Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe ... · Electroforeza in gel de agaroza...

Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza de cereale germinate

ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

I. MATERIALE SI METODE 1. Tulpinile de bacterii lactice utilizate in determinarile genetice (tabelul 1):

Tabelul 1 Tulpinile de bacterii lactice utilizate in determinarile genetice Tulpina Sursa Lactobacillus plantarum 15GAL Colectia MIUG Grau Lactobacillus brevis 16GAL Colectia MIUG Grau Lactobacillus sp. L Colectia MIUG Secara

Tulpina utilizata in procesul de clonare este Escherichia coli 5α, cu genotipul supE44, lacU169(θ80 lacZ∆M15), hsdR 17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1 (Hanahan, 1983) .

2. Medii de cultura: Mediul pentru izolarea si cultivarea bacteriilor lactice: MRS broth (Pronadisa) Mediul de cultivare pentru tulpina Escherichia coli 5α: mediul Luria-Bertani (LB) care contine extract de drojdie 0.5%,

peptona 1% si clorura de sodiu 1% (Sambrook et al., 1989). Pentru mediul solid se foloseste agar bacteriologic 2%. In scopul cultivarii tulpinilor bacteriene cu plasmide purtatoare a genei marker de rezistenta la ampicilina Amp

R se adauga in mediu ampicilina pana la concentratia finala de 100mg/ml.

Mediul de cultivare a tulpinilor recombinate E. coli DH5α: LBA/IPTG/X-Gal (extract de drojdie 0,5%, triptona 1%, NaCl 0.5%, ampicilina 2µl/ml, X-Gal 2µl/ml).

3. Kituri utilizate: G NOME Kit (Biomedicals) s-a utilizat pentru izolarea de ADN total de la tulpinile de bacterii lactice alese spre analiza. High Pure PCR Product Purification Kit” (Roche), pentru purificarea fragmentelor genice amplificate prin PCR. TOPO®TA Cloning® Kit (Invitrogen) pentru clonarea genelor de interes in vectorul pCR2.1 – TOPO. BigDye Terminator v3.0 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) pentru secventierea genelor

ADNr16S obtinute prin reverstranscriere. 4. Izolarea de AD! total cu G !OME Kit (Biomedicals)

Tulpinile de bacteria lactice se inoculeaza in 5ml MRS lichid si se incubeaza 18h la 37°C. 2ml inocul se centrifugheaza 5min la 10.000rpm. Biomasa se resuspenda in 110µl lizozim si se incubeaza la 37ºC pentru 40min. Se adauga Cell Suspension

Solution pana la volumul final de 1,85ml. A doua incubare se realizeaza timp de 15min la 55ºC dupa adaugarea a 50µl R%ase

Mix si a 100µl Cell Lysis Solution. Pentru deproteinizare se foloseste 25µl suspensie Protease Mix si se incubeaza 120min la 55ºC. Se adauga 500µl “Salt-Out” Mixture si se refrigereaza 10min la 4°C pentru eliminarea tuturor sarurilor. Se centrifugheaza 10min la 10.000rpm, se colecteaza supernatantul si se adauga 2ml TE buffer si 8ml etanol 100%. O centrifugare de 15min la 1500g permite sedimentarea ADN. Se elimina supernatantul si ADN total se usuca la temperatura camerei pentru 15min. Elutia ADN total se realizeaza in TE (10mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA).

5. Polymerase Chain Reaction (PCR) Reactia de amplificare se utilizeaza pentru obtinerea fragmentelor de ADN (ADNr16S) in scopul identificarii genetice a bacteriilor lactice. Ampliconul este inserat in vectorul comercial de clonare pCR2.1 - TOPO II (Invitrogen). Amplificarea se realizeaza intr-un termocicler “Gene Amp PCR System 2400”. Reactia de amplificare contine ADN matrita cu o concentratie cuprinsa intre 1-10ng/ml, 3-5 unitati din polimeraza corespunzatoare (tabelul 2), tamponul de reactie corespunzator enzimei, deoxinucleotidele trifosfat (dNTP) in concentratie finala de 0,2mM si primerii specifici 0.2µM (tabelul 3). Concentratia MgCl2 variaza intre 1 si 5mM, in functie de enzima utilizata. Fragmentele genice amplificate prin PCR au fost purificate cu “High Pure PCR Product Purification Kit” (Roche).

Tabelul 2 Polimerazele utilizate pentru amplificarea fragmentelor ADN

Enzima Produs Caracteristici

Rol Activitate

exonucleazica Capacitatea de

amplificare Easy- A High Fidelity PCR

Cloning Enzyme Stratagene da 5kb amplificarea genei

ADNr16S Pfu Ultra DNA polymerase Stratagene da Peste 15kb amplificarea genei bgl1


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

Tabelul 3. Primerii utilizati pentru amplificarea fragmentelor ADN

Oligonucleotidele (Sigma)

Secventa nucleotidica

Scop

AL 656 TGACTGACTGAGTGCCAGCMGCCGCGG Amplificarea genei ADNr 16S - forward

AL 657 TGACTGACTGAGAGCTCTACCTTGTTACGMYTT Amplificarea genei ADNr 16S - reverse

SA 641 GCTGGATCCATGTTGATGATAGTACAGCTTTTGGTC BamH1

Amplificarea genei bgl1 - forward

SA 640 ACCTCTAGATCAATAGTAAACAGGACAGATGTC Xba

Amplificarea genei bgl1 - reverse

Tabelul 4. Setarea parametrilor PCR

Pentru amplificarea fragmentelor de AD!r16S Pentru amplificarea genei bgl1 95ºC 1min 95ºC 5min 50ºC 30sec x 5 95ºC 30sec 72ºC 1min 50sec 48,4ºC 30sec x 35

95ºC 1min 72ºC 3min 55ºC 30sec x30 72ºC 8min 72ºC 1min 50sec 4ºC ∞

72ºC 10min 4ºC ∞

6. Clonarea genelor de interes in vectorul pCR2.1-TOPO. Genele de interes:

gena pentru ARNr16S – folosita in scopul identificarii tulpinilor de bacterii lactice si gena bgl1 – pentru B-glucozidaza

Genele au fost clonate individual (30min la temperatura camerei) in vectorul pCR2.1-TOPO, utilizandu-se TOPO®TA Cloning® Kit (Invitrogen).

7. Electroforeza AD! in gel de agaroza Migrarea fragmentelor de ADN se realizeaza in gel de agaroza 0.7% (Pronadisa). Pentru prepararea gelului se utilizeaza tampon TBE (0.5%) compus din Tris 44.5mM, acid boric 44.5mM, EDTA 1.25mM, care este de asemenea utilizat ca si tampon de electroforeza. Probele se dizolva in albastru de brom fenol 0.25%. Migrarea se realizeaza la un voltaj constant de 7V/cm, timp de 30min.

8. Transformarea celulelor competente E. coli DH5α Se incubeaza amestecul de 50µl celule competente E. coli DH5α şi 10µl ADN recombinant (pCR2.1 – TOPO cu gena de interes) in trei pasi: 30min pe gheaţă, 45sec. la 42ºC şi iarăşi 2min pe gheaţă. Se adaugă în tubul Eppendorf 300µl mediu lichid Luria-Berthani şi se incubează 1h la 37ºC. În două plăci Petri cu mediu solid LBA/IPTG/ X-Gal se luteaza câte 10µl şi respectiv 200µl amestec de transformare. Plăcile se incubează 24h la 37ºC pentru obţinerea coloniilor trasformate.

9. Verificarea moleculara a transformantilor Din coloniile E. coli DH5α transformate se izoleaza si purifica ADN plasmidial (care reprezinta vectorul pCR2.1 - TOPO II recombinat) pentru verificarea prezentei moleculelor de ADN recombinat in celulele transformate. In acest scop clonele bacteriene vor fi cultivate in mediu LB lichid (suplimentat cu ampicilina 100mg/ml), la 37ºC, cu agitare, timp de 20h.

10. Izolarea de AD! plasmidial recombinat Sedimentul bacterian de la tulpinile E. coli DH5α transformate, se resuspenda in 100µl soluţie I (GTE buffer: glucoză 50mM; 25mM Tris-HCl; 10mM EDTA, pH=8.0), se vortexează şi se menţine 5min la temperatura camerei, in scopul distrugerii peretelui celular. Liza celulelor se realizeaza cu 200µl soluţie II (0.2 NaOH 10N, 1% SDS) iar soluţia III (3M acetat de potasiu) reface pH-ul neutru. O centrifugare de 10min la 14000rpm, 4ºC permite sedimentarea resturilor celulare, a proteinelor, a ADN cromozomal si a ARN cu greutate moleculara mare. Deproteinizarea este realizata cu 240µl izopropanol. Amestecul se lasă 10min la temperatura camerei, se centrifughează 10min la 14000rpm, 4ºC, se aspiră supernatantul si se adaugă 200µl etanol 70% rece (-20ºC) in scopul precipitarii acizilor nucleici. Sedimentul ADN plasmidial se resuspenda in 40µl TE (pH 8.0) şi se păstrează la 4ºC.

11. Secventierea AD! plasmidial recombinat (pCR2.1-TOPO – AD!r 16S) pentru identificarea genetica a tulpinilor de bacteria lactice Secventierea s-a realizat in cadrul departamentului SCSIE, Universidad de Valencia. Pentru a fi secventiat, ADN plasmidial recombinat a fost marcat prin PCR cu BigDye Terminator v3.0 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA,


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

USA). Primerul utilizat pentru reactia “terminator” este notat cu M13 Forward si are urmatoarea secventa nucleotidica: CTGGCCGTCGTTTTAC. Pentru reactia PCR cu BigDye terminator s-a folosit urmatorul protocol:

94ºC 3min

96ºC 10sec 50ºC 5sec x 99 60ºC 4min 4ºC ∞

Pentru analiza secventei nucleotidice s-a utilizat programul DNAMAN Versiunea 4.03 (Lynnon Biosoft®). Analiza BLAST

(Basic Local Alignment Search Tool) a secventelor a fost posibila prin utilizarea serviciului online al National Center for

Biotechnology Information (NIH, SUA), la adresa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. 12. Transformarea tulpinii Lb. plantarum cu vectorul pCR2.1 -TOPO recombinat (pCR2.1-TOPO – bgl1)

Pentru transformarea tulpinii de Lb. plantarum 15GAL, s-a realizat o cultivare over night in MRS broth suplimentat cu 1% glucoza si 0.1% glicina. Aceast preinocul a fost diluat 1:40 (vol/vol) in acelasi mediu si s-a continuat incubarea pana la o densitate optica (DO600 = 0.6). Pentru a induce starea de competent, celulele bacteriene au fost sedimentate prin centrifugare la 6.800g, 10min si spalate succesiv de doua ori in solutie rece de MgCl2 1mM si intr-un amestec de polietilenglicol 30% si glycerol 10%. Pentru electroporare s-au folosit 50µl celule competente Lb. plantarum 15GAL si 5µl ADN plasmidial (vectorul pCR2.1-TOPO cu gena bgl1 – 10ng) intr-o cuva de electroporare de 0.2cm grosime. Electroporarea s-a realizat cu un Gene Pulser (Bio-Rad) al carui program prezenta pentru tensiune, capacitate si rezistenta urmatoarele setari, 1,5kV, 25µF si 400Ω. Celulele electroporate au fost transferate in 0.5ml mediu MRS continand sucroza 0.5M si MgCl2 0.1M si incubate la 30ºC pentru 2h inainte de insamantare pe mediu selectivMRS cu ampicilina.

13. Testarea activitatii Beta-glucozidazei Tulpina bacteriana transformata a fost insamantata pe mediu care contine: 50gMRS broth/L, 5g arbutin/L (Sigma) si 20g agar/L. pH-ul a fost ajustat la 5.5 iar mediul a fost sterilizat prin autoclavare la 121ºC pentru 15min. Dupa autoclavare s-a adaugat in mediu o solutie de citrat feric de amoniu 0,02% (w/v) sterilizat prin filtrare. Pentru a evalua activitatea Beta-glucozidazei, in placa cu acest mediu s-a inoculat 0,5ml din cultura transformata de L. plantarum. Placile au fost incubate la 37ºC timp de 3 zile. Coloniile izolate care prezinta activitate Beta-glucozidazica hidrolizeaza substratul si determina aparitia unui halou maro inchis.

II. REZULTATE ŞI DISCUŢII

1. OBTI!EREA U!OR RECOMBI!A!TI DE BACTERII LACTICE CU POTE!TIAL BIOTEH!OLOGIC RIDICAT ACTIVITATEA 1.1 IZOLAREA DE AD! CROMOZOMAL SI PLASMIDIAL DE LA TULPI!ILE DE BACTERII LACTICE A!ALIZATE Dupa izolarea de ADN total cu G NOME Kit (Biomedicals), s-a verificat puritatea acestuia prin electroforeza in gel de agaroza 0.7% si se observa existenta celor trei benzi ADN corespunzatoare celor trei tulpini (Figura 1). Prin raportarea la markerul de greutate moleculara λPst se poate aprecia ca ADN genomic izolat are o greutate molecular de aproximativ 11,5kb.

Figura 1. Electroforeza in gel de agaroza 0.7% a ADN total

Concentratia si puritatea ADN total izolat, pentru cele trei tulpini, a fost citita la NanoDrop ND 1000 Spectrophotometer (Tab. 5). Din analiza datelor reise faptul ca ADN total izolat este pur avand un raport A260 / A280 <2.

λPst 15Gal 16Gal L

11501pb


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

Tabelul 5 Concentratia si puritatea ADNtotal pentru tulpinile: 15Gal, 16Gal, si L Tulpina Concentratia AD! genomic izolat (ng/µl) A-260nm A-280 260/280

Lb. plantarum 15GAL 77,1 1,542 0,824 1,87 Lb. brevis 16 GAL 82,0 1,640 0,894 1,83

Lactobacillus sp. L 41,5 0,830 0,417 1,99 Utilizand primerii AL656 respectiv AL657 s-a realizat amplificarea PCR a ADNr16S din AND total izolat anterior. Verificarea amplificarii s-a realizat electroforetic in gel de agaroza 0.7% (Figura 2). Prin vizualizarea gelului de electroforeza se poate afirma ca marimea fragmentelor PCR obtinute este de aproximativ 1500pb.

Figura 2. Electroforeza in gel a produsilor rezultati prin amplificarea genelor ADNr 16S

Pentru clonarea ampliconului ADNr16S s-a utilizat vectorul comercial pCR 2.1-TOPO. Harta genetica a acestuia este prezentata in figura 3.Vectorul prezinta doua gene marker de rezistenta la ampicilina si kanamicina si originea replicarii vectorului pUC. Pentru contraselectia recombinantilor se utilizeaza gena lacZ care nu se va mai exprima dupa inserarea genelor de interes.

Figura 3. Harta genetica a pCR2.1-TOPO (Invitrogen)

~ 1,5kb

λPst 15Gal 16Gal L

~ 1,5kb


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

Figura 4. Screening-ul de culoare a transformantilor pCR2.1 -TOPO - ARNr16S cu X-Gal / IPTG

Dupa clonarea genei ADNr16S amplificate in vectorul pCR2.1-TOPO, s-a realizat transformarea celulelor E. coli DH5α. Prin screening-ul de culoare, au fost selectate clonele de culoare albă, care prezintă vectorul pCR2.1 -TOPO cu gena pasager integrată (Figura 4). Concentratia si puritatea ADN plasmidial recombinat (vectorul pCR2.1 -TOPO -ADNr16S) izolat din transformanti au fost analizate la NanoDrop ND 1000 Spectrophotometer (Figura 5). Raportul A260/A280 in cele trei cazuri este < 2 iar raportul A260/A230 ≥ 2 ceea ce demonstreaza ca ADN plasmidial recombinant nu este contaminat nici cu protein, nici cu oligozaharide.

Figura 5 Histogramele spectrofotometrice ale ADNplasmidial recombinant pentru tulpinile 15GAL, 16GAL si L

Vectorul recombinat a fost amplificat prin reactia PCR terminator cu primerul M13Forward din kitul BigDye Terminator v3.0 cycle sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Analiza secventelor nucleotidice din ADN plasmidial recombinat izolat de la cele trei tulpini de bacterii lactice a confirmat identificarea realizata si cu ajutorul testelor API, si anume: tulpina notata cu 15Gal este Lactobacillus plantarum HDRS1 cu probabilitate 98% (Anexa 1), 16Gal este Lactobacillus brevis JH-1, cu probabilitate 99% (Anexa 2), iar tulpina notata cu L este Weissella confusa C5-7, cu probabilitate 99%. (Anexa 3). ACTIVITAŢILE 1.2 SI 1.3 AMPLIFICAREA PRI! PCR A GE!ELOR CODIFICATOARE DE E!ZIME RESPO!SABILE PE!TRU CARACTERE BIOTEH!OLOGICE AVA!TAJOASE SI UTILIZAREA TEH!OLOGIEI AD!-RECOMBI!A!T I! SCOPUL OBTI!ERII U!OR TULPI!I I!ALT PERFORMA!TE DE BACTERII LACTICE. Biomasa celulozica reprezinta o sursa de carbon naturala, abundenta pentru producerea de combustibili pretiosi dar si pentru confectionarea de biomateriale durabile atat pe termen scurt cat si pe termen lung. Pe de alta parte acidul lactic este un produs comercial, viabil al carui consum preconizat va fi mai mare de 60.000tone/an. Acidul lactic prezinta o gama larga de aplicatii precum industriile farmaceutica, textila, cosmetica si chimica.(…..). Transfomarea materialului celulozic in acid lactic nu este inca un punct de vedere corespunzator datorita costurilor ridicate ale enzimelor implicate in hidroliza celulozei. Procesul poate implica fie doi pasi pentru transformarea celulozei in glucoza si apoi fermentatia acesteia pana la acid lactic, fie o singura etapa in care hidroliza celulozei cu ajutorul celulazelor sa fie cuplata cu fermentatia in scopul eliminarii blocajului datorat excesului de glucoza.(…). In timpul SSF (simultaneous saccharification and fermentation) inhibarea prin glucoza este in totalitate inlaturata, dar inhibarea prin celobioza ramane ca atare. Adaugarea de Beta – glucozidaza la inceputul acestui proces (SSF) inlatura blocajul datorat celobiozei dar totusi nu este o solutie din cauza dezactivarii enzimatice rapide. De aceea pentru inlaturarea acestor blocaje este avantajos sa se utilizeze o tulpina producatoare de acid lactic dar care are capacitatea de a utiliza eficient atat glucoza cat si celobioza. Se stie din literatura de specialitate ca unele specii de Lactobacillus utilizeaza celobioza ca sursa de carbon dar nu se stiu foarte multe despre formarea de acid lactic din celobioza. In acest scop, s-a realizat clonarea genei codificatoare pentru Beta – glucozidaza in vectorul pCR2.1-TOPO si transformarea Lactobacillus plantarum 15GAL cu acest plasmid recombinat in vederea obtinerii unei tulpini bacteriene capabile sa utilizeze celobioza ca sursa de carbon. Se cunoaste faptul ca celobioza este un dizaharid care contine o pondere insemnata in cariopsele de


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

grau germinat. Beta – glucozidaza este codificata de gena bgl1 si este o enzima care actioneaza asupra legaturilor ß1, 4 dintre doua molecule de glucoza (ex. celobioza ). Beta – glucozidaza este de fapt o exocelulaza care are specificitate pentru o varietate de substraturi beta-D-glicozidice. Face parte din marea familie a beta – D – Glucozid- glucohidrolazelor (CAZy = Carbohydrate-Active enzymes found at http://afmb.cnrs-mrs.r/CAZY),si mai este cunoscuta sub denumirile: celobiaza sau amigdalaza. Gena pentru Beta-glucozidaza a fost amplificata prin PCR din ADN genomic de Saccharomyces fibuligera utilizand primerii SA640, SA641 care contin secventa de nucleotide pentru enzimele de restrictie FastDigest (Fermentas): XbaI (SA640) si respectiv, BamHI (SA641). Integrarea bgl1 in vectorul pCR2.1-TOPO realizandu-se astfel la nivelul situsurilor Xba / BamHI. Dupa transformarea celulelor de E. coli DH5α cu vectorul recombinat s-au ales patru colonii din care s-a izolat acest plasmid prin metoda lizei alcaline. S-a verificat integrarea genei de interes (bgl1) in vector prin digestia cu endonucleazele de restrictie XbaI/ BamHI. Migrarea fragmentelor ADN (gena bgl1 si vectorul pCR2.1-TOPO) clivate cu cele doua endonucleaze de restrictie s-a realizat prin electroforeza in gel de agaroza 0.7% (Figura 6).

Figura 6. Electroforeza in gel de agaroza 0.7% a ADN plasmidial recombinant clivat cu endonucleazele XbaI / BamHI.

Cifrele 1-4 prezinta ADN plasmidial al celor 4 colonii de E. coli DH5α verficate.

Deoarece toate cele patru colonii bacteriene de E. coliDH5α verificate poseda gena bgl1 integrata in vector, s-a ales ADN-ul plasmidial izolat de la colonia 1 pentru a fi verificata orientarea genei de interes in vector. In urma digestiei cu endonucleazele de restrictie SmaI/XbaI se constata o insertie 5’ 3’de la BamHI XbaI (Figura 7).

Figura 7. Electroforeza in gel de agaroza a ADN plasmidial recombinat clivat cu Sma I (B); Sma /XbaI (C) si neclivat (A).

Cu acest ADN plasmidial s-a transformat, prin electroporare, tulpina de Lactobacillus plantarum 15GAL iar transformantii s-au cultivat pe mediu selectiv (MRS cu ampicilina). In paralel s-a lucrat o proba martor (tulpina de Lactobacillus plantarum 15GAL

netransformata) pe acelasi mediu si in aceleasi conditii. Specificam ca in etapa anterioara s-a evaluat antibiotipul la aceasta tulpina, constatandu-se sensibilitatea fata de ampicilina. Din acest motiv in placa martor nu s-a observat nici o colonie bacteriana. In schimb, pe mediul MRS suplimentat cu ampicilina si insamantat cu tulpina recombinata s-a obtinut o eficienta a transformarii de 4 x 102 transformanti/µg ADN. Testarea activitatii Beta-glucozidazei in tulpina transformata s-a realizat pe mediu MRS agarizat cu arbutin. Dupa incubarea coloniilor la 37°C nu s-a observant formarea haloului brun in jurul coloniilor transformate.Cauzele posibile ale acestui rezultat ar putea fi :

neexprimarea genei bgl1 in celulele gazda fie din lipsa promotorului corespunzator fie datorita existentei unor represori ai transcrierii.

blocarea secreţiei enzimei sintetizate.

λPst 1 2 3 4

pCR2.1 –TOPO (~3.9kb)

bgl1 (~2.7kb)

λPst A B C

C 6.6kb ~5.0kb

~3.9kb ~2.4kb


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

OBIECTIVUL 2. DIVERSIFICAREA TEH!OLOGIEI DE GERMI!ARE, PRI! TRATAME!TE DE SUPRAFATA Î! ETAPA DE Î!MUIERE

ACTIVITATEA 2.1. REDUCEREA PH-ULUI APEI DE Î!MUIERE Î! PREZE!ŢĂ DE ACID ACETIC

În vederea creşterii inocuităţii biologice a produsului finit s-a conceput o variantă de schemă de procesare (varianta biotehnologică A), unde s-a prevăzut tratamentul de suprafaţă al boabelor cu soluţie de acid acetic (0,5%) (fig.8). Pentru aceasta am utilizat acid acetic (sub forma oţetului alimentar cu 9° aciditate) adăugat în apa în care grâul stă imersat în a treia etapă de înmuiere umedă. Adăugat în concentraţie de 0,5%, se reduce pH-ul la 4,5 – 5,0 sub valorile optime pentru dezvoltarea bacteriilor, în scopul reducerii numărului acestora şi îmbunătăţirii calităţii microbiologice a produsului finit. Eficienţa acestui procedeu ar fi fost şi mai evidentă dacă s-ar fi practicat în toate cele trei etape de înmuiere umedă, deoarece s-a dovedit că acestea sunt punctele critice ale contaminării microbiologice, însă acest lucru încetineşte şi inhibă procesul de germinare. Scăderea pH-ului la valori mai mici de 4,5 are acelaşi efect. Este cunoscut faptul că fiecare specie de microorganisme se dezvoltă într-un interval de pH optim: pentru drojdii acesta este cuprins, în general, între 4,0 – 6,5 , pentru mucegaiuri domeniul de pH optim este de 4,5 – 6,8 iar pentru bacterii de 6,5 – 7,5. La pH acid, sunt complexaţi ionii de Mg2+, sunt saturate în H+ permeazele cationice şi deci se anulează transportul cationilor în celule. La pH alcalin sunt complexaţi ionii de Ca2+, Zn2+, Fe2+, care sunt cofactori ai enzimelor microbiene, iar membrana este saturată în OH- şi deci este împiedicat transportul anionilor în celule. Dereglarea pH-ului are drept consecinţă perturbarea cineticii reacţiilor enzimatice şi deci afectarea metabolismului microorganismelor.

Fig.8. Varianta biotehnologică A de îmbunătăţire a inocuităţii microbiologice a grâului germinat comparativ cu tehnologia standard (→ → → → Martor →→→→Varianta A)


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1 2 3 4 5 6

Momentul germinarii

Numar de m

icroorganisme/g

Bacterii aerobe

mezof ile, ufc/g

MartorBacterii aerobe

mezof ile, ufc/g

Varianta ADrojdii si mucegaiuri,

ufc/g, Martor

Drojdii si mucegaiuri,

ufc/g, Varianta A

Bacterii coliforme,

NPC/g Martor

Bacterii coliforme,

NPC/g Varianta A

1,00E+031,

00E+041,

00E+05

1,00E+061,

00E+071,

00E+08

Martor Varianta A

ufc/g

Grau negerminat

Inmuiere umeda II

Inmuiere umeda III

A doua zi de

germinare

A treia zi de

germinare

Granovit fulgi

Fig.9. Analiza microbiologică a germinării în varianta biotehnologică A, comparativ cu varianta Martor

Fig.10. Încărcătura microbiologică cu bacterii aerobe mezofile a subproduselor şi produsului finit în varianta

biotehnologică A, comparativ cu Martorul

Scăderea pH-lui apei în care grâul stă imersat în a treia etapă de înmuiere umedă la 4,5 – 5,0 a determinat reducerea la 72 % a numărului total de bacterii aerobe şi mezofile/g la proba 4 din a doua zi de germinare (8·105 ufc/g) comparativ cu proba martor similară (2,5·106 ufc/g). Numărul de bacterii aerobe şi mezofile se reduce la 70% (7·107 ufc/g) pentru proba 5 (a treia zi de germinare) comparativ cu martorul (1·108 ufc/g) şi la 37,6% la produsul finit (proba 6) (fig. 9,10). Totuşi valoarea de 3,2·105ufc/g, la care ajunge numărul total de bacterii aerobe mezofile la produsul finit, (proba 6 în varianta biotehnologică A) nu se încadrează în limitele admise de normele microbiologice (104ufc/g). Numărul probabil de coliformi scade de 3 ori la proba 4, la 21,4 % la proba 5 (de la 3,5·104 la 7,5·103 NPC/g) şi la 37,5% la produsul finit în cazul variantei biotehnologice A faţă de martor (de la 1,2·104 la 4,5·103 NPC/g) (fig. 9, 11). S-a observat că temperaturile blânde la care se face uscarea fulgilor rezultaţi după aplatizare, favorizează dezvoltarea coliformilor, gradul de reducere fiind mai mic faţă de cel corespunzător probei 5. Deci, nici NPC/g în varianta biotehnologică A nu scade suficient de mult pentru a corespunde normelor microbiologice în vigoare (102ufc/g). În ceea ce priveşte numărul de fungi se remarcă faptul că pH-ul în domeniul acid favorizează dezvoltarea acestora, valorile ufc/g fiind de 2,4 ori mai ridicate comparativ cu martorul. Deşi dintre drojdii predomină specii ale genului Saccharomyces sp., iar mucegaiurile nu sunt prezente, totuşi numărul total depăşeşte valoare impusă de standardul microbiologic de firmă (102ufc/g) (fig. 9,12).

1,00E+036,

00E+031,

10E+041,

60E+042,

10E+042,

60E+043,

10E+043,

60E+044,

10E+04

Martor Varianta A

NPC/g

Grau negerminat

Inmuierea umeda II

Inmuierea umeda III

A doua zi de

germinare

A treia zi de

germinare

Granovit fulgi

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

Martor Varianta A

ufc/g

Grau negerminat

Inmuiere umeda II

Inmuiere umeda III

A doua zi de

germinare

A treia zi de

germinare

Granovit fulgi

Fig.11. Variabilitatea cantitativă a bacteriilor coliforme pe parcursul procesării în varianta biotehnologică A,

comparativ cu martorul

Fig.12. Diversitatea cantitativă a fungilor în etapele procesării în varianta biotehnologică A, comparativ cu tehnologia clasică

ACTIVITATEA 2.2. TRATAME!TE DE SUPRAFAŢĂ PRI! IMERSIA CARIOPSELOR Î! BIOPREPARATUL BIOLACT Pentru eficientizarea procesului şi îmbunătăţirea inocuităţii produsului finit, în calitate de produs cu efect bioconservant, s-a utilizat bioprodusul Biolact obţinut conform reţetei tradiţionale de fabricare a borşului, după trei zile de fermentaţie lactică cu Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, a substratului pe bază de tărâţe de grâu, cu un pH=3 (fig.13). Tratamentul de suprafaţă s-a realizat în toate cazurile, prin imersarea boabelor de grâu în Biolact, cu variaţia duratei de imersare şi a etapei tehnologice


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

aleasă pe bază studiului punctelor critice, care a certificat amplificarea contaminărilor datorată condiţiilor fizico-chimice optime pentru multiplicarea microorganismelor. Astfel s-au conceput două variante de tratament biotehnologic, comparativ cu procedeul clasic, (proba martor-M): • Varianta B Prima înmuiere umedă timp de 14 ore în Biolact şi două etape de imersie de câte 15 minute, după spălările II şi III. • Varianta B’ Imersia cariopselor în Biolact, în două etape a câte 15 minute fiecare, după spălările II şi III. Tratamentul de suprafaţă de scurtă durată, repetat, înainte de germinare, nu afectează activitatea enzimelor şi asigură inhibarea drastică a microorganismelor contaminante, conducând la obţinerea unor produse finite cu grad de inocuitate ridicat. În prezent, bacteriile lactice sunt probioticele cele mai utilizate, cu rol de factor de protecţie pentru stabilitatea microbiologică a alimentelor, securitatea alimentară şi sănătatea consumatorilor. Utilizarea culturilor de bacterii lactice exogene cum sunt cele de Lactobacillus

delbrueckii ssp. delbruekii din Biolact, ca promotori în producerea de compuşi naturali cu efect antimicrobian, cu rol bioconservant, reprezintă o alternativă de îmbunătăţire a calităţii microbiologice a produselor de tip Granovit, care sunt obţinute prin procesare minimă.

Fig.13. Diversificarea biotehnologiei de obţinere a fulgilor Granovit prin tratament de suprafaţă cu bioprodusul Biolact (→→→→Martor →→→→Varianta B →→→→Varianta B’)

Pornind de la grâu cu o încărcătură microbiologică mare, se observă o evoluţie diferenţiată a microbiotei atât în cazul subproduselor cât şi a fulgilor Granovit, în funcţie de varianta de procesare (fig.14). Din analiza valorilor obţinute la proba martor (M) se poate observa că spălările succesive din etapa de înmuiere înlătură microbiota epifită, dar în etapa de uscare are loc o înmulţire masivă a microorganismelor, tocmai datorită temperaturilor moderate la care se face această uscare. Astfel, se ajunge ca numărul de bacterii aerobe mezofile pe gram de produs finit, în cazul probei martor să fie de ~100 de ori mai mare decât la grâul folosit ca materie primă (fig.14).


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

Martor Varianta

B

Varianta

B’

Martor Varianta

B

Varianta

B’

Martor Varianta

B

Varianta

B’

Bacterii aerobe mezofile,

ufc/g

Drojdii si mucegaiuri, ufc/g Bacterii coliforme, NPC/g

Numar de microorganisme/g

Grau negerminat

Inmuiere II

Inmuiere III

A doua zi de germinare

A treia zi de germinare

Granovit fulgi

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1 2 3 4 5 6

Momentele germinarii

ufc/g

Martor

Varianta B

Varianta B'

Fig. 14. Calitatea microbiologică pe faze şi a produsului finit

în variantele de tratament cu Biolact, comparativ cu tehnologia clasică

Fig.15. Încărcătura microbiologică cu bacterii aerobe, mezofile a subproduselor şi produsului finit la procesarea în

variantele biotehnologice cu Biolact, comparativ cu tehnologia clasică

Dacă se compară rezultatele obţinute în cele două variante biotehnologice (B şi B’) (fig. 15) se observă că timpul mai mare de imersare a probei B în Biolact (14 h) influenţează direct proporţional şi încărcătura microbiană (o parte din bacteriile lactice din bioprodus rămân aderente pe bob), astfel că în a treia zi de germinare (proba 5), numărul de bacterii aerobe mezofile pe gram în varianta B este de ≈10 ori mai mare comparativ cu B’. Prin uscare, în varianta B (proba 6), se reduce de 2 ori concentraţia de bacterii aerobe mezofile, faţă de grâul umed din a treia zi de germinare (proba 5). Totuşi, comparativ cu grâul folosit ca materie primă (M), valoarea ufc/g la produsul finit este de 5 ori mai mare şi depăşeşte limita maximă admisă pentru un astfel de produs obţinut prin procedee de procesare minimă (3·105ufc/g). Aceasta se explică probabil prin prelungirea înmuierii în Biolact. În varianta B’, concentraţia de bacterii aerobe mezofile (ufc/g) se menţine relativ constantă pe parcursul procesării, iar fulgii obţinuţi prezintă o încărcătură microbiană sub limita maximă admisă (1,3·105 ufc/g în proba 6). Deci înmuierile de câte 15 minute în Biolact, după spălatul II şi III, sunt suficiente pentru îmbunătăţirea calităţii microbiene a produsului Granovit (fig.15).

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1 2 3 4 5 6


ufc/g

Martor

Varianta B

Varianta B’

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1 2 3 4 5 6


NPC/g

Martor

Varianta B

Varianta B'

Fig.16. Diversitatea cantitativă a fungilor a fungilor în etapele procesării în variantele biotehnologice cu Biolact,

comparativ cu tehnologia clasică

Fig.17. Variabilitatea cantitativă a bacteriilor coliforme pe parcursul procesării în variantele biotehnologice cu Biolact,

comparativ cu martor

În ceea ce priveşte variaţia contaminării cu fungi (drojdii şi mucegaiuri) se poate observa că produsul finit obţinut în varianta martor (proba 6) prezintă un număr de drojdii şi mucegaiuri de 10 ori mai mare comparativ cu cel al grâului materie primă şi de 103 ori mai crescut faţă de limita acceptată de normele microbiologice. Timpul mai lung de imersie în Biolact, în varianta B’, explică numărul de 100 de ori mai mare al drojdiilor şi mucegaiurilor în proba 5 B’ comparativ cu B. Totuşi predominanţa drojdiilor poate avea mai multe explicaţii: fie că bacteriile lactice din bioprodus nu au reuşit să inhibe suficient dezvoltarea drojdiilor, fie că aciditatea creată de bacteriile lactice favorizează dezvoltarea drojdiilor, sau că însuşi bioprodusul constituie o sursă nutritivă bogată pentru drojdii (fig.16). Fulgii obţinuţi în varianta B’ posedă un număr de ≈ 5ori mai mic de drojdii şi mucegaiuri comparativ cu varianta B şi varianta M, totuşi valoarea se menţine mult peste limita maximă admisă (de 300 de ori mai mare). Dintre drojdii, predomină speciile genului Saccharomyces. Aceasta poate constitui un beneficiu pentru calitatea produsului. Dacă se compară calitatea microbiologică a produselor finite cu cea a materiei prime, în varianta B, numărul de drojdii creşte de 10 ori, iar în varianta B’ - doar de 2 ori (fig.16). Se remarcă încă o dată că varianta B este mai eficientă.


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

Fulgii Granovit obţinuţi conform variantei martor, conţin NPC/g de 1,3·104, numărul de bacterii coliforme fiind de ≈2,6 de ori mai mare comparativ cu limita maximă admisă de standardul de firmă (5·103NPC/g). Pentru celelalte probe, NPC/g ≤ 2,5·103, este mai mic decât limita maximă admisă pentru un astfel de produs fabricat la temperaturi moderate de uscare (fig. 17). În concluzie, tratamentul cu Biolact, conform variantei B, şi mai ales în varianta biotehnologică B’, poate fi considerat o metodă biotehnologică eficientă de îmbunătăţire a calităţii microbiologice a produsului Granovit. ACTIVITATEA 2.3. VARIA!TE BIOTEH!OLOGICE UTILIZÂ!D CULTURI STARTER DE BACTERII LACTICE SELECŢIO!ATE Au fost concepute noi variante biotehnologice în care, pentru îmbunătăţirea inocuităţii, s-a prevăzut utilizarea culturilor de bacterii lactice selecţionate. Tratamentul de suprafaţă s-a realizat cu culturi pure de bacterii lactice selecţionate, cultivate 1-2 zile pe mediul MRS lichid. Datorită rezultatelor bune pe care le-am obţinut în varianta biotehnologică B prin imersia boabelor în Biolact şi ştiind că acesta este obţinut prin fermentaţie cu bacterii lactice, s-au testat în procesul tehnologic de germinare a grâului, culturile starter de bacterii lactice izolate din diverse surse şi verificate ca manifestând activitate antimicrobiană. Astfel, s-au utilizat culturi aparţinând la 12 tulpini selecţionate cu activitate antimicrobiană faţă de un spectru cât mai larg de microorganisme din microbiota epifită a grâului, care au servit pentru tratamentul de suprafaţă al cariopselor în a treia etapă de înmuiere a grâului, după spălatul III (fig.18). Astfel, durata tratamentelor de suprafaţă a fost de 30 minute (varianta C) şi respectiv de 60 minute (varianta C’), iar raportul - de 500 ml inocul 2% /kg grâu (concentraţia inoculului fiind de 106ufc/g). Tratamentele similare aplicate în fazele anterioare de înmuiere umedă I şi II, ca şi prelungirea timpului de imersie a cariopselor în culturile starter au demonstrat încetinirea germinării fiind afectate enzimele implicate în acest proces, prin scăderea drastică a pH-ului şi fără să aducă un beneficiu suplimentar calităţii microbiologice a produsului finit. Produsul comercial rezultat a fost denumit Granolact.

Fig. 18. Diversificarea biotehnologiei de obţinere a fulgilor de grâu germinat cu adaos exogen de bacterii lactice selecţionate

(→→→→Martor →→→→Varianta C’ →→→→Varianta C)


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

2.3.1. Efectul bacteriilor lactice selecţionate asupra inocuităţii produsului Granolact Din cele 17 tulpini de bacterii lactice la care s-a testat acivitatea antimicrobiană in vitro faţă de microorganisme din microbiota epifită a grâului, s-au selectat 12 tulpini care au prezentat spectru antimicrobian faţă de 2 sau mai multe tulpini ”sensibile” (tulpini indicator). În urma analizei microbiologice cantitative ale microbiotei produsului finit Granolact, pentru fiecare tulpină de bacterie lactică selecţionată pentru tratamentul de suprafaţă de scurtă durată, s-a observat că reducerea cea mai semnificativă se înregistrează în cazul tulpinilor de lactobacili izolate din microbiota epifită a grâului: Lactobacillus sp. 13GAL, 14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL. Din compararea valorilor ufc/g şi NPC/g în cele două variante biotehnologice de lucru, reiese că varianta experimentală C (30 minute durată de imersie) este cea mai eficientă din punct de vedere microbiologic şi biotehnologic. Astfel, germinarea nu este afectată în cazul tratamentului de suprafaţă de scurtă durată cu aceste tulpini, iar calitatea microbiologică poate fi considerată bună: numărul bacterii aerobe, mezofile variază între 1,2·105ufc/g (pentru Lactobacillus sp. 16GAL) şi 1,8·105ufc/g (pentru Lactobacillus sp. 14GAL); numărul de drojdii şi mucegaiuri variază de la < 1·102ufc/g (pentru Lactobacillus sp. 16GAL), la 5,5·102ufc/g (pentru Lactobacillus sp.14GAL); numărul probabil de coliformi este cuprins între 2,5·102/g (pentru Lactobacillus sp. 16GAL) şi 6,3·103/g (pentru Lactobacillus sp. 13GAL,14GAL,15GAL) (fig.19).Eficienţa tratamentului biotehnologic cu tulpinile Lactobacillus sp. 13GAL, 14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL, asupra calităţii microbiologice a produsului finit se poate observa din analiza procentelor de reducere care variază între 55% şi 99% în cazul bacteriilor aerobe mezofile, între 64% şi 99,93% în cazul drojdiilor şi mucegaiurilor şi între 53,85% şi 98,08% în cazul bacteriilor coliforme (fig.20). Din cele 5 tulpini izolate din microbiota grâului: Lactobacillus sp. 13GAL, 14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL, cea mai eficientă este 16GAL. Astfel, la analiza microbiologică a produsului finit obţinut în varianta C, cu această tulpină, numărul de bacterii aerobe mezofile atinge cel mai scăzut nivel: 1,2·105 ufc/g (valoare care se înscrie în standardul de firmă - 3·105ufc/g, dar nu şi în cel emis de Ministerul Sănătăţii – 104ufc/g) (fig. 21). În ceea ce priveşte numărul de drojdii şi mucegaiuri produsul finit cu tulpina Lactobacillus sp. 16GAL, se încadrează în standardul microbiologic (<102ufc/g) (fig.22).

1,00E+021,

00E+031,

00E+041,

00E+051,

00E+061,

00E+071,

00E+08

Martor

1 GAL

4GAL

5 GAL

7 GAL

8 GAL

11 GAL

12 GAL

13 GAL

14 GAL

15 GAL

16 GAL

17 GAL

Tulpini de bacterii lactice selectionate

ufc/g

Bacterii aerobe mezofile varianta C Bacterii aerobe mezofile varianta C'

Drojdii si mucegaiuri varianta C Drojdii si mucegaiuri varianta C'

Bacterii coliforme varianta C Bacterii coliforme varianta C'

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Mart

or1 G

AL3 G

AL4 G

AL5 G

AL7 G

AL8 G

AL11 G

AL12 G

AL13 G

AL14 G

AL15 G

AL16 G

AL17 G

AL


Red

ucer

e %

Mar

tor

Bacterii aerobe mezofile

Drojdii si mucegaiuri

Bacterii coliforme

Fig.19. Analiza microbiologică a fulgilor Granolact în variantele

biotehnologice de germinare C şi C’ Fig.20. Îmbunătăţirea calităţii microbiologice a fulgilor de grâu

Granolact, în varianta C, comparativ cu martorul

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

Martor

1 GAL

4GAL

5 GAL

7 GAL

8 GAL

11 GAL

12 GAL

13 GAL

14 GAL

15 GAL

16 GAL

17 GAL

Tulpini de bacterii lactice selec\ionate

ufc/g

Varianta C

Varianta C'

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

Martor

1 GAL

4GAL

5 GAL

7 GAL

8 GAL

11 GAL

12 GAL

13 GAL

14 GAL

15 GAL

16 GAL

17 GAL

Tulpini de bacterii lactice selec\ionate

ufc/g

Varianta C

Varianta C'

Fig.21. Încărcătura cu bacterii aerobe mezofile a fulgilor Granolact obţinuţi în variantele biotehnologice C şi C’,

comparativ cu proba martor

Fig.22. Distribuţia cantitativă a contaminării cu fungi a fulgilor Granolact obţinuţi în variantele C şi C’, comparativ

cu martorulNumărul probabil de coliformi corespunzător acestui produs este de 2,5·102/g ceea ce corespunde standardului de firmă, dar nu şi în cel emis de Ministerul Sănătăţii ( 102ufc/g) (fig. 23).


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

Martor

1 GAL

4GAL

5 GAL

7 GAL

8 GAL

11 GAL

12 GAL

13 GAL

14 GAL

15 GAL

16 GAL

17 GAL


NPC/g

Bacterii coliforme (NPC/g) C Bacterii coliforme (NPC/g) C'

Fig. 23.Variabilitatea cantitativă a bacteriilor coliforme în produsul Granolact obţinut prin cele două variante biotehnologice C şi

C’, comparativ cu martorul S-a comparat potenţialul tulpinilor selecţionate Lactobacillus sp. 13GAL, 14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL izolate din microbiota epifită a grâului şi care s-au dovedit ca fiind cele mai eficiente în reducerea încărcăturii microbiene a produsului finit, cu câteva tulpini bacteriene oferite din colecţia MICROGEN Bucureşti a Centrului de Cercetări Genetice, Microbiologice şi Biotehnologice (din engl. Center for Research in Genetics, Microbiology and Biotechnology) cunoscute cu activitate antimicrobiană importantă. Durata tratamentului de suprafaţă a fost de 30 min., iar momentul aplicării a fost acelaşi, a treia etapă de înmuiere umedă, înainte de preuscare. Tulpinile utilizate sunt prezentate în tabelul 6.

Tab.6. Tulpini de bacterii lactice din colecţia MICROGEN al căror potenţial antimicrobian a fost comparat cu Lactobacillus sp. 13GAL, 14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL

Indicativul tulpinii

Denumire specie

2 Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus 6901 3 Lb. plantarum ATCC 8014 18 Enterococcus faecium 16216 19 Enterococcus faecium VL 28 20 Enterococcus faecium VL 43 21 Lactobacillus acidophilus GM 14 22 Lactobacillus johnsoni La1

Prin analiza microbiologică cantitativă a produsului finit s-a constatat că numărul de bacterii aerobe mezofile scade sub 3·105ufc/g (cât este standardul de firmă) pentru tulpinile Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus 6901, Lb. plantarum ATCC 8014, Lactobacillus sp. 13GAL, 14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL, Lb. acidophilus GM 14 (fig. 24). Numărul de drojdii şi mucegaiuri scade sub 102 ufc/g doar în cazul tratamentului de suprafaţă cu tulpinile Lb. plantarum ATCC

8014 şi Lb. acidophilus GM 14. Probabil pH-ul acid creat de bacteriile lactice, cu care s-a realizat tratamentul de suprafaţă, favorizează dezvoltarea drojdiilor pentru că acestea predomină şi mai ales specii ale genului Saccharomyces sp (fig. 24). Numărul probabil de coliformi scade sub 5·103 NPC/g în cazul tuturor tulpinilor analizate, dar se remarcă tulpinile Lb. delbrueckii

ssp. bulgaricus 6901, Lb. plantarum ATCC 8014, Enterococcus faecium VL 28 şi Lb. acidophilus GM 14 (fig. 24). Tulpina Lb. acidophilus GM14 (indicativ 21) se remarcă printr-o activitate antimicrobiană intensă atât asupra bacteriilor aerobe, mezofile cât şi asupra drojdiilor şi mucegaiurilor, dar mai ales asupra bacteriilor coliforme asupra cărora are efect bactericid deoarece acestea nu se mai regăsesc în produsul finit (fig. 24). Acest efect s-ar explica prin potenţialul acestei bacterii de a elabora bacteriocine. Toate tulpinile testate pot fi considerate probiotice în primul rând datorită îmbunătăţirii calităţii microbiologice a produsului finit Granolact. Pentru tulpinile Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus 6901, Lb. johnsoni La1, această calitate este deja confirmată.

1,00E+001,

00E+011,

00E+021,

00E+031,

00E+041,

00E+051,

00E+061,

00E+071,

00E+08

Admis

Control 2 3 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22


ufc/g

Bacterii aerobe mezofile Drojdii si mucegaiuri Bacterii coliforme

Fig.24. Analiza comparativă a calităţii microbiologice a produsului Granolact, obţinut cu diferite tulpini de bacterii lactice selecţionate


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

Tulpinile izolate din microbiota epifită a grâului 13GAL, 14GAL, 15GAL (Lb. plantarum) şi 16GAL, 17GAL (Lb. brevis), au un efect antimicrobian intermediar comparativ cu tulpinile din colecţia Centrului MICROGEN al Universităţii Bucureşti. Astfel, sunt mai puţin eficiente comparativ cu tulpinile 2, 3, 21, însă sunt comparabile ca efect antimicrobian cu tulpinile 20 ( Enterococcus

faecium VL 43) şi 22 (Lb. johnsoni La1) şi sunt mai eficiente decât tulpinile 18 (Enterococcus faecium 16216) sau 19 (Enterococcus faecium VL 28) (fig. 24). Deşi toate tulpinile izolate prin studii proprii modifică în sens pozitiv toţi parametrii microbiologici verificaţi, aceştia situându-se sub limita impusă de standardul de firmă, se remarcă tulpina Lb. brevis 16GAL care induce cea mai bună inocuitate produsului finit Granolact. Totuşi, normele microbiologice stabilite prin Ordinul Ministerului Sănătăţii, care impun mai puţin de 104 ufc/g bacterii aerobe mezofile, 102 ufc/g pentru drojdii şi mucegaiuri şi pentru bacterii coliforme, nu sunt îndeplinite decât parţial.

2.3.2. Stabilitatea microbiologică a produsului probiotic Granolact S-a urmărit, pe un interval de 3 luni, numărul total de bacterii aerobe, mezofile, de drojdii şi mucegaiuri şi de bacterii coliforme, în paralel cu evoluţia numărului de bacterii lactice, în produsul obţinut prin tratamentul de suprafaţă al grâului germinat cu tulpina Lactobacillus sp. 16GAL (tab.7).

Tab. 7.Calitatea microbiologică a produsului probiotic Granolact (grâu germinat + Lactobacillus sp. 16 GAL) în timpul păstrării

Indicator microbiologic

!umăr de microorganisme după

1 zi 1 săpt. 2 săpt. 3 săpt. 1 lună 2 luni 3 luni Bacterii aerobe,

mezofile, ufc/g 1,8 ·106 1,2 ·106 8 ·105 3 ·105 2 ·105 4 ·103 2,5 ·103

Drojdii şi mucegaiuri,

ufc/g 4 ·103 7 ·103 8 ·103 7 ·103 7 ·103 6 ·103 2 ·103

Bacterii coliforme,

NPC/g 6 ·102 5 ·102 5 ·102 3 ·102 2,5 ·102 1,3 ·102 0,6 ·102

Bacterii lactice, ufc/g

1,2 ·106 1 ·106 7 ·105 2 ·105 9 ·104 3,7 ·103 3 ·103

Numărul de bacterii, atât bacteriile aerobe mezofile, cât şi cele coliforme, se reduce drastic după 2 săptămâni de depozitare a produsului ceea ce îmbunătăţeşte semnificativ calitatea microbiologică a produsului. Valorile tuturor parametrilor microbiologici scad mult sub limitele admise prin standardul de calitate. Astfel, bacteriile aerobe, mezofile scad de la 1,8·106 ufc/g iniţial, la 2,5·103 ufc/g în a treia lună de păstrare. Din numărul total de bacterii regăsite pe gram de produs, 92,5% sunt bacterii lactice adsorbite în timpul tratamentului de suprafaţă al grâului germinat. Bacteriile coliforme scad numeric de la 6·102 la 0,6·102 îmbunătăţind vizibil inocuitatea produsului Granolact (fig.25). Scade însă proporţional şi numărul bacteriilor lactice din produsul probiotic, la o lună de depozitare regăsindu-se 9·104ufc/g, mai puţin de 10% din numărul iniţial (1,2·106 ufc/g), datorită, probabil deshidratării din timpul etapei de uscare a grâului germinat şi lipsei unui substrat nutritiv accesibil în perioada de depozitare. La 3 luni de depozitare în produsul Granolact se mai regăsesc 3·103ufc/g bacterii lactice (fig. 25). În aceste condiţii se impune reducerea termenului de garanţie al produsului probiotic comercializat sub această formă, uscată, la 2 săptămâni maxim, cu toate că se cunoaşte că bacteriile lactice îşi manifestă caracterul lor probiotic chiar şi în stare nevie. Numărul de drojdii creşte în primele 2 săptămâni de depozitare a produsului Granolact, apoi se menţine constant până în a doua lună, pentru ca în a treia lună de păstrare numărul de ufc/g produs să scadă sub valoarea din momentul fabricării (fig. 25). Trebuie specificat că mucegaiurile nu s-au dezvoltat pe toată durata analizată.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

1 zi

1 sapt

2 sapt

3 sapt

1 luna

2 luni

3 luni

Durat` de p`strare

% modificare

Bacterii

aerobe

mezofile

Drojdii si

mucegaiu

ri(ufc/g)

Bacterii

coliforme

Bacterii

lactice

0 100 200 300

Martor

A

B

B’

C

C’

Varianta biotehnologica

% modificare fa\` de martor

Bacterii

coliforme

Drojdii si

mucegaiuri

Bacterii

aerobe

mezofile

Fig.25. Evoluţia indicatorilor microbiologici la produsul

probiotic Granolact pe durata a 3 luni de păstrare

Fig.26. Gradul de modificare a inocuităţii microbiologice a produsului finit în diferite variante biotehnologice,

comparativ cu martorul


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

2.3.3.. Eficienţa utilizării culturilor starter de bacterii lactice comparativ cu variantele biotehnologice cu tratamente de suprafaţă cu acid acetic şi bioprodus Biolact Varianta biotehnologică A a fost lucrată separat de variantele B şi C (în altă lună, folosind alt grâu ca materie primă) şi din acest motiv prezintă alte valori martor ale celor trei indicatori microbiologici studiaţi. Pentru compararea variantelor biotehnologice de lucru s-au analizat produsele finite obţinute de fiecare dată. S-a determinat gradul de modificare realizat pentru fiecare variantă biotehnologică în parte şi pentru fiecare indicator microbiologic şi s-a exprimat procentual faţă de martorul corespunzător, considerat 100. Nu s-a putut calcula % reducere faţă de martor pentru că, în unele cazuri, rezultatul este o creştere a numărului de ufc/g (de exemplu, numărul de drojdii şi mucegaiuri din produsul finit în varianta biotehnologică A). Varianta biotehnologică A în care s-a propus utilizarea acidului acetic în concentraţie de 0,5% la apa de la a treia înmuiere pentru scăderea pH-ului la 4,5 – 5,0 determină sporirea de 2,4 ori a numărului de drojdii si mucegaiuri faţă de martor compensată de reducerea semnificativă a numărului da bacterii aerobe şi mezofile (3,76% faţă de martor). Bacteriile coliforme se reduc la 37,5% comparativ cu martorul (fig.26). Varianta biotehnologică B, care implică o imersie îndelungată, de 14h, în bioprodusul Biolact la prima înmuiere, la care se adaugă două perioade scurte, de câte 15 min., de imersie după spălările II şi III a determinat încetinirea procesului de germinare, deşi gradul de inocuitate al produsului finit este mai bun comparativ cu varianta A. Acest lucru este relevant în special în privinţa coliformilor la care reducerea este mai pronunţată faţă de varinata A (de 19,23% faţă de martor). Gradul de reducere al numărului de bacterii aerobe şi mezofile (ufc/g) este de 4,16% faţă de martor, apropiat de cel din varianta de tratament cu acid acetic. Numărul de ufc/g pentru drojdii şi mucegaiuri rămâne neschimbat faţă de martor (fig.26). Varianta B’ în care se renunţă la perioada lungă de imersie în Biolact de la prima înmuiere, pastrându-se doar cele două imersii de scurtă durată, după spălările II şi III, este mult mai eficientă decât variantele anterioare. Gradul de reducere la numărul de drojdii şi mucegaiuri este mult îmbunătăţit (de 21,4% faţă de martor) la fel şi numărul de bacterii aerobe, mezofile (scade la 1,08% faţă de martor). Numărul probabil de coliformi este neschimbat faţă de varianta B (fig. 26). Variantele de lucru cu tratamente de suprafaţă cu culturi starter de bacterii lactice, dau cele mai bune rezultate. Inocuitatea produsului finit Granolact este sensibil îmbunătăţită în privinţa tuturor celor trei indicatori microbiologici. Varianta C’ la care durata tratamentului de suprafaţă de după spălatul III este de 60 minute, frânează procesul de germinare fără să aducă o îmbunătăţire suplimentară a calităţii microbiologice a produsului finit. Astfel, gradul de reducere pentru bacterii aerobe, mezofile este de 2,08%, pentru drojdii şi mucegaiuri de 0,17%, iar la coliformi de 3,07% comparativ cu proba martor (fig. 26). Varianta biotehnologică C la care durata tratamentului de suprafaţă este redusă la 30 minute este cea recomandată deoarece nu afectează procesul de germinare şi, în acelaşi timp, îmbunătăţeşte cel mai eficient calitatea microbiologică a produsului finit. Astfel, reducerea numărului de bacterii aerobe, mezofile este de 99%, în privinţa drojdiilor şi mucegaiurilor s-a obţinut o reducere de 99,93%, iar pentru bacterii coliforme scad cu 80,77% (fig.26). Analiza microbiologică comparativă a produselor finite obţinute prin variantele biotehnologice B’ (care utilizează produsul Biolact fabricat prin metoda tradiţională) şi C (care utilizează culturi starter de bacterii lactice) a demonstrat eficienţa bacteriilor lactice, deşi este mai costisitoare (implică izolarea tulpinilor în stare pură, selecţionarea lor, întreţinerea lor în laborator pe medii selective, conservarea lor şi prepararea periodică a inoculului). Aceasta prezintă însă avantajul folosirii unor tulpini atent selecţionate, pe baza anumitor teste in vitro şi in vivo care atestă caracterul lor probiotic, conferind rolul de aliment funcţional produsului finit în care se regăsesc (Granolact).

CO!CLUZII

S-a izolat ADN total de la 3 tulpini de bacterii lactice izolate de pe cereale şi s-a determinat puritatea şi integritatea atât electroforetic cât şi spectrofotometric.

Secvenţierea genelor ADNr care codifică ARNr 16S (Anexele 1. şi 2.)a confirmat faptul că tulpina 15GAL este Lb.

plantarum HDRS1 iar tulpina 16GAL este Lb. brevis JH-1 aşa cum a reieşit şi din identificarea cu kituri API. Tot prin analiza BLAST a secvenţelor ADNr cu ajutorul programului D!AMA! Versiunea 4.03 (Lynnon Biosoft®) a

fost identificată tulpina Lactobacillus sp. L ca aparţinând tulpinii Weissella confusa C5-,7 cunoscută ca având o importantă activitate antifungică faţă de Penicillium roqueforti, Aspergillus niger şi Endomyces fibuligera (Anexa3).

Utilizând vectorul pCR2.1 –TOPO a fost clonată gena bgl-1 în genomul tulpinii Lb. plantarum 15GAL şi s-au obţinut recombinanţi genetici cu o eficienţă de 4 x 102 transformanti/µg ADN, dar gena nu se exprimă în sistemul celular gazdă, din motive încă necunoscute .

Scăderea pH-ului apei de înmuiere reduce semnificativ, în cerealele germinate, numărul total de bacterii aerobe, mezofile ca şi numărul probabil de coliformi (la 37,5% faţă de varianta standard), dar calitatea microbiologică nu se încadrează în normativele impuse de Ministerul Sănătăţii. Valorile pH-ului în domeniu uşor acid, din varianta biotehnologică A, favorizează dezvoltarea drojdiilor, dar mucegaiurile sunt inhibate.

Tratamentele scurte şi repetate ale cariopselor de grâu cu bioprodusul Biolact, în varianta biotehnologică B’, sunt mai eficiente în privinţa tuturor parametrilor microbiologici analizaţi şi nu afectează germinarea. În varianta biotehnologică B, timpul lung de imersie în Biolact, încetineşte germinarea fără să îmbunătăţească suplimentar inocuitatea produsului finit, comparativ cu varianta B’.

Timpul de imersie scurt în cultura starter (30 minute ăn variant biotehnologică C) este mai eficient în privinţa tuturor parametrilor microbiologici analizaţi şi nu afectează germinarea.


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

Deşi toate tulpinile selecţionate au efect de reducere a parametrilor microbiologici verificaţi sub limita impusă de standardul de firmă, s-a remarcat tulpina Lb. brevis 16 GAL care asigură cea mai bună inocuitate produsului finit Granolact.

Tulpinile izolate din microbiota epifită a grâului Lb. plantarum 13GAL, 14GAL, 15GAL şi Lb. brevis 16GAL, 17GAL, au un efect inhibitor comparabil cu tulpinile oferite spre studiu de Centrul MICROGEN al Universităţii Bucureşti.

Din numărul total de bacterii regăsite pe gram de produs, 92,5 % sunt bacterii lactice adsorbite în timpul tratamentului de suprafaţă al grâului germinat, dar la o lună de depozitare se mai regăsesc mai puţin de 10% din numărul iniţial de bacterii lactice, probabil datorită deshidratării din timpul etapei de uscare a grâului germinat şi lipsei unui substrat nutritiv accesibil în perioada de depozitare.

În timpul depozitării inocuitatea produsului se îmbunătăţeşte, dar dacă se urmăreşte efectul probiotic al acestuia, se recomandă consumarea lui în primele 2 săptămâni de fabricaţie

A EXA 1

GenBank: DQ141558.2 Lactobacillus plantarum strain HDRS1 16S ribosomal R!A gene, partial sequence LOCUS DQ141558 1548 bp DNA linear BCT 25-JUL-2008 DEFINITION Lactobacillus plantarum strain HDRS1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION DQ141558 VERSION DQ141558.2 GI:194442161 ORGANISM Lactobacillus plantarum Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactobacillus. REFERENCE 1 (bases 1 to 1548) AUTHORS Zou,P., Ge,J. and Ping,W. TITLE The research of separation and identification of Lactobacillus plantarum strain HDRS1 JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1548) AUTHORS Zou,P., Ge,J., Ping,W. and Song,G. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-JUL-2005) College of Life Science, Microbiology, Xuefu, Harbin, Heilongjiang 150080, China REFERENCE 3 (bases 1 to 1548) AUTHORS Zou,P., Ge,J., Ping,W. and Song,G. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-JUL-2008) College of Life Science, Microbiology, Xuefu, Harbin, Heilongjiang 150080, China REMARK Sequence update by database staff to remove vector contamination COMMENT On Jul 25, 2008 this sequence version replaced gi:71905247. FEATURES Location/Qualifier source 1..1548 /organism="Lactobacillus plantarum" /mol_type="genomic DNA" /strain="HDRS1" /db_xref="taxon:1590" rRNA <1..>1548 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 61 gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 121 tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 181 taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt 241 ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtgaggtaa cggctcacca tggcaatgat 301 acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 361 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 421 gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 481 gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 541 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 601 ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac 661 tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 721 atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct 781 cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa 841 tgctaagtgt tggagggttt ccgcctttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc 901 ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

961 tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat 1021 gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt 1081 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc 1141 agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1201 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1261 tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc 1321 ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1381 tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg 1441 taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt aggaaccagc cgcctaaggt gggacagatg 1501 attagggtga agtcgtaaca aggtagccgt agaatcacta gtgaattc

A EXA 2 GenBank: FJ824740.1 Lactobacillus brevis strain JH-1 16S ribosomal R!A gene, partial sequence

LOCUS FJ824740 1446 bp DNA linear BCT 07-APR-2009 DEFINITION Lactobacillus brevis strain JH-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION FJ824740 VERSION FJ824740.1 GI:226295430 ORGANISM Lactobacillus brevis Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactobacillus. REFERENCE 1 (bases 1 to 1446) AUTHORS Jiang,H., Lu,Z. and Li,Y. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (13-MAR-2009) College of Food Science and Technology, Nanjing Argricultural University, Weigang 1, Nanjing, Jiangsu 210095, China FEATURES Location/Qualifiers source 1..1446 /organism="Lactobacillus brevis" /mol_type="genomic DNA" /strain="JH-1" /db_xref="taxon:1580" rRNA <1..>1446 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 atacatgcaa gtcgaacgag cttccgttga atgacgtgct tgcactgatt tcaacaatga 61 agcgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaatctgc ccagaagcag gggataacac 121 ttggaaacag gtgctaatac cgtataacaa caaaatccgc atggattttg tttgaaaggt 181 ggcttcggct atcacttctg gatgatcccg cggcgtatta gttagttggt gaggtaaagg 241 cccaccaaga cgatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag 301 acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc 361 tgatggagca atgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa 421 gaagaacacc tttgagagta actgttcaag ggttgacggt atttaaccag aaagccacgg 481 ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg 541 ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg 601 agaagtgcat cggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt 661 agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctagtctg 721 taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 781 atgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa 841 cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 901 ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc 961 aggtcttgac atcttctgcc aatcttagag ataagacgtt cccttcgggg acagaatgac 1021 aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1081 gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt cagttgggca ctctggtgag actgccggtg 1141 acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1201 acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt cgcgaagtcg tgaggctaag ctaatctctt 1261 aaagccgttc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtt ggaatcgcta 1321 gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1381 cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagc cggtgagata accttcggga gtcagccgtc 1441 taaggt


ID_658 nr. 315/01.10.2007

2009

A EXA 3

GenBank: FJ429978.1 Weissella confusa strain C5-7 16S ribosomal R!A gene, partial sequence LOCUS FJ429978 1418 bp DNA linear BCT 03-MAR-2009 DEFINITION Weissella confusa strain C5-7 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION FJ429978 VERSION FJ429978.1 GI:222839982 ORGANISM Weissella confusa Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Weissella. REFERENCE 1 (bases 1 to 1418) AUTHORS Valerio,F., Favilla,M., De Bellis,P., Sisto,A., de Candia,S. and Lavermicocca,P. TITLE Antifungal activity of strains of lactic acid bacteria isolated from a semolina ecosystem against Penicillium roqueforti, Aspergillus niger and Endomyces fibuliger contaminating bakery products JOURNAL Syst. Appl. Microbiol. 32 (6), 438-448 (2009) PUBMED 19243908 REFERENCE 2 (bases 1 to 1418) AUTHORS Favilla,M., De Bellis,P., Sisto,A. and Valerio,F. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (31-OCT-2008) Institute of Sciences of Food Production (ISPA), National Research Council (CNR), Via Amendola, 122/O, Bari 70126, Italy FEATURES Location/Qualifiers source 1..1418 /organism="Weissella confusa" /mol_type="genomic DNA" /strain="C5-7" /db_xref="taxon:1583" rRNA <1..>1418 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 acgctttgtg gttcaactga tttgaagagc ttgctcagat atgacgatgg acattgcaaa 61 gagtggcgaa cgggtgagta acacgtggga aacctacctc ttagcagggg ataacatttg 121 gaaacagatg ctaataccgt ataacaatga caaccgcatg gttgttattt aaaagatggt 181 tctgctatca ctaagagatg gtcccgcggt gcattagcta gttggtaagg taatggctta 241 ccaaggcgat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg ccacaatggg actgagacac 301 ggcccatact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat 361 ggagcaacgc cgcgtgtgtg atgaagggtt tcggctcgta aaacactgtt gtaagagaag 421 aatgacattg agagtaactg ttcaatgtgt gacggtatct taccagaaag gaacggctaa 481 atacgtgcca gcagccgcgg taatacgtat gttccaagcg ttatccggat ttattgggcg 541 taaagcgagc gcagacggtt atttaagtct gaagtgaaag ccctcagctc aactgaggaa 601 ttgctttgga aactggatga cttgagtgca gtagaggaaa gtggaactcc atgtgtagcg 661 gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctttct ggactgtaac 721 tgacgttgag gctcgaaagt gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacac 781 cgtaaacgat gagtgctagg tgtttgaggg tttccgccct taagtgccgc agctaacgca 841 ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 901 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 961 cttgacatcc cttgacaact ccagagatgg agcgttccct tcggggacaa ggtgacaggt 1021 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1081 aacccttatt actagttgcc agcattcagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa 1141 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1201 gtgctacaat ggcgtataca acgagttgcc aacccgcgag ggtgagctaa tctcttaaag 1261 tacgtctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa 1321 tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca 1381 ccatgagagt ttgtaacacc caaagccggt ggggtaac

Date post:	27-Oct-2019
Category:	Documents
Upload:	others
View:	38 times
Download:	1 times

Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe ... · Electroforeza in gel de agaroza...

Documents