+ All Categories
Home > Documents > Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Date post: 19-Jan-2016
Category:
Upload: bijouxbratarihandmade
View: 165 times
Download: 15 times
Share this document with a friend
Description:
fgf
24
Capitolul 24 Ecologia microorganismelor ce afectează industria farmaceutică. Controlul microbiologic al aerului şi norme de monitorizare ale aerului. Controlul microbiologic al apei. î. Introducere Calitatea microbiologică a produselor farmaceutice este influenţată de mediul în care sunt fabricate şi de materialele folosite în producerea lor. Prezenţa unei game variate de microorganisme saprofite în mediul înconjurător creează condiţii de contaminare a produselor farmaceuti ce, ducând în final la degradarea medicamentelor. Cu excepţia preparatelor care sunt sterilizate în recipientul final, microfiora produsului finit poate fi reprezentată de contaminanţii materiilor prime, de flora de pe echipamentul de producţie, din atmosferă, de la operator sau din recipeintul final în care se ambalează produsul. Contaminarea produselor farmaceutice se poate realiza cu germeni patogeni sau cu bacterii saprofite condi ţionat patogene. în cadrul fabricării medicamentelor pe cale industrială există riscul de contaminare microbiană favorizată de capacitatea metabolică a unor microorganisme de a se adapta ia variaţii ale temperaturii şi pH-ului şi de posibilitatea de a utiliza anumite substanţe din compoziţia produsului. Unele microorganisme au capacitatea de a se adapta şi supravieţui în condiţii precare, stafilococii şi enterococii se dezvoltă în condiţii de hipersalinitate (20-30%), iar bacteriile zaharolitice se pot dezvolta la concentraţii mari ale zaharurilor (40-60%), tincturile alcoolice pot să conţină specii de bacili sporulaţi, cum ar fi Bacillus cereus; fungii se dezvoltă în condiţii variate de pH, temperatură şi umiditate, o mare parte din medicamente permiţând dezvoltarea unei game diverse de genuri microbiene. Sursele de contaminare a produselor farmaceutice sunt reprezentate de: atmosferă (microaerofioră) apă persoana care produce medicamentul (operatorul) materialele utilizate la obţinerea preparatului (substanţa brută: substanţe sintetice, semisintetice, substanţe de origine animală sau vegetală, diferiţi adjuvanţi) echipamentul de producţie recipientul final în care a fost ambalat. Unele microorganisme pot creşte chiar în prezenţa conservanţilor şi deteriorează produsul farmaceutic. Bacteriile distruse în procesul final de sterilizare a produsului pot lăsa reziduuri toxice sau pirogenice, deoarece fracţia pirogenă, lipidul A, prezent în peretele celular bacterian nu este distrus. Paralel cu îmbunătăţ irea tehnologiilor de producere a medicamentelor s-a dezvoltat şi ghidul de bune practici („Good Manufacturing Practices") pentru minimalizarea contaminării microbiene, care se poate realiza prin studiul ecologiei microorganismelor, a riscurilor reprezentate de acestea şi controlul contaminării. Obiectivul ghidului este de a îmbunătăţi siguranţa microbiologică a produselor într-o modalitate eficientă (raport optim cost- calitate) şi dezvoltarea tehnicilor rapide de detecţie a microorganismelor. 2. Atmosfera. 2.1. Conţinutul microbian. Aerul nu este un mediu natural propice pentru creşterea şi reproducerea microorganismelor deoarece nu conţine cantitatea necesară de umezeală şi hrană. Aproape
Transcript
Page 1: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Capitolul 24 Ecologia microorganismelor ce afectează industria farmaceutică. Controlul microbiologic al aerului şi norme de monitorizare ale aerului. Controlul microbiologic al

apei.

î. Introducere Calitatea microbiologică a produselor farmaceutice este influenţată de mediul în care sunt fabricate şi de materialele folosite în producerea lor.

Prezenţa unei game variate de microorganisme saprofite în mediul înconjurător creează condiţii de contaminare a produselor farmaceutice, ducând în final la degradarea medicamentelor. Cu excepţia preparatelor care sunt sterilizate în recipientul final, microfiora produsului finit poate fi reprezentată de contaminanţii materiilor prime, de flora de pe echipamentul de producţie, din atmosferă, de la operator sau din recipeintul final în care se ambalează produsul.

Contaminarea produselor farmaceutice se poate realiza cu germeni patogeni sau cu bacterii saprofite condiţionat patogene. în cadrul fabricării medicamentelor pe cale industrială există riscul de contaminare microbiană favorizată de capacitatea metabolică a unor microorganisme de a se adapta ia variaţii ale temperaturii şi pH-ului şi de posibilitatea de a utiliza anumite substanţe din compoziţia produsului.

Unele microorganisme au capacitatea de a se adapta şi supravieţui în condiţii precare, stafilococii şi enterococii se dezvoltă în condiţii de hipersalinitate (20-30%), iar bacteriile zaharolitice se pot dezvolta la concentraţii mari ale zaharurilor (40-60%), tincturile alcoolice pot să conţină specii de bacili sporulaţi, cum ar fi Bacillus cereus; fungii se dezvoltă în condiţii variate de pH, temperatură şi umiditate, o mare parte din medicamente permiţând dezvoltarea unei game diverse de genuri microbiene.

Sursele de contaminare a produselor farmaceutice sunt reprezentate de: • atmosferă (microaerofioră) • apă • persoana care produce medicamentul (operatorul) • materialele utilizate la obţinerea preparatului (substanţa brută: substanţe sintetice,

semisintetice, substanţe de origine animală sau vegetală, diferiţi adjuvanţi) • echipamentul de producţie • recipientul final în care a fost ambalat.

Unele microorganisme pot creşte chiar în prezenţa conservanţilor şi deteriorează produsul farmaceutic. Bacteriile distruse în procesul final de sterilizare a produsului pot lăsa reziduuri toxice sau pirogenice, deoarece fracţia pirogenă, lipidul A, prezent în peretele celular bacterian nu este distrus.

Paralel cu îmbunătăţirea tehnologiilor de producere a medicamentelor s-a dezvoltat şi ghidul de bune practici („Good Manufacturing Practices") pentru minimalizarea contaminării microbiene, care se poate realiza prin studiul ecologiei microorganismelor, a riscurilor reprezentate de acestea şi controlul contaminării.

Obiectivul ghidului este de a îmbunătăţi siguranţa microbiologică a produselor într-o modalitate eficientă (raport optim cost-calitate) şi dezvoltarea tehnicilor rapide de detecţie a microorganismelor.

2. Atmosfera. 2.1. Conţinutul microbian. Aerul nu este un mediu natural propice pentru creşterea şi reproducerea

microorganismelor deoarece nu conţine cantitatea necesară de umezeală şi hrană. Aproape

Page 2: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

orice mostră de aer netratat conţine bacterii, mucegai şi drojdii. Pentru a putea supravieţui, microorganismele trebuie sa fie capabile să tolereze deshidratarea din mediu.

Numărul organismelor din atmosferă depinde de activitatea din mediu, cantitatea de praf ce este dislocată, umiditate.

Microorganismele izolate în mod normai din aer sunt: Bacterii sporulate : Baciîlus spp şi Clostridium spp. Bacterii nesporulate: Staphylîococcus spp, Streptococcus spp, Corynebactenum spp. Mucegaiuri: Penicillium spp, Cladosporium spp, Aspergillus spp, Mucor spp. Levuri: Rhodotorulaspp. Numărul microorganismelor din atmosferă Depinde de activitatea din mediu şi de cantitatea de praf produsă. Conţinutul microbian este mai ridicat:

• în zona cu utilaje în activitate (care funcţionează), • zona cu personal care lucrează, • într-o încăpere murdară, necurăţată faţă de o cameră curată/aseptică. Conţinutul

microbian este influenţat de umiditate, într-o încăpere umedă şi rece numărul microorganismelor este mai mic, deoarece contaminanţii sunt aduşi pe sol de către picăturile de umezeală (aerul într-un depozit rece nu conţine de obicei microorganisme). Aerul este mai puţin contaminat în iernile umede decât în verile călduroase şi uscate. ^ Microorganismele sunt transportate în atmosferă prin praf, tegument, haine, m picăturile de salivă sau spută rezultate din vorbire, tuse sau strănut.

Bacteriile si mucegaiurile care nu sunt ataşate de particule se vor depune cu uşurinţa într-o încăpere fără curenţi de aer. Rata depozitării depinde de curenţii de aer: ventilaţie, sisteme de extracţie a aerului, curenţi de convecţie deasupra surselor de încălzire şi de activitatea din încăpere. . ..

Numărul microorganismelor din aer poate creşte în timpul manipulam materialelor contaminate, în timpul preparării, amestecării şi adăugărilor în procesul de fabricaţie.

Utilizarea amidonului şi a unor zaharuri în stare uscată favorizează dezvoltarea mucegaiurilor (la numărătoare/detecţie).

Unele ambalaje, de exemplu cartonul, au o microfloră reprezentata de mucegaiuri, bacterii; acest fapt este reflectat prin numărul crescut de microorganisme (prin metode de cultivare/ numărare a microorganismelor) înjurai de utilajelor de ambalare.

Metode uzuale de verificare microbiologică a calităţii aerului A. însămânţarea se poate realiza: • direct pe medii solide (metoda prin sedimentare, metodele de impact, metoda

eîectroprecipitării); • indirect, prin intermediul unui lichid steril cum ar fi soluţie salină izotonă sterila,

bulion nutritiv steril (metodele de recoltare prin aspiraţie). A.l. Metoda prin sedimentare: Deschiderea şi expunerea la aer a plăcilor Petri cu mediu (geloza sânge) timp de

câteva minute până la 1 oră; incubare la 3TC, 24 ore. Se lasă pe masă încă 24 ore la temperatura camerei (pentru pigmentogeneza); Se numără coloniile pentru a obţine numărul total de germeni (NTG) Dezavantaje: • se evidenţiază mai ales bacteriile din picăturile de salivă şi praful bactenan; • nu se obţine numărul real de germeni, ci doar fracţiunile de sedimentare în

intervalul de expunere; ■

Page 3: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Pentru evaluarea pe unitatea de volum de aer se utilizează formula lui Omeliansky, care se bazează pe observaţia că în 5 minute se depun pe o suprafaţă de 100 cm* microorganismele din 10 litri aer.

Formula de calcul este: Nr. germeni/m3 aer = n x 10000/ (SxT/5) n=nr colonii apărute pe suprafaţa mediului; S= suprafaţa cutiei Petri (cm2), T= timpul de expunere (min). A.2. Metode de recoltare prin aspiraţie: A.2 a) Metodele de filtrare: • Se utilizează un filtru de sticlă care conţine material filtrant (nisip de cuarţ steril

sau zaharuri zaharoză, îacîoză) sau membrane filtrante. * o pompă de aspirare şi un debitmetru. Aerul este aspirat prin materialul filtrant care va reţine microorganismele; Dacă s-a folosit nisip de cuarţ sau masă filtrantă din zaharuri, acestea se spală cu

soluţie salină izotonă sterilă şi se fac diluţii care se vor însămânţa pe medii solide. Dacă s-au folosit membrane filtrante (filtrul Milipore), după trecerea unui curent de

aer peste ele, se aplică pe suprafaţa mediului. Se incubează în termostat la 37°C, 24 ore. Se numără coloniile apărute şi se raportează la m3 de aer, cunoscând volumul de aer

filtrat. A.2 b) Metoda de barbotare: Aerul filtrat este trecut prin vase de barbotare care conţin soluţie salină izotonă sterilă

şi care reţin microorganismele. Din suspensie se fac diluţii şi se însămânţează pe mediu. A.2 e) Metoda de impact: în industria farmaceutică se foloseşte detectorul Merck pentru probe de aer. Aerul aspirat este proiectat pe suprafaţa mediului, impactul realizându-se printr-un

curent de aer turbionar sau prin trecerea aerului printr-o fantă îngustă. Se incubează la 37°C, 24 ore.Cunoscând volumul de aer recoltat, evaluăm numărul de microorganisme folosind formula: Nr. microrganisme/m3= n x 1000/V

n= numărul de colonii crescute pe o placă; V= volumul de aer aspirat. A.2 d) Metoda electroprecipitării: Se bazează pe principiul ionizării particulelor de aer; acestea se depun pe electrozii care se găsesc pe mediu B. Determinarea indicatorilor biologici:

• determinarea florei mezofile: coloniile care apar pe plăci după incubare la 37°C, 24 ore. Flora mezofilă este un indicator orientativ al gradului de contaminare a aerului. Se interpretează ca număr de microorganisme dezvoltate la 37°C/m3"

• determinarea streptococilor hemolitici: pentru însămânţare se foloseşte geloză sânge 5%. Coloniile de streptococ se identifică după hemoliză (alfa/beta), după morfologie, se numără coloniile şi se raportează la m3 aer;

• determinarea stafilocociîor: se foloseşte geloză sânge 5%; coloniile de stafiîococ se identifică, se observă prezenţa sau absenţa hemolizei; se raportează numărul total de stafilococi sau stafilococi hemolitici;

• determinarea coliformilor: se face pe geloză sânge. Coloniile care se consideră a fi de enterobacterii sunt trecute pe medii diferenţiale.

• determinarea fungilor: prin metoda sedimentării, folosind mediu Sabouraud. Se incubează la 37°C, timp de 24-48-72 ore urmărind apariţia coloniilor caracteristice (cremoase, alb gălbui în cazul fungilor din genul Candida).

Page 4: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Numărul total de fungi/ m3 în aer se obţine folosind folosind formula lui Omelianski.Valori normale: sunt cele sub 550 UFC/m3 aer, (UFC= unităţi formatoare de colonii)

Contaminare medie: 550-700 colonii/m3 aer. Contaminare maximă: peste 700 colonii/m aer. Această metodă asigură informaţii asupra încărcăturii microbiene de la locul

producţiei. Standardul microbioiogic a sursei de aer şi riscul acceptat este determinat de tipul (forma) de prezentare a medicamentului: orale, injectabile, etc.

Produsele injectabile sau de uz oftalmic ce nu pot fi sterilizate la finalul producţiei prin căldură umedă, trebuie produse în zone unde numărătoarea microorganismelor în mediu este foarte scăzută. Microaeroflora este un punct critic al fabricării medicamentelor de acest tip.

Cu toate ca aceste produse trebuie sa treacă un test de sterilitate, testul în sine este distructiv şi prin urmare doar câteva mostre sunt testate (aleator).

Numărătoarea microorganismelor din atmosferă este importantă pentru a detecta încărcătura microbiană reală, pentru prevenirea contaminării sporadice a unor recipiente care ocazional pot trece nedetectate la testele de sterilitate.

în cazul identificării unei calităţi microbiologice neeorespunzătoare a aerului (se depăşeşte pragul critic) se emite un avertisment cu privire la posibila contaminare şi se iau măsuri de remediere rapidă a situaţiei.

Producerea preparatelor lichide sau semi-solide pentru uz oral sau pentru uz topic necesită un mediu înconjurător curat, atât în etapa de producere cat şi în cea de umplere.

Multe forme de prezentare a medicamentelor sunt protejate prin conservanţi chimici sau prin pH împotriva dezvoltării bacteriilor care le pot contamina. Protejarea împotriva sporilor de mucegai este mult mai greu de realizat.

2.2. Reducerea numărului de microorganisme Numărul microorganismelor din atmosferă poate fi redus prin filtrare, dezinfecţie

chimică, raze ultraviolete. 1. Filtrarea este cea mai utilizată metodă, filtrele pot fi fabricate dintr-o gamă largă de

materiale: celuloză, vată de sticlă, amestec de fibre de sticlă sau politetrafluoretilenă (PTFE) cu răşini sau lianţi acrilici etc. Standardele pentru calitatea aerului filtrat sunt

178

Page 5: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

notate în Marea Britanie într-un sistem notat de la A ia D, iar în USA există 6 clase de la clasa î la clasa 100.000. Pentru condiţii asepsie strictă este necesar să sa îndepărteze toate particulele peste 0,1

microni, folosind un filtru eficient HEPA. Pentru operaţii standard aerul trebuie să conţină <100 particule/ 3,5 litri, diametrul

porilor este de 0,5 microni sau mai mare (gradul A în UK sau 100 în USA). Aceasta filtrare este precedată de o etapă de filtrare grosieră.

Filtrele trebuie menţinute în stare uscată pentru a fi eficiente, deoarece microorganismele se pot deplasa de-a lungul filtrelor umede.

Aerul filtrat poate fi folosit pentru a curăţa o încăpere sau o anumită zonă. Se bazează pe principiul curgerii laminare, care permite ca etapele procesului de fabricaţie să fie desfăşurate într-un mediu steril. Direcţia fluxului de aer poate fi orizontală sau verticală în funcţie de tipul de echipament utilizat, de tipul operaţiei, de tipul materialului. Este important ca să nu existe nici o obstrucţie între sursa de aer şi produsul expus, pentru a nu apărea contaminarea cu microorganisme sau alte particule deviate de pe suprafeţe nesterile. Pentru monitorizarea fluxului de aer sunt necesare dispozitive care să asigure menţinerea permanentă a presiunii pozitive între zona curată către cea mai puţin curată. Integritatea şi funcţionarea corectă a sistemului de filtrare a aerului trebuie verificată cu regularitate.

Cea mai utilizată metodă este aceea de numărare a particulelor în zona de lucru şi pe suprafaţa filtrului.

2. Dezinfectanţii chimici

Utilizarea dezinfectanţilor este limitată din cauza proprietăţilor iritante a aerosolilor.. Se pot obţine rezultate bune cu propilen gîicoî pulverizat la o concentraţie de 0,05-0,5mg/l sau cu compuşii cuartenari ai amoniului la 0,075 %. Pentru zonele ce pot fi sigilate pentru dezinfectare este eficientă formaldehida în concentraţie 1-2 mg/l de aer, la o umiditate relativă de 80-90%.

3. Iradierea cu UV cu lungime de undă între 240-280 nm pentru reducerea contaminării aerului. Iradierea UV este activă doar la o distanţă mică de sursă. Bacteriile în formă sporulată şi fungii (în special cei cu înveliş puternic pigmentat) sunt adesea rezistenţi. Eficienţa metodei creşte în combinaţie cu filtrarea aerului.

23. Aerul comprimat Aerul comprimat are numeroase aplicaţii în fabricarea produselor farmaceutice, de

exemplu transportul pudrelor, al suspensiilor; utilizat în aerarea dn procesul de fermentare.

179

Page 6: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Este sterilizat prin filtrare sau o combinaţie între căldură şi filtrare pentru a evita contaminarea cu microorganisme a produsele farmaceutice pentru obţinerea cărora este utilizat. , \

Conţinutul microbian ai aerului comprimat poate fi estimat prin barbotarea unui volum cunoscut de aer în bulion nutritiv apoi

a. filtrarea printr-o membrană, care este apoi aplicată pe suprafaţa plăcii Petri cu geloză, incubare şi numărătoarea coloniilor. b. sau se foloseşte o metodă mai rapidă prin detecţia modificărilor caracteristicilor fizice sau chimice ale bulionului nutritiv.

3. Apa Ecologia microbiana a apei are o mare importanţă în industria farmaceutică. Apa este utilizată drept constituent al multor produse farmaceutice şi este utilizată în procesele de spălare şi răcire. Sunt importante două aspecte: • A.Calitatea apei brute şi orice procesare a sa • B. Sistemul de distribuţie Microoorganismeie specifice apei proaspete includ: Vseudomonas spp, Alcaligenes

spp., Flavohacterium spp., Chromobacter spp., Serratia spp. Sunt bacterii nepretenţioase din punct de vedere nutritiv şi au o temperatură de creştere

relativ scăzută. Bacteriile ce ajung în apă din cauza eroziunii solului, apioilor abundente şi putrefacţiei

plantelor includ: Bacillus subtilis, B.megaterium, Enterobacîer aerogenes E. cloacae. Prin contaminarie cu deşeuri (ape uzate, de canalizare): Proteus spp., E.coli şi alte

enterobacterii, Streptococcus faecalis, Clostridium spp. O examinare a rezervei de apă industrială înmagazinată a arătat că 98% din

contaminare se datorează bacteriilor Gram-negative. Alte organisme izolate Micrococcus spp., Cytophaga spp., levuri, fungi şi actinomicete.

Apa distlîată în urma procesului de fabricare apa distilată nu conţine microorganisme. Contaminarea poate apărea din cauza unor defecte ale sistemului de răcire, de

depozitare sau ale sistemului de distribuţie. Flora ce poate contamina apa distilată este de obicei formată din bacterii Gram-negative. Când apare contaminarea, flora microbiana este introdusă după sterilizare şi astfel este o cultură pură (uneori până la 1 .OOO.QOG/ml).

Apa distilată este folosită pentru obţinerea de preparate farmaceutice orale sau topice pentru care este acceptat un număr mic de bacterii.

Este utilizată şi pentru obţinerea produselor de administrare parenteraiă după distilare şi sterilizare prin căldură. Apa pentru astfel de preparate se păstrează la 80°C pentru a preveni dezvoltarea bacteriană şi producerea de substanţe pirogene care însoţesc creşterea bacteriană.

Apa obţinută prin osmoză reversă Apa este împinsă de presiunea osmotică printr-o membrană semiperrneabilă care

acţionează ca un filtra molecular. Se împiedică difuziunea substanţelor solubile dizolvate în apă.

Substanţele solubile cu greutate moleculară mare nu difuzează deloc. Procesul este inversul procesului natural de osmoză. Osmoza reversă îndepărtează microorganismele şi pirogenii.

Contaminarea post-osmoză reversă poate avea loc atunci când vasul de depozitare sau sistemul de distribuţie sunt contaminate cu microorganisme.

Page 7: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Sistemul de distribuţie Un recipient de depozitare contaminat acţionează ca un rezervor microbian şi

contaminează toata apa ce trece prin el. Toate recipientele de depozitare se testează regulat. Recircularea constantă a apei la o presiune pozitivă, asigură un sistem optim de reducere a creşterii florei microbiene.

Se foloseşte un sistem de resteriîizare a apei prin filtrare sau UV înainte ca apa să reintre în rezervor.

Dezinfecţia apei Se folosesc trei metode de tratare a apei: dezinfecţie chimică, filtrare, radiaţii UV.

3.1. Tratarea chimică Se aplică de obicei apei brute, apei din reţea, apei dedurizate, sistemului de depozitare şi distribuţie a apei distilate, deionizate, a apei produse prin osmoză reversă. Se folosesc hipocloritul de sodiu, clorul (cei mai utilizaţi agenţi de tratare a rezervei de apă).

3.2. Filtrarea apei Este utilă în situaţiile în care consumul este moderat şi există un circuit continuu al apei. Apa se reîntoarce în rezervor şi este refiltrată. Se instalează un filtru terminal cu diametru de 0,22 micrometri din cauza dimensiunii mici a bacteriilor. Filtrele trebuie dezinfectate sau, cel mai eficient, scoase şi sterilizate prin autoclavare.

3.3. Razele UV Razele UV cu lungime de undă de 254 nm sunt eficiente pentru dezinfecţia apei

limpezi (claritate bună). Avantaje sunt reprezentate de lipsa mirosului sau gustului neplăcut ca la dezinfectarea chimică şi nu se produce colonizare microbiană (spre deosebire de filtre).

3.4. Verificarea microbiană Filtrarea prin membrane este una dintre cele mai utilizate şi eficiente metode de

verificare a apei. Permite concentrarea unui număr mic de microorganisme dintr-un volum mare de apă. Când se testează rezervele de apă clorinată se adaugă un agent inactivator (tiosulfatul de sodiu).Temperatura de incubare pentru izolarea microorganismelor este de 37°C. Deoarece multe specii de contaminanţi fecali nu cresc la 37°C, trebuie ca plăcile Petri să se incubeze la 20-26°C.

Controlul bacteriologic al apelor denumite „medicale", utilizate pentru pacienţi, personalul medical sau materiale:

■ apa sterilă pentru spălarea mâinilor în chirurgie ■ apa pentru spălarea arsurilor ■ apa pentru hemodializă ■ apă sterilă pentru preparate injectabile ■ apa purificată utilizată în farmacie şi în laboratoare

Apa sterilă este utilizată pentru spălarea mâinilor chirurgilor, a endoscoapelor. Periodic, apa sterilă este controlată; sunt prelevate probe din flacoanele cu apă sterilă care conţin 5-10mg tiosuîfat de sodiu pentru a neutraliza urmele de clor prezente în apă. Nu trebuie să conţină nici un microorganism la 100 ml.

Tehnici microbiologice: • tehnica plăcilor cu geloză. sânge:

Geloza sânge 5 % este încălzită la 44°C+/- 2°C realizându-se însămânţarea prin înglobare. Se incubează 24 ore la 30-35 C, apoi 48 ore la 20-21°C. Se numără după fiecare perioadă de incubare coloniile apărute şi se evaluează numărul de colonii/ml apă, ţinând cont de dilutie.

• tehnica filtrării prin membrană: Se filtrează prin membrană cu dimensiunea porilor de 0,45u, un eşantion din apă sau

din diîuţiiîe preparate pentru a obţineîn final maximum 100 de colonii.

181

Page 8: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Membrana filtrantă se aplică pe placa Petri cu mediu solid şi se incubează la îermostat la temperatura de 30-35°C timp de 24-72 ore.

Se numără coloniile după fiecare perioadă de incubare şi rezultatul se exprimă în număr de microorganisme/ml, luând în calcul şi eventuala diluţie a probei.

Cercetarea microorganismelor în apă sterilă, apă pentru farmacie Se foloseşte tehnica filtrării prin membrană care se aplică pe placa Petri. Se

termostatează la 30°C. Se numără şi se identifică coloniile apărute. • Pentru evidenţierea stafilococului auriu se utilizează mediul hiperclorurat selectiv

Chapman solid, • Pentru Pseudomonas aeruginpsa se utilizează mediul cu geloză simplă pentru

evidenţierea pigmentogenezei. • Escherichia coli se dezvoltă pe medii selective şi selectivo-diferenţiale pentru

Enterobacteriaceae (CLED, AABTL, ADCL Leifson, etc, • Salmonella spp. se dezvoltă optim pe medii de cultură care conţin selenit.

Analiza parazitologică a apei Recoltarea probelor se realizează în mod similar cu recoltarea pentru analiza

bacteriologică. Apa potabilă, apa utilizată în farmacii, nu trebuie să conţină ouă de helminţi. Pentru

evidenţierea de ouă de geobeîminţi din apă şi din instalaţiile de tratare şi stocare a apei se recoltează 10 1 de apă, se lasă 24 ore pentru sedimentare, se centrifughează, se aruncă supematantul şi se realizează preparate proaspete din sediment. Se pot evidenţia ouă de paraziţi dacă aceştia există în proba de apă examinată. Rezultatul se exprimă în număr de ouă paraziti/îitru.

182

Page 9: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Capitolul 25 Controlul microbiologic al suprafeţelor neanimate şi tegumentului. Controlul

microbiologic al materiilor prime. Aspecte microbiologice importante in procesul de ambalare a produselor farmaceutice,

a clădirilor utilizate pentru procesul producţie şi a echipamentelor.

1. Pielea şi flora tractului respirator 1.1. Transferul microbian de Ia operatori Microorganismele pot fi transferate produselor farmaceutice de către operatori. Contaminarea preparatelor de administrare orală (comprimate şi pulberi) poate duce la

degradarea soluţiilor şi suspensiilor. în cazul preparatelor parenterale contaminarea poate avea consecinţe grave.

Microorganisme prezente pe tegument • Staphyilococcus aureus (pe mâini şi faţă, în straturile profunde ale pielii, nu este

eliminat prin spălare), Sarcina spp., difteroizii, ocazional bacterii Gram negative: Acinetobacter şi Aîcaligenes spp.

• levuri lipofile în zonele grase şi ceroase ale pielii: Pityrosporum ovale pe scalp, P. orhiculare pe pielea glabră; fungi dermatofiţi: Epidermophyton spp, Microsporon spp, Trichophyton spp;

• bacterii saprofite în ceara din îumenul urechii • în cazul unei igiene personale precare se pot găsi bacterii fecale sau bacterii dintr-o

eventuală leziune a tegumentului. Aproximativ 20% din leziunile deschise fără manifestări clinice sunt» colonizate cu Staphilococcus aureus.

• Alţi contaminanţi: micrococi, enterococi, streptococci a-hemolitici şi nonhemolitici, Clostridium spp.,Bacillus sp.p, bacterii intestinale Gram-negative.

• Leziuni ce pot fi infectate cu: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, enterococi, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa.

» In fosele nazale pot exista ca saprofiţi: Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis • In nazofaringe se găsesc streptococi din grupul viridans, neisserii saprofite,

Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae. Microorganismele cele mai răspândite în timpul respiraţiei normale şi vorbirii sunt

streptococii saprofiţi din grupul viridans. Supravieţuirea microorganismului depinde de natura obiectului şi condiţiile de mediu. Rezistenţa în mediul extern poate fi îndelungată, ani uneori pentru sporii bacterieni, fungi, levuri.

Persistenţa bacteriiiorcu importanţă clinică pe suprafeţe (uscate) (Kramer etal. BMC Infectious Diseases 2006 6:130 doi:10.1186/1471-2334-6-130) Acinetobacter spp. 3 zile - 5 luni Bordetella pertussis 3 - 5 zile Campylobacter jejuni până la 6 zile Clostridium difficile (spori) până la 5 luni Corynebacterium diphtheriae 7 zile - 6 luni Escherichia coli 2 ore -16 luni Enterococcus spp.5 zile - 4 luni Haemophilus influenzae 12 zile Klebsiella spp.pmâ la 30 luni Mycobacterium tuberculosis până la 4 luni Pseudomonas aeruginosa până la 16 luni Salmonella typhi 6 ore- 4 săptămâni

183

Page 10: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Serratia marcescens 3 zile - 2 luni Shigeila spp.2 zile - 5 luni Stapkylococcus aureus 7 zile - 7 luni Streptococcus pneumoniae 1-20 zile Streptococcus pyogenes 3 zile- 6 luni Vibrio cholerae î - 7 zile

Persistenţa Căngilor cu relevanţă clinică medicală pe suprafeţe uscate Candida albicans 1 -120 zile Candida parapsilosis 14 zile Torulopsis glabrata 102-150 zile

Persistenta virusurilor cu relevantă clinică medicală pe suprafeţe uscate Adenovirus Virusul hepatitei A: 2 ore- 60 zile Virusul hepatitei B : 1 săptămână HIV: 1 săptămână Virusul Herpes simplex tip Îşi 2 de la4 ore- 8 săptămâni Virusul gripal 1-2 zile Papillomavirus 16:1 zile Poliovirus tip 1:4 ore - 8 zile Poliovirus tip 2; 1 zi - 8 săptămâni Virusul respirator sinciţial până la 6 ore Rhinovirus :2 ore - 7 zile Rotavirus: 6-60 zile' Perioada de supravieţuire depinde de natura obiectelor contaminate, de suprafaţa

acestora, de gradul lor de curăţenie. Ţesăturile groase şi pufoase reţin un număr mai mare de microorganisme.

Instalaţiile de producţie, materiile prime, ambalajele, echipamentele de protecţie

purtate de operator pot fi surse de contaminare a produselor farmaceutice. Există pericolul transferului de microorganisme de la operatori la preparatele

farmaceutice şi acesta trebuie redus prin instruirea în igiena personală dublată de controale medicale regulate pentru a preveni transferul de microorganisme patogene sau saprofite condiţionat patogene.

Metodele de determinare a contaminării suprafeţelor obiectelor 1. Plăcile de contact Se presează plăcile Petri ce conţin mediu de cultură pe suprafaţa mediului sau pe

suprafaţa obiectului analizat. Se incubează la 37°C, 24 ore. Se numără de coloniile. 2. Prelevarea probelor cu tamponul sterii Utilizăm tampoane sterile dispuse în bulion steril; cu ajutorul lor se prelevează proba,

ştergând o suprafaţă pătrată cu latura de 2,5 cm. După recoltare tampoanele se reintroduc în eprubete, se agită pentru a descărca

microorganismele. Se pune 1 ml pe fundul unei plăci Petri sterile şi se toarnă geloză simplă (mediul lichefiat şi răcit la 45°C). Se lasă să se răcească la temperatura camerei.

în paralel se face şi o diluţie del/10 a suspensiei din eprubeta cu tampon şi se va depune lml pe fundul unei plăci Petri care se toarnă deasupra mediului geloză simplă (lichefiat şi răcit la 45°C). Se lasă să se răcească la temperatura camerei. Tamponul se

Page 11: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

reintroduce în bulion. Incubarea la termostat 48 ore la 37°C pentru plăcile Petri, eventual 24 ore la temperatura camerei si 24 ore la 37°C pentru eprubetele cu bulion.

Se numără coloniile dezvoltate pe mediul solid din plăcile Petri şi rezultatul se exprimă în număr de microorganisme /cm de suprafaţă.

Din bulion se însămânţează 0.1 ml pe mediul cu geloză sânge, mediul hiperclorurat Chapmann şi pe mediu cu lactoză şi se incubează la termostat 24 ore la 37°C, coloniile suspecte se vor izola pe medii corespunzătoare şi se vor identifica.

Metodele pentru studierea florei microbiene cutanate: 1. Metoda amprentelor * se aplică pe tegument mediile solide turnate în plăci Petri * se aplică degetele mâinii (amprentare) pe geloză timp de 15 secunde. * se şterge tegumentul pe o anumită suprafaţă cu un tampon şi însămânţează pe

geloză. Mediul se termostatează la 37°C pentru 24 ore după care se citesc plăcile. 2. Metoda peliculelor adezive Se aplică pe tegument o folie adezivă pentru a detaşa microorganismele aflate pe

tegument. Folia este aplicată pe fundul unei plăci Petri cu faţa de contact în sus peste care turnăm mediul de cultură. Se incubează la 30 C, 2-5 zile şi se numără coloniile dezvoltate pe materialul adeziv.

Î.2. Igiena şi hainele de protecţie Zonele desemnate pentru producerea preparatelor injectabile, a colirurilor sau

soluţiilor otice au facilităţi igienico-sanitare la intrare: papuci sterili, săpun antiseptic, uscătoare de mâini cu aer cald. Pentru fabricarea acestor produse este necesar ca operatorii sa poarte haine sterile incluzând, halat, pantaloni, cizme, glugă, mască şi mănuşi.

2, Materiile prime Pentru controlul contaminării produselor farmaceutice şi a mediului trebuie utilizate

materii prime cu caracteristici microbiologice adecvate. Materiile prime netratate ce provin dintr-o sursă naturală, de obicei, prezintă o microfloră extinsă şi variată.

1. Produsele din surse animale ca gelatina, pulberea de tiroidă, de pancreas pot fi contaminate cu patogeni animali.

Farmacopeea are ca cerinţă absenţa speciei Escherichia coli şi a genului Salmonella pentru a folosi produsul la obţinerea unui preparat farmaceutic.

2. Produse vegetale precum agarul, rubarba, amidonul, pot fi contaminate cu: • microfloră vegetală: Erwihia spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., streptococi

185

Page 12: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

• mncQgmmiCladosporium spp., Fusarium spp., Alternaria spp. • levuri • în cazul contaminării fecale sunt prezente E. coli şi Salmonella 3.

Materialele sintetice sunt de obicei necontaminate. Produsele naturale cu grad mare de contaminare cu bacterii nepatogene se pot utiliza

doar dacă se sterilizează în prealabil. Sterilizarea se realizează prin căldură, filtrare, iradiere, recristaiizare dintr-un solvent bactericid ca de exemplu alcoolul. Pentru produse uscate, acolo unde este posibil, se foloseşte etilen oxidul.

în ceea ce priveşte controlul microbiologic al materiilor prime folosite pentru prepararea medicamentelor se vor face recoltări din diferitele loturi de substanţe, cele solide se vor solubiliza în ser fiziologic steril şi se vor însămânţa pe medii de cultură corespunzătoare. Incubarea se va face atât în condiţii aerobe cât şi anaerobe pentru a detecta prezenta bacteriilor aerobe, anaerobe şi a fungilor.

Dacă pe mediile de cultură se dezvoltă fungi sau bacterii saprofite, numărul total trebuie să se încadreze într-un anumit interval de valori pentru a putea accepta lotul respectiv de materii prime în cadrul procesului tehnologic al medicamentului.

Dacă sunt bacterii saprofite condiţionat patogene, numărul microorganismelor respective trebuie să fie inferior anumitor valori standard.

în cazul izolării bacteriilor Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (saprofiţi condiţionat patogeni) sau a Salmonella spp. (patogen) lotul de materie primă corespunzător trebuie exclus din sistemul de producţie.

3. Ambalarea La finalul procesului produsele farmaceutice se ambalează pentru protejarea

produsului si pentru a preveni pătrunderea microorganismelor sau a umezelii. Microflora de pe amblaj depinde de compoziţie şi de condiţiile de stocare ale acestuia. în funcţie de tipul de produs farmaceutic se determină dacă este necesară sterilizarea

ambalajului. Containerele de sticlă sunt sterile când ies din cuptor dar se pot contamina în încăperi

prăfuite şi de aceea se transportă în cutii. Pot fi contaminate cu spori de Penicillium spp., Aspergillus sp. şi bacterii Bacillus spp. Recipientele de sticlă se spală şi atunci când produsul este lichid sau semisolid se foloseşte şi un dezinfectant.

Recipientele de plastic au un grad de contaminare redus şi nu trebuie,în general, dezinfectate. Transportate în condiţii necorespunzătoare se pot contamina cu fungi^

Unele ambalaje folosite pentru materiile prime precum saci de hârtie necăptuşiţi pot absorbi umezeala şi pot fi deteriorate microbian şi astfel contaminează şi conţinutul. Din acest motiv se preferă sacii cătuşiţi cu polietilenă.

Ambalajele cu un număr scăzut de microorganisme sunt acelea care au care au o suprafaţă netedă impermeabilă fără porozităţi (celuloză, polietilenă, polipropiienă, foiţele de metal şi laminate).

Cartonul netratat conţine: • spori de mucegai de Cladosporium spp., Apergillus spp. şi Penicillinum spp. • bacterii precum Bacillus spp. şi Micrococcus spp.

în cazul soluţiilor injectabile şi preparatelor oftalmice care sunt preparate în condiţii de asepsie, dar nu sunt sterilizate în recipientul lor final, ambalajul trebuie sa fie sterilizat. Pentru fiole şi flacoane se sterilizează prin căldură uscată la 170 C.

Recipientele şi capacele sunt sterilizate la căldură umedă sau prin sterilizare chimică sau iradiere.

Indiferent de tipul sterilizării, procesul trebuie sa fie validat şi trebuie stabilite punctele critice de control.

Page 13: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

4. Clădirile 4.1. Pereţi şi tavane Mucegaiul este cea mai răspândita floră a pereţilor şi tavanelor. Speciile cele mai des

întâlnite sunt: Cladosporium spp., Aspergillus spp. mai ales A.niger şi A. flavus, Penicillinum spp. frecvent în clădirile slab aerisite, cu pereţii vopsiţi.

Pentru a reduce creşterea microbiană pereţii şi tavanele trebuie sa fie netede, impermeabile şi lavabile şi aceste condiţii se îndeplinesc prin placarea pereţilor cu plastic laminat. în zonele cu umiditate ridicată se folosesc cărămizile şlefuite sau faianţă. Pentru eliminarea aburului este obligatorie ventilaţia în tavan.

4.2. Podele şi scurgeri (canale de scurgere) Pentru a minimaliza contaminarea microbiană toate podelele trebuie sa fie uşor de

curăţat, impermeabile, cu suprafaţa netedă. Jn unele zone poate fi necesar ca podeaua să fie înclinată spre scurgere, îmbinarea

podea-perete trebuie sa fie acoperită. Se aplică o etanşeizare rezistentă în zonele în care se folosesc lichide de curăţat acide

sau alcaline; dacă acest aspect este neglijat, suprafaţa se denivelează şi devine poroasă şi este colonizată rapid de microorganisme.

Zonele în care se desfăşoară operaţiuni aseptice trebuie să aibă obligatoriu un sistem de ventilare, aerisirea nu se va face pe ferestră.

5. Echipamentul Trebuie aplicate reguli pentru reducerea riscului de colonizare microbiană a pieselor

de echipament folosite pentru fabricarea sau pentru ambalarea produselor farmaceutice: • toate echipamentele trebuie sa fie uşor de demontat • toate suprafeţele care vin în contact cu produsul trebuie să fie netede, fără colţuri

ascuţite şi îmbinări rotunjite sau acoperite • trebuie sa existe şuruburi cu filetul exterior uşor accesibil pentru curăţare • mufele de cuplare de la toate conductele şi valvele trebuie să se poată scoate

separat şi curăţa • lamele de la agitator şi cuva de la cuptor, de preferat, trebuie să formeze o singură

piesă şi să fie accesibile pentru curăţat; dacă lamele sunt prinse de cuva, produsul fabricat poate rămâne între lame şi cuvă şi poate constitui suport pentru dezvoltarea microorganismelor

» se preferă dispozitivele de etanşeizare mecanică pentru ambalat cutii deoarece ambalajul este greu de sterilizat

5.1. Curăţarea Agentul ales rebuie să fie potrivit cu suprafaţa de curăţare şi să nu fie coroziv, să

îndepărteze produsul fără a lăsa reziduuri, să fie compatibil cu rezerva de apă. Se pot folosi simultan agenţi de curăţare şi sterilizare, caz în care agenţii trebuie să fie compatibili.

5.2. Dezinfecţia şi sterilizarea Echipamentul poate fi sterilizat sau dezinfectat la cald, chimic, sau combinaţie între

cele două proceduri. Multe rezervoare, eprubete, piesele mici de echipament pot fi autoclavate( important

ca aburul să ajungă pe toate suprafeţele lor. Echipamentul folosit la fabricarea şi ambalarea pudrelor este sterilizat prin

căldură uscată. Dezinfectanţii chimici uzuali conţin hipoclorit de sodiu. Ca metodă de dezinfecţie poate fi utilizatăcufundarea totală a obiectelor mici sau

pulverizarea suprafeţelor interioare a echipamentelor mai mari. 5.3. Verificările microbiene

187

Page 14: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Pentru validarea controlului se testează o mostră de apă finală de spălare pe o placă Petri cu agar nutritiv.Pentra testare se poate folosi şi un tampon fabricat fie din bumbac steril sau din alginat de calciu. Alginatul de calciu este folosit cu un diluant ce conţine 1% hexametafosfat de sodiu care dizolvă tamponul şi eliberează organismele adunate de pe echipament; aceste organisme pot fi apoi acoperite cu geloză sau pot fi folosite metode alternative de evaluare. Se pot utiliza metode de detecţie rapidă a microorganismelor.

Page 15: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Capitolul 26 Norme microbiologice pentru produsele farmaceutice. Analiza microbiologică a

produselor farmaceutice nesterile

Norme microbiologice pentru produsele farmaceutice In cadrul procesului tehnologic (sinteză, ambalare, depozitare, distribuire) trebuie

respectate o serie de măsuri pentru a asigura condiţiile obligatorii de calitate microbiologică a produselor farmaceutice. Aceste etape ale procesului tehnologic sunt reglementate de Agenţia Naţională a Medicamentului.

Conform Farmacopeei Europene produsele farmaceutice se încadrează în 4 categorii: • Categoria 1, produse sterile, care nu trebuie să conţină nici un tip de

microorganism (aerob, anaerob, microaerofil); în acest grup sunt încadrate preparate de adrninistrare parenterală.

• Categoria a 2-a, produse nesteriîe dar numărul total de organisme aerobe este limitat:

- microorganisme aerobe IO2 /mg/ml; - enterobacterii IO1 /mg/ml; - Pseudomonas aeruginosa absent la 1 g sau 1 ml; - Staphylococcus aureus absent la 1 g sau 1 ml. In această categorie sunt încadrate preparate de uz local tegumentar şi pentru tractusul respirator. • Categoria a 3-a: preparate pentru administrare orală şi rectală.

Sunt admise IO3 bacterii aerobe şi IO2 fungi/g/ml, cu condiţia ca E. coli să fie absent. Pentru preparatele pentru administrare orală, care conţin materii prime de origine naturală sunt admise IO3 microorganisme/g/ml. Numărul total de microorganisme aerobe: -104 bacterii şi 102 fungi/g/ml;

- IO2 enterobacterii/g/ml; - Salmonella absent - la 10 g sau 10 ml; - E. coli absent - la 1 g sau 1 ml; - Staphylococcus aureus absent - la 1 g sau 1 ml ® Categoria a 4-a, remedii pe bază de plante 4.1. Remedii pe bază de plante, peste care se adaugă apă la temperatura de fierbere,

înainte de a fi utilizate. Trebuie să îndeplinească următoarele condiţii privin încărcătura bacteriană maximă: - <107 bacterii aerobe/g/ml - <102 E. coii/g/ml 4.2. Alte remedii pe bază de plante Trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: - <105 bacterii aerobe şi IO4 fungi/g/ml - <10 enterobacterii/g/ml - E. coli absent la 1 g sau 1 ml - Salmonella absent la 10 g sau 10 ml

Microorganisme ce pot fi izolate din produsele farmaceutice: Din produsele farmaceutice pot izolate bacterii

• aerobe, microaerofile, anaerobe • patogene, condiţionat patogene sau nepatogene pentru om.

Exemple:

189

Page 16: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Clostridium perfringens: fiole cu adrenalină sau cu ser fiziologi Clostridium tetant catgut, alcool medicinal, talc Candida albicans: unguente cu corticosteroizi, antibiotice Citrohacter: coliruri Enterobacteriaceae (în general): produse chimice şi organice şi minerale, produse de origine animală, vegetală, pudre, granule, comprimate, gelule, pomezi, supozitoare etc. Escherichia coli: coliruri, amidon din cartof sau grâu. Haemophiîus influenzae: coliruri Hafiiia: coliruri Klebsiella: unguente cu corticosteroizi, antibiotice, aerosoli Peniciîîium notatum: unguente cu corticosteroizi, antibiotice Pseudomonas spp:. coliruri cu pilocarpină sau fluoresceină, pudră cu 1% clorhexidină unguente cu corticosteroizi Serratia: coliruri Sacharomyces cerevisiae: unguente cu corticosteroizi, cu antibiotice Shigella: coliruri Salmonella: extract tiroidian, produse apiterapeutice. Streptococcus faecaiis: produse chimice organice şi minerale, produse brute de origine animală şi vegetală, pudre, granule, comprimate.

Modificările preparatelor farmaceutice m cursul conservării pot fi fizice, chimice şi microbiologice Modificările microbiologice sunt produse de microorganisme (bacterii, levuri,

ciuperci sau alge). Microorganismele pot exista în medicament încă de la preparare (provenind din materii prime contaminate, din spaţiul de lucru necorespunzător, din utilaje folosite, de la personal) sau pot pătrunde în medicament în timpul depozitării.

La administrarea unor preparate contaminate cu microorganisme sau cu produşi de metabolism ale acestora (toxine, substanţe pirogene) apar fenomene toxice la administrare.

Produsele farmaceutice în care se dezvoltă fungi pot fi alterate şi pot avea un aspect fizic modificat.

Dezvoltarea microorganismelor este favorizată de prezenţa apei, de aceea preparatele apoase, lichide şi moi sunt cele mai afectate de microorganisme.

Substanţele auxiliare (zahărul, amidonul, gumele, pectina, gelatina) constituie medii de dezvoltare prielnice şi cresc riscul modificărilor microbiologice din preparatele farmaceutice. Microorganismele produc modificări şi în preparate solide păstrate necorespunzător.

Trebuie luate măsuri pentru prevenirea contaminărilor la preparare şi depozitare şi folosirea de agenţi antimicrobieni (conservanfi), aleşi în funcţie de natura formei farmaceutice de stabilizat, de calea de administrare şi de compatibilitatea cu celelalte componente ale formulării.

Concentraţia conservantului trebuie să fie astfel aleasă încât să asigure protecţia faţă de microorganisme şi să nu producă efecte secundare nedorite după administrare.

Alte forme de contaminare pot fi cauzate de către insecte, furnici, viermi, rozătoare, etc.

Produsele farmaceutice trebuie preparate în fabrici de profil în condiţii de perfectă securitate din punct de vedere al normelor microbiologice; ţinând cont de aceste criterii, produsele farmaceutice se clasifică în cele 4 categorii menţionate.

Page 17: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Alegerea şi controlul mediilor de cultură; tehnici de evaluare a sterilităţii Mediile de cultură sunt alese pentru a permite dezvoltarea microorganismelor chiar

când acestea sunt în număr foarte mic în produsul de controlat. Mediile trebuie să asigure condiţii pentru creşterea unor microorganisme pretenţioase ca cerinţe de dezvoltare.

Mediile de cultură au o compoziţie complexă care să permită dezvoltarea a cât mai multor specii microbiene; mediile sunt sterile, perfect limpezi, cu valoare nutritivă verificată pe tulpini de referinţă.

Mediile de cultură cel mai frecvent folosite sunt: • mediul lichid cu thioglicolat de Na (pentru cultivarea bacteriilor aerobe şi

anaerobe); • mediul lichid Sabouraud (pentru cultivarea fungilor). Se folosesc medii proaspete, în general în primele 2 zile de la preparare. Până în

momentul însămânţării, ele se conservă la temperatura camerei sau în frigider şi la întuneric. Se recomandă introducerea în mediile de cultură a unor substanţe neutralizante,

deoarece numeroase medicamente conţin substanţe conservante cu scopul de a preveni contaminarea bacteriană sau unele medicamente au prin ele însele o acţiune antimicrobiană. O alternativă o constituie msămânţarea unei cantităţi din produsul farmaceutic de controlat într-o cantitate mare de mediu de cultură, astfel încât să se realizeze o diluare a substanţelor cu acţiune antimicrobiană din medicament pentru a permite dezvoltarea microbiană.

De exemplu dacă produsul controlat pentru sterilitate conţine sulfamide, se foloseşte acidul paraaminobenzoic; pentru compuşii cu penicilină se utilizează peniciîinază; pentru compuşii cu fenol se utilizează cărbunele vegetal sau caolinul, pentru cei cu compuşi de mercur se utilzează acidul thiogiicolic, thiosulfatul de sodiu sau hiposuîfitul de sodiu. Insămânţarea probelor din medicamentul de controlat pe medii de cultură

a) Se controlează cel puţin 2 probe din acelaşi lot sau aceeaşi serie de producţie. Există situaţii în care sunt emise'dispoziţii oficiale care stabilesc un anumit procent din totalul fiolelor rezultate prin repartizarea medicamentului dintr-un recipient unic.

b) Cantitatea de mediu dintr-un recipient este de 25-100 ml pentru a se realiza o diluare a conservantilor.

c) Raportul dintre cantitatea de produs şi cantitatea de mediu este 1/5 - 1/100. Cantitatea de mediu în care se face însămânţarea este de 0,1 ml şi 0,5 ml.

Introducerea în mediul de cultură a unei cantităţi mai mari de inocul poate duce la modificarea aspectului mediilor de cultură (tulburare, precipitare etc), ducând la eventuale erori în citirea şi interpretarea rezultatelor culturii.

d) însămânţarea probelor în medii de cultură se realizează în boxe care corespund normelor de funcţionare. înaintea şi în timpul efectuării însămânţării produselor de controlat se realizează un control microbiologic al microaeroflorei din boxă.

Personalul care efectuează controlul de sterilitate utilizează echipament steril, halat, bonetă, ochelari de protecţie, mască, etc. în timpul lucrului se interzice deschiderea boxei, vorbitul, circulaţia sau mişcările inutile.

Se deschid fiola sau flaconul închise ermetic, se prelevează o cantitate de produs şi se însămânţează în recipientele cu medii de cultură folosind pipete şi instrumente sterile şi evitând pătrunderea microorganismelor din mediul extern, msămânţarea se face în cel puţin 2 recipiente.

Recipientele însămânţate se incubează la termostat la 37°C pentru bacterii şi la 28°C pentru fungi iar o parte din mediile însămânţate se menţin la temperatura camerei pentru a detecta creşterea microorganismelor cu temperatură optimă de creştere mai redusă. Eprubetele cu bulion cu thioglicolat de Na însămânţate se menţin timp de 7 zile la 37C; cele cu mediu Sabouraud se urmăresc 10 zile la 24°C - 28°C.

191

Page 18: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Citirea şi interpretarea rezultatelor Medicamentul controlat corespunde cerinţei de sterilitate dacă după aceste intervale de

timp în toate recipientele cu medii de cultură însămânţate nu se constată creştere microbiană. Creşterea microorganismelor se observă macroscopic, deoarece are ca urmare

modificarea aspectului mediilor de cultură (tulburarea mediului, apariţia unei pelicule la suprafaţa mediului, depozit pe fundul tubului). Există însă produse, (vaccinul antirabic), care sunt tulburi şi modifică mediile de cultură de la însămânţare, fără a indica prin aceasta şi dezvoltarea microorganismelor. Aprecierea rezultatelor controlului de sterilitate se completează cu examenul microscopic, pe frotiuri colorate Gram, în toate cazurile în care se constată modificarea transparenţei iniţiale a mediilor de cultură.

în cazul medicamentelor care introduse în mediile de cultură produc modificări fizice ale acestora, creşterea microbiană se determină prin treceri pe medii de cultură lichide şi solide.

Dacă se constată creştere microbiană în toate recipientele însămânţate sau numai în unele, se repetă controlul de sterilitate pe un număr dublu de probe.

în cazul când la acest al doilea control se observă creşterea microorganismelor cu aceleaşi microorganisme ca la primul control, lotul de medicamente respectiv nu îndeplineşte condiţia de sterilitate şi va fi rebutat.

Dacă la al doilea control de sterilitate se constată creşterea microbiană într-un număr redus de recipiente şi cu alte microorganisme decât la primul control se mai face un al treilea control.

Dacă la acest al treilea control nu se dezvoltă microorganisme în mediile însămânţate, medicamentul corespunde cerinţei de sterilitate, dacă microorganismele se vor dezvolta chiar numai într-un singur recipient, medicamentul nu corespunde cerinţei de sterilitate.

I Controlul sterilităţii indică sterilitatea sau lipsa de sterilitate a produsului. Există două modalităţi tehnice: o Filtrarea. o

însămânţarea directă pe mediul de cultură. 1. Filtrarea prin membrană Metodă uzuală folosită pentru controlul produselor lichide: soluţii slab alcoolice,

soluţii uleioase, precum şi unguente şi creme care pot fi aduse în formă de soluţie, folosind diluenţi sterili, fără activitate antimicrobiană.

Fiolele şi flacoanele vor fi dezinfectate pe suprafaţa exterioară înainte de a fi desfăcute.

în cazul produselor vidate, se dezinfectează dopul de cauciuc şi se introduce în interiorul flaconului un ac cu seringă sterilă, la care este adaptat un dispozitiv de filtrare sterilizat.

Membranele filtrante sunt produse din nitrat de celuloză pentru filtrarea soluţiilor apoase, uleioase şi slab alcoolice şi celuloză simplă pentru filtrarea soluţiilor puternic alcoolice.

Membrana filtrantă se prelevează cu o pensă sterilă, se dispune pe suprafaţa unui mediu solid şi va fi termostată.

Pentru pulberi solubile sterile, uleiuri şi soluţii uleioase sterile se foloseşte o cantitate din proba de analizat, conform valorilor impuse de Farmacopeea Europeană.

Pentru unguente şi creme se va realiza în prealabil o diluare la cald (40%), folosind diluenţi în concentraţie de 1% şi apoi o filtrare prin tehnica obişnuită.

Pentru preparatele farmaceutice neinjectabile şi preparatele oftaîmice se însămânţează o cantitate de probă standardizată pe mediile de cultură.

Page 19: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

2. însămânţarea directă în mediul de cultură Se însămânţează o cantitate din proba de testat direct pe mediul de cultură. Pentru a neutraliza activitatea antimicrobiană a probelor analizate se face tratarea acestora cu o substanţă sterilă corespunzătoare sau prin diluare.

După însămânţare probele sunt termostatate 14 zile la 30-35°C pentru bacterii şi 20-25 C pentru fungi. Examinarea culturilor se va face în fiecare zi.

Dacă după 14 zile tuburile îşi păstrează transparenţa iniţială, proba analizată este considerată sterilă.

Dacă se observă se o creştere microbiană, în condiţiile în care s-au asigurat toate regulile de aspesie, se va relua testarea folosind un număr dublu de tuburi; dacă nu există creştere microbiană proba va fi considerată sterilă; dacă bacteriile se vor dezvolta în unul sau mai multe tuburi în cazul retestării, înseamnă că proba analizată nu este corespunzătoare.

Controlul sterilităţii produselor farmaceutice nesterile Prezenţa microorganismelor în medicamente impune definirea criteriilor

microbiologice de calitate pentru diferitele forme medicamentoase. Din punct de vedere microbiologic, medicamentele pot fi grupate în două categorii:

sterile şi nesterile. In grupul medicamentelor obligatoriu sterile sunt incluse cele injectabile şi topice (cu

aplicare pe tegumente, mucoase; ex: coliruri, soluţii, pomezi utilizabile în plăgi, arsuri etc). Pentru medicamentele obligatoriu sterile sunt prevăzute controale riguroase de sterilitate prin tehnici speciale, definite cu claritate în toate farmacopeele şi normele oficiale de control.

Medicamentele cu administrare orală sunt nesterile. Dată fiind răspândirea generală a microorganismelor şi caracterul deschis al procedeelor tehnologice folosite pentru prepararea acestor medicamente, este admisă prezenţa unei anumite încărcături microbiene.

Pentru medicamentele sterile (injectabile şi cele topice) criteriul microbiologic de calitate este reprezentat de absenţa oricărui microorganism (sterilitatea).

Pentru medicamentele nesterile (uz oral, etc) criteriul microbiologic de calitate este reprezentat de încărcătura microbiană care reprezintă totalitatea microorganismelor, viabile sau neviabile, ce pot fi puse evidenţiate pe unitatea de volum sau greutate; încărcătura microbiană maximă se constată în medicamentele realizate prin procedee tehnologice deschise în care intervin întreruperi sau stocări la temperaturi ce favorizează dezvoltarea microbiană.

Microorganismele prezente în medicamentele de uz oral provin în cea mai mare parte din aer. Atunci când sunt izolate bacterii din genul Escherichia, Proteus aceasta atestă o contaminare fecală (în preparate pe bază de materii prime de origine animală).

Produsele vegetale aduc în preparatele medicamentoase îndeosebi bacterii din genul Bacillus şi fungi.

Determinarea încărcăturii microbiene a materiilor prime ca şi a formelor medicamentoase finite prezintă interes pentru aprecierea calităţii tehnice a materiei prime, aprecierea calităţii produselor finite, evidenţierea unei contaminări fecale prin prezenţa unor indicatori sanitari; stabilirea unei eventuale contaminări cu microorganisme patogene.

In cazul unor materii prime cu încărcătură microbiană crescută se poate indica excluderea acesteia din procesul tehnologic sau introducerea unor prelucrări speciale în cursul etapelor procesului tehnologic în scopul de a reduce cantităţile microorganismelor existente iniţial.

Pentru produsele finite se prevăd limite ale încărcăturii microbiene. Dacă normele admise pentru încărcătura microbiană sunt depăşite, produsele farmaceutice sunt excluse la control.

'' ■ ■ ■ : ■ ■ ' ■

193

Page 20: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

în cazul punerii în evidenţă a unor indicatori microbiologici sanitari materiile prime sau formele medicamentoase finite nu pot fi folosite. Prin indicatori sanitari se înţeleg anumite specii microbiene cu acelaşi habitat ca şi anumite microorganisme patogene, a căror prezenţă indică probabilitatea contaminării cu patogeni; exemplu Eschenchia coli, enterococ etc.

Limitele încărcăturii microbiene totale nu sunt încă stabilite prin farmacopei, deoarece sesizarea acţiunii defavorabile a numărului crescut de microorganisme este de dată relativ recentă. Există cercetări pe plan internaţional destinate stabilirii limitelor admisibile pentru încărcătura microbiană a medicamentelor per orale.

Determinarea încărcătorii microbiene a medicamentelor orale impune următoarele

etape: • Recoltarea, transportul şi conservarea probelor de materii prime şi produse

finite. * Determinarea încărcăturii microbiene totale.

1. Recoltare, transport, conservare Probele necesare analizelor se recoltează în condiţii de asepsie folosind instrumentar şi

recipiente sterile. Cantităţile indicate pentru prelevare sunt precizate în normele de control specifice fiecărui produs.

Pentru materiile prime se indică prelevarea din mai multe puncte şi se preferă preferat din porţiunile cu aspect morfologic modificat faţă decel normal.

în cazul produselor farmaceutice finite se prelevează probe din mai multe recipiente. Probele sunt etichetate şi transportate rapid la laborator însoţite de o fişă cu date asupra produsului (denumirea probei, numărul şarjei, seria, depozitul) unde sunt menţinute în condiţii similare cu cele în care se găseau la momentul recoltării.

Determinarea încărcăturii microbiene totale. Pregătirea probelor pentru analize este diferită în funcţie de natura probei. a) Substanţe solubile în apă (lactoză, bicarbonat de sodiu, sulfat de sodiu, glucoza,

etc). Se cântăreşte 1 g substanţă şi se dizolvă în 10 mi apă distilată sterilă. Cântărirea se

face în fiolă de cântărire sterilă şi folosind o spatulă sterilă. Din soluţie se fac diluţii 1/10 -1/1000 în apă distilată sterilă.

b) Substanţe insolubile în apă (amidon, carbo medicinalis etc). Se cântăreşte 1 g substanţă şi se suspensionează în 10 ml apă distilată sterilă. Suspensia se omogenizează prin agitare într-un balon cu perle de sticlă apoi se filtrează prin hârtie de filtru sterilă. Din soluţia filtrată se fac diluţii 1/10 -1/1000 în apă distilată sterilă.

c) Materii prime de natură vegetală (folia digitalis lanata, Foliam Boldo, Cynara scolimus, etc.) Se triturează într-un mojar steril. Se cântăreşte 1 g pulbere şi se suspensionează în 10 ml apă distilată sterilă. Suspensia se omogenizează prin agitare într-un balon cu perle de sticlă apoi se filtrează prin hârtie de filtru sterilă. Se fac diluţii 1/10 -1/100000 în apă distilată sterilă.

d) Materii prime de natură animală (tiroidă pulbere, etc). Se triturează o cantitate de produs într-un mojar steril. Se cîntăreşte 1 g de material şi se suspensionează în 10 ml apă distilată sterilă. Suspensia se omogenizează prin agitare în balon cu perle de sticlă sterile apoi se filtrează prin hârtie de filtru sterilă. Se fac diluţii 1/10 -1/100000 în apă distilată sterili

e) Medicamentele sub formă lichidă (Anghirol etc). Se scutură energic flaconul, se prelevează cu pipetă sterilă şi în condiţii de lucru aseptic 1 ml din produs şi se pipetează peste 9 ml apă distilată sterilă. Se continuă diluţiile pînă la 1/100000.

f) Tablete, drajeuri (Polivitamine, Cortelax, Digitalis tablete, Extraveral, etc). Se cântăresc 5 tablete (drajeuri) şi se mojarează în mojar steril. Se stabileşte prin calcul cantitatea

Page 21: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

corespunzătoare unei tablete (drajeu) şi se cântăreşte echivalentul său în pulberea fin mojarată. Materialul cântărit se suspensionează în 10 ml apă distilată sterilă. Suspensia se omogenizează prin agitare în flacon cu perle de sticlă sterile apoi se filtrează. Din soluţia rezultată se fac diluţii 1/10 -1/100000 în apă distilată sterilă.

Tehnica determinării încărcăturii microbiene totale Pentru efectuarea acestei determinări se^ fac însămânţări din diluţiile probelor de

analizat realizate conform indicaţiilor anterioare. însămânţările se fac prin încorporarea a 1 ml din fiecare diluţie în 15 ml geîoză glucozată topită şi adusă la temperatura de 450-500°C. După agitare rapidă, mediul este turnat în plăci Petri sterile cu diametru 10-12 cm. Pentru fiecare diluţie se pregătesc 2 plăci. Termostatarea se face la 37°C timp de 24 ore după care se numără colomile dezvoltate pe fiecare placă. Se stabileşte media pentru plăcile paralele efectuate la fiecare diluţie.

i Pentru calcul se aleg plăcile în care numărul coloniilor este de ordinul zecilor şi

sutelor. Se raportează numărul aflat la cantitatea de material luată în lucru ţinând seama de diîuţia efectuată, astfel: XT • ■ (M^D.WfMjXA) Nr .microorganisme=■*—« ---- l-—-—? ---- u.

2 unde: Ml, M2 = media citirilor la fiecare diluţie aleasă, Dl, D2 = diluţiile corespunzătoare din care s-au Scut însămânţările. Rezultatul final reprezintă numărul de microorganisme vii / unitatea de măsură luată în lucru (g sau ml).

Schema tehnicii de lucru

Probă Substanţe solubile Substanţe insolubile Materii prime de natură vegetală

• Diluant Apă distilată Apă distilată Apă distilată

Cantitate probă luată în lucru (%) 10g 10 g 10g

Diluţii 1/10- 1/1000 1/10-1/1000 1/10-1/100000

Materii prime de natură animală

Apă distilată lOg 1/10-1/100000

Medicamente lichide Tablete, drajeuri

Apă distilată Apă distilată

10g Echivalentul

1/10-1/100000 1/10-1/100000

greutăţii unei tablete

Page 22: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

1 ml din fiecare diluţie ^ ^

încorporat în 15 ml mediu încorporat în 15 ml mediu

Geloză glucozată Geloză sânge

Chapman Mediu cu săruri biliare

Sabouraud cu adaus de 20 mg/ml tetraciclină

Mcubare la 37°C încubare la 28°C

~^J^

, Citirea numărului de colonii

Nu se poate număra Sute Zeci

Unităţi

sau absent

1

Prin acest control se urmăreşte aprecierea cantitativă a bacteriilor mezofile şi a fungilor care cresc în aerobioză. Determinările sunt realizate în conformitate cu Farmacopeea Europeană 2002; se urmăreşte folosirea unor condiţii optime de lucru, astfel încât sa fie posibilă evitarea contaminării accidentale a produselor examinate.

în condiţiile în care produsul examinat beneficiază prin definiţie de activitate proprie antimicrobiană,' aceasta trebuie neutralizată, fără a realiza însă efecte toxice pentru microorganismele eventual prezente în aceste produse farmaceutice.

Numărul de microorganisme aerobe va fi determinat prin: • metoda filtrării prin membrană;

Fiecare mediu însămânţat este turnat în placă şi lăsat să

se solidifice

Page 23: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

• metoda încorporării în placă (metoda de însămânţare prin înglobare) sau a numărării microorganismelor în placă

1. Metoda filtrării prin membrană Tehnică Proba examinată va măsura 10 g sau 10 ml şi se va alege aleator din containerul în care

este stocat preparatul. • Pentru produsele solubile în apă din probă se face o suspensie l/10.în soluţie de NaCl

- peptonă, se reglează pH ui la 7. Dacă produsul are activitate antimicrobiană în diîuent se adaugă un agent de inactivare.

• Pentru produsele negrase insolubile în apă se folosesc 10 g probă, 90 ml soluţie, tampon NaCl peptonă, pH 7. Se adaugă agent de inactivare pentru produsele cu activitate antimicrobiană, agent activ de suprafaţă (îg Tween 80)

• Pentru produsele grase din probă se face o suspensie în soluţie de NaCl peptonă, se adaugă Tween 80 steril sau alt agent activ de suprafaţă,' se omogenizează, se încălzeşte la 400C. Se mai adaugă soluţie preîncălzită de peptonă-NaCl pH 7 pentru a obţine diluţia 1:10 din produs; se agită pentru formarea unei emulsii. Emulsia rezultată prin această tehnică va fi apoi trecută prin membrana filtrantă.

• Plasturii transdermali: Se îndepărtează foliile protectoare de pe 10 probe; se dispun pe tăvi din sticlă, cu partea adezivă în sus;acoperire cu comprese steriie;transfer în minim 500 ml soluţie tampon cu inactivatori;agitare viguroasă timp de minim 30 min.Fiîtrarea se realizează pe 2 membrane filtrante cu diametru al porilor de 0,45 um, diametru care reţine bacteriile;

-Filtre din nitrat de celuloză pentru soluţii apoase, uleioase, slab alcoolice -Filtre din acetat de celuloză pentru probe puternic alcoolice După filtrare una din* membranele filtrante va fi transferată pe un mediu agarizat pentru

numărarea bacteriilor; cea de-a doua membrană filtrantă va fi transferată pe un mediu pentru fungi.

După termostatarea 30-35°C pentru bacterii şi 20-25°C pentru fungi se va calcula numărul de unităţi formatoare de colonii/g sau /ml de produs, folosind un dispozitiv dotat cu un senzor care înregistrează fiecare colonie dezvoltată.

Se folosesc diferite tipuri de echipamente de filtrare în vid, fie din oţel inoxidabil reutiiizabil, fie echipament de unică folosinţă. Filtrele de membrană sunt sterile, ambalate individual steril. Există şi dispensere pentru filtrele de membrană.

3. Metoda încorporării în placă (metoda de însămânţare prin înglobare) sau a numărării microorganismelor în placă

Tehnică Se folosesc plăci Petri sterile cu diametrul de 9 cm, 15-20 ml de mediu fîuidificat la

maximum 45°C. 1 ml soluţie de probă este amestecat cu agar lichid pentru bacterii respectiv pentru fungi.

Se incubează la 30-35°C până la 5 zile pentru bacterii şi la 20-25°C pentru fungi, până la 5 zile. Se calculează numărul unităţilor formatoare de colonii pe gram sau pe ml. a. metoda inundării plăcii b. metoda epuizării pe suprafaţa mediului (cel mai frecvent) Se etalează produsul de studiat pe suprafaţa mediului (medii speciale pentru bacterii şi

fungi); 0,1 ml din proba pregătită va fi etalată pe suprafaţa mediului (cel puţin 2 plăci pentru fiecare diluţie).

Numărul total de microorganisme aerobe rezultă din suma numărului de bacterii şi fungi găsite.

197

Page 24: Capitolul 24 Ecologia Microorganismelor Ce Af Ectează Industria Farmaceutică

Dacă sunt prelevate mai multe probe din puncte diferite ale unui container se va calcula numărul de bacterii aerobe pentru fiecare probă luată.

Teste specifice pentru identificarea microorganismelor din produsele nesterile 1. Evaluarea cantitativă Tehnică: se realizează diluţii din produsul de testat, diluţii care conţin 0,1 g/ml, ^0,01

g/ml, 0,001 g/ml, care se însămânţează pe medii de cultură. Se incubează 24 de ore la 37 C şi apoi se vor realiza subculturi din fiecare diluţie în parte, în vederea obţinerii de colonii izolate.

Se va sublinia care este cantitatea minimă de produs care are rezultate pozitive şi cea mai mare cantitate de produs care are rezultate negative pentru creşterea bacteriană. Calcularea numărului probabil de bacterii prezente pentru fiecare diluţie în parte se face în conformitate cu Farmacopeea Europeană şi este prezentată în tabelul următor.

Rezultatele pentru fiecare cantitate de produs Nr. probabil bacterii /g

0,1 g sau 0,01 g sau 0,01 . 0,001 g sau 0,001 ml produs 0,1 ml ml

+ Mai mult de 10

Mai puţin de 10 dar mai mult de 10 Mai puţin de IO2 dar mai mult de 10 Mai puţin de 10

+++ peste IO3

++ 103-102 + 102-10

mai puţin de 10

. ■ .■ - - - 2. Determinarea anumitor microorganisme cu interes deosebit (saprofite

condiţionat patogene sau patogene) ' Se fac culturi pe medii de îmbogăţire specifice bacteriei pe care dorim sa o izolam,

însămânţare pe medii selective sau speciale şi identificarea coloniilor suspecte prin metode biochimice.

Exemple de astfel de determinări: pentru Escherichia coli, Salmonella spp, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, alte bacterii Gram negative, Clostridium perfringens.

198

+


Recommended