Partea I Capitolul X. BIODISPOZITIVE ŞI BIOSENZORI 10.1. Introducere 10.1.1. Introducere în domeniul “bio- engineering” Într-o primă etapă dorim să subliniem importanţa domeniului bio-ingineresc, în contextul actual. Vom porni de la câteva motive de ordin social şi economic. Se ştie că populaţia globului este în creştere numerică. În diverse rapoarte sociologice se specifică o creştere a mediei de vârstă. În Europa, se prognozează că până în anul 2020 peste 30% din populaţie va avea o vârstă mai mare de 60 de ani, în timp ce procentul persoanelor cu handicap va tinde spre 20%, [66]. Este de la sine înţeles că rata bolilor cronice va fi în continuă creştere. În schimb, numărul limitat de medici nu va mai putea satisface o cerere atât de numeroasă. Serviciile de sănătate publică au reacţionat la acest fapt. În cadrul unui program de sănătate publică internaţional [66, 67], s-au lansat trei direcţii principale de lucru în următorii zece ani:
Transcript
Partea I
Capitolul X. BIODISPOZITIVE ŞI BIOSENZORI
10.1. Introducere10.1.1. Introducere în domeniul “bio-engineering”
Într-o primă etapă dorim să subliniem importanţa domeniului bio-ingineresc, în contextul actual. Vom porni de la câteva motive de ordin social şi economic. Se ştie că populaţia globului este în creştere numerică. În diverse rapoarte sociologice se specifică o creştere a mediei de vârstă. În Europa, se prognozează că până în anul 2020 peste 30% din populaţie va avea o vârstă mai mare de 60 de ani, în timp ce procentul persoanelor cu handicap va tinde spre 20%, [66]. Este de la sine înţeles că rata bolilor cronice va fi în continuă creştere. În schimb, numărul limitat de medici nu va mai putea satisface o cerere atât de numeroasă. Serviciile de sănătate publică au reacţionat la acest fapt. În cadrul unui program de sănătate publică internaţional [66, 67], s-au lansat trei direcţii principale de lucru în următorii zece ani:
(1) sporirea accesului individual la actul medical decizional, prin intermediul “telemedicinei” şi “internetului”. Pacientul se poate informa despre boala sa, se autourmăreşte în timpul tratamentului (cu ajutorul unor biodispozitive, biosenzori) şi poate fi monitorizat “de la distanţă” de către medic.(2) creşterea rolului geneticii în depistarea precoce, prevenirea şi corectarea unor boli.(3) “Electronic healthcare” sau orientarea noilor tehnologii electronice – micro şi nano – spre îngrijirea sănătăţii.
În scopul îndeplinirii acestor trei deziderate se va lucra intens în următoarele arii, [68]:a) Telemedicina – se referă la crearea unei reţele de comunicaţii de tip Internet, între: unitatea medicală, unitatea farmaceutică şi pacient. Acest
sistem poate servi la îngrijiri medicale la domiciliul pacientului, permite consultaţii profesionale de la distanţă, ori rezolvă cazuri de urgenţă pentru pacienţii aflaţi în locuri izolate.b) Analize biologice. În acest sens, se doreşte realizarea unor biosenzori ce pot fi utilizaţi direct de către pacient. Momentan există sisteme de monitorizare individuală a glicemiei şi ureei. Din punct de vedere al plasării biodispozitivelor, există două metode de abordare: (1) metode invazive (“in vivo”), când biodispozitivul este implantat în corpul pacientului (aici elementul cheie este găsirea de materiale biocompatibile); (2) metode ne-invazive (“in vitro”), când se prelevează sânge sau alt biolichid (printr-o puncţie spre exemplu), iar apoi analiza se efectuează în afara corpului.c) Monitorizarea pacienţilor – are în vedere totalitatea metodelor de transmitere în timp util, a tuturor parametrilor măsuraţi cu ajutorul biosenzorilor, spre un centru medical decizional (fizic sau virtual). Interpretarea analizelor se va face fie de către o persoană fizică, fie de către un software specializat.d) Crearea de dispozitive implantabile pentru: regenerarea funcţiei unor organe, tratamentul bolilor cronice, înregistrarea de semnale biologice, proteze pentru diferite organe.e) Chirurgie cu invazie minimă . Tehnica laparoscopică a minimizat mult invazia în actul chirurgical. Finalul acestei curse ar fi intervenţia chirurgicală la nivel celular. Acest domeniu reprezintă o cerere continuă pentru industria de micro- şi nano-componente electronice. f) Succesul geneticii , care este condiţionat de existenţa unor nano-instrumente şi nano-dispozitive, necesare manipulării materialului genetic.
Acum câteva detalii de ordin economic. În 1996, se estima valoarea desfacerilor de produse medicale pe plan internaţional la 130B$ [68]. Dintre acestea, microsistemele din aparatura medicală valorau 120M$ [68]. Asta înseamnă că microsistemele sunt prezente în majoritatea aparatelor medicale. Pentru produse în valoare de 73B$ a rezultat următoarea repartiţie, [68]: 37B$ pentru instrumentar medical şi chirurgical, 19B$ pentru analize de sânge efectuate cu biosenzori, 12B$ pentru sisteme furnizoare de medicamente, 2.5B$ pentru aparate necesare bolilor cardiace, 2.5B$ pentru proteze auditive.
Se observă că piaţa biosenzorilor este o provocare pentru micro- şi nano-electronică. Aici nu mai există delimitări clare între domeniile: electronic, biologic, chimic, fizic. În final, toate elementele componente ale biosenzorului sunt integrate pe un singur cip sau pe un multicip hibrid [68]. În continuare se va descrie principiul senzorial din lumea vie. Înţelegând
bine aceste mecanisme, proiectanţii de biosenzori au căutat să aducă cât mai aproape de natură principiul de funcţionare al senzorilor.
10.1.2. Principiul senzorial în lumea vie
Biosenzorii au fost realizaţi după o atentă observaţie a receptării substanţelor în lumea vie. La scară microscopică, vorbim despre recepţionarea substanţelor la nivel celular. Cuplarea unor substanţe de celule provoacă schimburi de sarcini ionice, eliberare de substanţe semnalizatoare etc. Aceste "impresii" sunt transmise mai departe pe cale biochimică. Să vedem în continuare cum captează o celulă vie doar o anumită substanţă din mediul înconjurător.
Celulele vii au posibilitatea să se adapteze la modificările mediului exterior cu ajutorul receptorilor. Receptorul constă dintr-o proteină ce este legată la membrana celulei. El posedă o înaltă afinitate de a se cupla doar cu anumite substanţe ce pot fi: hormoni, enzime, anticorpi, produşi de metabolism, ioni - denumite liganţi. Un receptor este specializat strict pe o substanţă. Spre exemplu, în sistemul nervos uman s-au evidenţiat două tipuri de receptori pentru neurohormonul acetilcolină: nicotinici - constau în proteine cu proprietăţi ionofore şi muscarinici - receptori cuplaţi de proteina G şi bazaţi pe sistemul mesagerilor secundari, [69, 70].
Fig. 10.1. Captarea unui ligant în receptorul celulei.
Legarea ligantului de proteina receptor cauzează schimbări structurale ale receptorului. Aceste modificări permit deschiderea temporară a unui canal
Na+
K+
Proteină - Receptor
Membrană celulară
Mediu intern celular
Biolichid (purtător de liganţi)
Mediu extern celular
Ligant
prin membrana celulei, pentru ionii cu mobilitate mare: Na+, K+ (vezi fig.10.1). Influxul de ioni pozitivi Na+, K+, modifică puternic potenţialul membranei (chiar o singură legătură produce o creştere detectabilă de potenţial). Se obţine astfel amplificarea substanţială a semnalului incident. După transmiterea semnalului, cel mai adesea, complexul receptor-ligant se degradează în interiorul celulei. De aceea, regenerarea unui nou receptor în membrană necesită ceva timp. Cele mai simple proteine receptor utilizate în domeniul biosenzorilor, au fost enzimele.
10.1.3. De la celula vie la biodispozitiv
De multe ori “tehnica" a împrumutat principii de funcţionare din principii similare biologice. Există dispozitive electronice ce pot fi considerate dualele unor simţuri: fototranzistorul "simte" semnalul luminos şi-l transmite amplificat, iar dispozitivele acustice cu cristal piezoelectric echivalează cu celulele receptoare de sunet, etc.
Biosenzorii sunt biodispozitive sau părţi ale acestora, care recepţionează substanţe. Deci clasa biodispozitivelor este o clasă mai largă, care o include pe cea a biosenzorilor.
Definiţie: Vom înţelege prin biodispozitiv un ansamblu de părţi electrice, biologice, mecanice, optice – ca elemente active – (traductoare, amplificatoare, de caracterizare, etc) şi a unor elemente de interconectare, capsule, terminale, microcanale de alimentare cu biolichid – ca elemente de conectare cu mediul extern.
Biodispozitivul poate avea funcţii complexe. Atunci când el este construit doar pentru a detecta o anumită substanţă, poartă numele de biosenzor. Dar există biodispozitive create şi în alte scopuri: caracterizarea unor materiale biologice, furnizarea unui medicament, sau detectarea multor substanţe (biodispozitiv de tip multisenzor) combinată cu furnizarea de substanţe, vehicularea şi manipularea de substanţe, ţesuturi, etc.
Un exemplu de biodispozitiv este cel utilizat pentru furnizarea insulinei la diabetici. Acest dispozitiv conţine ca elemente active: structuri traductoare care detectează nivelul glicemiei şi o micropompă pentru insulină, [68]. În continuare ne vom focaliza atenţia mai mult asupra biodispozitivelor ce au ca unică funcţie recepţionarea de substanţe – biosenzorii.
10.2. Biosenzor - definiţii, clasificări
Definiţie: Biosenzorul constă în cuplarea spaţială între un substrat biologic activ (receptorul) imobilizat pe un traductor de semnal (dispozitiv electronic) şi un circuit electronic de amplificare. Toate aceste elemente integrate într-o singură capsulă poartă numele de biocip. În figura 10.2 este prezentată schematic structura bloc a unui biosenzor.
O problemă specifică a biosenzorilor este imobilizarea receptorilor pe suprafeţele dispozitivelor electronice. Doar cu titlu informativ, dăm ca exemple câteva metode: a) adsorbţia biomoleculelor pe suprafeţe (ce utilizează forţele de adeziune, iar alteori forţele de atracţie electrostatică); b) captarea biomoleculelor în geluri din polimeri (fixarea moleculelor este mai sigură); c) crearea unor reacţii chimice prin care biomoleculele se leagă covalent de elementele traductorului.
O altă problemă specifică este refacerea substratului biologic (după consumarea complexului receptor-ligant) pentru o nouă măsurătoare. Timpul de regenerare al receptorului este un parametru important în alegerea unui biosenzor de către un utilizator.
Fig. 10.2. Prezentareaschematică a unui biosenzor.
Substanţa purtătoare a diverşilor liganţi, poate fi: ser, limfă, sânge; generic o vom denumi biolichid. Spre exemplu în sânge există o multitudine de liganţi. Receptorii au rolul de a extrage din acel amestec o singură substanţă, pentru care au afinitate. Această substanţă, pentru analiza căreia a fost conceput biosenzorul, o vom numi analit. Spre exemplu dacă se doreşte măsurarea concentraţiei de glucoză din sânge, se foloseşte ca receptor enzima GOD (glucozoxidază), iar analitul este glucoza.
RECEPTOR
TRADUCTOR
(DISPOZITIVELECTRONIC)
Substanţe purtătoare de diverşi liganţi
Semnal electric (I, V)
Circuit electronicde amplificare
Modificările ce au loc în biosenzor la reţinerea analitului, pot fi: modificarea grosimii unui strat, schimbarea indicelui de refracţie, a temperaturii, modificări în absorbţia luminii, creşterea sarcinii electrice, modificări de potenţial electric sau de curent electric. Clasificarea biosenzorilor.1) Biosenzori de afinitate. Analitul nu se modifică chimic în timpul măsurătorii. El doar se leagă de receptor. La sfârşit el poate fi îndepărtat chimic sau prin spălare. 2) Biosenzori de metabolism. Aici substratul biologic se consumă printr-o reacţie chimică cu analitul. Se formează un nou produs. Starea iniţială se poate reface după completa consumare a analitului. Exemplu: se doreşte detectarea microorganismului Helycobacter Pylor în substanţa purtătoare - suc gastric. În metabolismul său, acest microb produce NH3 (amoniac). Aşadar, senzorul nu va detecta microbul în sine, ci concentraţia de amoniac. 3) Imunosenzori. Detectarea substanţelor de tip antigen (Ag) se face cu ajutorul anticorpilor (Ac), pe principiul "lacăt-cheie". Anticorpii sunt proteine cu molecule în formă de Y (numite imunoglobuline). În vârfurile Y-ului sunt doar două locuri, unde se poate leaga un singur tip de antigen. Aceşti anticorpi sunt produşi de organism ca răspuns la o anumită substanţă străină (antigen), pe care nu o poate elimina prin fagocitoză şi căreia, în ultimă instanţă, îi "încurcă planurile", legându-se de ea: Ac+Ag AcAg. Exemplu: În referinţa [2] se descrie un biosenzor cu material piezoelectric acoperit cu anticorpi pentru Candida Albicans (microorganism din familia fungilor). În timp de aproximativ o oră celulele receptoare au captat între 106 şi 108 celule de Candida A., având ca rezultat scăderea frecvenţei de rezonanţă a cristalului piezoelectric cu 0,5...1,4kHz.4) Senzori biomimetici. Cu ajutorul acestor senzori se detectează semnale fizice (sunet, stres mecanic, lumină) pe baza interacţiunii lor cu substratul biologic activ (receptorul).
10.3. Structura şi funcţiile traductorilor
Traductorii trebuie să convertească în mărimi electrice parametri generali ca: entalpia de reacţie (termistorul), modificări ale masei depuse (cristal piezoelectric), grosimi ale unor straturi transparente (dispozitive optoelectronice), concentraţii de substanţe sau ioni (traductoare ISE).
10.3.1. Traductori termici
La senzorii de metabolism există reacţii chimice între analiţi şi anumiţi receptori enzimatici cu degajare / absorbţie de căldură. În acest caz nu se măsoară cantitatea analitului, ci variaţia de temperatură, T. Tabelul 10.1 prezintă entalpiile molare, H, a câtorva reacţii catalizate de enzime.
Tabelul 10.1. Entalpiile molare a câtorva reacţii catalizate de enzime.
Enzima-receptor se imobilizează pe sticlă poroasă pe suprafaţa unui termistor. Se imersează totul în soluţia de măsurat. Termistorul joacă rolul traductorului şi furnizează T. De aici rezultă numărul de moli de analit, conform relaţiei:
(10.1)
unde ν este numărul de moli de analit, C este căldura molară a dispozitivului (ce se determină anterior prin măsurători calorimetrice). Dezavantajul principal este schimbul de căldură ce apare între diversele componente ale experimentului, ceea ce va induce erori mari în evaluarea lui T. Optimizările vizează izolarea calorimetrică a biosenzorului într-un reactor.
10.3.2. Traductori optoelectronici
Cu ajutorul traductorilor optici se poate indica variaţia unor parametri precum: coeficient de absorbţie a luminii, lungime de undă, indice de refracţie, grosimi ale unor straturi transparente. Ca exemplu, în figura 10.3, este prezentat principiul de detectare a albuminei serice cu un senzor optoelectronic, [2].
Rec.
Rec.
Rec.
Rec.
Rec.
Rec.
A
Membrana debromocresol
A
A
LEDFotodioda
Biolichidpurtătorde analit A
Fig. 10.3. Principiul de detectare a albuminei serice cu un senzor optoelectronic.Receptorul a fost imobilizat pe o membrană de bromocresol transparent. Curgerea biolichidului purtător de albumină a determinat captarea ei pe receptori. Creşterea grosimii stratului de analit se face între o sursă de lumină (led) şi un detector de lumină (fotodiodă). Curentul prin fotodiodă scade pe măsură ce creşte grosimea stratului de albumină depus pe receptor.
10.3.3. Traductori piezoelectrici
Principiul pe care se lucrează aici urmăreşte scăderea frecvenţei de rezonanţă a unui cristal piezoelectric când se absoarbe un material străin la suprafaţa sa şi-l comprimă, [71]. Cristalul este acoperit cu un material receptor. Efectele zgomotului electric au putut fi înlăturate prin utilizarea de cristale pereche. Aceşti traductori au fost utilizaţi pentru detectarea: NOx, COx, H+, microorganisme, [2].
10.3.4. Traductori electrochimici
Reacţiile electrochimice se produc la interfaţa electrod – soluţie, iar reacţiile biologice cu transfer de electroni se produc la interfaţa enzimă – soluţie. Se utilizează potenţiometria, când se determină variaţia potenţialului electric al unui electrod receptor în funcţie de concentraţia ionilor de analit dintr-o soluţie. Metoda tradiţională de detecţie a unor ioni într-o substanţă purtătoare foloseşte ISE (Ion Selective Electrodes). Din punct de vedere electronic ISE poate fi privită ca o sursă de tensiune electromotoare (de sute de milivolţi pentru biosenzori) şi cu o impedanţă de ieşire mare (până la sute de M), [72]. Masa electrică este soluţia, iar ieşirea sursei este electrodul de referinţă. Dacă concentraţia ionilor de analit din soluţie se modifică, atunci potenţialul electrodului sensibil la aceşti ioni (receptorul) se modifică după relaţia lui Nerst, (9.8). Spre exemplu, în cazul pH-ului (concentraţia ionilor de H+), o scădere a acestuia cu o unitate, determină creşterea tensiunii furnizate cu circa 55mV, [72].
Mulţi biosenzori electrochimici folosesc amperometria. În acest caz au loc reacţii chimice de oxido-reducere cu transfer de electroni în medii electrolitice. În domeniul biosenzorilor, această tehnică a însemnat detectarea unui analit prin măsurarea concentraţiei unui produs de metabolism, mult mai uşor de determinat. Pentru aceasta se folosesc electrozi cu enzime receptor aşezate în unul sau mai multe straturi. Pentru
măsurarea concentraţiei de glucoză se foloseşte enzima GOD care accelerează foarte mult procesul de oxidare al glucozei, în urma căruia rezultă şi H2O2. Este mult mai uşor să se măsoară concentraţia de H2O2, după care se calculează din reacţie concentraţia de glucoză. Curenţii care se stabilesc în aceste straturi sunt de natura unor curenţi de difuzie, [2]. Curentul, Ilim este proporţional cu concentraţia substanţei care se determină mai uşor, ci, (i=H2O2, în exemplul anterior cu glucoza), conform modelului (9.14), (9.15).
10.3.5. Traductori biologic intacţi
Pentru determinarea unui analit, aceste traductoare folosesc chemoreceptori direct din lumea vie. Spre exemplu, s-a realizat un receptor de acetilcolină, utilizând organul electric al peştelui Torpedo şi un senzor capacitiv, [2]. Când biolichidul purtător conţinea acetilcolină în concentraţie mărită, creştea tensiunea electrică furnizată de traductorul organic al peştelui, ceea ce încărca senzorul capacitiv. S-au putut face măsurători în domeniul 1....100mol/l concentraţie de acetilcolină în biolichidul purtător prin tehnici de C-V-metrie.
Altă direcţie de lucru este cuplarea unor celule receptoare vii cu una sau mai multe fibre nervoase. Stimularea unor celule olfactive sau gustative cu un anumit analit conduce la generarea unui impuls nervos detectabil către neuronii din fibră. Ca exemplu, s-a realizat un senzor pentru determinarea concentraţiei de aminoacizi, utilizând drept traductor organul olfactiv din antenulele crabului Calinectes Sadipus. Antenulele, legate de o unică fibră nervoasă, au fost conectate cu o sondă de platină. Stimularea receptorilor olfactivi cu aminoacidul L-glutamat, în concentraţia 0,01...1mmol/l, a creat impulsuri nervoase măsurabile, cu valori cuprinse între 10-1000V. În plus, s-a obţinut o linearitate bună în această gamă de măsură, [2].
Observaţie: Au fost amintite şi exemplificate o serie de substanţe ca: acetilcolina, dopamina, ioni de Na+, Ca+, K+. Ele participă ca neurotransmiţători la propagarea impulsului nervos. De reţinut, că transmiterea unui impuls nervos se face pur electric: prin deplasare de sarcină electrică. Datorită acestei comportări "electronice" a sistemului nervos uman, s-a dezvoltat o ramură nouă în ştiinţele biologice: neuroelectrofiziologia, [2].
10.4. Dispozitive Bio-FET
Prin Bio-FET vom înţelege totalitatea dispozitivelor biologice ce conţin ca element traductor activ un tranzistor cu efect de câmp. Ele pot fi biosenzori (precum tranzistoarele ISFET, ENFET, etc) sau dispozitive de testare şi investigare a materialelor biologice, sau dispozitive create în alte scopuri.
10.4.1. Tranzistoarele ISFET
Tranzistoarele ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) au derivat direct din ISE (electrozii sensibili la ioni). Din punct de vedere constructiv, dispozitivul ISFET este un MOSFET, pentru care receptorul - un electrod ce sezizează doar anumiţi ioni (de exemplu de Ca+, K+…) - este un metal special (Pt, Pd, Ir). Regiunea porţii este imersată într-o soluţie biologică cu analit. Modelarea se face analog cu cea a MOS-FET-ului, doar că tensiunea de poartă VG depinde de concentraţia ionilor de analit conform relaţiei lui Nerst. O categorie aparte o reprezintă tranzistoarele MEM-FET (MEMbrane-FET), la care electrodul receptor este o membrană organică depusă în dreptul porţii tranzistorului, şi care captează selectiv sarcina ionică. În figura 10.4. este prezentată structura şi simbolul ales pentru tranzistorul ISFET.
(a) (b)
Fig. 10.4. a) Structura tranzistorului ISFET; b) Simbol.
Tensiunile aplicate: VS=VSB=0, VG>0 şi VD>0 se menţin constante. Când concentraţia ionilor de analit creşte, se modifică diferenţa de potenţial metal-semiconductor, conform cu relaţia (9.8). Deci variază VFB şi în consecinţă potenţialul porţii. Rezultă o îmbogăţire a canalului în electroni,
G
D
SB
S
. . . . . . . . . . . .
Canal de electroni
p-substrat
SB (Substrat)
n+ n+
S D SiO2/ Si3N4
G Biolichid cu ioni ISE de analit
iar în final o creştere a curentului de drenă. Fluctuaţiile concentraţiei de ioni de analit se traduc prin fluctuaţii ale curentului ID.
Adoptând pentru curentul de drenă al tranzistorului ISFET modelul simplificat în regim cvasiliniar (5.52), plus efectul tensiunii de poartă asupra mobilităţii purtătorilor din canal, (5.61), în care neglijăm termenul VDS
2, la tensiuni VDS mici, avem:
(10.2)
Tensiunea de poartă totală, VGt este suma tensiunii, VG, aplicată de la o sursă externă şi a potenţialului de electrod ΔΦME, dat de relaţia lui Nerst:
(10.3)
Prin înlocuirea relaţiei (10.3) în relaţia (10.2), rezultă dependenţa curentului de drenă, ID, de concentraţia de analit, cA:
(10.4)
Observaţie: Ne dorim o sensibilitate curent-concentraţie de analit cât mai mare. Relaţia (10.4) arată că este mai favorabil un regim de lucru la tensiuni VGt mici, astfel încât să se poată neglija efectul atenuării mobilităţii sub influenţa câmpului electric transversal. Rezultă astfel, o dependenţă logaritmică curent-concentraţie. În plus, dacă s-ar lucra sub prag, unde ID
depinde exponenţial de VG (vezi relaţia 5.94), prin compunere cu relaţia lui Nerst ar rezulta o dependenţă polinomială curent-concentraţie, net superioară funcţiei logaritmice.
Observaţie: ISFET-urile care determină concentraţia ionilor de H+ se mai notează prin pH-FET-uri, ţinând cont că pH=-lg [cH+]. O soluţie apoasă este neutră când pH=7, moment în care concentraţia ionilor de H+ o egalează pe cea a ionilor negativi de OH-. Soluţia apoasă este acidă pentru pH<7 şi bazică pentru pH>7. Pentru electrolitul complex al organismului uman neutralitatea are loc de asemenea când cH+=cOH-, dar aceasta se întâmplă la temperatura de 370C pentru un pH=6,75. Sângele are pH=7,36, deci se comportă slab bazic.
Cu acest gen de tranzistor s-au făcut experimente pentru determinarea concentraţiei ionilor de H+ şi K+. National Company Japan a realizat un
biosenzor integrat pe cip de tipul Silicon On Sapphire, conţinând un K+-FET cu membrană de GOD şi două H+-FET cu membrană de urează. Cu acest biosenzor se pot face simultan analize de glucoză şi uree în sânge [2].
Alt exemplu. S-a realizat un dispozitiv ISFET, ca senzor de metabolism, ce măsoară concentraţia de amoniac, ca în figura 10.5, [2]. Receptorul care sesizează NH4
- este Paladiu (Pd). El este depus peste oxidul de poartă. Se constată o creştere majoră a sensibilităţii biosenzorului dacă peste Paladiu se depune un strat de Iridiu (Ir). Se obţine o creştere a tensiunii VG de la 20mV în cazul electrodului de Pd, la 400mV în cazul acoperirii Pd cu Ir, când concentraţia de NH4
- este 400ppm. De reţinut aceste două materiale: paladiu, iridiu, în construcţia biosenzorilor.
Fig. 10.5. Dispozitiv MOS pentru detectarea ionului de amoniu.
Un alt dispozitiv specific măsurătorilor de potenţiometrie este prezentat în figura 10.6. Scopul acestui Bio-FET este caracterizarea electrică a unor biolichide, [2].
(a) (b)0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 VG(V)
ID(A)
80
60
40
20
. . . . . . . . . . . .
p-substrat
SB
n+ n+
S D
VG biolichid
Pd SiO2
NH3
Ir Ir Ir Ir Ir
VS VD
VG
Semiconductor organic
Suport izolator
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
~ ~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
Fig. 10.6. a) Dispozitiv Bio-FET microelectrochimic; b) Caracteristica ID-VG măsurată.
Primul dispozitiv microelectrochimic studiat deţinea semiconductori organici (polimeri) depuşi între sursă şi drenă. Se obţineau caracteristici ca de diodă. Dacă în plus intervenea al treilea electrod - poarta, se obţineau caracteristicile din figura 10.6.b., pentru semiconductorul organic din polianilină. Ca şi la tranzistoarele MOS, s-a constatat că în vecinătatea "pragului", rezistenţa între sursă şi drenă variază cu peste 6 ordine de mărime la variaţii foarte mici ale tensiunii VG (cu 0,1...0,3V). Spre deosebire de tranzistoarele pe Siliciu, la tranzistoarele Bio-FET de acest gen, după atingerea unei valori maxime curentul scade. Acest dispozitiv este potrivit pentru studierea proprietăţilor diverselor materiale biologice. Dacă se înlocuieşte semiconductorul organic cu o soluţie neutră, în care se creşte concentraţia unui neurotransmiţător (adrenalină, noradrenalină, acetilcolină, dopamină, serotonină etc) se pot obţine caracteristici ID-VG, furnizoare de parametri de model. Modelele tranzistoarelor MOS pot fi extinse şi aici, pe anumite subdomenii de măsură. Acest lucru permite extragerea unor parametri echivalenţi (tensiune de prag - concentraţie de prag, tensiune de nivel mare - concentraţie de neurotransmiţător de nivel ridicat). Aceşti parametri ar putea fi deosebit de utili în stabilirea unor concentraţii limită între care se face transmiterea impulsului nervos.
Denumirea de ISFET este generică. Prin tranzistoare ISFET trebuie să se înţeleagă doar acele FET-uri care determină concentraţia ionilor într-o soluţie pe baza unui electrod selectiv prin metoda potenţiometrică. Din această clasă de tranzistoare au derivat şi IMuno-FET, ENzime-FET, Microbial-FET, a căror denumire sugerează tipul relaţiei analit-receptor. De aceea, termenul generic de "Bio-FET" acoperă orice tranzistor cu efect de câmp folosit ca element traductor în domeniul biosenzorilor.
M. Gotoh şi colaboratorii săi, [73] a realizat un senzor pentru acetilcolină cu un tranzistor ISFET. Receptorii au fost fixaţi pe poarta tranzistorului cu ajutorul unei membrane de polivinilbutirat. Legarea acetilcolinei de receptori în concentraţie de 0,1....10mol/l a produs creşteri detectabile ale potenţialului porţii (zeci de mV).
Tamya şi colaboratorii, [74] au realizat un senzor de metabolism cu tranzistor Bio-FET pentru determinarea alcoolului. Microorganismul Gluconobacter, care prin metabolismul său produce alcool, a fost prins într-o peliculă de arginat de calciu pe poarta tranzistorului. Astfel de dispozitive fac parte din categoria aşa numitelor Microbial-FET-uri.
IMmuno-Fet-uri sunt tranzistoare cu efect de câmp, a căror poartă este acoperită cu o membrană ce conţine anticorpi. În 1987, D. Begreld, [75] a realizat o astfel de probă pentru detectarea imunoglobulinei umane IgG cu ajutorul albuminei. S-au detectat concentraţii de analit de ordinul 10-11..10-7
mol/l, [2, 75]. Avantajul major al unor astfel de dispozitive este recepţionarea sigură doar a analitului dorit (deoarece se lucrează pe principiul lacăt-cheie). Dezavantajele sunt legate de dificultatea realizării unei membrane receptoare perfect izolatoare, dar şi imuno-responsivă şi suficient de subţire pentru a transmite creşterile de potenţial cauzate de cuplarea Ag-Ac, la suprafaţa semiconductorului.
Cea mai consacrată aplicaţie în medicină a metodei potenţiometrice a fost măsurarea ureei sangvine. Ureea, în prezenţa catalizatorului urează, dă anumiţi ioni ca produşi de reacţie: NH4
+, OH-, HCO3-. Concentraţia acestor
substanţe încărcate electric a fost uşor de măsurat cu ISE. Această clasă tranzistoarelor Bio-FET, ce utilizează o membrană enzimatică receptivă pentru ionii de analit (amoniu, în cazul de faţă) poartă numele de EN-FET (ENzime-FET). Enzima receptoare - urează - se depune fie pe capacitoare MOS cu straturi de Ir/Pd, fie în poarta tranzistorului peste un strat de Si3N4. Răspunsul neliniar al unui astfel de senzor va fi studiat în paragraful 10.9.
Întrebare: Care este diferenţa între ISFET şi ENFET ?Rǎspuns: La tranzistorul ISFET, metalul porţii (Pt, Pd, Ir) este elementul receptor. El reacţioneazǎ electrochimic cu ionii (de H+, K+, Ca+) şi formeazǎ la echilibru termic un ‘’material cu un alt EF’’, conform relaţiei lui Nerst. Variaţiile de concentraţie de analit (ioni în cazul nostru) se traduc în variaţii ale MS. La tranzistoarele ENFET, pe metalul porţii se depune o enzimǎ receptoare (de exemplu acetilcolinesterază - AcChE). Ea va favoriza hidroliza acetilcolinei în colină, acetat şi H+. În urma reacţiei rezultă 1 mol de H+ per 1 mol de reactant de acetilcolină. EN-FET-urile sunt în majoritate senzori de metabolism, iar în cazul de faţă se măsoară concentraţia ionilor de H+. Acesta este rolul enzimei specifice – că accelerează foarte mult o reacţie catalitică (hidroliza în exemplul nostru), şi se obţin ioni de H+ cu preponderenţă din hidroliza doar a analitului (acetilcolină în exemplul nostru). Concentraţia de analit se traduce în concentraţie de sarcinǎ acumulatǎ în poarta tranzistorului şi deci în variaţii de curent prin tranzistor.
10.4.3. Optimizări ale tranzistoarelor Bio-FET
Să considerăm un tranzistor Bio-FET care măsoară concentraţia ionilor de K+ captaţi de o membrană permeabilă. De fapt este vorba de un tranzistor
MIS-FET care are, în locul oxidului de poartă, biolichid ce conţine ioni. Receptorii se pot depune fie lângă metalul porţii, fie lângă suprafaţa semiconductorului, fie sunt dispersaţi în volumul respectiv. Când biolichidul curge prin acest spaţiu, receptorii captează ionii de K+ (în aceeaşi manieră în care celulele vii reţin analiţii din sânge, când acesta curge prin capilare foarte înguste). Ionii se vor aglomera lângă receptor.
(a) (b) (c)Fig. 10.7. Distribuţia sarcinii ionice de analit (K+) captat de receptori (liniile punctate)
ce au fost plasaţi: (a) superior, (b) inferior, (c) uniform în volum.
Metalul porţii deţine un MS cunoscut. Sarcina ionilor de potasiu, captaţi din lichidul purtător de către receptor, polarizează poarta tranzistorului. Acelaşi lucru îl făceau ionii de sodiu şi potasiu în cazul tranzistoarelor MOS, atunci când calculam tensiunea de benzi netede.
Se studiază în continuare poziţia de amplasare optimă a unei membrane cu receptori în spaţiul porţii tranzistorului Bio-FET, astfel încât efectul ionilor să fie cât mai puternic resimţit la suprafaţa semiconductorului, [76]. În figura 10.7 sunt prezentate trei variante de distribuţie a sarcinii electrice ionice în dreptul porţii tranzistorului, când receptorii sunt plasaţi: superior (la x=0), inferior (la x=xG) şi dispersaţi uniform în volumul porţii (vezi şi fig. 10.8).
Fig. 10.8. Structura Bio-FET.
K+
K+ K+ K+ K+ K+
Receptor
0 xG x
sa
M I S
0 xG x
Receptorsb
K+
K+ K+
K+ K+ K+
M I S
K+ K+ K+ K
K+ K+ K+ K K+ K+ K+ K
Receptori
0 xG x
sc
M I S
p-substrat
n+ n+
S D
G
Biolichid cu ioni K+
receptorMetal0
Izol.(Bio-lichid)
xG
Semic.
x
receptor
K+K+
K+
curgere
Prin integrarea ecuaţiei Poisson în spaţiul , se calculează tensiunea echivalentă indusă pe poartă de către ionii K+. Se aproximează distribuţia de sarcină ca fiind liniară în cele 3 situaţii. Dacă se notează cu CG = is/xG capacitatea specifică a izolatorului de deasupra porţii şi cu sa, sb, sc, densităţile de sarcină de suprafaţă în cele 3 cazuri (vezi fig. 10.7.a, b, c), se deduc următoarele expresii pentru tensiunea indusă pe poartă:
; ; (10.5)
Se poate presupune că sa=sb=sc pentru receptori identici, ce atrag aceeaşi cantitate de analit la suprafaţă, indiferent de poziţie. Un răspuns maxim se obţine în cazul c. Dacă nu este posibilă plasarea receptorilor uniform în volum, atunci preferabilă este situaţia b, adică plasarea receptorilor cât mai aproape de suprafaţa semiconductorului.
10.5. Biodispozitive de tip MEMS
Sunt biodispozitive care combină structuri mecanice (micropompe, actuatori) cu structuri microelectronice. În cazul Sistemelor Micro-Electr-Mecanice (MEMS) problemele sunt legate de vehicularea biolichidului în spaţiul porţii tranzistorului. În mod clasic, acest lucru se face cu o micropompă cu membrană şi valve, acţionată de un actuator, figura 10.9.a.
Difuzor
Actuator
Confuzor
Camera de admisie
Camera de refulare
deformată membranaîn repaus
Actuator
Valva V1
Valva V2
Camera de admisie
Camera de refulare
membrana
deformată
în repaus
(a) (b)
Fig. 10.9. Metode de vehiculare a biolichidului: a) micropompă cu membrană şi valve; b) micropompă cu membrană şi difuzor-confuzor.
Prin actuator se înţelege dispozitiv de acţionare. Proiectarea actuatorilor se studiază la automatizări. Dezavantajele acestei micropompe sunt: fiabilitatea scăzută (deoarece valvele fiind elemente în mişcare se pot bloca, defecta uşor), posibilitatea deteriorării unor componente biologice prin închiderea / deschiderea valvelor. De aceea este preferată micropompa cu difuzor-confuzor din fig.10.9.b, fără părţi în mişcare, [77]. Este adevărat că atunci când actuatorul ridică membrana, se absoarbe lichid atât prin difuzor din camera de admisie (un flux mare), cât şi prin confuzor din camera de refulare - fapt nedorit - (dar un flux mic). Oricum, marele avantaj vine din simplitatea tehnologică: microstructurile difuzor-confuzor se realizează uşor prin corodare anizotropă a siliciului; în plus nu au părţi în mişcare.
Fig. 10.10. Structură Bio-FET cu tranzistor SOI-MOSFET.
Actuator
S D
Si-film, p = membrana micropompei = corp tranzistor
canal de inversie
SiSi
Si, p Si, p Si, p
K+
M e m b r a n a c u R e c e p t o r i
Camera de admisie Biolichid Camera de refulare
Biolichid
Gfront
n+n+
Gback
oxid poartă faţă
Oxid îngropat
În figura 10.10 este prezentată o variantă constructivă de tranzistor Bio-FET pe structură SOI şi alimentare prin micropompă cu difuzor-confuzor. Filmul de siliciu reprezintă sediul tranzistorului, dar şi membrana pe care o acţionează actuatorul. Elementul traductor din fig. 10.10 este un tranzistor SOI-MOSFET clasic. Pentru a avea canalul de inversie cât mai aproape de membrana cu receptori, se recomandă polarizarea porţii din spate, Gback. Poarta din faţă, Gfront, poate fi utilizată doar pentru conexiunea mecanică cu actuatorul. Analiza făcută cu formulele (10.5) recomandă plasarea membranei cu receptori pe partea inferioară a filmului de siliciu (cât mai aproape de zona activă a tranzistorului). Microcanalele difuzor-confuzor au o formă în trunchi de piramidă şi se obţin uşor prin corodare (spre exemplu pentru Si <111>, unghiul de corodare este 54,740). Membrana cu receptori poate fi depusă sub stratul îngropat. Acest izolator îngropat reprezintă un excelent strat de stopare a corodării siliciului.
Fig. 10.11. Structură SOI-BioFET optimizată.
Tehnologiile SOI permit realizarea unor filme de siliciu de grosimi variabile. Ele trebuie astfel proiectate încât să reziste din punct de vedere mecanic. Aceasta deoarece din punct de vedere electric, se doreşte un film
S D
Si-film, n = membrana micropompei = = corp tranzistor
SiSi
Si, p Si, p Si, p
K+
M e m b r a n a c u R e c e p t o r i
Camera de admisie Biolichid
Camera de refulare Biolichid
Gback
canal de acumulare
Oxid îngropat
cât mai subţire pentru o sensibilitate maximă a senzorului. Este nevoie ca traductorul să fie sensibil la tensiuni foarte mici (proporţionale cu concentraţii mici de analit). De aceea, se poate utiliza aici tranzistorul pseudo-MOS ca element traductor, deoarece are avantajul faţă de tranzistorul SOI-MOSFET, că "simte" tensiuni de poartă în orice regim de lucru. Astfel, se elimină o grijă suplimentară: aducerea tranzistorului în regim de inversie. Avem următoarele simplificări tehnologice: nu mai sunt necesare difuziile n+ în filmul de siliciu, nici depunerile de oxid şi metal pentru poarta din faţă, Gfront. Mai putem face încă un pas în optimizarea structurii: eliminarea actuatorului. El avea rolul de a ridica şi coborâ membrana de siliciu. Acelaşi efect îl poate avea poarta din spate (care ea însăşi nu este mobilă), dar acţionează un film de siliciu “suspendat”, care se poate arcui. Se pot adapta aici principiile de la tranzistorul MOS cu poartă mobilă, dar având grijă ca deformarea filmului de siliciu să nu ducă la spargerea sa. De fapt, nu este nevoie de o deformare prea amplă a filmului. Mici pulsuri negative-pozitive (de cca 8V), aplicate pe Gback, pot produce încovoieri suficiente ale filmului pentru a recircula biolichidul prin dreptul membranei cu receptori.Figura 10.11. prezintă structura optimizată a SOI-BioFET. Pentru recircularea biolichidului este necesar să se fixeze VS=VD=0V, iar pe terminalul Gback să se aplice într-un timp tr, pulsuri de tensiune de +8V şi respectiv –8V. Această manevră arcuieşte în jos filmul de siliciu la tensiuni pozitive, iar prin confuzor se elimină vechiul fluid; apoi, la tensiuni negative, filmul se arcuieşte în sus şi prin difuzor se absoarbe noul fluid. După timpul de recirculare, tr, (calculat din considerente de microfluidică) se poate presupune că s-a împrospătat tot biolichidul în spaţiul porţii. Urmează măsurătorile electrice.
Pentru măsurarea concentraţiei de analit captat în spaţiul porţii de către receptor, se monitorizează curentul de drenă, ID. Se procedează astfel: se aplică tensiuni constante, de referinţă pe cele 3 terminale: VS=0, VD>0, VGback>0. În acest mod, tranzistorul pseudo-MOS este în regim de acumulare, unde curenţii sunt mai mari şi deci mai uşor de măsurat. Se lasă dispozitivul în repaus un timp de captare, tc, (calculat din considerente biologice: captarea analitului pe receptor). Se citeşte curentul ID. Cu ajutorul acestui curent, dintr-o relaţie de tipul (10.4) se calculează concentraţia de analit, cA.
10. 6. Biodispozitive pentru caracterizare
Spre deosebire de biosenzori, care sunt biodispozitive destinate determinării concentraţiei unui analit într-un amestec de substanţe, biodispozitivele concepute pentru caracterizarea proprietăţilor fizico-chimice ale unor compuşi biologici pot măsura alte mărimi decât concentraţiile (curenţi, capacităţi electrice). Prin măsurători polarografice se determină curentul în funcţie de tensiunea aplicată pe biodispozitiv.
Diferenţa dintre polarografia clasică, utilizată în chimie, şi cea aplicată aici constă în faptul că biodispozitivul lucrează cu o cantitate mult mai mică de substanţe. Spre exemplu, dacă într-o instalaţie chimică de polarografie se utilizează 100-500 ml soluţie între doi electrozi metalici, la biodispozitive cantitatea de soluţie ajunge la 0,1-0,5 ml. Uneori această cantitate infimă de biolichid este încapsulată în cadrul unei structuri complexe pentru a evita evaporarea sau reacţiile chimice secundare nedorite. Alteori este închisă într-o cavitate ce comunică cu exteriorul sau cu un microrezervor prin intermediul unei membrane semipermeabile.
În fig.10.12.a este prezentat un biodispozitiv pentru caracterizarea soluţiei de epinefrină (adrenalină) de concentraţie 1 mg/ml, de uz farmaceutic. Această substanţă este un neurotransmiţător (sau un neurohormon) din familia catecolaminelor. Ambele denumiri provin fie din latinescul “ad-renes” fie din grecescul “epi-nephros” şi înseamnă literal acelaşi lucru: “pe rinichi”, sugerând prin aceasta, glanda suprarenală care secretă acest neurotransmiţător. Din punct de vedere chimic adrenalina, C9H13NO3, conţine un lanţ aromatic (“catecol”), la care se leagă un grup ce conţine nitrogen (“amina”), fig.10.12.b.
(a) (b)Fig.10.12. Structura biodispozitivului, (b) formula chimică a epinefrinei ca ion.
Cei doi electrozi metalici, Met1 şi Met2, au fost denumiţi sursă şi drenă (notaţi S şi D), iar tensiunea pe biodispozitiv a fost notată cu VDS. Volumul de biolichid utilizat a fost de aproximativ 0,2 ml (1 picătură), iar distanţa dintre electrozi d=1mm. Izolatorul 1 a fost plexiglassul, iar izolatorul 2 aerul. Cei doi electrozi metalici au fost realizaţi din aliajul Sn 60 Pb38 Cu 2 ISO – 9453 (25), [78].
În figura 10.13 sunt prezentate rezultatele experimentale. Biodispozitivul înseriat cu o rezistenţă de valoare mare, R=110 kΩ, a fost alimentat la o sursă de tensiune US. În figura 10.13.a sunt prezentate rezultatele măsurătorilor în curent continuu, sub forma caracteristicilor ID – VDS. Apariţia regiunilor cu rezistenţă diferenţială negativă demonstrează amorsarea unei surse interne de tensiune inversă, bazată pe reacţia electrochimică de reducere a adrenalinquinonei în adrenalină, [79]:
Pe porţiuni, caracteristica poate fi modelată cu relaţia Butler – Volmer, dacă predominant este procesul de electrod sau cu legile de difuzie ale lui Fick, dacă predominant este procesul de difuzie a ionilor de analit. Oricum ambele relaţii descriu dependenţe neliniare, exponenţiale pe porţiuni ale caracteristicii statice a biodispozitivului, care prin logaritmare dau relaţia Tafel de legătură dintre curent şi potenţialul pe dispozitiv:
(10.6)
unde: ID este curentul prin biodispozitiv, VDS – tensiunea între Sursă şi Drenă, α(0,1) este coeficientul de transfer, q – sarcina electrică elementară, z – numărul de electroni schimbaţi în reacţia de oxido – reducere (z = 2 în cazul de faţă), k – constanta lui Boltzmann, I0 – curentul de saturaţie pentru reacţia de oxido-reducere, sau curentul limită pentru procesul de difuzie (ce depinde de constanta de difuzie a moleculei de epinefrină). Presupunând procesul redox predominant, se poate determina rata reacţiei de oxidare a adrenalinei, KAdr+ , din relaţia, [62]:
0
50
100
150
200
250
300
350
0 1 2Potential, [ V ]
Cur
ent [
uA],
(Adr
1, N
aCl)
0
5
10
15
20
25
Cur
ent [
uA],
(Adr
2)
NaCl Adr1 Adr2
0
10
20
-100 400 900timp ( s )
Tens
iune
sur
sa
Us
( V )
-500
0
500
1000
1500
2000
Tens
iune
bio
disp
oziti
v ( m
V )
Us(V)U adren. U NaCl
Fig. 10.13. (a) Caracteristicile ID -VDS ale biodispozitivului cu 2 terminale în curent continuu; (b) Curbele de comutaţie.
(10.7)
La nivelul sinapsei neuronale aceşti neurotransmiţători asigură transmiterea impulsului nervos (care este o supratensiune de la -30mV la 70mV). Aşadar, fiziologic predomină un regim de comutaţie. De aceea, în fig.10.13.b au fost studiate curbele VDS – timp în regim de comutaţie pentru două biolichide: soluţii apoase de adrenalină (caz în care VDS s-a notat cu Uadren) şi de NaCl cu aceeaşi concentraţie de 1mg/ml (caz în care VDS s-a notat cu UNaCl în figura 10.13.b). Adrenalina este mult mai sensibilă la variaţii de tensiune electrică decât clorura de sodiu. Astfel, se observă în fig.10.13.b că atunci când tensiunea sursei externe US a comutat de la 0V la 2V, tensiunea pe biodispozitivul cu soluţie de adrenalină a atins 320mV, în timp ce tensiunea pe biodispozitivul cu soluţie de NaCl a atins doar 90mV, [79].
Semiconductoarele organice tind să înlocuiască clasicele joncţiuni pn pe Siliciu, în măsura în care prezintă conducţie electrică neliniară. Biolichidele şi în special cele utilizate de sistemul nervos în propagarea influxului nervos pot fi candidaţi demni de luat în seamă, aşa cum rezultă experimental. Întrucât în biodispozitive conducţia electrică prin soluţie este şi ionică şi electronică, se poate pune problema obţinerii unor separări de sarcini prin acţiunea unui al treilea electrod.
-180
-140
-100
-60
-20
20
0 10 20 30
V g ( V )
I d
( u
A )
Vd=1VVd=2V
(a) (b)Fig.10.14. (a) Structura biodispozitivului de test cu trei terminale; (b) caracteristica ID –
VGS în curent continuu.
În fig.10.14.a este prezentat un biodispozitiv de caracterizare cu trei terminale ce utilizează aceleaşi materiale ca şi cel anterior prezentat. Metalul de poartă Met 3 a fost Al plasat pe spatele izolatorului1, iar biolichidul soluţie de epinefrină 1mg/ml. În fig. 10.14.b sunt prezentate curbe ID – VGS măsurate la tensiunile VDS= 1V, 2V. Liniaritatea acestor curbe în gama de măsură abordată, infirmă instalarea unor canale de inversie/acumulare; dar dezalinierea lor pentru cele două valori distincte ale lui VDS probează experimental că al treilea terminal influenţează curentul prin biodispozitiv, probabil datorită segregării ionilor pozitivi şi negativi care circulă prin soluţia lichidă.
10.7. Biodispozitive pentru furnizarea de substanţe active
Toate biodispozitivele utilizate ca proteze auditive, ca implant sub-retinal, biostimulatoare cardiace, detectoare de uree – declanşatoare de dializă, detectoare de glucoză – declanşatoare de insulină, micropompe de dozare/microdozare de medicamente reprezintă câteva exemple de biodispozitive concepute în scopul substituirii unor deficienţe organice. De cele mai multe ori ele includ un sistem de biosenzori multifuncţionali, integrat cu circuitul electronic de prelucrare într-un biocip, sau structuri MEMS obţinute prin micro ori nanotehnologii. În prezent, convergenţa dintre ştiinţa materialelor biocompatibile şi microtehnologii au direcţionat aceste biodispozitive spre aplicaţii in vivo. Aşa au apărut biodispozitivele implantabile în ţesut, oferind platforme pentru terapeutică, precum livrare de substanţe active la momentul oportun.
Met3
)
În fig.10.15 este prezentat un biodispozitiv implantabil pentru furnizarea insulinei. El face parte dintr-o clasa mai largă, bazată pe aşa numitele biomicrocapsule, care au scopul de a asigura un spaţiu sigur pentru o specie de celule închise într-o cavitate şi plasate în interiorul unui organism gazdă.Se creează o cameră imunoizolantă reprezentată de două membrane semipermeabile, care să permită schimbul de nutrienţi cu exteriorul. Urmează închiderea camerei după introducerea celulelor. Materialele membranei trebuie să asigure o funcţionare normală a celulelor încapsulate, fără să permită recunoaşterea lor din partea corpului, deci evitarea funcţiilor de respingere.
Din punct de vedere tehnologic se porneşte de la corodarea anizotropă a două plachete de siliciu până la obţinerea unor membrane subţiri cu grosimi de circa 10 μm. Aceste membrane sunt porozificate astfel încât se obţin microcanale cu lungimi între 6-9 μm şi diametre nanometrice. Se creează camera imunoizolantă. Se acoperă marginile plachetelor cu colagen sau albumină serică, se introduc celulele în cavitate şi apoi se lipesc plachetele de siliciu, închizând camera. Membranele semipermeabile din Si poros permit celulelor să funcţioneze normal (absorb nutrienţi din exterior şi furnizează insulină prin membrana poroasă), fig.10.15, [80]. S-a demonstrat că celulele producătoare de insulină au o viabilitate de aproximativ 8 zile pe substrat de Si poros, dar prezintă o proliferare superioară în aceste 8 zile pe Si poros faţă de substratul de latex, clasic utilizat în biochimie, [81].
Fig.10.15. Dispozitiv de furnizare a insulinei prin încapsularea celulelor secretoare de insulină între două membrane de Si-poros.
10.8. Biodispozitive pentru prelevare individuală a celulelor vii
Principiile de funcţionare ale acestor biodispozitive sunt bazate pe legi fizice, chimice şi biologice în general. Dar fabricaţia lor este posibilă doar prin utilizarea micro şi nanotehnologiilor. Acesta a fost motivul esenţial, pentru care dezvoltarea acestor biodispozitive a putut fi pusă în practică mai mult de către ingineri microelectronişti decât de către biologi.
1. Biodispozitive pentru încapsulare individuală a celulelor viiÎn acest domeniu s-a căutat un material suport, biocompatibil cu celulele vii, prelucrabil prin metode MEMS/NEMS, pentru a furniza locaşuri individuale pentru celule. O celulă izolată în această capsulă poate fi alimentată cu nutrienţi, iar în final i se pot măsura unii parametri biologici precum: ratele de asimilaţie/dezasimilaţie, timpul de viaţă, proliferarea.
Unul dintre mediile de implantare unicelulară a fost siliciul nanoporos cu pori de dimensiuni cuprinse între 7 şi 49nm, [81, 82]. Celulele depuse pe
acest substrat au fost celulele secretoare de insulină (insulinome). În paralel s-a studiat comportamentul acestor celule pe suporturi binecunoscute în biologie: (a) suport din latex şi (b) suport dintr-un material de referinţă (“petri dishes”). După 8 zile, procentajul de supravieţiure al celulelor insulinome a fost cuprins între 90-100% pe materialul de referinţă, dar şi pe membrana de siliciu poros, iar pe membrana de latex de doar 70%. După 4 zile proliferarea celulelor insulinome a fost de acelaşi ordin de mărime, 5×105celule/ml, pe membranele de Si-poros şi de “petri dishes” şi mult mai mică pe suportul de latex, 2×104celule/ml. După încă 4 zile (deci 8 zile în total), proliferarea pe suportul de referinţă a ajuns la 4,5×106celule/ml, pe Si-poros a ajuns la 2×106celule/ml, iar pe latex a ajuns doar la 2,2×104celule/ml, [81].
Următorul pas a fost căutarea unor substraturi cu microcapsule, cu ajutorul cărora să se studieze in vitro celulele vii, menţinându-le aceeaşi stare morfofuncţională ca în mediul in vivo. Au fost studiate trei tipuri de substraturi: (a) siliciu, (b) strat de Au depus peste Si, (c) sticlă, toate cu forme ce mimează “cuiburile” in vivo, în care cresc celulele eucariote. În cele 3 substraturi s-au realizat microcavităţi de 1-40μm prin tehnici de corodare anizotropă, [83].
Fig.10.16. Comportarea celulelor pe substrat de Siliciu.
S-au folosit măşti hexagonale, pătrate şi circulare pentru creearea unor capsule cu diverse forme. Celulele au fost plasate în cavităţi şi introduse într-un incubator, unde au fost alimentate cu nutrienţi, astfel încât condiţiile lor de viaţă să fie cât mai apropiate de cele in vivo. Celulele depuse în aceste mirocavităţi au fost celulele fibroblaste dermice, prelevate prin biopsia pielii, [83]. Experienţele au demonstrat că:- celulele fibroblaste aderă bine la toate cele 3 materiale utilizate;- comportamentul celulelor nu depinde de forma capsulei (haxagonală, circulară, etc.); celulele caută să ia forma capsulei;- comportamentul celulelor în timp a dovedit însă o dependenţă de materialul substratului. Cultura de fibroblaste s-a înmulţit şi a supravieţiut cel mai mult pe suportul de sticlă;- prin microscopie optică s-a observat că histologia (structura) membranară şi citoplasmatică a celulei a fost identică cu cea observată la culturile aflate pe materialul de referinţă “petri dishes”;- tendinţa generală a celulelor a fost să iasă puţin din alveole pentru a genera un film coerent peste substrat; în special zona celulei ce conţinea nucleii se bomba deasupra substratului.
2. Micro şi nano instrumente de manevrare celularăÎn acest scop au fost împrumutate o serie de dispozitive din diverse domenii şi adaptate, miniaturizate pentru scopuri biologice: micropompe cu difuzor/confuzor [77], microdoze, microgrippere mecanice [84], micropipete [85], pulsuri laser pentru aducerea/eliminarea celulelor din microcavităţi [86].
Membrana Citoplasma Nucleu
Fig. 10.17. Secţiune transversală printr-un microgripper tactil.
Gripperele sunt instrumente de manevrare şi asamblare utilizate în tehnică. Microgripperele utilizate în domeniul biologic trebuie să manipuleze materiale de dimensiuni micronice sau submicronice. În aceste cazuri actuarea se face utilizând forţe electrostatice sau piezoelectrice, care erau inutilizabile la scară macroscopică. Adăugând sistemului micromecanic un senzor piezoelectric, ce sesizează “atingerea” şi eventual o microcameră de luat vederi, se poate obţine un microgripper ca în figura 10.17, care nu numai că manevrează microelementele, dar şi “pipăie” şi “vede”, [84]. Principiul de funcţionare al actuatorului bio-termic se bazează pe coeficienţii de dilatare diferiţi ai aluminiului şi siliciului. Când structura este încălzită consola se încovoaie. Datorită senzorului piezorezistiv incorporat, rezistenţa electrică a stratului de siliciu este puternic dependentă de stresul mecanic. Astfel, forţa tactilă mecanică este “citită” cu uşurinţă, graţie unei punţi Wheatstone integrată în consolă. De asemenea au fost împrumutate din electrochimie tehnici de separare a unor componente celulare: electroforeza, electroosmoza, dielectroforeza, [87]. Proteinele sunt formaţiuni globulare aranjate în aşa manieră încât zonele hodrofobe sunt orientate spre interior, iar zonele hidrofile sunt în contact direct cu mediul apos exterior. De asemenea, aranjamentul grupărilor acide şi bazice ale proteinei este puternic influenţat şi de pH-ul mediului exterior, adică de concentraţia ionilor de H+. Toate aceste considerente duc la modelarea globulară a proteinelor. Lanţul proteic are diverse dimensiuni şi diverse încărcături electrice. Electroforeza proteinelor este influenţată de sarcina electrică, de dimensiuni, de solubilitate şi de activitatea biologică, fig.10.18.a, [87]. Mobilitatea μ, se defineşte similar, ca fiind raportul dintre viteza unui segment proteic v, per intensitatea câmpului electric aplicat din exterior, E, deducându-se formula:
µ = v/E = Q/{6() r} (10.8)
unde se poate constata că mobilitatea creşte cu sarcina globală Q, şi scade cu raza r a proteinei globulare, depinzând de asemenea de coeficientul de vâscozitate η. Ca aplicaţie la acest studiu se poate observa electroforeza Acidului Dezoxiribo Nucleic (ADN) în fig.10.18.b.
(a) (b)Fig. 10.18. (a) Electroforeza unui lanţ proteic este influenţată şi de încărcătura electrică
a segmentelor proteice, dar şi de masa lor; (b) exemplu – electroforeza ADN-ului.
Micropipetele sunt alte intrumente clasice miniaturizate, fig.10.19.
Fig. 10.19. Micropipete: (a) de dimensiunea firului de păr; (b) pentru manevrări ale organitelor celulare
Pentru a manevra membrana unei celule vii, se utilizează o micropipetă ca în fig. 10.19.b. După o încălzire bine controlată a unui tub capilar de sticlă sau cuarţ cu diametrul de aproximativ 1 μm se plasează pe membrană. După răcire, prin conracţia aerului din capilar se poate trage de celulă.
Pentru a măsura activitatea celulară a celulelor miocite prelevate de la broască, cercetătorii au utilizat o micropipetă ca în figura 10.20, [87]. Este necesar un contact foarte bun pipetă-celulă pentru măsurători corecte (spre exemplu măsurători ale deschiderii canalelor ionofore de pe pereţii celulari). Acest contact este obţinut prin sucţiune, când celula miocită (prezentată în stânga) este prinsă de pipetă.
Fig. 10.20. Micropipete ce acţionează asupra membranei unei celule miocite.
10.9. Analiza răspunsurilor neliniare ale biosenzorilor
Deoarece biosenzorii conţin elemente traductoare active în combinaţie cu receptori biologici, este de aşteptat ca răspunsul lor să fie neliniar. În figura 10.21. este prezentat răspunsul tensiune - concentraţie de uree a unui senzor cu Ir/Pd pe capacitor MOS, raportat de Winquist în 1985, [88]. Analitul măsurat aici este ureea sangvină. Se observă că răspunsul senzorului prezintă o pantă de aproximativ 0,7mV/mol/l între 1...20mol/l concentraţie de analit. La concentraţii mari de uree se constată o drastică scădere a sensibilităţii senzorului (explicat prin creşterea pH-ului în stratul de receptori enzimatici). Întrucât însăşi producătorii acestui senzor constată comportări diferite la nivele "mari" şi nivele "mici" ale concentraţiei de analit, ar fi de dorit: 1) modelarea acestui răspuns neliniar; 2) stabilirea unei graniţe (unei concentraţii de prag) între cele două nivele. Pentru a nu fi tributari nici unei convenţii, cea mai generală metodă, pentru aflarea concentraţiei de prag, ar fi aplicarea teoremei conducţiei electrice neliniare.
Fig. 10.21. Dependenţa experimentală tensiune-concentraţie de uree (după Winquist [88]); alegerea unui model analitic prin metoda celor mai mici pătrate (curba punctată).
În acest scop, pentru răspunsul experimental din fig. 10.21, a fost ales ca model de fitare relaţia (2.81):
, c>0 (10.9)
unde V este tensiunea măsurată, c - concentraţia de analit (uree), - are semnificaţia unui factor de atenuare a sensibilităţii la nivele mari ale concentraţiei de analit, - un parametru ce caracterizează neliniaritatea receptorului şi a - un factor ce caracterizează nivelele mici ale concentraţiei de analit.
Observaţie: Curba experimentală din figura 10.16 a fost trasată prin interpolare (cu funcţii splain de gradul I), iar curba analitică a fost trasată prin metoda curbelor de regresie, adoptând criteriul celor mai mici pătrate.
Întrebare: În ce constă interpolarea şi în ce constă metoda curbelor de regresie? Când se foloseşte fiecare metodă pentru trasarea unei curbe?Indicaţie: Interpolarea trasează graficul funcţiei prin punctele date, dar ne “forţează mâna” la anumite forme standard pentru funcţie. Regresia trasează graficul printre punctele date şi putem alege noi modelul funcţiei. Alegând un criteriu de regresie (spre exemplu metoda celor mai mici pătrate), obţinem parametrii modelului ales de noi.
Din criteriile de regresie ale curbei analitice au rezultat următoarele valori pentru parametrii de model: a=0,95mV/mol/l, =0,098(mol/l)-0,78, =0,78. Deoarece modelul (10.9) ales pentru răspunsul biosenzorului se supune condiţiilor TCEN (vezi clasa acestor funcţii prezentate în paragraful
2.7) se poate aplica direct rezultatul (2.85) pentru determinarea concentraţiei de prag:
(10.10)
Rezultă cT=19,01717mol/l. Aflarea unei graniţe cT, poate fi un avantaj pentru descompunerea domeniului de măsură în două game: una cu sensibilităţi mari (pentru c<cT) şi una cu sensibilităţi mici (pentru c>cT).
În figura 10.22 sunt prezentate răspunsurile curent-concentraţie de Oxigen înregistrate de un Microbial-FET ce conţine microorganisme producătoare de oxigen: Bacillus Subtilis şi Trichosporon Cutaneum, [89].
(a) (b)
Fig. 10.22. Curbe experimentale şi analitice pentru răspunsul unui microbial-FET: (a) necesar depistării Bacillus S.; (b) necesar depistării Trichosporon C.
Celulele de Bacillus S. şi Trichosporon C. au fost fixate cu un strat de nitroceluloză în poarta tranzistorului. Aceste microorganisme au fost puse în contact cu o soluţie conţinând glucoză. Prin metabolismul lor, ele au generat oxigen, a cărui cantitate a fost măsurată. S-a adoptat tot modelul analitic (10.9). Au rezultat următorii parametri de model de fitare: Pentru Bacillus S. : a=18nA/mg, =2,8*10-2(mg/l)-1, =1.Pentru Trichosporon C.: a=15nA/mg, =9,9*10-3(mg/l)-0,94, =0,94.Prin aplicarea rezultatului (2.85) au rezultat conform TCEN următoarele concentraţii de prag: cT-BacillusS=35,71mgO2/l, cT-TrichosporonC=135,61mgO2/l.
Aceste exemple vor să arate că teorema conducţiei electrice neliniare poate fi aplicată şi în cazul biosenzorilor. Valorile concentraţiilor de prag ce rezultă din această teoremă pot reprezenta graniţe utile, ce despart domeniile de măsură în două game - cu sensibilitate mare şi cu sensibilitate mică.
10.9. Perspective de cercetare în domeniul bioelectronicii
O direcţie vizează continuarea combinaţiei de succes dintre biotehnologie şi microelectronică. Se urmăreşte integrarea pe acelaşi cip a biosenzorului şi a sistemului digital de prelucrare a semnalului. Scopul ar fi obţinerea unor actuatoare integrate complet şi controlate de nivelul analitului în sânge. S-ar putea realiza actuatoare, care să furnizeze automat anumite medicamente în sânge, sau micropompe de declanşare a dializei, [2].
O altă direcţie de cercetare se bazează pe observaţia făcută de Scheller [2] în legătură cu procesarea de semnal făcută la nivel enzimatic. Există două tipuri distincte de enzime ce pot realiza suma matematică a semnalelor generate de doi senzori distincţi [2]. De asemenea, s-a realizat diferenţa şi produsul de convoluţie a două semnale cu ajutorul a două enzime distincte. Dacă acest lucru va fi făcut în viitor la o scală mică de integrare şi cu o viteză de răspuns superioară circuitelor digitale, vom asista în viitor la dezvoltarea biocalculatoarelor.
Modelarea răspunsurilor biosenzorilor prezentată aici este doar o provocare. Dacă un biosenzor are un comportament neliniar, cu atât mai mult un organism viu are. Modelarea răspunsurilor în lumea biologică şi în special în medicină este un teren neatins încă. Utilitatea lor ar fi imensă. Un
exemplu: medicul analizează răspunsul unui electrocardiograf doar calitativ. Acest răspuns s-ar putea modela cu parametri ce ar indica elasticitatea vaselor de sânge, timpi de comutaţie, amplitudini - parametri ce ar putea duce la un diagnostic optimizat.
Aplicaţii ale TCEN sunt interesante mai ales în analiza răspunsurilor lumii vii. Spre exemplu, dozarea medicamentelor ar putea fi făcută pe baza stabilirii concentraţiei de prag. Organismul uman prezintă o anumită reactivitate biologică la un medicament. Dacă se administrează în concentraţii prea mici, organismul nu "simte" nimic. Peste o doză "prag" reactivitatea începe să se facă simţită. În viitor s-ar putea dovedi o reactivitate chiar şi sub prag. Parţial s-a demonstrat acest lucru. Scăzând concentraţia medicamentului foarte mult, s-a ajuns la stabilirea unor diluţii foarte înalte (homeopatice), la care reactivitatea organismului creşte din nou. Aceste concentraţii, sau în celălalt caz, diluţii prag, ale unor medicamente, ar putea fi extrase cu TCEN.
Dezvoltări în direcţia electrofiziologiei. Proprietăţile fundamentale ale neuronilor constau în generarea şi conducerea impulsurilor electrice nervoase. Un stimul cu intensitatea sub prag nu se propagă. Asemănarea conducţiei electrice intraneuronale cu dispozitivele MOS este frapantă. Între doi neuroni conducţia se face prin intermediul mediatorilor chimici şi a neurotransmiţătorilor (substanţe ca acetilcolina, dopamina etc). Iată de ce aceste substanţe sunt atât de intens cercetate cu ajutorul biosenzorilor. Dar nu numai neuronii, ci toate celulele au comportamente electrice: conducţia prin canalele ionofore, încărcătura electrică a mediului micelar, electroforeza proteinelor sunt doar câteva exemple.
De asemenea, deosebit de interesantă ar fi modelarea în domeniul electronicii celulare şi a transmiterii semnalelor biologice. Există o transmisie la nivel intracelular (prin mesagerii secunzi spre receptorii nucleari), o transmisie intercelulară (prin circulaţia sangvină a analiţilor) şi apoi o transmisie globală între organe. Electrofiziologii au avansat mult în ultimele decenii, reuşind prin observaţii directe să explice unele fenomene electrice ce apar în funcţionarea celulelor. Şi instrumentele puse la dispoziţie de nanotehnologii i-au ajutat. Însă ceea ce lipseşte în acest domeniu este modelarea. O stăpânire cantitativă a fenomenului la nivel celular şi apoi globală, ar fi cheia unei medicini moderne. Este de aşteptat ca această modelare să fie extrem de dificilă, întrucât organismul are diverse metode de adaptare printr-un număr extrem de mare de feed-back-uri. De aceea ele trebuie să debuteze treptat: mai întâi la nivel celular şi în cele din urmă la nivelul ansamblului organismului viu.
Părerea personală a autorului acestei cărţi este că în viitor vom asista la o convergenţă a ştiinţelor într-un mod surprinzător. Dacă în trecut, materia acestei lumi a fost studiată din unghiul chimistului, al fizicianului, al biologului, al electronistului, astăzi asistăm la o superspecializare pe domenii extrem de înguste: electronişti specializaţi doar pe tranzistoare SET, sau doar pe nanotuburi de carbon, ori biologi care studiază doar un anumit organit celular. Ironia soartei este că electronistul care aprofundează mult nanotuburile le redescoperă printre proteinele din canalele ionofore celulare, iar biologii sunt forţaţi să dea explicaţii despre fenomene electrice celulare. Probabil că doar conlucrarea acestor cercetători va asigura succesul în viitor.
