos, hemoragic, necrotic. Organul cel mai afectat este bursa lui Fabricius; de aceea, pe parcursul bolii se instaleză o stare de imunosupresie. Factorul etiologic a cărui încadrare taxonomică este încă distrusă, are majoritatea caracterelor unui reovirus. În celulele infectate, unii autori au pus în evidență și particule mai mici, asemănătoare cu parvovirusurile defective adenoasociate, dat rolul etiologic al acestora pare a fi neînsemnat. Genul AQUABIRNAVIRUS
Virusul pancreatitei infecțioase necrotice a păstrăvilor
Afectează tineretul diferitelor specii de păstrăvi. Virionii sunt icozaedrali, au dimensiunile de 45-65 nm și capsida constituită din 92 capsomere. Familia PICORNAVIRIDAE Picornavirusurile sunt cele mai mici virusuri, cu diametrul de 20-30 nm. Capsida este icozaedrală și constituită din 60 capsomere, compuse din polipeptide diferite. Genomul este un singur lanț de ARN monocatenar cu greutatea moleculară de 2,5 x 106.
Multiplicarea lor are loc în citoplasmă.
Virusologie generală
236
Studiul genelor identificate în ARN viral a demonstrat că ele codifică biosinteza de proteine structurale și numai una sau două ARN replicaze.
Familia Picornaviridae are 6 genuri: - Enterovirus, - Cardiovirus, - Aphtovirus, - Rhinovirus - Hepatovirus; - Parechovirus;
Genul ENTEROVIRUS
Genul cuprinde numeroase specii patogene pentru
vertebrate, unele de importanță majoră pentru patologia umană și animală.
Enterovirusuri umane Virusul poliomielitei este patogen pentru om fiind
localizat la nivelul tubului digestiv. Majoritatea indivizilor se imunizează la o vârstă foarte fragedă, infecțiile clinice sub formă de paralizie infantilă producându-se la un număr foarte restrâns de gazde. În prezent se cunosc trei serotipuri, toate cultivabile în culturi celulare de om și alte primate, după cum și în diferite linii celulare. În monostraturi formează plaje. În serul bolnavilor sunt decelabili anticorpi fixatori de complement și neutralizanți. Vaccinarea cu virusuri atenuate, după metodele Salk și Sabin, conferă stări de imunitate solide, iar aplicarea lor organizată în ultimii ani a dus la restrângerea sensibilă a cazurilor de poliomielită.
Virusurile coxsackie sunt numite astfel după o
localitate din statul New York, sunt asemănătoare cu virusul poliomielitei și se izolează din tubul digestiv al copiilor, mai ales în perioada de vară și toamnă. Uneori produc forme clinice de boală, caracterizate prin simptome și leziuni variate ca: exantem al extremităților, leziuni vezicular-ulcerative la nivelul faringelui, tulburări respiratorii, miocardite, orhite etc.
Virusurile coxsackie se împart în două grupe: A și B, distincte prin tipul de celule pe care se cultivă, simptomele și
Virusologie generală
237
leziiunile produse la organismele infectate. Tipul A se multiplică în culturi celulare și un număr redus de tulpini sunt patogene pentru embrioni, în timp ce tipul B se dezvoltă bine în culturi celulare.
Fiecare grup conține mai multe serotipuri. Toate virusurile coxsackie sunt patogene experimental pentru șoarecele sugar, care poate fi utilizat în scopul izolării tulpinilor.
Enterovirusuri porcine Virusurile bolii de Teschen, particula virală are
dimensiuni de 30 nm. Capsida icozaedrală constituită din 32 capsomere; sunt
eter și coloroform rezistente și sensibile la congelare; pierzându-și patogenitatea; nu au proprietăți hemaglutinante.
În prezent se cunosc două tipuri de virus de Teschen: 1 și 2. Ambele se cultivă pe embrioni de găină și în culturi celulare renale de porc, producând efect citopatic.
În condiții experimentale sunt patogene numai pentru porc, iar în condiții naturale sunt patogene pentru suine și uneori la ovine.
Infecția naturală este cunoscută sub denumirile de encefalomielita infecțioasă a suinelor, boala de Teschen, după numele localității unde a fost diagnosticată prima oară, în Cehoslavacia, sau boala de Talfan, după cel al localității engleze unde a fost diagnosticată mai târziu; virusul de Talfan a fost considerat la început distinct de cel de Teschen, ca apoi să se constate identitatea celor două virusuri.
Pentru diagnosticul etiologic al bolii se impune izolarea virusului în culturi celulare renale de porc și identificarea lui prin seroneutralizare cu un ser cunoscut.
Imunizarea efectivelor în pericol de contaminare se face prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau inactivate.
Virusul bolii veziculoase a porcului Acest virus
produce o infecție epizootică la suine asemănătoare anatomoclinic cu febra aftoasă.
Virionul are o structură corpusculară și diametrul de 30-32 nm. Capsida, de simetrie icozaedrală, este constituită din capsomere cilindrice. Virusul este rezistent la pH 5 și la eter.
Virusologie generală
238
Antigenic omogen, el este total distinct de virusul febrei aftoase. Unele tulpini sunt hemaglutinante.
Cultivarea este posibilă pe celule renale primare și secundare de porc; produce efect citopatic și microplaje. Virusul este patogen pentru suine și în condiții naturale și experimentale; nu se pretează pentru prepararea de vaccinuri, fiind slab imunogen. În laboratoarele în care se lucrează în cantități masive cu acest virus s-au semnalat infecții la om, asemănătoare cu cele produse de unele virusuri coxsackie.
Enterovirusuri aviare Virusul encefalomielitei infecțioase a păsărilor
particula virală are 20-30 nm. Cultivarea virusului este posibilă pe embrion de găină și în culturi celulare. Infecția pe embrion reușește cel mai bine în cazul inoculării intracerebrale, intravenoase, intraviteline, intraamniotice sau intraalantoidiene. Embrionii mor într-un interval de 9-11 zile. Uneori, în cazul când embrionii supraviețuiesc, puii manifestă, după ecloziune, semnele bolii.
În culturi celulare (nevroglii, fibroblaste embrionare sau celule renale de pui) virusul se multiplică fără să producă efect citopatic evident; celulele tind spre forme sferice, iar citoplasma lor devine granulară. Prin treceri seriate, producția de virus devine din ce în ce mai intensă, dar este însoțită de atenuarea patogenității. Antigenic nu se constată diferențe între tulpini.
În condiții naturale virusul produce infecții grave la tineretul aviar, transmisibile prin contact, cu difuziune enzootică. Boala, numită encefalomielita infecțioasă a păsărilor, se caracterizează printr-un procent ridicat de mortalitate.
Pentru diagnosticul etiologic al bolii se impune izolarea virusului, verificarea experimentală a patogenității lui pentru pui, pe cale intracerebrală și identificarea lui prin reacția de seroneutralizare cu seruri specifice.
Virusul are proprietăți imunogene și se pretează pentru prepararea de vaccinuri vii sau inactivate, care dau bune rezultate în imunoprofilaxia bolii. În cazul vaccinării găinilor ouătoare, imunitatea se transmite prin ou.
Virusologie generală
239
Enterovirusuri orfane La mai multe specii animale –om, maimuță, bovine,
suine etc.- au fost izolate enterovirusuri care în culturi celulare produc efect citopatic și al căror rol etiologic în producerea unor infecții la speciile de la care au fost izolate este incert. Aceste virusuri se izolează deseori de la animale clinic sănătoase. Ele sunt virusuri temperate, se multiplică de regulă în celulele tubului digestiv, fără a perturba funcționalitatea normală a celulelor respective, infecția fiind de tip endosimbiotic. În anumite condiții sunt însă capabile să producă infecții digestive, respiratorii, nervoase etc.
Pentru desemnarea acestor virusuri se folosesc curent inițialele: E = enterovirus, C = citopatogen; inițiala speciei animale la care virusul se găsește în stare biofită (H = uman, B = bovin, S = suin, M = maimuță); O = orfan, rezultând următoarele grupe de simboluri: ECHO, ECBO, ECSO, ECMO.
Virusurile ECHO au fost identificate pentru prima oară
în culturile renale de maimuță în timpul unor încercări de izolare a poliovirusurilor; se multiplică bine într-o gamă destul de largă de celule, producând un efect citopatic evident, însoțit de formarea de plaje; nu se cultivă pe embrioni de găină; au efect hemaglutinant asupra hematiilor umane din grupa O. Antigenic au fost identificate peste 30 de serotipuri. Potențial și inconstant patogene, produc uneori encefalite la om.
Virusurile ECBO a fost izolate din conținutul intestinal
de la taurine sănătoase și din focare în care animalele manifestau simptome respiratorii sau avorturi. Unele tulpini aglutinează globulele roșii de bou, iar altele pe cele de cal, oaie, cobai. Toate tulpinile se multiplică în culturi celulare renale de vițel, producând un efect citopatic evident. Înrudiri antigenice au fost semnalate cu virusul ECHO și cu poliovirusul de tip II. În condiții experimentale produc uneori avorturi la cobăițe gestante și leziuni asemănătoare celor produse de virusul Coxsackie A la șoareci și hamsteri.
Virusurile ECSO (ECPO) au sediul în tubul digestiv la
suine, rolul lor în determinarea unei stări patologice fiind incert; uneori ele sunt omologate cu virusurile bolii de Teschen.
Virusologie generală
240
Genul APHTOVIRUS Genul Aphtovirus, nou creat în 1979, a fost propus de
comitetul internațional de taxonomie a virusurilor pentru virusul febrei aftose, încadrat până atunci în genul Rhinovirus.
Virusul febrei aftoase Istoric. Virusul febrei aftoase a fost primul virus
zoopatogen descoperit în anul 1898 de către Löffler și Frosch, care au demonstrat posibilitatea transmiterii infecției cu filtrate din leziuni. Vallée și Carré demonstrează, în 1922, pluralitatea antigenică a virusului. Waldmann (1920) reproduce primul infecția experimentală pe cobai prin inoculare intraplantară, iar mai târziu (1938) inițiază, împreună cu Köbe, prima metodă de preparare în cantități industriale a vaccinului antiaftos obținut din mucoasele linguale recoltate de la taurine infectate experimental. Frenkel (1947) pune la punct o metodă de cultivare a virusului “in vitro” pe mucoase linguale de bou în stare neproliferantă, menținute în stare vie într-un mediu adecvat, metodă care și astăzi se mai folosește în unele țări pentru prepararea vaccinului antiaftos. Hoffmann (1942) demonstrează receptivitatea în condiții experimentale a șoarecelui sugar, însușire care a determinat inițial pe virusologi să așeze virusul febrei aftoase alături de enterovirusuri și care și-a găsit o aplicație în practica tipizării virusului prin seroneutralizare. Alexandru Ciucă (1928) demonstrează posibilitatea utilizării în același scop a reacției de fixare a complementului.
Structura virionului. Virusul febrei aftoase este unul din cele mai mici virusuri; dimensiunile lui variază între 10-30 nm, fiind de regulă de 20-25 nm. Genomul viral este constituit din ARN monocatenar cu masa moleculară de 2,8 x 106 daltoni. Forma particulei virale este icozaedrală, în unele imagini electronooptice prezetându-se și cuboidal sau sferic. Capsida este constituită din aproximativ 32 capsomere de formă cilindrică, mai mari comparativ cu capsomerele altor picornavirusuri.
Examenele electronooptice executate din depozite de ultracentrifugare de material viral purificat au relevat prezența
Virusologie generală
241
a două categorii de particule antigenic identice, dar distincte sub aspectul mărimii și al infecțiozității; unele mici, de 7 nm, lipsite de proprietăți infecțioase și altele mai mari, de 25 nm, cu care poate fi reprodusă infecția.
Proprietăți fizico-chimice. Virusul este rezistent la eter, cloroform, detergenți, săruri biliare, la valori ale pH de 3 și 7,4-7,6, manifestând un grad de labilitate la pH 5. La 560C este inactivat în 30 minute.
Cultivabilitate. Fiind un virus epiteliotrop, se multiplică cel mai bine în celulele epiteliului lingual. Timp de mulția ani s-a cultivat în laborator după metoda lui Frenkel, în epitelii linguale de bou neproliferante “in vitro”. În ultimii ani s-a reușit și s-a extins cultivarea virusului aftos în culturi celulare. Cele mai adecvate sunt celulele renale de vițel și purcel. Virusul se multiplică în bune condiții atât în celulele menținute în suspensii cât și în monostrat, unde produce efect citopatic. Obișnuit nu se multiplică în ouă embrionate; poate fi însă adaptat, mai ales prin treceri seriate pe cale intravenosă la embrioni în vârstă de 14 zile.
Proprietăți antigenice. Virusul febrei aftoase se caracterizează prin existența unui număr mare de tipuri și variante antigenice. Tipurile clasice propuse de Vallée și Carré sunt:
- O (după localitatea Oise), - A (după denumirea franceză a Germaniei –
Allemagne), - C (fiind al treilea tip, a fost notat cu a treia
literă a alfabetului). În cadrul fiecărui tip s-au evidențiat mai târziu mai
multe subtipuri sau vairante, după cum urmează: - 11 în cadrul tipului O, - 32 în cadrul tipului A, - 5 în cadrul tipului C.
Brooksby și Galloway (1958), studiind tulpinile de virus aftos izolate în diverse epizootii pe continentul african, identifică 3 tipuri antigenice, iar mai târziu un al 4-lea tip în Asia. Autorii desemnează tulpinile africane cu inițialele SAT (Southern African Territories), urmat de numărul de ordine al tipului: SAT 1, SAT 2 și SAT 3. Pentru tipul izolat în Asia se utilizează apelativul Asia 1. În cadrul tipurilor africane și asiatic
Virusologie generală
242
s-au descris, de asemenea, mai multe subtipuri sau variante: 7 la SAT 1, 3 la SAT 2, 4 la SAT 3 și 3 la Asia 1.
Tipurile și subtipurile pot uneori să se transforme dintr-unul în altul. Cel mai stabil este tipul O.
Pluralitatea antigenică a virusului febrei aftoase prezintă o importanță deosebită pentru evoluția epizootiilor de febră aftoasă și prepararea vaccinurilor antiaftoase. În cursul unei epizootii se pot schimba variantele și uneori chiar tipurile.
Pentru identificarea tipurilor și subtipurilor se poate folosi seroprotecția pe șoareci sugari sau cobai și RFC. Fără a fi la fel de sensibilă ca RFC, poate fi aplicată pentru serotipizare și imunodifuzia.
Rezistența față de factorii ecologici. Virusul rezistă cel mai bine în epiteliile aftelor (până la 2 luni în tipul iernii). Temperatura de 80-1000C îl distruge instantaneu, iar la 55-560C rezistă până la 40 minute. Expus la lumina solară directă rezistă până la 5 ore. În sol, în funcție de umiditate și temperatură, rezistă 25-50 zile. În stare uscată, pe părul animalelor, furaje sau obiecte între 5-20 săptămâni, iar în gunoiul de grajd, până la 43 zile. În timpul iernii, în gunoiul înghețat sau în interiorul căpițelor de paie și fân își păstrează infecțiozitatea peste 100 zile. În carnea refrigerată se păstrează până la 80 zile, iar în cea congelată până la 6 luni. În lapte, după Buxton și Fraser (1977), virusul este omorât în 15 secunde la 700C, în 30 secunde la 650C, în 24 ore la 370C, în 6 zile la temperatura camerei (18-220) și în 12 zile la temperatura frigiderului (4-70); în unt rezistă 8 zile.
Substanțele cele mai active față de virusul febrei aftoase sunt: hidroxidul de sodiu 1-2%, formolul 1/10, acidul sulfuric N/10 și sublimatul 1/3.000.
Infecția naturală. Gazdele receptive sunt speciile biongulate demestice: boul, capra, oaia și porcul cât și cele exotice sau sălbatice: cămila, renul, antilopa, girafa etc. Localizările cele mai frecvente sunt cele bucale și podale. Procentul de mortalitate este redus, gravitatea infecției constând în procentul foarte ridicat de mortalitate, datorită extraordinarei puteri de difuziune a virusului în efectivele speciilor sensibile. Fără luarea promptă a unor măsuri eficiente de combatere și profilaxie, infecția poate avea o extensie epizootică sau panzootică.
Virusologie generală
243
Infecția experimentală. Speciile natural receptive sunt sensibile și în condiții experimentale. Animalul de laborator cel mai sensibil este șoarecele sugar în vârstă de 7-9 zile care, pe cale intraperitoneală, manifestă la 2-3 zile de la inoculare simptome caracteristice constând din paralizia spastică a trenului posterior și slăbiciunea musculaturii cefei. Examenul histopatologic relevă prezența de leziuni necrotice în musculatura striată și miocard. Țesuturile șoriceilor infectați conțin virus într-un titru ridicat. Cobaiul, a cărui receptivitate a fost descoperită mai devreme a trecut însă în ultimii ani pe planul al doilea în practica experimentării cu virusul febrei aftoase, nu toate tulpinile fiind patogene pentru această specie. Inocularea se face intraplantar, leziunile primare apar la locul de inoculare, după care se generează la celelalte membre și la mucoasa bucală în 2-12 zile. {obolanul, hamsterul, iepurele, câinele și pisica, deși ceva mai greu, pot fi de asemenea infectate în condiții experimentale.
Proprietăți imunogene și metode de imunizare. Virusul febrei aftoase are o ridicată valoare imunogenă și se pretează la obținerea de vaccinuri și seruri cu o bună capacitate imuizantă. În prepararea acestora trrebuie să se țină totdeauna seama de tipul și subtipul antigenic izolat din focar. Vaccinul antiaftos concentrat și saponinat s-a preparat la noi în țară mulți ani după metoda Waldmann și Köbe, iar în prezent se prepară din culturi celulare. Serul antiaftos se obține prin hiperimunizarea bovinelor și are o valoare protectoare ridicată.
Genul RHINOVIRUS Prin reașezarea taxonomică a virusului febrei aftoase, au rămas încadrate în genul Rhinovirus specii cu o pondere relativ minoră pentru patologia veterinară. Rhinovirusuri equine Au fost izolate din focare enzootice în care animalele prezentau o rinofaringită acută însoțită de reacții febrile. Cultivarea acestor virusuri a fost posibilă în culturi de celule de cal, iepure, om etc., în care produc efect citopatic.
Virusologie generală
244
Serologic s-au putut distinge trei tipuri antigenice, din care tipul 1 are cel mai ridicat grad de incidență.
FAMILIA CALICIVIRIDAE. Familia cuprinde 3 genuri comune: Calicivirus, Lagovirus și Vesivirus. Genul CALICIVIRUS
Particulele virale sunt de 35-45 milimicroni, au o capsidă icozaedrală, constituită din 32 capsomere, genomul este format din ARN monocatenar cu greutatea moleculară 2,8 x 106.
Calicivirusurile sunt rezistente la eter și la pH 5. Din acest gen fac parte; virusul exantemului veziculos al
porcului virusul bolii hemoragice a iepurelui și virusul calicivirozei feline.
Calicivirusuri feline Au fost izolate în culturi de celule renale de pisică cu
afecțiuni respiratorii primare sau asociate cu simptome de panleucopenie, după cum și din conjunctivite și stomatite. Încadrarea acestor agenți în genul Calicivirus se bazează pe similitudinea lor cu virusul exantemului veziculos la examenul electronooptic, după cum și a unei stabilități cu caracter intermediar între entero și rhinovirusuri la pH 3. Virusul bolii hemoragice a iepurelui, încadrat inițial în picornovirus sau parvovirus, este încadrat astăzi de Oblinger și colab., 1990 și Studdert 1994 în genul Calcivirus, familia Calciviridae. Particula virală conține ARN având dimensiuni de 40 nm. Boala afectează iepurii domestici și sălbatici și se caracterizează printr-un sindrom hemoragipar, necroze hepatice, procese de coagulare intravenoasă diseminată și mortalitate de 50-90%.
Genul VESIVIRUS
Virusologie generală
245
Virusul exantemului veziculos al porcului Virionul icozaedral are 13-20 milimicroni. Virusul este
necultivabil pe ouă embrionate, ci numai în culturi celulare embrionare de porc.
Structura antigenică este heterogenă, constatându-se, ca și la virusul febrei aftoase, un grad accentuat de pluralitate; au fost descrise 13 tipuri imunologice notate cu literele alfabetului. Ele sunt însă cantonate în California, în restul lumii fiind prezent numai tipul B.
Virusul este sensibil față de agenții fizici și chimici uzuali. În carnea refrigerată și congelată rezistă 4-18 săptămâni.
Infecția naturală prezintă multe asemănări cu febra aftoasă, atât sub aspectul anatomo-clinic, cât și epizootologic, virusul având însă o capacitate de difuziune ceva mai redusă, comparativ cu virusul febrei aftoase.
Prepararea vaccinului fiind posibilă numai pe porc, este prea costisitoare și nu s-a introdus în practică.
VIROIZII O formă acelulară de viață, mai simplă decât virusurile și de dimensiuni incomparabil mai mici, este reprezentată de viroizi. Denumirea lor arată înrudirea cu virusurile, ei fiind în esență molecule mici de acid nucleic neprotejat de învelișul proteic denumit capsidă și nici de învelișul exterior ce conține lipide și proteine,așa cum este cazul la unele virusuri. În 1971 au fost evidențiate pentru prima oară niște maladii ale plantelor, provocate de un tip special de agenți patogeni subvirali denumiți viroizi. Printre aceste maladii ale plantelor pot fi citate: boala stelării tuberculilor de cartof, nanismul și pătarea clorotică a crizantemelor, cloroza castraveților, boala cadang-cadang a palmierilor de cocos, etc. Primul viroid a fost descoperit de către cercetătorul american T.O. Dienner la Beltsville (SUA) în urma unor cercetări efectuate în perioada 1967-1071 la cartof. Viroizii sunt un tip special de agenți patogeni, similari virusurilor, dar cu o organizare mai simplă și de dimensiuni mult mai mici.
Virusologie generală
246
Viroizii sunt forme acelulare de viață, alcătuite din molecule de ARN de talie mică, neprotajate de proteine. De pildă, viroidul cartofului care provoacă deformarea tuberculilor are un genom reprezentat de o moleculă circulară de ARN cu regiuni mono- și dublu catenare, alcătuită dintr-o secvență de 359 de nucleotide. Este pentru prima oară că se identifică o astfel de structură circulară formată din ARN monocatenar. În general s-a constatat că viroizii sunt localizați în nucelul celulelor, unde se replică cu ajutorul unei enzime de tipul replicazelor din celula gazdă. La plante s-au identificat secvențe de nucleotide din ADN-ul nuclear complementare cu ARN-ul viroizilor, dar se pare că replicația viroizilor nu se realizează prin intermediul ADN. Cercetări noi arată că în celulele vegetale există o multitudine de enzime, care pot replica moleculele de ARN, folosind ca matriță chiar moleculele de ARN ale virionului. Originea viroizilor nu este prea bine cunoscută. Pornindu-se de la observația că genele plantelor și animalelor sunt alcătuite din regiuni informaționale, denumite exoni și regiuni non-informaționale, denumite introni, care sunt eliminați în procesul de activare al genelor, s-a emis ipoteza că viroizii ar proveni din introni nedegradați. Capacitatea patogenă a viroizilor se datorează interreacției lor cu genomul celulei gazdă, probabil prin perturbarea mecanismelor de reglaj genetic ale acesteia. Ca urmare, se consideră că viroizii sunt la limita inferioară a vieții, fiind sisteme genetice autoreplicative, care posedă un program genetic redus la minim. Recent s-a demonstrat că și unele maladii umane sunt provocate de viroizi. Astfel la un trib din Noua Guinee a fost identificată maladia Kuru, care provoacă degenerescența creierului. O altă maladie similară, denumită Kreutzfeld-Jacob, provoacă degenerarea progresivă a țesuturilor cerebrale, iar la oi este cunoscută căpiala, care afectează sistemul nervos. Până acum, aceste maladii erau considerate ca fiind provocate de așa-numitele virusuri lente, cu o evoluție îndelungată. Cercetări mai noi arată că unele sunt provocate de viroizi. Investigații efectuate în Anglia, la Institutul de Cercetări asupra Bolilor Animalelor, au demonstrat prezența unei mici molecule de acid nucleic în țesuturile cerebrale de la oile bolnave de căpială. În
Virusologie generală
247
acest caz se pare că este vorba de un viroid alcătuit dintr-o moleculă mică de acid nucleic, autoreplicativ, neprotejat de proteine, sau de anvelopa în care este închisă uneori capsida virală. În concluzie, viroizii pot fi considerați o noua clasă de agenți patogeni subvirali, alcătuiți exlusiv dintr-o moleculă de acid nucleic, cei mai mici cunoscuți până în prezent. Ei sunt forme înrudite cu virusurile, dar foarte primitive. Caracteristicile lor denotă existența unei distanțe filogenetice apreciabile față de virusuri.
PRIONII Prionii sunt agenți patogeni fără precedent care generează un grup de boli neurovegetative printr-un mecanism complet nou. Bolile prionice se pot caracteriza ca dereglări genetice, sporadice sau infecțioase, cauzate de dereglări ale proteinei prionice (PrP) (de la acronomul și anagrama din limba engleză Proteinaceous infectious particle ). Prionul este o particulă infecțioasă proteică care rezistă la tratamente draconice (formol, sterilizare clasică iradiații). Americanul Stanley Prusiner (premiant Nobel în medicină, 1997) a descoperit în 1997 acest germene “neconvențional” care provoacă encefalopatii spongiforme transmisibile (EST), boli cunoscute la oaie încă din 1732 (scrapie) și la om din 1920 (MCJ). Encefalopatiile spongiforme transmisibile (EST),sunt boli ale omului și ale mamiferelor sunt caracterizate prin:
- perioada de incubație lungă, de ordinul anilor; - simptomatologie exclusiv nervoasă și evoluție clinică
lentă, ce durează săptămâni, cel mai adesea luni, uneori ani, întotdeauna cu sfârșit letal;
- transimisibilitatea pe cale parenterală sau digestivă, la aceeași specie sau la alte specii, atunci când se folosește ca material infectant țesutul nervos, uneori și alte țesuturi recoltate din cazuri de boală;
Virusologie generală
248
- absența oricărui răspuns imun față de agentul transmisibil, deși gazda își păstrează nealterată competența imunologică față de alte antigene;
- leziuni degenerative ale encefalului, reprezentate prin vacuolizări ale pericarionilor și ale neuropilului, necrobioză neuronală, proliferări gliale (astrocitoză) și uneori formarea de plăci amiloide; frecvența și localizarea acestor modificări variază în mare măsură în funcție de specia și rasa animalului gazdă și de tulpina agentului transmisibil.
EST ale animalelor și ale omului semnalate până în prezent sunt expuse în tabelele 1 și 2.
Virusologie generală
249
Tabelul nr. 6
Encefalopatiile spongiforme transmisibile ale animalelor
Entitatea nosologică
Specii afectate în condiții naturale, mod de transmitere
Scrapie Oi, capre; contagiozitate redusă, se transmite de la mamă la făt și prin învelitorile fetale
Encefalopatia transmisibilă a nurcilor (ETN)
Nurca de crescătorie; necontagioasă, transmisă prin hrana contaminată cu agenții scrapie (?) sau ESB
Boala cronică cahectizantă a cervideelor
Trei specii de cervidee din America de Nord; semnalată la animale în captivitate, dar și la exemplare în libertate; suspectă a fi contagioasă
Encefalopatia spongiformă bovină (ESB)
Bovine domestice; apărută în 1985 în Regatul Unit, ulterior semnalată și în alte țări; transmisă cu făină de carne-oase; necontagioasă, dar se suspectează un procent redus de infecții transplacentare; argumente circumstanțiale în favoarea ipotezei transmiterii la felide și la om (v.BCJ)
Encefalopatia ongulatelor exotice
{apte specii de Bovidae sălbatice în captivitate; transmisă prin făina de carne-oase, foarte probabil
Encefalopatia spongiformă felină (ESF)
-pisici domestice și 4 specii de feline sălbatice în captivitate; apărută în 1990, foarte probabil în urma contactului cu agentul ESB
Virusologie generală
250
Tabelul nr.7
Encefalopatiile spongiforme transmisibile ale omului
Entitate nosologică Mod de transmitere Boala Kuru Întâlnită la o anumită populație din Papua-Noua Guinee; asociată cu un
canibalism ritual și a dispărut odată cu acesta. Boala Creutzfeld-Jacob (BCJ) Uniform răspândită pe glob, cu o prevalență anuală medie de 1 x 10-6; se
cunosc forme familiale, iatrogene și sporadice, în general este semnalată la vârsta medie de 65 ani și durează cca.4 luni.
Boala Gertmann-Straussler Scheinker (BGSS)
Forme familiale asociate cu o mutație a genei Prn-p; evoluție morfoclinică diferită de BCJ; vârsta apariției 35-55 ani, durata bolii 2-10 ani, simptomele spino-cerebeloase preced demența
Insomnia fatală familială (IFF)
Semnalată din 1992, forme familiale asociate cu o mutație a genei Prn-p.
Varianta bolii Creuttzfeld –Jacob (v. BCJ)
Din 1994 până în prezent au fost semnalate 21 cazuri în Regatul Unit și 1 caz în Franța, la indivizii între 19 și 41 ani ( media = 21 ani), cu o durată a evoluției de 7,5 – 22,5 luni; tabloul morfoclinic diferit de BCJ; argumente circumstanțiale în sprijinul ipotezei că este asociată și produsă de agentul ESB.
Virusologie generală
251
Dintre aceste boli, scrapia este cunoscută de mult și cel mai intens studiată. Cunoștințele actuale privind etiopatogeneză EST se bazează în bună parte pe studiul acestei boli. Astfel, scrapia a fost prima EST în care s-a demonstrat transmisibilitatea atât la oaie, cât și la șoarece (Chandler, 1961, citat de 39) iar ulterior și la alte specii. În 1959 Hadlow (citat de 43) atrage atenția asupra asemănării modificărilor histologice din scrapie cu cele întâlnite în Kuru, boala a cărei etiologie era până atunci necunoscută. Această observație a determinat reluarea experimentelor de transmitere a acestei la primate și ulterior la alte specii. Rezultatele pozitive obținute au inaugurat un nou capitol al patologiei omului, acela al demențelor transmisibile (Gajdusck D.C. et al., 1966 citați de 21). Modelul oferit de scrapie a permis aprofundarea etiopatogenezei celorlalte EST, precum și a mecanismelor moleculare implicate. Câteva date privind agentul scrapiei
Numită PrPsc ( de la scrapie) sau proteina PrPres ( de la rezistență) ce provine nu din expresia unei gene, ca toate proteinele, dar din păcate replicându-se în specia unei proteine prezente la suprafața numeroaselor tipuri celulare, de la neuroni până la spermatozoizi. Rolul acestei proteine normale numită PrPc, rămâne insuficient cunoscut, cu excepția creierului unde ea este implicată în transmisia semnalelor între celule (rol neurotransmițător). Descoperirea transmisibilității bolii a condus la ipoteza implicării în etiologie a unui virus. Toate încercările de a demonstra prezența acestuia și eventualul răspunsul imun al organismului la infecție au eșuat (43) Ipoteza etiologiei virale a fost zdruncinată și de descoperirea rezistenței deosebite a agentului scrapiei – ulterior și a agenților altor EST – la acțiunea aldehidei formice și a altor factori chimici sau fizici ce inactivează toate virusuri cunoscute. Astfel s-a demonstrat că infectivitatea suspensiilor de creier este păstrată, deși mult diminuată, în urma expunerii la 3600C timp de 60 minute. Tratamentul prealabil cu aldehidă formică mărește rezistența la acțiunea factorului termic. (11).
Virusologie generală
252
Lucrările de purificare și fracționare a suspensiilor de țesut nervos recoltat de la animale bolnave au demonstrat că infectivitatea maximă este asociată cu o proteină de tipul amiloidului, cu greutate moleculară de 27- 30 kDa. Această moleculă proteică infectantă a fost denumită “prion”, termen derivat din “proteinaceus infectious particle”, sau proteină prionică, desemnată cu acronimul PrP27-30 (Prusiner et al., 1982, citați de 44). Teoria prionică în etiopatogeneza EST a determinat și denumirea acestor afecțiuni ca boli prionice. În aceleași fracțiuni cu infectivitate maximă, obținute în urma tratării suspensiilor de țesut nervos infectat cu ajutorul unor detergenți, s-au pus în evidență fibrele cu o grosime variind între 4 și 16 nm și o lungime ce poate atinge 500 nm (35-36). Ele au fost denumite fibrile scrapie-asociate (SAF). Ulterior s-a demonstrat că SAF sunt constituite din PrP27-30 care, în anumite condiții experimentale, formează agregate fibrilare de până la 1000 molecule (Diringer et al., 1983, citați de 26) Prezența PrP27-30 și a SAF a fost demosntrată în cazul tuturor EST cunoscute și a devenit un criteriu de confirmare a diagnosticului clinic. Aceeași proteină este și componenta principală a plăcilor amiloide întâlnite în unele EST. Este de menționat că amiloidul prezent în cazul EST este chimic și antigenic diferit de cel semnalat în sistemul nervos central la subiecții senili sau în cazul altor demențe, netransmisibile, ale omului, ca de exemplu boala Alzheimer. (22) PrP27-30 este o fracțiune rezistentă la proteaza K, fapt pentru care este desemnată cu simbolul PrPres și rezultă din clivarea enzimatică a unei proteine precursoare cu greutatea moleculară 33-35 kDa (PrP33-35) (Bolton et al. 1982, citați de 9; Oesh N. et al., 1985, citați de 11,46,47) În anul 1985, Oesh et al. (citați de 9) descoperă că proteina prionică PrP33-35 din cazurile de EST este o formă izomerică a unei proteine normale produsă de celulele neinfectate. Această descoperire senzațională este confirmată de alte colective (Hay et al, 1987; Bedheim et al, 1988, citați de 9) Pentru a diferenția cele două forme s-a propus terminologia următoare: -PrPsc (“sc” de la scrapie) pentru proteina precursoare PrP 25,25,30,35
Virusologie generală
253
-PrPc (“c” de la cell= celulă) pentru proteina prionică normală, denumită și PrPsen (sensibilă la proteinaza K) Gena care controlează conteza PrPc a fost desemnată prin acronimul Prn-p. Gena Prn-p și produsul său de expresie Gena care controlează expresia PrPc a fost identificată la numeroase specii de vertebrate ( om, oaie, capră, hamster, șoarece, șobolan, broască) la unele nevertebrate (nematode, drosofila) și probabil la levuri (53). La om ea este localizată pe brațul scurt (p) al cromozomului 20 (Robakis N.K. et al., 1986, citați de 12). Homologia secvențelor nucleotidice la diferite specii este de 80-90% (18) Faptul că această genă este înalt conservată pe scara filogenetică sugerează că produsul său de expresie are un rol important în organism, deși încă necunoscut. Proteina prionică normală este o glicoproteină de suprafață. Ea are multe asemănări structurale cu proteina ce modulează receptorii de acetilcolină (Harris et al., 1989, citați de 12). Se presupune că ar interveni în recunoașterea celulară (44). Rolul central al genei Prn-p și al proteinei prionice în patogeneza EST este demonstrat de faptul că șoareci la care această genă a fost deletată nu mai sunt receptivi la infecția cu agenții EST (Bueler H. et al. 1993, citați de 15). Pe de altă parte, șoarecii transgenici, la care gena Prn-p a fost înlocuită cu gena similară de hamster, în urma infecției experimentale, produc prioni cu caracterele celor de hamster (Scott M. et al., 1989, citați de 44) Când proteina normală (PrPc) se transformă în agent infecțios (PrPsc), ce schimbă forma, constituienții săi de bază, acizii aminați, au tendința de a se suprapune în foi în loc să se ruleze în elice. Această structură numită, în foi bete, rezistă la degradarea enzimatică și s-a constatat acumularea sa în creier, fără să se știe cum agentul infecțios câștigă acest organ. Acumularea proteinelor PrPsc antrenează moartea neuronilor, cum o arată autopsia creierelor victimelor encefalitei spongiforme transmisibile.
Virusologie generală
254
Dar după experiențele realizate “ in vitro”, moartea neuronală ar fi mai degrabă programată de către mici celule vecine cu neuronii, celulele microgliale care proliferează la indivizii bolnavi. Funcționând ca macrofage, aceste celule reacționează la prezența proteinelor PrPsc, secretând semnale chimice, toxice, capabile să bulverseze funcționarea normală a organismelor. Cercetătorii francezi, reușesc întradevăr, să demonstreze că proteinele PsPsc prezente la suprafața neuronilor, reglează transmisia semnelor nervoase.” Celulele infectate de către prioni sunt de asemenea mult mai sensibilizate la stressul oxidativ (responsabil de îmbătrânire celulară), confirmă Sylvain Lehmann de la Institutul de Genetică Umană Montpelier, care demonstrează aceasta pe culturi celulare de neuroni de șoarece, infectați de prioni
Forma patologică a proteinei prionice PrPsc, are secvența aminoacizilor identică cu aceea a formei normale PrPc (Stahl et al., 1993, citați de 45) Cele două proteine se deosebesc prin structura secundară a lanțului polipeptidic. PrPc are o configurație predominant helicoidală (42%) și probabil este lipsită de structuri beta-plisate. Structurile alfa-helix sunt distribuite în patru regiuni, cunoscute ca H1-H4 (figură). 81/82 117 129 171 219 51 91 105 145 178 219 253 H1 H2 H3 H4
Gena prionică umană Săgețile indică zonele de polimorfism. Parantezele marchează regiunile cu conformație alfa-helix. Paranteza îngroșată indică amplasarea a 5 secvențe
repetitive ce codifică câte un octapeptid.
Virusologie generală
255
Situsurile corespunzătoare acestor regiuni sunt situate între codonii 105-145 (H1 și H2) și codonii 178-219 (H3 și H4) (45) Dimpotrivă PrPsc prezintă o configurație predominant beta-plisată (43%) structurile alfa-helix constituind doar 30% (Pan K.M. et. al. 1993, citați de 15). Această configurație este caracteristică amiliodului și în general, proteinelor fibrilare. Modificarea conformațională a PrPc conferă PrPsc rezultată proprietăți diferite, precum lipsa de solubilitate în detergenți, rezistența la proteoliză și capacitatea de a forma agregate (45). PrPsc ia naștere prin transformarea PrPc după ce lanțul polipeptidic al acesteia din urmă a fost asamblat. Acest proces post-translațional se realizează prin despiralarea structurilor alfa-helix și replierea catenei de aminoacizi în structuri beta-plisate (Borchelt et al. 1990, citați de 45) Spre deosebire de PrPc, PrPsc nu este transportată în exteriorul celulei. Ambele forme pot fi identificate prin Western blot în membranele microsomale și sinaptosomale ale neuronilor (47). Sub acțiunea enzimelor proteolitice, lanțul polipeptidic al PrPsc se scurtează, rămânând doar secvența cuprinsă între pozițiile 680232 care reprezintă fracțiunea rezistentă la proteaze și constituie PrP27-30 (8) Această rezistență împiedică metabolizarea și duce la acumularea în sistemul nervos central cu declanșarea vacuolizării pericarionului, a proceselor dendritice și axoniale și în mai mică măsură, a astrocitelor și a oligodendrocitelor (Prusiner S.B. et al., 1987, Gajdusek D.C., 1988, citați de 47). Astfel, modificările conformaționale ale proteinei prionice normale din structuri alfa –helix în structuri beta-plisate este elementul central în formarea prionilor și în patogeneza EST (45) Intervenția genotipului gazdei în expresia morfoclinică a EST Prima demonstrație a intervenției genomului gazdei în patogeneza EST a fost realizată în 1959 de către Gordon (citat de 39), care a infectat 1027 oi din 24 rase cu același agent al scrapiei. După doi ani de observație autorul a constatat că
Virusologie generală
256
procentul de morbiditate a variat de la zero la Dorset-Down, la 78% la rasa Herdwick. Cercetările ulterioare au demonstrat că perioada de incubație și rezistența în boala experimentală sunt controlate de o genă Sip (= scrapie incubation period) cu două alele: sA (short) și pA (prolonged). Majoritatea oilor cu alela sA, dominantă pentru susceptibilitate, fac boala după infecția experimentală, perioada de incubație fiind mai scurtă la homozigoți, care sunt și cei mai receptivi la infecția în condiții naturale. În schimb, oile homozigote pentru alela pA fac rareori boala, chiar după infecția intracerebrală. Heterozigoții sA/pA sunt relativ rezistenți la infecția naturală. Rolul polimorfismului genei Prn-p a fost amănunțit studiat în etiopatogena EST umane. Cercetările au pornit de la observațiile privind epidemiologia bolii Creutzfeld-Jacob (PCJ), cea mai cunoscută din această grupă. BCJ este relativ uniform răspândită pe glob, având o prevalență anuală de cca 1/1 milion, deși se cunosc câteva grupări de cazuri în rândul populațiilor cu o anumită origine etnică. Până în prezent boala nu a putut fi asociată cu EST ale animalelor. Din punct de vedere epidemiologic, se recunosc trei forme de BCJ (16,45) -forma iatrogenă (5%) în care infecția se realizează prin contactul cu unele țesuturi ale indivizilor bolnavi (transplant de cornee sau de duramater, electrozi de electroencefalografie, tratamentul cu hormon somatotrop preparat din hipofize recoltate de la cadavre); -forma familială (10%) este întâlnită la mai mulți descendenți ai aceleiași familii; -forma sporadică (85%), care nu poate fi asociată cu nici un element al celorlalte două forme. Alte două forme morfoclinice de EST ale omului, boala Gerstmann-Straussler-Scheinker (BGSS) și insomnia familială fatală (IFF) au, de asemenea, un caracter familial. Aceste observații au condus la concentrarea cercetărilor asupra genotipului cazurilor familiale și sporadice de EST umane. În toate formele ereditare de EST umane (BGSS, IFF și BCJ cu evoluție familial) au fost identificate mutații în cadrul deschis de lectură al genei Prn-p.
Virusologie generală
257
Formarea și multiplicarea prionilor Mecanismul intim al transformării proteinei prionice normale PrPc în forma sa patologică PrPsc nu este pe deplin cunoscut. Datele obținute până în prezent, în special cele furnizate de experimentele pe șoareci transgenici și cu peptide sintetice, permit unele ipoteze plauzibile. Acestea încearcă să explice formarea și multiplicarea prionilor în cele trei forme ale EST cunoscute: infecțioasă (exogenă), ereditară și sporadică. Majoritatea datelor ce vin în sprijinul acestor ipoteze provin din rezultatele infecțiilor experimentale cu agenți ai EST, în special cu cel al scrapiei. O primă ipoteză a încercat să explice formarea prionilor printr-o eroare de translație a cadrului de lectură (56). Ca urmare ar rezulta proteina anormală PrPsc. Ipoteza a fost abandonată în momentul în care s-a demonstrat că transformarea PrPc în PrPsc este un proces post-translațional (Borchelt et al., 1990, citați de 45). După sinteza PrPc, aceasta migrează spre membrana plasmatică. Transformarea ei în forma patologică are loc într-un compartiment bogat în colesterol al membranei (Gorodinsky A și Harris D.A., 1995, Tarabulos et al., 1995, citați de 45). Infectivitatea maximă a fracțiunilor obținute din suspensiile de creier infectat este asociată cu membranele microsomale și sinaptosomale (48,49). În cazul infecției experimentale, a fost demonstrată (42) prezența în aceste zone a unui complex cu o greutate moleculară de cca 60 Kda alcătuit din PrPc și forma sa patologică PrPsc (48). Formarea acestui dimer este o fază intermediară obligatorie în conversia PrPc în PrPsc (Prusiner S.B., 1990, citat de 45. El a fost obținut în vitro într-un experiment în care PrPc marcată a fost pusă în contact cu PrPsc în exces. Proteina marcată a fost transformată într-o proteină cu structură beta-plisată, rezistentă la proteoliza și cu tendința de a forma agregate fibrilare (Kocisko D.A. et al., 1994, citați de 5). Formarea complexului PrPc – PrPsc este facilitată când secvența de aminoacizi a celor două forme izomere este identică (Prusiner S.B. et al. 1990, citați de 15, Scott M., et al. 1993, citați de 45)
Virusologie generală
258
Toate aceste rezultate demonstrează că interacțiunea dintre cele două forme ale proteinei se produce la nivelul primelor două regiuni alfa-helix (H1 și H2). Cuplarea PrPsc la PrPc are drept rezultat transformarea structurii secundare a acesteia din urmă într-o structură beta-plisată. Astfel s-a emis ipoteza că PrPsc se prezintă sub forma unui dimer. Ea explică unele rezultatele obținute în infecția experimentală a șoarecilor transgenici (Carlson G.A. et al. 1994, citați de 45) și este sprijinită de lucrările privind rezistența prionilor la radiațiile ionizante care indică o țintă de cca 55 kDa (Alper T et al, 1966, Bellinger Kawahara C.G. et al, 1988, citați 45) Datele prezentate sprijină ipoteza conform căreia PrPsc servește drept matriță pentru transformarea conformației PrPc din alfa-helicoidală în beta-plisată. Acest proces se desfășoară în lanț, fiecare moleculă de PrPsc nou formată servind drept matriță pentru convertirea altei molecule de PrPc. Recent a fost emisă ipoteza că în procesul de amplificare a PrPsc, un rol important ar putea reveni trombocitelor care, sub acțiunea unor agoniști, cum ar fi colagenul, exprimă intens PrPc, la nivelul membranei celulare (40). Tromocitele ar putea constitui un loc ideal pentru procesul de conversie a PrPc în PrPsc, fiind totodată și un transportor al acesteia din urmă în întregul organism.. Un argument în favoarea acestei ipoteze este observația că, la două săptămâni de la infecția pe cale intracerebrală a șoarecelui, infectivitatea maximă nu se constată în creier, ci în splină, sediul principal de distrugere și catabolizare a trombocitelor (Kimberlin R.H. și Walker C.A., 1988, citați de 27) Datele de mai sus explică formarea PrPsc în organismul infectat cu prioni. Aceasta se poate întâmpla în cazul EST la animale și a unor forme de boală la om: Kuru și forma iatrogenă a BCJ. Formarea PrPsc în cazurile ereditare și în cele sporadice, cunsocută până în prezent doar la om, este explicată prin alte mecanisme. Cazurile de EST cu caracter ereditar pot fi explicate prin mutațiile cunoscute. Acestea sunt responsabile pentru codificarea unei PrPc care, prin modificările punctuale în secvența de aminoacizi, își pierde în mod spontan conformația
Virusologie generală
259
alfa-helix, fiind convertită în PrPsc cu conformație beta-plisată (45). O confirmare a ipotezei conversiei spontane a proteinei prionice în cazul mutațiilor menționate în tabelul 4, este oferită de șoarecii transgenici cu mutația Pro 120 Lcu, întâlnită în BGSS la om. Aceste animale fac o boală neurodegenerativă identică cu scrapia și produc “ de novo” prioni (Hsiao K et al. 1990, citați de 15). Rămâne de explicat mecanismul formării prionilor în BCJ sporadică ce reprezintă peste 85% din totalul cazurilor și o prevalență anuală de cca 1 x 10-6. În aceste forme nu s-au constatat mutații ale genei Prn-p. Proteina proteică normală PrPc conține două regiuni potențial convertibile în configurație beta-plisată. În mulțimea acestor molecule se găsesc entități cu o structură apropiată de pragul necesar conversiei structurii alfa- helicoidale în beta-plisată. În mod accidental, una din aceste molecule “traversează” acest prag, devenind PrPsc. Odată formată, molecula de PrPsc servește drept matriță pentru conversia posttranslațională a altor molecule de PrPc produse continuu de celule. Această conversie se produce spontan, printr-un proces stocastic sau este declanșată de o moleculă anorganică prezentă în celulă ( de ex. siliciu și aluminiu), ipoteză spirjinită de rezistența neobișnuită a prionilor la acțiunea temperaturii ridicate (11). Astfel, procesul de formare a PrPsc ar putea fi comparat cu cel al creșterii cristalelor în jurul unui nucleu de cristalizare sau cu polimerizarea, dar nu identică. Astfel de procese spontane se produc în populația umană cu o frecvență anuală de cca. 1 x 10-6, ceea ce corespunde cu prevalența BCJ sporadice. Transmisibilitatea EST și bariere de specie Încercările de transmitere experimentală a scrapiei și a altor EST la specii diferite de aceea de origine au relevat existența unei “bariere de specie”, experimentată fie prin lipsa totală de receptivitate, fie printr-o perioadă de incubație prelungită la primul pasaj pe noua gazdă, perioadă care în pasajele următoare se scurtează și se stabilizează (Dickinson A.G., 1976, Kimberlin R.H. et al, 1989, citați de 34). Revenirea la gazda de origine este, de asemenea, însoțită de o perioadă prelungită de
Virusologie generală
260
incubație la primul pasaj, sugerând “adaptarea “agentului patogen la noua gazdă (Kimberlin R.H., et al, 1987, citați de 34) În infecția experimentală a tuturor speciilor receptive, cea mai severă este calea intracerebrală, urmată, în ordine descrescătoare, de căile intraperitoneală, sucutanată și digestivă. În cazul infecției cu agentul scrapie la hamsteri, dozele necesare pentru infecțiile parenterale și digestive sunt de 105 și respectiv 109 ori mai mari decât doza pentru infecția intracerebrală (44) Posibilitatea transmiterii experimentale a agenților EST la alte specii decât aceea de origine a ridicat întrebarea dacă aceste boli pot fi transmise intersepecific în condiții naturale. Primul exemplu cunoscut este cel oferit de encefalopatia transmisibilă a nurcii (ETN), semnalată pentru prima dată într-o crescătorie din SUA (Hartsough G.R. și Burger D., 1965, citați de 34), iar ulterior în Canada, Finlanda, Germania, Rusia (34). Inițial s-a crezut că boala este consecința alimentației cu organe provenite de la oile cu scrapie. Totuși infecția experimentală a nurcilor nu a reușit pe cale digestivă când s-a folosit material patologic provenit de la cazuri de scrapie de origine americană. Infecția pe cale intracerebrală cu același material a reprodus boala numai după o perioadă de incubație de 11-24 luni. De asemenea, în focarul de ETN descris în Canada (Ontario) există certitudinea că nurcile îmbolnăvite nu au consumat carne sau deșeuri de abator rezultate de la ovine. (Hadlow W.J., Karstad L., 1968, citați de 34) Într-un focar de ETN din SUA, alături de crescătoria de nurci exista și o fermă de taurine cu frecvente cazuri de “sindrom al vacii culcate”. Carnea și organele acestora erau folosite ca hrană pentru nurcile care nu aveau nici un contact cu oile sau cu produse ale acestora. Inocularea intracerebrală a suspensiei din creierul nurcilor bolnave la doi tăurași, a reprodus la aceștia o encefalopatie spongiformă după o perioadă de incubație de 18-19 luni. Administrarea pe cale digestivă a creierului tăurașilor la nurci a reprodus boala după o incubație de doar 7 luni, sugerând că țesuturile bovinelor bolnave sunt puternic infectate pentru nurcă (Marsh R.F. și Hartsough G.R., 1985m 1988, citați de 34) Odată cu apariția ESB în Regatul Unit, s-au reluat experimentele de transmitere a tulpinii de origine bovină la
Virusologie generală
261
nurci. Boala a fost reprodusă la acestea după o perioadă de incubație de 15 luni, în cazul infecției pe cale digestivă sau de 12 luni după inocularea intracerebrală (Robinson M.M et al, 1994, citați de 34). Datele prezentate dovedesc că agentul ESB poate fi transmis la nurcă, traversând cu ușurință această barieră de specie. Problema a căpătat noi valențe după apariția ESB în anii 1985-1986. Demonstrându-se că sursa de infecție a bovinelor a fost făina de carne-oase din furajul combinat, s-a emis inițial ipoteza că boala este produsă de o tulpină de agent de scrapie ovină care a traversat bariera de specie. Datele acumulate ulterior nu confirmă această ipoteză și scot în evidență numeroase diferențe între agentul ESB și cel al scrapiei. Infecția experimentală cu izolatele de scrapie prezintă o mare diversitate sub raport morfoclinic, atât la oaie, cât și la animale de laborator. Această diversitate este reprezentată prin durata perioadei de incubație, tipul de localizarea leziunilor. Aceste diferențe se întâlnesc la cele cca. 15 tulpini europene de agent al scrapiei. Dimpotrivă, toate izolatele din cazurile de ESB din Europa, indiferent de țara de origine, se comportă identic în infecția experimentală a bovinelor sau a animalelor de laborator. Ele își păstrează proprietățile inițiale chiar și după trecerea la alte specii (3) În infecția experimentală a șoarecilor aparținând aceluiași genotip, cronologia evenimentelor patogenetice este diferită în cazul scrapiei de aceea observată după inocularea agentului ESB.(31) Încercările de a transmite pe cale digestivă agentul scrapiei la bovine nu au reușit până în prezent (3,4,38) Cele de mai sus pun sub semnul întrebării ipoteza că ESB este consecința traverării barierei de specie de către o tulpină de agent al scrapiei. Este mai plauzibilă ipoteza alternativă, că epizootia a fost declanșată de o tulpină de origine bovină apărută spontan și amplificată ulterior prin includerea făinii de carne-oase în furajarea aceleiași specii. (4,38) După cum se știe, apariția și extinderea bolii a fost favorizată și de unele modificări
Virusologie generală
262
în procesul de fabricație a acestui produs, modificări ce au diminuat efectul distructiv asupra prionilor (6,52). De asemenea, au apărut cazuri sporadice de EST la felinele sălbatice în captivitate: ghepard (Acinonyx jubatus), tigru (Panthera tigris), ocelot (Felis pardalis), puma (Felis concolor).(37) Începând din anul 1990, au fost semnalate cazuri de EST la pisici, înregistrându-se până în 1995, un număr de 80 de cazuri, majoritatea în Regatul Unit, câteva în alte țări europene (13,37). Cercetările retrospective au demonstrat că această nouă entitate morbidă, encefalopatia spongiformă a felinelor (ESF), nu a existat înăinte de anul 1986.(38) Tulpinile izolate de la pisici, nyla și kudu, inoculate la șoareci, au reprodus la aceștia leziuni identice cu cele induse de tulpina de ESB (Bruce M.E. et al., 1994, citați de 52; Fram et al., 1994, citați de 13) Începând din februarie 1994, s-au înregistrat în Regatul Unit și apoi în Franța cazuri de BCJ cu un tablou morfoclinic total diferit de cel cunoscut până atunci. Diferențele constau în vârsta medie a apariției bolii (29 ani față de 61 ani), tabloul clinic, aspectul electronoencefalogramei, taboul histopatologic și histochimic (14, 30, 51, 55). Aceste diferențe au determinat individualizarea acestei noi entități morbide ca “varianta BCJ” . Până în prezent s-au înregistrat în total 21 de cauzuri. Datele prezentate susțin ipoteza că agentul ESB este diferit de cel al scrapiei și are capacitatea de a traversa bariera de specie, trecând de la bovinele domestice (bos taurus) la alte specii ale aceleiași familii, la felide și probabil la om. Deși, până în prezent, nu există decât câteva dovezi circumstanțiale ale ipotezei că la originea v. BCJ este ESB, aceasta rămâne cea mai plauzibilă și, desigur, cea mai alarmantă, declanșând ceea ce mass-media a numit ‘criza vacii nebune” (2,17,38,50) Deși agentul ESB pare să aibă un spectru de gazdă mai larg decât alți agenți ai EST, bariera de specie se manifestă și în acest caz în diferite grade. Astfel, el poate fi transmis pe cale digestivă și pe cale intracerebrală la șoarece, oaie, capră, nurcă, pisică (7,19). Infecția porcului și a marmosetei (Callithrix jacchus, maimuța din America de Sud), reușește doar pe cale intracerebrală, în timp ce administrarea în hrană a unor doze
Virusologie generală
263
foarte mari, de material infectant rămâne fără efect (1,3,50). Hamsterul nu este receptiv nici pe cale intracerebrală (3,7) Bariera de specie se poate explica, prin caracterul relativ specific al prionilor produși de fiecare specie. Eficiența cu care un prion heterolog va induce trnsformarea PrPc a gazdei în PrPsc depinde de apropierea secvenței aminoacizilor PrP a celor două specii. Diferențele vor fi exprimate prin prelungirea perioadei de incubație în primele pasaje, prin receptivitatea doar la inocularea intracerebrală sau prin absența totală a receptivității. Astfel, nurca (Mustela vison) este receptivă la scrapie și la ESB, în timp ce ruda sa foarte apropiată, dihorul (Mustela putorius) nu este (Bartz J.C. et al., 1994, citați de 37) De asemenea, atrage atenția faptul că, dintre numeroasele specii carnivore ce au fost potențial expuse contactului cu țesuturile infectate cu agentul ESB, numai cinci nu au făcut EST. De exemplu, câinele a fost expus în măsură cel mai puțin egală cu pisica domestică, fără a se înregistra nici un caz de boală (37, 38) O explicație a acestor date ar putea fi oferită de compararea secvenței PrPc la diferite specii. Secvenționarea acesteia s-a realizat până în prezent doar la un număr limitat de specii. Rezultatele obținute demonstrează că gena Prn-p nu este un indicator fidel al înrudirii filogenetice a speciilor, în sensul că unele specii, apropiate după caracterele controlate de totalitatea genomului, pot prezenta diferențe remarcabile în ce privește gena Prn-p. Pe de altă parte, cu cât două specii sunt mai apropiate sub raportul acestei gene, cu atât mai ușor va fi traversată bariera de specie dintre ele. (38) Analiza unei dendograme privind secvențele proteinei PrPc la câteva specii, demonstrează apropierea genei Prn-p a nurcii (fam. Mustelidae) de genele diferiților reprezentanți ai familiei Bovidae: vaca domestică, oaia, capra, kudu (38). Pe de altă, aceeași dendogramă situează omul la fel de departe atât față de oaie, cât și față de bovine. Totuși, dacă există o certitudine că omul nu este receptiv la scrapie, nu se poate afirma același lucru și față de ESB. Encefalopatiile spongiforme transmisibile au deschis capitolul bolilor prionice, “o nouă frontieră în patologia infecțioasă” (50) Pentru prima dată se descoperă că modificarea structurii secundare a unei proteine normale a organismului o transformă
Virusologie generală
264
într-o formă patologică ce se comportă ca un agent infecțios, transmisibil la indivizi din aceeași specie sau din alte specii. Conversia proteinei prionice normale se poate produce fie sub acțiunea formei sale patologice pătrunsă în organism (infecția exogenă), fie ca urmare a unei mutații a genei prionice sau a unui proces stocastic în care o moleculă își schimbă spontan structura secundară, transformându-se în forma sa patologică. Ulterior ea devine o matriță pentru conversia în cascadă a altor molecule. Astfel, în majoritatea cazurilor cunoscute, bolile prionice poartă dubla amprentă de boli genetice și infecțioase. Studiul etiopatogenezei encefalopatiilor spongiforme transmisibile a deschis câteva noi domenii în cercetarea biomedicală. Unul din acestea este verificarea ipotezei conform căreia mecanisme moleculare similare celor întâlnite în bolile prionice ar putea fi implicate în etiopatogeneza încă neelucidată a altor boli, între care, pe primul loc, se situează boala Alzheimer, boala Parkinson și scleroza amiotrofică laterală (45). În fața unui tablou clinic al bolii, nu există din păcate altă alegere pentru a confirma presupusa ESB, decât să așteptăm moartea animalului. De fapt, agentul infecțios trebuie să fie destul de concentrat pentru a putea fi detectat și acestea nu se întâmplă decât atunci când creierul se găsește în stadiul terminal al bolii. Datorită faptului că nu se pot vizualiza protinele PrPsc, s-a recurs la două metode complementare pentru a le putea identifica. Observarea la microscop a țesutului cerebral. Depozitele de proteine PrPsc a prionilor ce determină EST, formeză plăci numite florale care au forma unor flori în care corola apare între leziuni. Marcarea cu ajutorul anticorpilor a proteinelor anormale PrPsc: chiar în țesuturi (teste imunohistochimice) sau în extracte de creier infecțios.
Virusologie generală
265
BIBLIOGRAFIE
1. ANGHELESCU S. șI col. – Actualități privind clasificarea și diagnosticul leucozei taurinelor. Revista de creșterea animalelor, 1976,26,nr.6.
2. BARLOW R.M. – Border disease or congenital tremor in lambs. The veterinary Annual, 1970, 11.
3. BARNA I. – Folosirea metodelor serologice în diagnosticul leucozei bovine. Sinteză în “Culegere de medicină veterinară:, 1978,3,p.23
4. BARNA I., PÂRVU GHE., IUGA C.- Leucozele și bolile de imunosupresie SIDA/AIDS like la animale. Ed. Ceres, București, 1995.
5. BÂRNAURE G. – Studiul biologiei virusului pestei porcine pe culturi celulare. București, Teză doct., Fac. Med.Vet., 1974, 168
6. BÂRNAURE G. – Aplicarea în practică a vaccinului viu antipestos porcin “Celvivac” preparat pe culturi de celule. Revista de creșterea animalelor, 1978, 28, nr.9, p. 55
7. BERBINSCHI C. – Metode de laborator privind diagnosticul bolii lui Aujeszky și de depistare a animalelor trecute prin infecția cu acest virus, Revista de Zootehnie și Medicină veterinară, 1970, 20,nr.8
8. BERBINSCHI C. și col. – Cu privire la evoluția gastroenteritei virotice la porcine. Revista de creșterea animalelor, 1977, 27, nr.4
9. BERBINSCHI C. și col. – Diagnosticul bolii Aleutine și mijloacele de asanare. Revista de creșterea animalelor, 1978, 28, nr,3
10. BERCEA I. și col. – Componența în aminoacizi a fracțiunilor proteice separate cromatografic din virusul bolii de Newcastle. Lucrări științifice IANB, seria C, Medicină veterinară, 1974.
11. BOWNR J.G. – Bluetongue Disease, Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 1971, 15.
12. BRAN L. și col. – Cercetări asupra valorii imunizante pentru porc a vaccinului contra bolii lui Aujeszky avianizat, atenuat, în comparație cu aceea a vaccinului saponinat, inactivat. Revista de Zootehnie și Medicină Veterinară, 1969, 19, nr.9.
13. BURNET F.M. – Principles of Animal Virology, 2-nd, New York and London, Academic Press, 1960, 490.
14. CAROL –DUMITRIU EMILIA – Studiul imunobiologic al tipurilor de virus variolic aviar. București, Teza de doctorat, Fac.Med.Vet., 1970, 459.
15. CAROL –DUMITRIU EMILIA și col. – Bursita infecțioasă (boala de Gumboro) la puii de carne. Revista de creșterea animalelor, 1978, 28.
16. CARP-CĂRARE M. și col. – Unele aspecte ale examenului electronomicroscopic în Difterovariola aviară. Sesiunea științifică de Medicină Veterinară, Iași, 1994.
17. CARP-CĂRARE M. – Microbiologie, Curs.Lito (pentru uzul studenților. Institutul Agronomic “Ion Ionescu de la Brad”Iași., 1991
18. CARP-CĂRARE M., GUGUIANU ELEONORA, DORINA TIMOFTE- Lucrări practice de Microbiologie Veterinară; U.A.M.V., uz intern, Iași, 1997.
Virusologie generală
266
19. CERNESCU C. – Virusologie medicală. Ed. Medicală., București, 1995. 20. CHELEMEN N.- Rolul jucat de diferitele specii animale în epidemiologia
gripei umane. Revista de Zootehnie și Medicină veterinară, 1970, 20, nr.5 21. COMAN I., - Relații fag-bacterie la grupul fagic CAM, București, Teză doct.,
Fac.Med.Vet., 1972 22. COMAN I. – Viroze respiratorii, digestive și genitale la taurine. București,
Centrul de material didactic și propagandă agricolă, 1978. 23. CURE C. – Difuziunea și persistența virusului bolii lui Aujeszky în
organismul animalelor infectate experimental. București, Teză de doctorat. Fac.Med.Vet., 1970.
24. DALTON A., HAGUENAU FRANCOISE – Ultrastructure of animal viruses and bacteriophages., New York and London, Academic Press, 1971
25. DEREVICI ADELINA – Adenovirusuri, adenoviroze. București, Litera, 1971, 260
26. DRAGANESCU N. – Arbovirusuri, București, Acad.RSR, 1970, 418 27. DRĂGHICI D. STĂNUICĂ D. – Epizootologia, diagnosticul și combaterea
gastroenteritei transmisibile a porcului. Revista de creșterea animalelor, 1976, 26, nr.8
28. DUNNE H.W. – Hog Cholera (European Swine Fever), Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 1973, 17,
29. FENNER F. și col. – The biology of animal viruses, New York, London, Academic Press, 1974
30. FENNER F. și col. – Classification and nomenclature of viruses, Second report of the International Committee of Taxonomy of viruses, Intervirology, 1976, nr.7
31. GILLESPIE J.H., SCOTT F.W. – Feline viral infections Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 1973, 17
32. GRĂDINARU D.A. și col. – Cu privire la diagnosticul serologic al leucozei enzootice bovine (LEB). Revista de cresterea animalelor, 1977
33. HANNOUN C. – Microbiologie generale – 2-les, Paris, Ediscience, Mc Fraw Hill, 1976.
34. HORZINEK M.C. – Compendium der allgemeinen Virulogie, Berlin und Hamburg, Verlag Paul Parey, 1975
35. IFTIMOVICI R. – Pasul antientropic.Contemporanul, 26 mai 1975 36. ISAACS A. – Interferon, Advances Virus Res., 1963 37. ISHII S., ISHITANI R. – Equine infectious anemia. Advances in Veterinary
Science and Comparative medicine, 1975 38. ISTRATE N. și col. – Utilizarea testului de microimunodifuzie în gel de agar
pentru diagnosticul anemiei infecțioase ecvine (AIE). Revista de creșterea animalelor, 1978
39. ISTRATE N. și col. – Diagnosticul serologic al infecțiilor cu virusul rinotraheitei și vulvovaginitei pustulare infecțioase bovine (IBR-IPV) prin testul de microimunodifuzie în gel de agar modificat (MIDM). Revista de creșterea animalelor, 1979,29
40. JARRETT W.F.H. – Cat leukemia and its viruses Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine ,1975 ,19 ,p. 165
42. KAPLAN A. – The Adenoviruses, New York, San Francisco, London, Academic Press, 1973,
43. KOOPMANS M., CREMERS H., WOODE G., HORZINEK M.C.; Bredavinuvirus (Toroviridae) infection and systemic antibody response in sertinel calves: American J.Vet.Vol. 5;9/1990, pag.1443.
44. LAUTIE R. – La Maladie d’Aujeszky. L’Expansion editeur, 1969 45. LAURIA S.E., DARNELL J.E. JR. – General Virology. New York, London,
Sydney, Jon Wiley and Sons, Inc., 1968 46. LWOFF A. – Lysogeny. Bact. Rev., 1853, 17 47. LWOFF A. – The Concept of Virus, J. of Gen.,, Microbiology, 1957, 17 48. LWOFF A. – Death and Transfiguration of a Problem, Bact. Rev., 1869, 33,
nr.3 49. MANOLESCU N. și col. – Metodă rapidă de diagnostic în pesta porcină
(studiul medulogramei ). Revista de creșterea animalelor, 1975, 25, nr.7 50. MANOLESCU N. și col.- The leukoconcentrate in classical hog cholera and
its aspects in cell cultures, Rev. Roum, Virol, 1975, 26, 1 51. MANOLESCU N. și col.- Tehnica leucoconcentratului în diagnosticul rapid
al anemiei infecțioase a cabalinelor. Revista de creșterea animalelor, 1976, 26, nr.11.
52. MANOLESCU N. și col. – Electronoptical aspects of the equine infectious anemia (EIA) virus in lymphocyte cultures. Archiva Veterinaria, 1978, 13.
53. MARDARI A. – Contribuții la studiul epizootologic, clinic și de laborator al gripei ecvine. Iași, Teză de doctorat, IMF, 1975,
54. MAYR A. – Interferonsierung: Eine neue Moglichkeit fur die prophylaxe und Therapie von Infektionskrankheiten, Berl, Munch, Tier, Wschr, 1974, 87
55. MAYR A și col. – Virologische Arbeitsmethoden. Bd.I. Zelkulturen Bebrutate Huhnereiree.Jena, G. Fischer, 1974
56. MĂRGINEANU C. – Curs de virusologie. Cluj Lito IMF., 1972 57. MICLEA E. și col. – Leucozele animalelor domestice. București, Ed. Ceres,
1978, 58. MOHD NOR N.M., GAN C.H., ONG B.L. – Infecția cu virusul Nipah la porci în
Malaezia peninsulară”, Rev. Sci. tehn. Off.Int. Epiz., 2000, 19 (1), 160-165. 59. MURRAY P, KOBAYASHI G., PLAFFER M.; ROSENTHAL K. – Medical
Microbiology, Second Edition International Student Edition published, 1994, London, England
60. ONEȚ E. – Studiul actual al cunoștințelor privind complexul leucozelor aviare. Sinteză in “Culegere de medicină veterinară”, 1978, 3
61. ONEȚ E. – Virusuri și viroze animale, Ed. Dacia, Cluj Napoca, 1982. 62. PA{CA DOINA – Cercetări privind etiopatogenia și imunopatologia
sarcomului Sticker. București, Teză de doctorat, 1971. 63. PAUL I. – Etimorfopatologie veterinară. Ed. ALL, București, 1996 64. PĂLTINEANU D. și col. – Aplicarea testului de imunofluorescență în
diagnosticul leucozei enzootice bovine (LEB). Revista de creșterea animalelor, 1978.
65. PĂTRA{CU I. – Cercetări privind diagnosticul serologic al leucozei limfoide aviare (complexul leucozelor aviare), București, Teză de doctorat. Fac.Med.Vet., 1978
Virusologie generală
268
66. PERIANU T., - Bolile infecțioase ale animalelor; Viroze, Vol.II. Ed. Fundația “Chemarea”, Iași, 1997.
67. PETZOLDT K. – Equine Herpesvirusinfektionen, Jena, G. Fischer,1974 68. PÎRVU G și col. – Concentratul leucocitar – metodă suplimentară în
diagnosticul hemopatiilor în general și al leucozelor în special. Revista de creșterea animalelor., 1978.
69. PÎRVU G și col. – Microprecipitarea în gel de agar în diagnosticul leucozei enzootice bovine. Revista de creșterea animalelor, 1979, 29
70. POP M. – Studiul epizootologic, clinic, anatomopatologic asupra febrei catarale maligne în R.S.Romania și cercetări privind terapia acestei boli. București, teză de doctorat, Fac.Med.Vet.1972
71. POPA M., CHI{IU N.St – Test de imunoelectroprecipitare cantitativă aplicat în diagnosticul pestei porcine. Revista de Zootehnie și Medicină Veterinară, 1971, 21, nr.7
72. POPA M., CHI{IU N.St.- Appreciation de la concentration relative d’un antigene du complexe moleculare du serum sanguin de porc par l'’mmuni-osmophorese quantitative. Archiva veterinaria, 1971
73. POPA M., MANOLESCU N. – Rolul măduvei hematoformatorii în etiopatogenia pestei porcine clasice. Revista de creșterea animalelor, 1975, 25
74. POPA M și col. – Diagnostic rapid în pesta porcină clasică prin imunofluorescență pe frotiu de concentrat leucocitar (LCT). Revista de creșterea animalelor, 1979. 29
75. POPOVICI V. – Mecanisme moleculare în etiopatogeneza encefalopatiilor spongiforme transmisibile SCMV, INMV “Pasteur”, 1997, p.7-20
76. POPOVICIU A. – Bolile porcilor cu sindrom vezicular. Sinteză In “Culegere de medicină veterinară”, 1977,2
77. PURCHASE H.G. – Metode de diagnostic al bursitei infecțioase aviare. Revista de creșterea animalelor, 1978.
78. RADU O și col. – Metode de diagnostic al bursitei infecțioase aviare. Revista de creșterea animalelor, 1978, 28.
79. RAICU P., STOIAN VERONICA – “Gene și cromozomi”, Ed. {tiințifică și Enciclopedică, 1989.
80. RĂDUCĂNESCU H., - Microbiologie veterinară, Institutul Agronomic “N.Bălcescu”-București, FMV, Curs Lito- pentru uzul studenților., vol. 1 și 2, 1984
81. RĂDUCĂNESCU H. – Microbiologie veterinară. Lito, (uzul studenților), vol.2, Institutul Agronomic “N.Bălcescu”, București, 1980.
82. ROHRER H. – Handbuch der Virusinfecktionen bei Tieren, Jena, VEG Gustav Verlag, 1865, 5 volume.
83. STARKE G., HLINAK P. – Grundriss der Algemeinen Virologie, 2 Aufl, Jena, G. Fischer, 1974
84. SERBAN O. – Cercetări privind proprietățile imunogene ale virusului rabic fix, București, Teză de doctorat, Fac.Med.Vet., 1975
85. STIRBU C și col. – Obținerea unei culturi de celule stabilizate de origine bovină infectată cronic cu VLB (virusul leucozei bovine). Revista de creșterea animalelor, 1978, 28
Virusologie generală
269
86. STIUBE P. – Morfologia și biologia fagilor CAM psicrofili, București, Teză de doctorat, Fac.Med.Vet, 1969
87. TEU{DEA V. – Febra aftoasă. Studiu monografic, București, Ed.Academiei, RPR, 1960
88. TOMESCU VENERA – Etude sur le probleme de l’interferon. Premiere communication: Le virus d’Aujeszky en tant qu”inducteur et inducteur de l’interferon. La Clinica Veterinaria, 1971, 94
89. TIBREA S. – Cercetări privind valoarea diferitelor metode de hiperimunizare în pesta porcină. București, Teză de doctorat. Fac.Med.Vet.
90. VIOR C și col. – Folosirea testului de seroprecipitare în gel de agar în diagnosticul bronșitei infecțioase aviare. Revista de Zootehnie și Medicină Veterinară, 1971.
91. VIOR C. și col. – Aplicarea vaccinărilor asociate în profilaxia pestei porcine și rujetului. Revista de creșterea animalelor, 1976.
92. WANDERA J.G. – Sheep Pulmonary Adenomatosis (Jaagsiekte). Advances in Veterinary Science and Comparative medicine, 1971, 15
93. WESTBURDY H.A. – “Boala produsă de virusul Hendra la cabaline”, Rev. Sci. tehn. Off.Int. Epiz., 2000, 19 (1), 151-159.
94. ZARNEA G. – Tratat de Microbiologie generala. Vol.I, “Virologie generală, Anatomie bacteriană”. Ed. Academiei, RSR, 1983
transmisson of BSE and scrapie to the common marmoset. Vet. Rec. April, 17, 403.
2. BARALON PH., GARY F., 1996 – Filiere bovine: consequences economigues de la “crise de vache folle” sur la filiere bovine. La Point veterinaire, 28, 179, 9
3. BARON T., MADEC J.Y., 1996 L’agent infectieux des encephalopathies spongiformes et sa transmissibilite. Le Point veterinaire, 28, 179, 9.
4. BELLI P., COUDERT M., 1996 Encephalopathie spongiforme bovine: ESB ou maladie “ de la vache folle”. Sci. Vet,.med. Comp, 98, 5
5. BEY REUTHER K. MASTERS C.L., 1994 Catching the culprit prion nature 370, 11 aug. 419
6. BRADLEY R., 1997. Aetiology, pathologenesis and surveillance of BSE. Argentine Sci. Adv. Common BSE ( 1 st meeting), Buenos Aires, p.15
7. BRADLEY R., 1997. Species barrier, transmizzibility and inactivation of BSE. Argentine Sci Adv. Common BSE ( 1 st meeting), Buenos Aires, p.33
8. BROWN P., 1990 The Phantassmagoric Immunology of Transmissible Spongiform Enceephalopathy. In “Immunologic Mechanisms in neurologic and Psychiatric Disease” ed. B.H. Waksman Raven Press, Ltd. NY.
9. BROWN P., 1990. Review. A therapeutic panorama of the spongiform encephalopathies Antiviral Chemistry & Chemotherapy 1(2), 75
Virusologie generală
270
10. BROWN P., 1990 Transmissble Spongiform Encephalopathy in Humans: Kuru, Creutzfeld-Jacob Disease and gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Can,J,Vet,Res. 54, 38
11. BROWN P., 1990., LIBERSKI P.P, WOLFF A., GAJDUSEK D.C., 1990. Resistance of Scrapie Infectivitu to Steam Autoclaving after Formaldehyde Fixation and Limited Survival after Ashig at 3600C. Practical and Theoretical Implications. J. Infect.Dis, 161, 467
12. BROWN P., GOLDFARB L..G., GAJDUSEK D.C., 1991. The new biology of spongiform encephalopathy: infectious amyloides with a genetic twist. The Lancet, 337, Aoril, 27, p.1019
13. CADORE J.L., 1996 L’encefalopathie spongiforme du chat. Le point vet. 28 178, 49.
14. CHAZOT G,M, BROUSSOLLE E., LAPRAS CL., BLATTLER T., ADUZZI A., KOPP N., 1996 new variant of Creutzfeld –Jacob disease in a 260year-old French man. The Lancet, 347 (April 27), 1181
15. COHLEN F.E., PAN K.M. HUANG Z., BALDWIN M., FLETTRICK R.J., PRUSINER S.B., 1994. Structural Clues to Prion Replication Science , 264, 22 april, 530.
16. COLLINGE J., 1996, new diagnostic tests for Prion Deseases. The New England Journal of medicine, 335, 11, 963
17. DORMONT D., SAVEY M., 1996, Encephalopathies sponfigormes transmissible et pathologie comparee. Le Point Veterinaire, 28, 179, 1
18. ELSSEN J.M., NUTIEN KHANG J., CLOUSCARD C., 1996 Sensibilite genetique aux encephalopathies spongiformes subygues transmissible. Le Point Vet, 28, 179, 27
19. FOSTER J.D., HOPE J., FRASER H., 1993. Sensibilite genetique aux encephalopathy to sheep and goats. Vet.Rec. October, 2,339
20. FOSTER J.D., WILSON M., HUNTER N., 1996 Immunolocalisation of the prion protein (PrP) in the brains of sheep with scrapie. Vet.Rec. November, 23, 512.
21. GAJDUSEK D.C., 1987. The transmissible Dementia and Other Brain Disorfers Caused by Unconventional Viruses. Relationship of transmissible to Nontransmissible Amyloidosis of the Brain. In”Viruses, Immunity an Mental Disorders” Plenum Publishing NY, p.3
22. GAJDUSEK D.C., GIBBS C.J., 1990. BRAIN A Amyloidoses. Precursor proteins andf the Amyloids of Transmissible and Nontransmissible Dementias. Biomedical Advances in Aging *(ed. Allan Goldstein) Plenum Publishing Corp, p.3
23. GIBBS C.J., 1997 Sporadic familial and new variant Creutzfeld-Jackob disease. Argentine Sci.Adv.Comm on BES, Buenos Aires, p.57.
24. GOLDFARB L.G. BROWN P., GOLDGABER D., ASHER D.M., GAJDUSEK D.C., 1990. PRIP gene mutations in transmissible spongiform encephalopathies, VIII th International Congress off Virusology-Berlin August, 26031
25. HUNTER N., GOLMANN W., FOSTER J.D., CAIRNS D., SMITH G., 1997 Natural Scrapie and PrP genotype; case control studies in british sheep. The Vet. Rec. Aug.9.137
Virusologie generală
271
26. KIMBERLIN R.H., 1984 Scrapie: the disease and the infections agent. Trend in Neurosciences, 7,1, 312
27. KIMBERLIN R.H., 1990 Tranmissible Encephathies in animals. Can J.vet. Res, 54, 30
28. KIMBERLIN R.H., 1992. Spongiform encephalophathies in animals. OIE. 60th general Session Comprehensive reports on technical items presented to the International Committee ir to Regional Commissions, p.27
29. KIRKWOD J.K., CUNNINGHAM A.A., WELLS G.A.H., WILESMITH J.W., BARNET J.E.F., 1993 Spongiform encephalopa in a herd of greater Kudu ( Tragelapbus strepsiceros): epidemiological observation. Vet.Rec. October, 9,.360
30. KOPP N., STREICHENBERGER N., 1996 La nouvelle variante de la maladie Creutzgeld0Jacobs. Le Point veterinaire, 18, 179, 43
31. LASMEZAS C.I., DESLYS J.P., DEMAIMAY R., ANJOU K.T.M, HAUW JJ, DORMONT D., 1996 Strain specific and common pathogenic events in murine models of scrapie and bovine spongiform encephalopathy. J.gen Cvirol, 77, 1601.
32. LASMEZAS C.I., DESLYS J.P., DEMAIMAY R., ANJOU K.T.M, HAUW JJ, DORMONT D., 1996 BSE tranbsmisssion to macaques . nature, 381, 27 June 743
33. MARSH R.F., 1990 Bovine spongiform encephalopathy in the United States JAVMA, 196, 10, 1677
36. NERTZ P.A. SOMMERVILLE R.A., MANUELIDIS I., MANUELIDIS E.E., 1984 Scrapie associated fibrils in Creutzfeldt-Jacob disease. Nature. 306, 474
37. MOUTOU F., SAVEY M., 1996 Zoologie et encephalopathies spongiformes subagues transmissibles. Le Point vet, 28, 179, 17
38. PASTORET P.P., HAMERS C., BROCHIER B., 1997. Le transmissibilite interspecifique des encephalopathies spongiformes. Ann. Med.Vet, 141, 5
39. PATTISON I.H., 1988 Fifty years with scrapie: A protein released by plates. The Labcetm 347m 9015m 1635
40. PERRINI F., FRANGIONE B, 1996 Prion protein released by plateles. The lancest, 347, 9015, 1635
41. PICARDO P. SEILER C., DLOUHY S.R., YOUNG K. FARLOW M.R., PRELLI F., FRANGIONE B., TAGLIAVINI F., GHETTI B., 1997 Straussler-Scheinker Disease, Argentinbe Sci Adv Comm on BSE ( 1st meeting), Buenos Aires, p.77
42. PRIOLA S.A., CAUGHEY B., WEHRLY K., CHESEBRO B., 1995 A 60-kDa prion protein (PrP) with proprerties of Both the Normal and Scrapie-associated Forms of PrP. J.Biol.Chemistry, 270, 3299
43. PRUSINER S., 1984 Les prions. Pour la Science, 86, 92. 44. PRUSINER S.,TORCHIA MM., WESTAWAY D., 1991 Molecular biology and
genetics of prion- replications for sheep scrapie. “Mad cow” and the BSE epidemic. Cornell vet. 81, 2, 85
Virusologie generală
272
45. PRUSINER S.B., TELLING G., COHEN E.F., DERAMOND S.J., 1996 – prion disease of humans and animals. Seminars in VIROLOGY, 7, 159
46. SAFAR J., WANG W., PADGETT M.P., CERONI M., PICARDO P., ZOPF D., 1990 Molecular mass, biochemical composition and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Procv Natl. Acad. Sci, USA, 87, 6373
47. SAFAR J., CERONI M. PICCARDO P., 1990 Scrapie associated precursor proteins: antigenic relationnship between species and immunocytochemical localization in normal, scrapie and Creutzfeldt0Jacobs disease brain, Neurology, 40, 513
48. SAFAR J., CERONI M. PICCARDO P.,LIBERSKI P.P. MIYAZAKI M., GAJDUSEK D.C., GIBBS C.J. 1990 Subcelulklar distribution and physicochemical propertiers of scrapie-associated pșrecursor protein and relationship with scrapie agent. Neurology, 40, 3, 503
49. SAFAR J. CERONI M. ,GAJDUSEK D.C., GIBBS C.J. 1991 Differences in the Membrane Interaction of Scrapie Amyloid proteins in Normal and Scrapie- or Creutzfeldt-Jacob Disease-Infected Brains J.Infect Dis., 163, 488
50. SAVEY M., 1996 Une nouvelle frontiere de la pathologie infectieuse. Le Point veterinaire, 28, 177
51. TABRIZZI S.J., SCARAVILLI F., HAWARD RE.S., COPLLINBGE J., ROSOR M.N., 1996 Creutsfeld-Jacob disease in a young woman. The Lancet, 347, (April 6,)945
52. TAYLOR D.M., WOODGATE S.L., 1997 Bovine spongiform encephalopathy the causal role of ruminant-derived protein in cattle diets. Rev.Sci. Off.int.Epiz.16, 1,187
53. WEISSMANN CH,. 1994 The Prion Connection: Now in Yeast? Science, 264, 22 Apr.528
54. WELLS G., DAWSON M., HAWKINS S., GREEN R., DEXTER UI., FRANCIS M., SIMMONS M., AUSTIN A., HORING M., 1994 Infectivity in the ileum of cattle orally with bovine spongiforme encephalopathy. Vet.Rec.135, 40
55. WILL R.G., IRONSIDE J.W., ZEIDLER M., COUSENS S.N., ESTIBEIRO K., ALPEROVITEH A., POSER S., POCCHIARI M., HORFMAN A., SMITH P.G., 1996 A new variant of Creutzfeldt-Jacob disease in the UK. The Lancet, 347 (April 6), 921
56. WILLS P.R., 1989 Induced frameshiftying mechanism of replication for information-carrying scrapie prion. Microbial Pathogenesis 6, 235.
