Antibiograma: testarea sensibilitatii in vitro a mieroorganismelor fata de antibiotiee (TSA - testarea

suseeptibilitatii fata de antibiotiee)

Antibiotice

substante eu efect antibaeterian produse de diferite microorganisme

substante semisintetiee, sintetiee (ehimioterapeutiee)

1. al~tibiotice~-lactamice

peniciline

penicilina

peniciline eu speetru larg (ampicilina, amoxieilina)

penieiline antistafiloeoeiee (oxaeilina)

penieiline antipseudomonazice (piperaeilina, ticarcilina)

cefalosporine (gen I-IV)

gen I - cefazolin, cefalotin.

gen II - eefuroxim

gen III - eeftazidim, eeftriaxon, cefotaxim,

gen IV - cefpirom, cefepim

cefamicine (cetoxitin)

monobactame (aztreonam)

carbapeneme (ertapenem, imipenem, meropenem)

combinatii ~-lactamine + inhibitori de lactamaza (amoxieilina+acid c1avulanie,

ampicilina+sulbactam, piperaeilina+tazobaetam, ticarcilina+c lavulanat)

2. macrolide, lincosamide

eritromicina, c1aritromieina, azitromieina

c1indamicina

3. Uuorochinolone

norfloxacin, eiprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin, moxifloxaein

4. tetraciclinetetraciclina, doxiciclina, minociclina

5. gJicilcicline

tigeciclina

6. aminoglicozide

kanamicina, gentamicina, amikacina, netilmicina

7. glicopeptide

vancomicina, teicoplanin

7.Oxazolidinone

linezolid

8. fenicoli

Illdicatiile efectuarii antibiogramei:

- in cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a caror susceptibilitate nu este predictibiHi

(~onditie: existenta standardizarii privind specia, antibioticul de testat)

ijecesitatea efectuarii antibiogramei se decide de catre medicul microbiolog in functie de:

felul produsului din care s-a izolat germenul,

specia bacteriana

Cand relevanta unui izolat este incerta, medicul microbiolog se consulta cu medicul curant ~i se ia 0

~ecizie in comun pe baza datelor clinice.

Metode:• metode calitative

o metoda difuzimetrica

• metode cantitative

o determinarea eMI (concentratia minima inhibitorie)

Metoda difuzimetrica Kirby-BauerSe testeaza sensibilitatea unei tulpini bacteriene izolate in cultura pura ~i identificate.

Este metoda utilizata de rutina pentru testarea susceptibilitatii izolatelor clinice.

FiiJ,'ld0 metoda calitativa, nu permite cuantificarea nivelului de rezistenta, rezultatele fiind exprimate

in sensibil, intermediar sau rezistent:

sensibil

• tulpina este sensibila [ata de antibioticul testat la 0 concentratie realizabila de catre

antibiotic in ser

• bacteriilor sensibile nu dispun de mecanisme de rezistenta

intermediar

• raspunsul terapeutic in cazul acestor izolate poate fi mai slab decat in cazul izolatelor

sensibile

• aeeasta categorie reprezinta totodata 0 zona de tampon care, in caz de erori tehnice minore

necontrolate, previne crearea unor discrepante majore in interpretare

• in caz de sensibilitate intermediara antibioticul poate fi utilizat clinic in anumite situatii:

o in infectii urinare - acele antibiotice, care se concentreaza in urina (realizeaza

concentratii mai mari in urina decat in ser)

o candpot fi administrate doze crescute (13-Iactamine)

• bacteriile rezistente nu pot fi inhibate de antibiotic la concentratia serica realizabila prin

administrare uzuala

in efectuarea ~i interpret area antibiogramelor calitative se urmaresc standarde intemationale. Inprezent standardul acceptat in cele mai multe tan (inc1usiv Romania) este eel american, elaborat de

CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Este in curs de elaborare un standard european de

catre EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing), care va avea ill vedere

caracterisiticile tulpinilor circulante ~ial infectiilor mai importante ill Europa.

Reailizareaantibiogramei conform standardului CLSI

.1. Prepararea inoculului:

se suspensioneaza 2-3 colomi izolate in ser fiziologic

turbiditatea suspensiei se controleaza nefelometric sau comparand cu tuburi etalon (contin

suspensii de particule latex/sulfat de Ba avand turbiditate determinata);

. se ajusteaza la 0.5 McFarland (1,5xI08 CFU/ml).

2. Insamantare:se alege un mediu corespunzator speciei bacteriene testate

• Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor

• Mueller-Hinton cu sange pentru pretentio~i (de ex. streptococi)

• medii speciale (pentru Haemophilus spp . neisserii)

se introduce un tampon in suspensia bacteriana, se stoarce pentru indepiirtarea excesului de lichid

se ~tergeuniform toata suprafata mediului de 3x

3. Depunerea microcomprimatelor de antibiotice

se aleg antibiotice1e care trebuie testate in functie de specia bacteriana testata si in functie de

localizarea infec!iei (anexa 1)

se depun discurile de antibiotic la 1.5 cm distanta de marginea cutiei Petri si la 3 cm distan¢ unul

fata de celi'ilalt(pot fi depuse max. 12 discuri)

15 min. temperatura camerei

4. Incubare

in functie de specia bacteriana: in atmosfera obi~nuita sau in atmosfera de CO2 (de ex.

streptococi, neisserii.)

16-18 ore (in cazu1germenilor pretentio~i pana la 20-24 de ore)

24 de ore in cazul testarii vancornicinei

apare 0 cultura bacteriana confluenta, in jurul rnicrocornprirnatelor apar zone de inhibitie (lipsa

cre~terii bacteriene)

se citesc diametrele zone lor de inhibitie

se compara diametrele citite cu diametre standard in funetie de antibiotic, cantitatea de antibiotic

din cornprimat, specia bacteriana testata

l) Tabel: Exemple de diametre standard, conform standardelor CLSI (Clinical Laboratory

Standards Institute USA).

Standard Specii bacteriene Antibiotic Rezistent Intermediar Sensibilsensibil

CLSI Staphylococcus levofloxacin 10 ug S; 15 mm 16-18 2: 19 mmi aureus

Streptococcus levofloxacin 10 ug S; 13 mm 14-16 2: 17mmpneumoniae

fenomene de sinergisrn/antagonism care reflecta diferite mecanisme de

rezistenta

6. Interpretarea antibiogramelor:

rezultatul se raporteaza: sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau rezistent (R) la antibioticul

testat

fiecare rezultat de antibiograma se interpreteaza!

nu se comunica diametrele citite (metoda calitativa)

Vartiabilele care influenteaza rezultatele:compozitia mediului (continut de cationi, timidina)

pH (optim: 7,2-7,4)

grosimea geIozei (standard: 4 nun)

inocuIul - 0,5 McFarland

microcomprimate (valabilitate, continut, conditii de pastrare)

timpul, temperatura de incubare

citirea diametrelor (lumina refractataJreflectata, colonii izolate, prezenta unui val, margini

crenelate)

Control de calitatemicrocomprimateIe

loturile noi de medii de cuItura se testeaza cu tulpini de referinta

- permit stabilirea concentratiei minime inhibitorii (eMI) a unui antibiotic

CMI: cantitatea cea mai mica de antibiotic care inhiba compIet multiplicarea unei bacterii

Este recomandata testarea cantitativa in urmatoareIe situatii:

cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite)

rezultate incerte cu metoda difuzimetrica / sensibilitate nedeterminata

situatii speciale (de ex. testarea sensibilitatii pneumococului la penicilina printr-o metoda

cantitativa cfmd diametrul zonei de inhibitie la oxacilina este sub 20 nun) ~

eMI obtinut se raporteaza la punctele de ruptura superior ~i inferior date de CLSI

~pecii bacteriene Sensibil Intermediar Rezistentsensibil

Stafilococi :::;0,25 - ~ 0,5Enterococi :::;8 ~16

Enterobacterii :::;8 16 ~32

Metoda dilupilor (macro/microdilupe)se realizeaza dilutii succesive din antibioticul de testat in mediu de cultura lichid

se adauga cantitiiti fixe din cultura bacterianii cercetata

incubare 18 ore 3SoC

concentratia minimacontrol de cre~tere

concentratiamaxima

Metoda dilupiIor in agarse realizeaza dilutii succesive din antibioticul testat in geloza Mueller-Hinton se insamanteaza

cultura bacteriana in spoturi

citire: eMI - concentratia cea mai mica care inhiba complet cre§terea sau apare maximum 0

colonie

E-testepe suprafata mediului de cultura solid §i insamantat se aplica :fa§iidin plastic impregnate ell

antibiotic in concentratie crescandii - la un capat concentratia este minima, Ia celalalt este

maxima; gradatiile sunt notate pe fa~ie;

incubare

Genul Staphylococcus

Stafiloeoci eoagulazo-pozitivi: S. aureus

Stafilococi coagulazo-uegativi (SCN) eu importanta clinica: S. lugdunensis, S. schleiferi, $.

hyicus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus

Produs patologic

portaj: secretie din cavitatea nazaHi anterioara, secretie faringeana, probe de pe tegumente

(zona axilara, perianala)

plagi, otite, infectii tegumentare => puroiul (S. aureus)

infectii urinare => urina (S. saprophyticus, S. aureus)

infectii gastro-intestinale, toxiinfectii alimentare => materii fecale, vomismente, alimente.

meningite => LCR

septicemie, febra puerperala => sange (S. aureus, SCN)

pneumonie => sputa.

infectii nosocomiale - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM) , SCN meticilino-

rezistent

1. Examenul direct aI pp:

macroscopic: puroi cremos, filamentos, galbui.

microscopic: coloratia Gram: coci gram (+), dispu~i in gramezi asemanatoare

ciorchinilor de strugure

2. Izolare:

mediul de imbogatire: mediul hiperclorurat lichid

Chapman (Ch)

nepretentios, poate fi cultivat pe geloza simpla sau geloza sange

Incubare aeroba la 37°C, 18 - 24 ore.

3. Identificarea bacteriei:

- Caraetere morfotinetoriale: frotiu din cultura pura => coci Gram (+), in gramezi.

Caractere de cultura: col "S" cu pigment galben-auriu pana la citrin

Caractere biochimice:

catalaza +

oxidaza -

coagulaza libera +: S. aureus;

coagulaza libera -: stafilococi coagulazo-negativi (SCN)

coagulaza legata + (clumping factor - CF): S.aureus, S. lugdunesis, S. schleiferi

producerea de DN-aza: S. aureus, S. schleiferi, S. hyicus

descompunerea manitolului - pe mediul Chapman => Ma(+); tulpini patogene;

producere de pigment: de la auriu la portocaliu, galben citrin (S. aureus, S.

lugdunensis, S. chromogenes, ~.a.)

producerea de hemolizine - pe geloza-sange

hemoliza ~ (S. aureus, S. haemolyticus, ~.a.)

nu prezinta hemoliza (majoritatea tulpinilor SCN)

Identificare pe baza rezistentei la novobiocina a S. saprophyticus

R. ag-ac: determinarea enterotoxinei produsa de stafilococ

4. Determinarea patogenitiitii:

in vitro: producerea de coagulaza, hemolizine, descompunerea manitolului

in vivo: inoculare la animale de laborator (cobai, iepure)

pentru identificarea sursei de infectie

- prin lizotip ie (determinarea sensibilitatii stafilococului fata de bactreiofagi; este 0 sensibilitate

stabilii a stafilococului)

- prin metode de biologie moleculara

Genu) Streptococcus

S. pyogenes

S. agalactiae

S. grup viridans

S. pneumoniae (Pneumococ)

S. pyogenes: secretie faringiana, secretie din leziuni tegumentare, siinge pentru serologie

S. agalactiae: secretie vaginala, secretia canalului cervical-la mama

LCR, sange, aspirat bron~ic - la nou-nascut

S. grup viridans: se gasesc in mod normal in seereiia faringiana; prin leziuni ale mucoasei

bueale pot patmnde in sange, cauzand endocardita subacuta la pacienii cu leziuni ale

endocardului valvular

Pneumococ: sputa, LCR, sange

1. Examen direct

a. Exam. macroscopic:

S. pyogenes, S. de gmp vilidans, enterococii - nu este necesar exam macroscopic

a produsului patologic

Pneumococ => sputa mginie

b. Exam. microscopic:

col GRAM: eoci gram(+)

o S. pyogenes: coci rotunzi, dispu~i in lanturi

o S. de gmp viridans: coci rotunzi sau ovalari dispu~i in laniUri

o Pneumocoeii: coci lanceolaii, dispu~i dip 10 eu capetele ascuiite spre

exterior ~i inconjurati de 0 capsula proprie.

2. lzolarca bacterici:

mediul de imbogatire: PIKE

Geloza-sange

Bulion-sange; Bulion ser; Bulion glucozat; Geloza ser

3. Identificare:

emt: (vezi anterior)

Caractere de eultura:

o eol "S" eu hemoliza ~ (clara, transparenta) => Streptoeoei ~-hemolitici

sensibilitate rata de

BACITRACINA - din peretele bacterian prin reacrii de

precipitare ~i aglutinare - stabilirea

grupelor Lancefield

Bila Optochina Inulina Esculina Rafmoza IS. de grup viridans Rezistent Rezistent - - + !

iI

Pneumoeoci Sensibil Sensibil + - - .~4. Antibiograma

Streptococul de grup A: ~i-a pastrat sensibilitatea fata de penicilina - nu se efectueaza

ABG (numai in situatii speciale, de ex. alergie la penicilina sau monitorizarea rezistentei'

la penicilina ~i alte antibiotice, lara comunicarea rezultatului)

Pentru ceilalti streptococi se efectueaza ABG

5. Evidentierea Ac

Streptolizina "0" = SLO= Ag => detennina fonnarea de Ac anti-SLO = ASLO

ASLO cre~te 'in primele 7 zile pana 'in saptamanile 3-4 dnd se mentine 'in platou ~i apoi

scade titrul pana la valori norrnale pana la 6 lun~ daea s-a intervenit eu un tratarnent

corespunzator (vindecare); sau poate sa creasca titrul Ac daea nu a fost tratat bolnavul sau s-

a produs 0 complicatie (RAA, afectare cardiaca, glomerulonefrita renala acuta, coreea minch

etc.).

Tehnica de lucru:

o dilutii suecesive ale serului bolnavului (Ae anti-SLO) ~i SLO (timp de reactie)

hematii

o daca exista Ac ace~tia se leaga de SLO, SLO se neutralizeaza: eritrocitele nu se

lizeaza => reactie (+).

o daca nu existi'i Ac => SLO lizeaza eritrocitele => hemoliza => reactie (-).

o Se cauta ultima eprubeta in care existi'i hematii nelizate => este titrul de Ac cautat.

Dg (+) la titrul de 1/200 UI/ml

Val < 1/200 ill/ml => nu exista infeqie streptococica

Val> 1/200 VI/ml => este infectie streptococica in evolutie.

- Ac anti-streptokinaza = ASK

- Ac anti-streptodornaza = ASD

Gen ulEnterococcusenterococii au fost inclusi initial in grupa D Lancefie1d a genului Streptococcus

in 1984, pe baza diferente10r genetice, genul Enterococcus s-a separat din genul

Streptococcus

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Podus patologic:urina

secretie uretrala, secretie prostatica, secretia canalului cervical

puroi din plagi

bila

materii fecale

sange

1. Examen direct

Exam. microscopic:

• se face doar pentru produsele pato10gice in mod normal sterile

• coci Gram +, ova1ari, mari, dispu~i in 1anturi scurte sau in dip10, imobili,

necapsu1ati, nesporu1ati

2. Izolarea bacteriei:

• geloza sange

• ABE (agar-bila-escu1ina)

• incubare la 37°e, 18 - 24 ore

3. Identificare:

Cmt: (vezi anterior)

Caractere de cultura:

o colonii S, <X hemo1itice sau nehemolitice

C. biochimice:

o cata1aza-

o oxidaza-

o rezistent 1abila

o hidrolizeaza esculina in prezenta a 40% hila sau saruri biliare

• pe mediu1 ABE - coloratie neagrii

-6-

o pe baza fermentiirii zaharurilor se pot impiirti in 5 grupe, in cadrul ciirora se

pot diferentia speciile tot pe baza fermentiirii zaharurilor

Esculina Xiloza Arabinoza

Enterococcus spp. + + +E. faeeium + - +

E. faeealis + - -

4. Identificare antigenica

latexaglutinare

5. Antibiograma

sunt germeni eu rezistenta creseuta la antibiotiee

antibiograma se efeetueazii obligatoriu

secretie uretraHi, secretie glande

Bartholini, secretie vaginaHi, secretie

prostatica

la femei se recolteaza in timpul sau

la sfar~itul cidului menstrual

secretie faringiana

secretie conjunctivali'i

urina

secretie faringiana

sange

LCR

Rezistenta: foarte sensibili la temperatura camerei, la uscaciune => recoltarea ~iinsamantarea

se fac la patul bolnavului!!!

1. Examenul microscopic:

coci Gram( -) sub forma de boaba de

cafea, dispu~i diplo

in infectii acute => se gasesc

intracelular

in infectii cronice => se giisesc intra-

~i extracelular

coci gram (-), dispu~i diplo

sunt capsulati

2. Izolarea: (sunt germeni foarte pretentio~i)

se insamanteaza imediat dupa recoltare

se inciilze~te mediulla 37°C

mediile de cultura utilizate: Geloza-chocolat, PElZER-STEFFEN, THAIER-MARTIN

• Incubarea se face cu CO2 obligatoriu 10% 24-48 ore la 37°C.

cc- col "S" friabile, asemanatoare perielor.

Incadrarea in genul Neisseria: Testul oxidazei => oxidazo( +)=Neisseria

Incadrarea in specie:

- Testul de umflare a capsulei => (+)=> N meningitidis => se stabile~te ~i serogruPlill

acesteia

- Fermentarea zaharurilor:

Gonococ Meningococ Neisserii saprofite

GLUCOZA + + +

MALTOZA - + + 1I

ZAHAROZA - - + I

Diagnostic rapid: bazat pe reactii Ag-Ac

- se pun in evidenta Ag meningococice direct din LCR

- Reaqii de precipitare inelara

- Reac!ii de aglutinare.

Produs patologic

• secre!ie nazo-faringiana - de la poarta de intrare• puroi -in otite, sinuzite• sputa - In pneumonii• LCR - In meningita

• sange - In septicemie

Recoltare ~i transport

• ! in meningita - recoltarea LCRo la patul bolnavuluio transport rapid la 37°C, este interzisa refrigerarea

• macroscopico LCR cu aspect purulent

• microscopico direct din pp. sau dupa centrifugare pentru concentrarea gerrneniloro frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen

• celule inflamatorii• cocobacili G-, capsulati. In culturi vechi l~i pierd capsula• izolati,in gramezi sau lanturi scurte, intraJextraleucocitar

• gerrnen pretentios• necesita incubare in CO2 10%, atmosfera umeda, 370C• necesita factori de cre~tere

o mediu Chocolato ! S. aureus produce factor de cre~tere V

• c.m.t.

• C.c.o colonii S sau Mo asemanatoare cu picaturile de rouao coloniile sunt mai numeroase in jurul coloniilor de S. aureus (satelitism)

• c. biochimiceo indol pozitive (majoritatea)o fermenteaza inconstant zaharurileo in prezent se folosesc teste API

• identificare antigenicao identificarea Ag capsular K

• reactii de umflare a capsulei• RIP, ELISA, latexaglutinare

• identificarea ANo se folosesc sonde nucleotidice produse comercial

Diagnostic serologic

• folosit pentru verificarea raspunsului imun dupa vaccinare

• ELISA, RIA

Antibiograma

• obligatorie• se face pe medii speciale (Haemophilus test medium - HTM)

Produsul patologic

falsa membrana, secretie faringiana,

secrelie nazala la purtatori

secretie conjunctivaH'i, vulvara, din plagi

Recoltarea se face cu 3 tampoane

1. eu primul tampon se efectueaza 3 frotiuri

frotiu colorat Gram - pentru observarea morfologiei ~idispozitiei spatiale

o C. diphtheriae - bacil Gram pozitiv, u~or Incurbat, cu capetele maciucate, dispus

caracteristic (litere chineze~ti, chibrituri aruncate pe masa)

frotiu colorat Neisser - pentru evidentierea corpusculilor metacomatici Babe~-Ernst

o C. diphtheriae - prezinta corpusculi metacromatici la capete

frotiu colorat Giemsa - pentru diagnosticul diferential cu angina fuso-spiralara

o pe frotiu se evidentiaza fusobacterii ~i forme spiral ate (Treponema vincenti)

2. Tamponul al doilea se insamanteaza pe mediul de imbogapre oeST

incubare 12-18 ore, dupa care se izoleaza pe medii caracteristice

3. Tamponul al treilea se descarca pe medii de cultura folosite pentru izolare, identificare

mediul Loffier - colonii caracteristice, circulare, u~or crenelate, alb-galbui

geloza sange - colonii albe-gri, perlate, friabile

mediul Gundel Tietz - se diferentiaza cele trei tipuri de bacil difteric

o tipul gravis - colonii negre, de tip R, plate, cu margini crenelate, centrol

mamelon at, cu striatiuni radiare, ca 0 "floare de margareta",

o tipul mitis - colonii negre, de tip S

o tipul intermedius - colonii de tip S-R

bulion: tipul gravis - formeaza pelicula la suprafata,restul mediului ramane clar

o tipul mitis - tulbura uniform mediul

o tipul intermedius - formeaza inella suprafata, depozit ~i tulbura uniform mediul

Caractere biochimice

producerea de H2S - se studiaza pe mediul PISU (cu cistina)

fermentarea zaharurilor

o In funciie de fermentarea glucozei, maltozei ~i zaharozei, bacilii difterici

se pot Incadra In specie (c. difteriae, hoffmanii, xerosis)

o in funciie de fermentarea dextrinei, amidonului ~i glicogenului, ti

incadram In tip (gravis, mitis ~i intermedius)

Caractere de patogenitate - cercetarea producerii de exotoxina difterica

teste in vivo

teste in vitro

o testul Elek - reaciie de precipitare In gel

• se toarna geloza peste 0 hfutie de filtru impregnatii fn ser antidifteric

• se insamanieaza In striuri tulpinile de cercetat

• daca 0 tulpina produce exotoxina difterica (Ag), aceasta este eliberata Jhmediu ~i apare 0 banda de precipitare

o testul Ramon - reactie de floculare prin care se dozeaza putere toxica a toxinei

Diagnosticul indirectIDR Shick - IDR de neutralizare

o se injecteaza strict intradermic 1 unitate de toxina

• dad organismul nu are anticorpi, toxina i~i exercita efectul eritematos ~i la

locul inocuIarii apare un eritem - organism receptiv.

• dadi organismul are anticorpi, ace~tia vor neutraliza toxina, deci nu apar

modificiiri la locul inoculiirii - organism imun

Bacillus anthracis -diagnosticul de laborator al infectiei dirbunoasc

in dirbunele cutanat - exudat din pustula maligna

In carbunele intestinal - materii fecale

In carbunele pulmonar - sputa

In formele septicemice - sange

pentru diagnostic retrospectiv - fragmente de organe

o bacB Gram pozitiv, cu capetele retezate sau u~or concave, a~ezati in lanruri, Cll

aspect ce imita trestia de bambus.

o pe medii solide - colonii de tip R cu suprafata rugoasa, centrul ombilicat, margini

dantelate Cll prelungiri laterale (cap de Medusa)

diagnostic diferential fata de alti germeni din genul Bacillus (B. cereus)-6-

o sensibilitatea la penicilina - B. Anthracis este sensibil, B. cereus esterezistent

sensihilitatea fata de bacteriofagi

4. Diagnostic retrospectiv

reaclia Ascoli - reaqie de precipitare inelara

o evidenliaza prezenla antigenelor in fragmente de organe recoltate de la cadavre