VIRUSURI

agenti care infecteaza bacterii,

plante, animale, oameni

DEFINITIE:

Caractere: dimensiuni foarte mici (nm) structura simpla parazitism dezvoltat (multiplicare doar in celule

vii) unitatea morfofunctionala infectioasa = virion

(corpuscul elementar)

IMPORTANTA:

determina boli aparente (sindroame definite) si/sau inaparente la om si animale

ORIGINEA VIRUSURILOR

gene celulare cu evolutie independenta celule degenerate sau involuate evolutie directa din celulele vii

primordiale cu proprietati autoreplicative

EVOLUTIA VIRUSURILOR

Virusuri ARN

prima molecula vie a fost un ARN auto catalitic cu dubla actiune: codificare si enzimatica

formele existente provin din ARN-ul primordial sau din interactiuni genetice intre virusurile ARN

Mecanisme: mutatii: defecte de transcriere cu rata mare si cu evolutie genetica

rapida; pot fi punctiforme (virusul gripal = drift antigenic) sau mari (blocuri de gene) care determina genotipuri noi

recombinarea (reorganizarea genetica): copiere alternativa cu rata mare intre virusuri omologe (virusul polio intreserotipuri) si neomologe (virusul hepatitei soarecelui/sens pozitiv si virusul gripal/sens negativ)

reasortarea: doar la virusurile cu genom segmentat prin schimburi de gene intre tulpini circulante animale si umane. Ex. virusurile gripale printr-o infectie mixta a virusurilor animale (aviare, porcine) cu vrusurile umane detetrmina aparitia de tulpini noi cu potential pandemic.

Virusuri ADN

evolutiv sunt superioare fata de v. ARN: transcriptia se face cu

sisteme celulare, sinteza ADN viral este concomitenta cu replicarea celulei parazitate, au enzime care stimuleaza sinteza de dezoxinucleotide, fac schimb de gene cu structuri celulare

provin din repliconi mobili: plasmide, transpozoni, retrotranspozoni

Mecanisme:- mutatii: rata mai mica, unele apar la presori de selectie (antivirale)

- recombinarea: acapararea de gene noi de la alte virusuri sau gene

celulare ( inclusiv de la plasmide sau epizomi)

EFECTELE EVOLUTIEI

Emergenta = aparitia de specii noi Reemergenta = reaparitia unor specii cunoscute cu

circulatie discontinua

Mecanisme: mutatii cu acumulare lenta (drift antigenic) recombinarile/reasortarile (shift antigenic)

FACTORI FAVORIZANTI:

depasirea barierei de specie (HIV) modificarea comportamentului gazda umana

(prostitutie/libertinaj – HIV, VHB, virusuri herpetice si cresterea consumului droguri)

demografici: crestere populatii, deplasari rural-urban cresterea circulatiei mondiale de persoane si marfuri modificari ecologice: defrisari, irigatii, baraje, urbanizare industrializare si tehnologie moderna: producere hrana la

nivel industrial, transplant de organe, transfuzii, tratamente imunosupresoare, antivirale si antobiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILOR

(Comitetul International de Taxonomie Virala)

CRITERII:1. caracteristici virion: dimensiuni, forma, structura, +/- invelis, forma, simetrie

2. genom: tip (AND sau ARN), nr. catene, forma catene (liniara sau circulara), sens

catene (+ sau -), nr. segmente, dimensiune

3. mod multiplicare: transcriere, translatie, loc ansamblare/maturare

4. proteinele virale: nr., structura (secvente a.a), functii (transcriptaze,

reverstranscriptaze, hemaglutinine, neuraminidaze, factori de fuziune)

5. comportament la agentii fizici (temperaturi, radiatii) si chimici (ioni, solventi,

detergenti)

6. proprietati biologice: spectru de gazda (bacterii, plante, animale), mod transmitere

7. patogenitate/tropism tisular: neurotropism (virusul rabic, virusuri encefalitice);

v.dermatotrope (poxvirusuri); respiratorii (virusul gripal, virusuri paragripale);

limfotrope (HTLV I si II); hepatitice (HVB, HCV); enterotrope (enterovirusurile)

8. distributie geografica (virusul encefalitei japoneze, virusul encefalitei West-Nile)

ORDINE :

Caracter definitoriu:

inrudire filogenetica intre familii

MONONEGAVIRALES cu FAMILIILE:

Bornaviridae Paramyxoviridae Filoviridae

Caractere: infecteaza animale (vertebrate si nevertrebate) si plante genom: ARN (liniar, monocatenar, sens -, secventa

similara a genelor) polimeraza ARN dependenta de ARN maturare prin inmugurire

NIDOVIRALES cu FAMILIILE:

Coronaviridae Arteriviridae

Caractere: infecteaza mamiferele genom: ARN (liniar, monocatenar, sens +) cu

functie de ARNm

CAUDOVIRALES cu FAMILIILE:

Myoviridae

Siphaviridae

Podaviridae

Caractere: infecteaza Bacteria (bacteriofagi) si Archea

FAMILIA

Caractere definitorii: cuprind virusuri cu caractere comune

(morfologie virion, organizare genomica) origine comuna a virusurilor pot exista si subfamilii, denumire + virinae

(Alphherpesvirinae)

GENUL

Caractere:

grup de specii dintr-o familie cu

proprietati comune distincte denumire = virus (Morbillivirus)

SPECIE

Caractere:

grup de tulpini care poseda anumite gene

denumire: virus Ebola

NUMAR VIRUSURI CUNOSCUTE/CLASIFICATE

4.000 specii cu

30.000 tipuri si subtipuri

VIRION

MORFOLOGIE vizualizarea se doar la microscopul electronic (transmisie, baleiaj

scanare) modul de studiu: 1. direct din produse patologice: pustule (v. vaccinia, v. variolic); vezicule

(v. varicela/zoster, v. herpetic); fecale (rotavirusuri)2. din tesuturi si celule infectate (bolnav, culturi celulare, oua embrionate,

animal)3. suspensii virale obtinute prin: cultivarea pe substrat sensibil (culturi

celulare, oua embrionate, animale), eliberare virus (inghet-dezghet, ultrasonare, mecanic, detergenti), suspensionare (solutii saline), centrifugare (3000 g)

4. purificare virus: ultracentrifugare (150.000 g), cromatografie, ultrafiltrare 5. concentrare: deshidratare, precipitare, ultrafiltrare (moleculara)6. examinarea propriu-zisa: coloratie negativa, imunoelectromicroscopie

criomicroscopie, difractia cu raze x, sectiuni celulare ultrafine

MARIMEA VIRUSURILOR

Sunt mai mici decat bacteriile (100-1000 ori), cu dimensiuni care variaza intre 18-30 nm (parvoviridae, picornaviridae), 450 nm (poxviridae), 900 nm (forme filamentoase,

dar cu diametru mic 80 nm - filoviridae).

FORMA sferica: virus cu invelis (virusuri gripale, virusuri

paragripale, virusuri herpetice), virusuri fara invelis (virusul polio, adenovirus)

cilindrica (rigida/flexibila): virusul mozaicului tutunului, fagi

paralelipidica: virusul variolic, virusul vaccinia cartus: virusul rabic filamentoasa: virusul Ebola sferica cu prelungire (coada): b. fagi

STRUCTURA VIRION

genom capsida +/- înveliş viral

Genom 1. tip acid nucleic: ADN sau ARN (majoritar)2. marime: dependenta de masa mol (daltoni ) si nr. nucleotide (kilobaza)

g. mol = 1,5 x10 6 daltoni (parvovirusuri); 150x106 (poxvirusuri) nr. nucleotide: 5-7kb (papovavirusuri); 231 kbp (herpesvirusuri) nr. gene: virusul gripal = 12, HIV = 9, v. vaccinia = 240 nr. proteine codificate: v. vaccinia = 250, virusul herpetic = 200, picornavirusul = 4

3. structura: v. ADN: monocatenare liniare (parvov.); monocatenar circular (fagX174); dublucatenare

liniare (adenovirusuri, virusuri herpetice); dublucatenare inchise extremitati (v.vaccinia); dublucat. circulare cu extremit monocat. (hepadnav.); dublucatenare circulare (v. polyoma)

v. ARN: monocatenar liniar (picornav, v.hepatitei A); monocatenar diploid /2 mol legate (retrov.). Unele v. ARN pot avea genom fragmentat care permite reasortarea: monocatenar liniar cu 8 segmente (orthomyxov.), monocatenar cu 2 segmente (arenav.), monocatenar cu 3 structuri circulare (bunyav.), dublucat cu 10-20 segmente (reovirusuri)

4. functii: depozitar al informatiei genetice determina infectivitatea virala (scade la izolarea acidului nucleic) autoreplicarea cu exceptia ARN viral moncat. cu sens negativ (orthomyxov.)

Capsida virala complexe proteice cu arhitectura si structura specifica care invelesc

acidul nucleic unitatile morfologice = capsomere asezate ordonat pe axe de simetrie Tipuri de simetrie: cubica – icosaedrica (virioni sferici): v. ADN (parvov. = 32 capsomere;

herpesv. = 162 capsomere; adenov. = 252 capsomere), v. ARN (picornav., calciv. = 32 capsomere)

helicoidala (tubulara): v. ARN cu sens negativ (proteinele formeaza un complex nucleocapsida/ribonucleoprot.; disocierea = pierderea infectivitatii la orthomyxov. si paramyxov.)

binara (icosaedrica, helicoidala): bacteriofagi (cap = icosaedru; coada = helicoidala)

Functii: protectie ac.nucleic atasare celula (virus fara invelis)

INVELISUL VIRAL

unele virusuri (ADN, ARN) prezinta un invelis (anvelopa sau peplos)

invelisul provine din: membrana celulara (ortomyxovirusuri, paramyxovirusuri, filovirusuri, retrovirusuri) sau m. nucleara (herpesvirusuri)

Structura:

1. derivata de la celula infectata:

• port. membrana celulara = strat bilipidic (fosfolipide, colesterol, glicolipide) in care sunt inserate proteinele virale

2. codificata de virus:

a.spiculi (peplomere):

glicoproteine (ancorate in invelis) cu trei portiuni: externa (glicozilata), medie (polipeptide), interna (peptide)

hemaglutinine (glicoproteine trimerice): se gasesc la majoritatea virusurilor cu invelis (orthomyxov., paramyxov., togav., coronav., rhabdov., flavir., bunyav.); au aspect de bastonas (microscopie eelectronica); functii = hemaglutinare/hemadsorbtie , atasare virus la receptori, induc raspuns imun.

neuraminidaze (glicoproteine tetramerice): la paramyxov. si orthomyxov.; functie = scindeaza acidul sialic din membrana celulara permitind penetrarea si eliberarea virusului

factori de fuziune: prezenti la paramyxov. in forma inactiva (FO) care prin proteoliza (proteaze cel.) se desfac in F1si F2 (forme active); functii = favorizeaza penetrarea virusului (fuzioneaza cu membrana celulara), fuziunea membranelor celulare cu formare de sincitii, hemoliza, difuziunea infectiei.

b. proteina M (matrix):

prezenta la majoritatea virusurilor cu anvelopa captuseste fata interna a stratului bilipidic are doua forme in celule: M1 si M2 functii: mentine integritatea anvelopei,

intervine in ansamblare - inmugurire prin legare de glicoproteine si nucleocapsida, favorizeaza transportul ionilor de H.

Functii invelis:

protectia nucleocapsidei atasare la receptori celulari ansamblare virion prin proteina Mdetermina activitati ca:

hemaglutinare, hemadsortie, hemoliza, fuziune

ENZIME VIRALE 1. ale invelisului2. nestructurale, legate de nucleocapsida cu rol in replicarea

genomului si sinteza de proteine virale: transcriptaze: ARN polimeraze dependente de ARN (v.

monocat. cu sens -: paramyxov., rhabdov., orthomyxov.; v.dublucat.; reov.)

ARN polimeraze dependente de ADN (poxv., herpesv.) reverstranscriptaze (retrov. si hepdnav.) cu functii de: ADN

polimeraza dependenta de ARN, ADN polimeraza dependenta de ADN, integreaza (retrovirusuri – integreaza ADN viral in ADN celular)

endonucleaze: cliveaza catenele acidul nucleic (v. gripal, pox. v.); integreaza genom viral oncogen in ADN celular (SV40, adenovirus)

AGENTI SUBVIRALI INFECTIOSI

virusuri incomplete, virusuri nefunctionale, acizi nucleici = formatiuni independente neviabile inafara celulei

replicarea depinde de celula gazda cu exceptia prionilor (autoreplicare)

pot determina boli la om si animale

Virusuri defective

virusuri cu genom incomplet care se replica prin coinfectie cu alt virus (helper)

pot determina infectii persistente (panencefalita scerozantasubacuta)

apar prin:odefecte de transcriere care duc la mutatii (v. ARN)

omultiplicare in celule nepermisive: infectii persistente mai ales la SNC (v. rujeolos, rubeolos, urlian)

Virusuri satelite

virusuri ADN cu genom mic,

monocatenar (sens +/-): replicare

in prezenta adenovirusurilor si

herpesvirusurilor

ViroiziARN monocatenar circular cu aspect de

bastonas; replicare dependenta de celula gazda

determina boli la plante de cultura, dar au asemanari cu infectia data de VHD la om (difera prin rolul de helper a VHB)

Prioni

agentii infectiosi de natura proteica care determina la om si animale boli ale SNC (om: Kuru, boala Creutzfeld –Jacob; animal: encefalita spongiforma bovina, etc.)

ACTIUNEAAGENTILOR FIZICI, CHIMICI si BIOLOGICI asupra VIRUSURILOR

Mod de actiune: distrugere/inactivare: atenuare, sterilizare conservare: transport produse patologice, pastrare laborator, mentinere

vaccinuri cu virusuri vii modificare: atenuarea patogenitatiiEfectele depind de: natura agentului, concentratie, timp de actiune tipul de virus: cele fara anvelopa mai rezistente mediul cu virus: produse patologice (sange, plasma, excretii, secretii) au

rol protector Sensibilitatea diferitelor structuri: acidul nucleic: radiatii UV, substante chimice (formaldehida, hipocloritul

de Na), agenti mutageni (ac. nitros, hidroxilamina), substante radioactive cu P, H

proteine virale: radiatii UV, enzime proteolitice, substante chimice (fenol, formaldehida)

invelisul: solventi (eter, cloroform), detergentii anionici

Agenti fizici:Temperatura:

caldura uscata: - mediu ambiant : + 180C - +250C (viabilitate: 2-3 ore = v. gripal, v. rujeolos; 7 ore = v. Ebola, v. Marburg; 24 ore = v. Epstein-Barr; 3 luni = v. coxsackie; >1 an = v. variolic - temperaturi intre +560C si + 100C pe durata de 30 min. inactiveaza majoritatea virusurilor - la +560C sunt inactivate: v. gripale (5 min.), v. urlian (20 min.), adenov/ herpesv/poliov (30 min) - sensibilitatea depinde de : tipul de virus (v. rujeolos = 3 minute la +60 0C, v. Ebola = 1 ora la 600C, v. hepatitei = 1ora la +1600C), substante protectoare (organice sau saruri ca Cl2Ca si Cl2Mg )

caldura umeda :

are eficienta mai mare in distrugerea virusurilor

a. fierbere (+1000C): v. hepatitei A, v. rabic: 10 min. v. hepatitei B: 30 min.

b. autoclavare (+ 210C, 15 psi): toate virusurile: 20 min.

Mod de actiune a caldurii:

alterarea proteinelor virale

FRIGUL

Conserva virusurile si mentine infectivitatea.

la +40C: majoritatea virusurilor se mentin perioade lungi congelarea (-200C) poate scadea seminficativ

infectivitatea (v. gripale) la –700C si azotul lichid (-1900C) se mentin ani de zile

toate virusurile inghetul si dezghetul repetat afecteaza virusurile cu

anvelopa (paramyxov., v. herpetice)

DESICATIA

Deshidratarea unui preparat prin modificarea temperaturii (<, >) in prezenta unor substante (CaCl2, KOH)

a. desicare lenta: scade patogenitatea (atenuare tulpini: v. rabic, v. polio)

b. desicare rapida (liofilizare): conserva virusurile inclusiv cele vaccinale pe durata a mai multor ani

pH-ul

<5 si >9 afecteaza infectiozitatea cu

exceptia enterovirusurilor, virusul gripal

B si arbovirusurile care se mentin la pH 3

si respectiv pH 9

RADIATIILE Efectele depind de: tipul de radiatie (ionizanta, neionizanta) si durata de expunere radiatii neionizante:

- lumina poate scadea viabilitatea si difuziunea virusurilor (v. aerogene determina epidemii in sezoanele cu insolatie scazuta)- radiatiile UV au actiune virulicida asupra unor virusuri prin alterarea bazelor ac nucleici (v. polio, v. rabic, v. urlian = distruse instantaneu; v. hepatitei A si v. rujeolos = distruse in 1-2 min.), exceptie fac v. hepatitei B si HIV care sunt rezistente.

radiatii ionizante: au efect virulicid prin alterarea ac. nucleici si a proteinelor virale - radiatiile X, gamma, alfa si beta inactiveaza virusurile in functie de doza si tip de virus (v. gripal rezista pina la 2400 R/RX, iar v. polio pina la 50.000 R timp de 40 min.)- radiatiile ionizante nu afecteaza antigenitatea - se folosesc la sterilizarea materialelor si a instrumentarului de unica folosinta - pot avea efect mutagen in doze mici

ULTRASUNETELE

Efecte posibile la >20kHz/sec.:

1. pierderea infectivitatii prin disruperea virionului

2. cresterea unor activitati prin desfacerea invelisului (v. gripal cresterea titru HA)

3. fara afectare: v. rujeolos, v. aftos

AGENTI CHIMICI

Efectele depind de: - natura substantei, intensitatea, durata de actiune si tipul de virus - nivelul actiunii: virion intreg, proteine, acid nucleic, invelis

Mod de actiune:- virulicida cu aplicare in decontaminare si sterilizare - diminuarea patogenitatii- conservare - stabilizare

Substante virulicide:

• agentii oxidanti (1%) inactiveaza virusurile :• apa oxigenata (3-6%, v.polio =1%); ozonul (dezinfectia apei)• permanganatul de K (1%); aldehidele (formaldehida = 1-8% pentru decontaminare si

sterilizare aer); glutaraldehida (2% distruge v. hepatitei B si HIV in 2 min.; se foloseste la sterilizarea instrumentar)

• clorul: actioneaza intens pe v polio, v. hepatitei A; hipocloritul Ca/Na (10%): afecteaza acizii nucleici; cloramina (2-5% uzual si 20% pentru v. hepatitei B)

• fenolii (1-5%) altereaza proteinele la virusurile cu invelis (v.gripal)• solventii organici (eter, cloroform) inactiveaza virusul cu anvelopa prin dizolvarea

lipidelor; active pe: v. gripal, v. rujeolos, v. urlian, v. herpetic (180re la +40C), dar nu actioneaza pe v. fara invelis (enterov., adenov.)

• detergentii sintetici (dezoxicolatul de Na; Tween 80) inactiveaza virusurile cu invelis (arbov., myxov.) nu si cele fara invelis (enterov.). Unii cresc activitatea Ha (Tween-80)

• detergentii cationici (saruri cuaternare de amoniu) au si efect de curatire in concentratie de 20%

• alcolii: etanolul (75%) inactiveaza toate virusurile, dar libere de mat. organic; metanolul nu este folosit curent (70% inactiveaza HIV in 15 min)

• Lactone (beta propiolactona): in concentratie de 0,2- 0,4% actioneaza rapid pe v. gripale, v. rujeolos, v. urlian, adenovirusuri

Agenti care diminueaza patogenitatea

formaldehida (0,2%) mentin imunogenitatea (vaccinuri inactivate) la v.rujeolos, v. urlian, v. encefalitice

fenolul (1%) folosit la vaccin antirabic beta propiolactona la vaccinul antirabic

AGENTI CONSERVANTI

glicerol (50%) mentin infectivitatea timp indelungat: v. polio (6 ani); v. herpetic (5 ani); v. febrei galbene (2 luni)

saruri de Mg. si Na mentin infectivitatea la temperaturi ridicate (Cl2Mg – v. polio la +500C)

AGENTI BIOLOGICI

secretiile umane si animale au substante cu actiune virulicida:

- lizozimul (saliva, lacrimi, secretii nazale): activ pe v.gripale si v. polio

- sucul gastric activ prin pH acid si pepsina - bila activa pe v. cu invelis (v. gripal, v. herpetic)

enzimele proteolitice (tripsina, papaina, pepsina, pronaza) lizeazainvelisul viral si proteinele virale; se folosesc pentru separarea acizilor nucleici de proteinele virale.

CULTIVAREA VIRUSURILOR

Virusurile se replica numai in celule vii (eucariote

sau procariote).

Cultivarea virusurilor se poate face in urmatoarele

sisteme:

I. substraturi celulare

II. oua embrionate

III. animale de laborator

I. Substraturi celulare: culturi de tesut: fragmente de tesuturi suspendate in mediu

nutritiv fara multiplicare: nu se mai folosesc organoculturi: fragmente de organe (esofag, stomac,

intestin, colon, cord, pancreas), mentinute in mediu, permit dezvoltarea a v. gripale A si B, v. echo, v. polio, v. rujeolos, etc. Celulele nu se multiplica si au o supravietuire scurta.

culturile celulare: suspensii monocelulare obtinute enzimatic sau chimic care se multiplica si au o durata de supravietuire variabila dependenta de cariotip si modul de obtinere.

- componente: a) celulele b) mediul nutritiv

a) Celulele

- sursa : tesuturi embrionare: embrion uman (trim. I), plaman de

embrion uman, embrion de gaina. Au potential inalt de multiplicare.

tesuturi adulte: rinichi (maimuta, caine, cobai, etc.) tesuturi tumorale (de la diverse biopsii) tesuturi de insecte: tantari (folosite la cultivarea

arbovirusuri)- mod obtinere: tripsinizarea fragmentelor de organ, suspendare in mediu

nutritiv, incubare la 370C

Clasificare :a. mod de cultivare: cultura in monostrat = strat celular continuu obtinut prin aderare si multiplicare pe

sticla sau plastic (flacon, tub, placi cu godeuri). Ele pot fi: stationare (plan orizontal), rotate (flacoane cilindrice cu o viteza de 14 - 16 rotatii/min.)

cultura in suspensie (fermentoare cu agitatie continua). Randament foarte mare. cultura pe microsfere (sticla, colagen, polistiren cu dim. de 5 mm )b. mod de obtinere si caractere cariotip: culturi primare: se obtin prin trisinizare, cariotipul este similar cu cel de origine

(diploid), supravietuiesc 7-21zile, se mentine tipul de celule (epitelial sau fibroblastic)

culturi secundare: se obtin prin tripsinizarea culturilor primare sau cu EDTA/versen (chelatori), au caractere asemanatoare cu cele primare

culturi diploide: se obtin din tesuturi embrionare, se pot face 20-50 de subcultivari, celule de tip fibroblastic, se folosesc la vaccinuri (MRC5)

culturi heteroploide (linii celulare continue): subcultivare nelimitata, se obtin din tesuturi tumorale sau transformate (virusuri, radiatii, substante chimice). Cresc rapid (2-3 zile), se folosesc in diagnosticul de laborator.

b) Medii nutritive

Asigura multiplicarea si viabilitatea celulara. 1. Medii biologice: plasma, extracte embrionare, lichid amniotic. Se folosesc

limitat.2. Medii sintetice :- compozitie: solutie salina tamponata (Hanks, Earle) + stabilizator de pH (Hepes) + indicator pH (rosu fenol) ser animal (ser fetal de vitel) si aminoacizi pentru aderare pe suport simultiplicare antibiotice (penicilina + streptomicina) si antifungice (fungizon) +/- hidrolizat de lactalbumina - tipuri: mediu de crestere (10% ser fetal de vitel) mediu de intretinere (2-5 % ser fetal de vitel)

MODIFICARILE CULTURII CELULARE INDUSE DE VIRUSURI

1. Efect citopatic (perturbari celulare structurale si functionale):- tip:

litic: celulele se rotunjesc, devin mai refringente si se desprind (enterov.) sau se maresc si se grupeaza (ciorchine) urmate de o desprindere rapida (adenov.)

formare de sincitii: fuziunea membranelor celulare cu aparitia de forme gigante cu mai multi nuclei (v. sincitial repirator, HIV, v. rujeolos)

citotoxic: distrugeri masive cu desprindere rapida - timp de aparitie si intensitate:

24-48 ore cu distrugere in 3-4 zile: v. polio 3-4 zile cu desprindere totala in 7-10 zile: v. Rujeolos

2. Formarea de plaje: reprezinta un efect citopatic limitat produs de o singura particula virala; se foloseste la clonarea virusurilor

3. Incluzii virale: formatiuni rotunde sau ovalare (componente virale) intranucleare (v. herpetice, adenov.) sau citoplasmatice (v.rabic ) puse in evidenta prin coloratii (M-G-G ) 4. Hemadsorbtia: se observa la virusuri cu hemaglutinine exprimate pe membrana celulara (gripale, paragripale) si se evidentiaza prin fixarea hematiilor la suprafata culturii 5. Inhibitia metabolica: celulele infectate nu vireaza indicatorul de pH 6. Interferenta: poate evidentia multiplicarea unui virus fara efect citopatogen (v. rubeolos) prin inocularea la 10 zile cu un virus cunoscut citopatogen (v. echo 11)7. Transformarea celulara: apare la infectii cu v. oncogene (polyoma, SV40) si se manifesta prin malignizare si multiplicare aberanta a celulelor (aglomerari de celule pluristratificate la nivelul monostratului)

Culturi celulare folosite curent in virusologie

UTILIZAREA CULTURILOR DE CELULE

diagnostic (izolare si identificare) obtinerea unor reactivi de diagnostic prepararea de vaccinuri virale

II. Oua embrionate

Sunt folosite pentru cultivarea anumitor virusuri: gripale, oncogene, poxvirusuri.

1. Tipuri dupa sursa: conventionale: folosite in diagnosticul gripei si la

prepararea vaccinului gripal LF (leukosis-free): obtinute in incubatoare speciale;

nu sunt infectate cu v. leucozei aviare SPF (specific-pathogen-free): nu contin contaminanti

de orice fel; se folosesc la seed-uri vaccinale (gripal, rujeolos)

2. Structura:

cochilie camera de aer membrana proprie membrana chorio

1. Ou embrionat: a) cochilie; b) membrana proprie; c) membrana

corioalantoidiana; d) lichid alantoidian; e) sac vitelin; f) sac amniotic

continand lichid amniotic; g) camera de aer; h) sac albumen; i) embrion

3. Selectie: oua embrionate de gaina de 10-11 zile cu coaja alba; incubare la 390C,

umiditate 75-80% 4 . Inocularea: pe membrana chorioalantoidiana: pentru virusuri care produc leziuni de tip

pocks (v. vaccinia, v. herpetic, v. oncogene, v. Rous) in cavitatea alantoidiana : v.gripale A si B in cavitatea amniotica : v. gripal C si v. urlian in sacul vitelin : v.herpetic 5. Modificari determinate de virusuri: leziuni ale mca: nodulare (pocks) date de poxvirusuri, v. herpetice, v. Rous activitate hemaglutinanta a lichidelor amniotice si alantoice: v. gripale A, B,C

si v. urlian moarte embrion: v. urlian, v. herpetic 6. Utilizare: diagnostic (izolare, caracterizare): v. gripale preparare reagenti de diagnostic: gripa preparare de vaccinuri: gripal

III. Animale de laborator

Se folosesc limitat:

- virusul nu se cultiva pe cultura celulara

sau ou (HIV, v. coxsackie A) sau in

cercetare (patogeneza, oncogeneza virala,

imunitate, substante antivirale)

1. Surse: mamifere mici: soarece, hamster, sobolan, cobai maimuta, dihor mamifere mari: oaie, capra, cal, vitel pasari: gaina, rata, curcanul

2. Selectia: a. susceptibilitatea la infectia virala:

specia: soarecele (v. coriomeningitei limfocitare), maimuta (v. rujeolos si VHB), cimpanzeul (HIV), hamsterul la v. oncogene

caractere genetice: soareci BALB (v. leucemiei murine) b. varsta: izolarea v. coxsackie la soareci de 72 ore c. starea de sanatate: carantinarea animalelor din zone necunoscute (maimute)d. animale speciale:

SPF = animale fara flora patogena Germ - free = animale fara flora asociata (patogena, saprofita)inbred (izogene) = animale homozigote obtinute prin inmultiri

consanguine transgenice = animale obtinute dupa injectarea unei gene de la parinti

izogeni in oul fecundat soareci nuzi = nu au păr si timus congenital

3. Utilizarea animalelor:

diagnosticul unor boli virale (virusul se dezvolta doar pe animale)

preparare de reagenti de diagnostic (seruri imune, antigene, complemente)

sursa de organe (rinichi: maimuta, caine) si ser (fetal vitel) pentru culturi celulare

Substrate celulare “in vitro” utilizate mai frecvent in laboratoarele de culturi celulare si diagnostic virusologic

continuare