B2. Metode de investigare a straturilor subtiri de spinel prin

microscopie de inalta rezolutie

B2.1. Difractie de raze X.

Difracţia cu raze X este o metodă des folosită pentu determinarea parametrilor dimensionali ai cristalelor,

spaţierea între planele cristalografice, plane de difracţie, fază şi constante de reţea. În ziua de azi este

utilizată la estimarea dimensiunii cristalitelor – nanocristale.

Pentru studiul materialelor cu raze X se foloseşte numai o gamă redusă de lungimi de undă. Se

foloseşte linia , de cele mai multe ori linia fiind filtrată cu ajutorul unui film absorbant (de exemplu

o folie subţire de nichel). Cel mai folosit metal este cuprul, care poate fi păstrat cu uşurinţă la temperaturi

scăzute, deoarece are o conductivitate termică mare şi produce linii şi puternice. Lungimea de undă

corespunzătoare liniei a cuprului este λ = 0.1541nm.

Studiul cristalelor cu raze X are la bază bine cunscuta lege a lui Bragg care dă distanţa între două

plane cristalografice (Fig. 12) – constanta reţelei:

,

unde λ este lungimea de undă a radiaţiei X,

n este ordinul difracţiei,

θ este unghiul de difracţie.

Difracţia are loc dacă este îndeplinită relaţia de mai sus. Aceasta se îndeplineşte dacă se variază în mod

continuu lungimea de undă sau unghiul sub care este iradiată proba, într-o gamă de valori. Folosind aceste

principii s-au dezvoltat mai multe metode experimentale de studiu al materialelor cu raze X: metoda Laue

(folosită în special pentru a determina orientarea unor cristale mari, fixe, iradiate cu o undă cu un spectru mai

larg de lungimi de undă), metoda cristalului rotitor (sursă monocromatică de raze X şi un cristal montat cu o

Fig. 12 Difracţia pe cristale a razelor X.

axă normală la raza incidentă) şi metoda pulberilor (folosită pentru determinarea cu acurateţe a parametrilor

reţelei).

Pentru determinarea dimensiunii cristalitelor se foloseşte relaţia Debye-Scherrer, care dă diametrul

pariculelor cu o precizie rezonabilă:

,

unde w este FWHM – lăţimea (banda) la jumătatea înălţimii (full width at half maximum) pentru diferitele

vârfuri din difractogramă.

În practică, datele experimentale obţinute prin metoda difracţiei cu raze X pentru o probă oarecare

sunt supuse erorilor de calibrare a instrumentului, erorilor instrumentale, fluctuaţiilor de putere care pot să

apară în timpul efectuării experimentului şi zgomotelor externe.

Investigaţiile cristalografice asupra filmelor subţiri de şi a celor dopate cu Li au

fost efectuate cu un difractometru folosind linia Kα a cuprului, folosind difracţia la unghiuri mici. Fasciculul

incident de raze X cade pe suprafaţa probei sub unu unghi de 3º. Datele au fost înregistrate folosind un pas

de 0.02º pentru unghiul 2θ. Dimensiunea granulelor a fost determinată folosind formula Debye-Scherrer.

Această tehnică permite analize cristalografice asupra filmelor subţiri cu o dimensiune de pană la 10 nm.

Fig. 13 Imagini TEM ale probei de obţinută prin metoda sol-gel.

M ă s u r ă t o r i l e e f e c t u a t e p e f i l m e s u b ţ i r i d e

şi dopate cu Li depuse pe suporturi de sticlă sau Pt, la diferite temperaturi au evidenţiat

structuri cubice, tipice pentru spinel. Folosirea de diferite substraturi pentru filmele subţiri investigate nu a

influenţat într-o măsură foarte mare intensitatea sau forma liniilor de difracţie. Proba tratată termic la

temperaturi mai înalte (500°C) depuse pe diferite tipuri de substraturi prezintă difractograme cu linii de

difracţie mai înguste. Acest lucru indică faptul că proba conţine structuri spinel bine cristalizate. S-a putut

determina de asemenea şi constanta reţelei având o valoare de . Proba dopată cu ioni de

Li a dus la o modificare a constantei reţelei ceea ce indică o incorporare a ionilor de

Li în structura spinel.

Pe de altă parte difractogramele pentru filmele preparate la o temperatură mai scăzută (300°C) sunt

mai puţin bine-definite (în acest caz s-a obţinut o constantă a reţelei de ), ceea ce

indică o structură amorfă.

Karthick şi colaboratorii au folosit difracţia cu raze X pentru determinarea structurii cristaline, dar şi

a purităţii şi conformităţii filmelor subţiri investigate. Difractogramele au fost măsurate în domeniul 0 - 80°;

şi de această dată folosind ecuaţia Debye-Scherrer s-a determinat dimensiunea cristalitelor.

O altă metodă de investigare este cea care foloseşte probe sub formă de pulbere – metoda pulberilor.

B2.2 Microscopie cu baleiaj de electroni in transmisie

Deoarece metoda de determinare a dimensiunii cristalitelor folosind ecuaţia Debye-Scherrer nu este una

foarte exactă se poate încerca pentru comparaţie şi determinarea dimensiunii folosind microscopia

electronică în transmisie.

Fig. 14 Imagine SEM (stânga) şi TEM (dreapta) pentru o probă de

Astfel din studiul prin ecuaţia Debye-Scherrer s-a estimat o dimensiune a

cristalitelor în intervalul 80-200 nm şi folosind imaginea TEM (Fig. 15) s-a obţinut o dimensiune între 50-

200 nm.

Mai mult, pentru o mai mare acurateţe se poate folosi şi microscopia electronică cu baleiaj (SEM)

pentru determinarea dimensiunii cristalitelor.

Difractometrul cu care este echipat Centrul de Microscopie – Microanaliză şi Procesarea Informaţiei

este un difractormetru de înaltă rezoluţie HRD3000 produs de ItalStructures având ca pricipale caracteristici:

stabilitate ridicată a generatorului de raze X dotat cu un microprocesor controlat de PC.

dispozitiv de optică paralelă

goniometru de mare precizie cu poziţionare cu motoare secvenţiale

un al doilea monocromator pentru radiaţia de Cu

5 grade de libertate, toate motorizate

Cu ajutorul lui se pot efectua măsurători tipice cristalografice de determinare difractogramelor, spaţierii între

planele cristalografice sau calculul constantelor de reţea atât pnetru pulberi cât şi pnetru filme subţiri,

aparatul având în dotare un dispozitiv special pentru investigarea filmelor subţiri. Deasemenea softul de care

dispune difractometrul poate calcula dimensiunea cristalitelor din probele investigate.

B2.3. Microscopie cu forte atomice

Studiul filmelor subtiri cu structuri de tip spinel presupune doua etape , o etapa de determinare a planelor

cristalografice prezente in filmele subtiri , prin intermediul difractiei de raze X, si o a doua etapa de

Fig. 15 Schema microscopului cu forte atomice.

investigare a structurii morfologice analizate prin microscopie cu forte atomice si microscopiei cu baleiaj al

electronilor. Studii asupra granularitatatii de la suprafta filmului , marimilor cristalelor sau asupra rugozitatii

cad in mod direct sub incidenta domeniului microscopiei cu forte atomice. Acest tip de masuratori nu sunt

specifice strucutrilor de spinel , fiind folosite in investigarea multor familii de materiale si dizpozitive.

Principiile teoretice si de functionare ce stau la baza acestor masuratori vor fi prezentate in cele ce vor urma.

Deasemnea vor fi prezentate si caractersitici specifice filmelor subtiri cu strucutura spinel ce pot fi

investigate prin intermediul acestei tehnici de microscopie.

B2.3.1 Microscopie cu forte atomice (atomic force microscopy: AFM) –

principiul de functionare

Sonda microscopului cu forta atomica este alcatuita dintr-o lamela sub forma de cruce, alungita si elastica,

numita cantilever, cu dimensiuni de ordinul zecilor de microni, în capatul careia este plasat un ac ascutit,

perpendicular pe cantilever. Cantileverul este miscat în plan xy si vertical de un sistem de pozitionare

piezoelectric, cu precizia în jur de 5 nm orizontal si pâna la 10 pm vertical. În timp ce acul baleiaza

suprafata, miscându-se în sus si în jos odata cu conturul acesteia, o raza laser cade oblic pe partea superioara

(puternic reflectatoare) a cantileverului si se reflecta catre un senzor alcatuit din doua fotodiode alaturate.

Diferenta dintre semnalele celor doua diode indica pozitia spotului laser pe senzor si deci pozitia pe verticala

a cantileverului. Deoarece distanta între cantilever si detector este de obicei de mii de ori mai mare decât

lungimea cantileverului, sistemul realizeaza o marire a deplasarii cu un factor de peste 2000, usor de

masurat.

Acul cu un varf foarte ascutit (in varf se afla cativa atomi), montat pe cantilever se deplasează pe

suprafaţa probei după un rastru de baleiaj. Vârful acului face ca latura cantilverului care îl conţine sa se

deformeze in funcţie de forţele care actioneaza asupra sa . Aceste forte sunt intr-o stricta relaţie cu harta

topografica a probei studiate. Vârful este apropiat de proba pana când intre acesta si molecule din proba se

stabileşte o forta din categoria fortelor van der Waals, bazate in primul rand pe fortele electrostatice dintre

particulele incarcate ale acului si probei. Aceasta forta, in funcţie de “denivelările” de la suprafaţa probei ,

respinge sau atrage vârful . Cantileverul sesizează aceste deplasări pe axa z , si in baza lor , alături de ofsetul

(x,y) căruia ii este asociata forta care actioneaza asupra vârfului pe axa z , unitatea de calcul asociata

microscopului cu forte atomice poate alcătui a harta topografica a probei.

In timp ce cantileverul de deformează , lumina provenita de la un laser este reflectata pe o fotodioda

splitata . Măsurând diferenţa de semnal (A-B) , deformările cantilverului pe axa z pot fi observate si

măsurate foarte precis.

Din moment ce cantileverul respecta legea lui Hooke pentru mici deplasamente , se regaseste o forta

de interactie intre vârf si proba .

Deplasarea vârfului sau a probei este realizata cu ajutorul unui dispozitiv de poziţionare deosebit de

precis realizat din ceramici piezo-electrice, cel mai adesea sub forma unui scanner tub . Scanner-ul este

capabil de rezoluţii sub nivelul unui Angstrom pe direcţiile axelor x,y si z. In mod convenţional , axa z , este

perpendiculara pe proba.

Mecanismul de detectie a semnalului sondei, actioneaza asupra circuitului de reactie, care la randul

sau actioneaza asupra traductorului piezoelectric ce actioneaza intr-un mod foarte fin asupra suportului

probei, in functie de modul de lucru dorit.

In figura 16 se poate observa ce se întâmpla la suprafaţa de contact dintre vârf si proba :

Componentele unui microscop cu forte atomice

(1) un cantilver prevăzut cu un vârf ascuţit

(2) un scanner care controlează poziţionarea pe axele x-y-z

(3) un laser cu semiconductor

(4) un fotodetector

(5) circuit de control al reacţiei .

Interactia vârf - proba

Interactia dintre vârf si proba are la baza forţele van der Waals, datorate, in special, forţelor electice dintre

particulele încărcate de pe suprafeţele probei si respectiv sondei de explorare (varful acului). In figura 17

este prezentata evolutia fortele van der Waals cu distanta.

Pe masura ce atomii sunt in mod apropiati in mod gradat, acestia se atrag slab intre ei . Atractia

creste pana cand atomii sunt atat de apropiati incat norul de electronii de pe orbita incep sa se respinga .

Fig. 16 Interactia varf proba

Aceasta respingere electrostatica slabeste din ce in ce mai mult forta de atractie pe masura ce distanta

interatomica continua sa se micsoreze. Forta devine zero cand distanta atinge cativa Angstromi

Modul in care contrastul unei imagini este realizat , poate fi obţinut in mai multe modalitati. In

microscopia cu forte atomice avem trei tipuri de interactie intre vârful cantilverului si proba :

1) modul contact continuu

2) modul contact intermitent

3) modul non-contact

Va fi prezentata mai jos o scurta descriere si comparative a acestor modalitati de scanare :

Modul de operare Forta interactiei

Modul contact Puternica (de respingere) – inaltime constanta sau forta constanta, Intre

suprafata si proba exista forte de cativa angstromi (10-7 to 10-11 N)

Modul non-contact Slaba (de atracţie)

Modul contact intermitent Puternica (de respingere)

Modul forţelor laterale Forţele de frecare exercita un cuplu asupra cantileverului

Modul forţelor magnetice Slaba - Este vizualizat câmpul magnetic de la suprafaţa

Modul termic Slaba – Este vizualizata harta termica a suprafeţei probei

Modul forţelor magnetice Slaba - Este vizualizat câmpul magnetic de la suprafaţa

Modul termic Slaba – Este vizualizata harta termica a suprafeţei probei

Modul contact :

Fig. 17 Evolutia fortelor van der Waals cu distanta dintre varf si suprafata probei.

Este cel mai comun mod de operare al microscopului cu forte atomice . Precum este sugerat si de numele

acestui mod , vârful si proba raman in contact strâns din momentul începerii scanării pana la sfarsitul

acesteia. Prin “contact” se intelege un regim de “respingere” al curbei aferente forţei inter-moleculare,

precum este prezentat in figura 18.

Regiunea de respingere din cadrul curbei este situate deasupra axei x. Unul din dezavatajele

rămânerii in contact cu proba este faptul ca exista un număr mare de forte laterale care isi exercita cuplul

asupra cantilverului in timp ce acesta este deplasat pe suprafaţa probei. Iată câteva caracteristici importante

ale modului contact :

Face posibila vizualizarea informaţiei 3d despre suprafaţa unei probe in mod nedistructiv

– 1.5 nm rezoluţie laterala

– 0.05 nm rezoluţie verticala

Forte puternice de respingere actioneaza intre vârf si proba

Necesita un procedeu de pregătire a probei foarte simplu

In cadrul acestui mod se pot analiza dielectrici si conductoare cu usurinta

– Microscopul cu forte atomice nu se bazează pe conductivitate .

– Nu necesita procedee precum pătarea sau umbrirea , necesare pentru studiul acestui tip de

materiale in cadrul unor altor tipuri de investigaţii asupra lor.

Operează atât in mediu gazos , cat si in mediu fluid .

– Fluid = mediu controlat de natura lichida si specimene hidratate

Pune la dispozitie informaţiei despre proprietatile fizice

– Elasticitate , Adeziune , Duritate , Frecare etc.

Modul contact intermitent :

Este cel mai folosit mod după modul contact. Când operează in aer sau in alte medii gazoase , cantileverul

oscileaza la frecventa sa de rezonanta (mărime de ordinul sutelor de de KHz) si este poziţionat deasupra

suprafeţei astfel încât va intra in contact cu aceasta doar o mica fracţie de timp din perioada sa de oscilaţie .

Acesta este tot un mod contact , precum si cel descrise mai devreme , dar perioada scurta de timp in care

contactul propriuzis are loc înseamnă ca forţele laterale sunt reduse considerabil pe parcursul deplasării

vârfului pe suprafaţa probei. Când se investighează probe care nu pot fi fixate cu stricteţe (slab imobilizate)

sau probe de o consistenta nu foarte dura , modul contact intermitent poate fi o alegere mult mai buna decât

modul contact pentru a vizualiza harta topografica a probei. Deasemnea in modul contactului intermitent sunt

posibile si metode (mai interesante) de obţinere a contrastului . In modul forţei constante , reacţia este

ajustata astfel încât oscilaţia cantilverului sa ramana constanta . O imagine poate fi formata din acest semnal

de amplitudine , dat fiind faptul ca vor exista mici variaţii in amplitudinea oscilatiilor datorita circuitelor

electronice care nu reactioneaza instantaneu fata de schimbările apărute la suprafaţa probei . Recent , o

atenţie deosebita a fost acordata imagisticii fazei . Acest procedeu functioneaza măsurând diferenţa de faza

dintre oscilaţiile dispozitivului piezo care controlează cantilverulul si oscilaţiile detectate . Se considera ca

acest constrast al imaginii obţinut este derivat din proprietati precum rigiditatea sau vâscoelasticitatea . Iată

câteva caracteristici importante ale modului contact intermitent :

– Decalajul fazelor poate măsura proprietatile ce ţin de compoziţie, adeziune, fricţiune, elasticitate

– Se pot identifica structurile amestecurilor de polimeri

– Este mai puţin dăunătore probelor de consistenta nu foarte dura decât modul contact

Modul non-contact :

Acest mod este o alta metoda care poate fi aleasa in investigaţia unei probe cu ajutorul microscopului cu

forte atomice.

Cantileverul trebuie baleiat deasupra suprafeţei probei , la o distanta la care nu mai suntem in regim

de respingere. Acest mod este un mod in care se operează destul de dificil in condiţiile ambiente. In modul

ambient , pe suprafaţa probelor se formează un strat mic de apa care va încerca in permanenta sa formeze o

punte capilara intre vârf si proba cauzând ca vraful sa fie in permanenta “tentat” de a sari in modul contact.

Fig. 18 AFM in modul de lucru contact

Chiar si in lichide sau in vid , faptul ca vârful este posibil sa sară din când in când in contact cu proba este

destul de probabil , iar imaginea obţinuta sa nu fie la urma urmei decât o imagine obţinuta intr-o forma

derivata a contactului intermitent. Reuşita acestui mod tine foarte mult de consistenta probei , si mediul in

care se desfasoara investigaţia .

Avantaje prezentate de microscopia cu forte atomice

Fata de alte sisteme de microscopie, microscopul cu forte atomice mai prezintă următoarele avantaje

esenţiale :

– Microscopul cu forte atomice face posibila vizualizarea imaginilor cu un contrast topografic

extraordinar , pot fi făcute măsurători precise de nivel pe suprafaţa probelor investigate (nu este

necesara tratarea probelor).

– Imaginile tridimensionale sunt obţinute fara o preparare costisitoare a probelor cu urmează a fi

studiate si oferă informaţii mult mai complete , decât pofilele bidiminesionale obţinute din probele

tăiate transversal .

– Microscopul cu forte atomice permite măsurarea precisa a pragurilor de inaltime de pe suprafaţa unei

probe, măsurare absolute independenta de reflectivitatea materialelor studiate

Investigatii pe structuri spinel.

1. Masuratori ale Modulului lui Young efectuate asupra Feritelor Nanocristaline cu structuri spinel

prin Microscopie cu forte Atomice

Fig. 19 AFM in modul de lucru non-contact

Utilizand Microscopia cu Forte Atomice Acustice (AFAM), modulul lui Young in cazul a doua flme subtiri

cu ferite nanocristaline cu strucutra de spinel , a fost masurat ca functie de temperatura de oxidare la scala

nano. Este prezenta o scadere generala a modului lui Young ca functie de temperatura de oxidare cu puncte

de minim si maxim intermediare. Aceste masuratori evidentiaza existenta gradientilor chimici de la stratul de

suprafata catre interiorul filmelor subtiri ce apar in timpul procesului de oxidare in faza y. Acestia conduc la

gradienti de stres care influenteaza modului lui Young si coercivitatea Hc. In aceasta tehnica de masurare ,

sunt masurate frecventele de rezonanta ale unui cantilever apartinand unui microscop cu forte atomice si

exploateaza dependenta acestora fata de fortele de contact varf-suprafata, in cazul de fata o constanta elastica

descrisa de teoria Hertizana a fenomenelor de contact. Dupa comparatii facute intre aceste metode de

masuratoare si metodele bazate pe nanoindentare a reiesit ca aceasta metoda pune la dispozitii rezultate

foarte precise , achizitionate printr-o metoda nedistructiva. In investigatiile AFAM (Atomic Force Acoustic

Microscopy) asupra filmelor subtiri cu strucutra spinel , este posibila aparitia efectelor neliniare , acest fapt

poate conduce chiar la capacitatea de a studia si masura o serie de parametrii neliniari la o scala nano

2. Studiul disolocarilor la suprafata materialelor cu strucutura spinel

Prin intemediul AFM pot fi studiate structurile sabloanelor de evaporare create de dislocarile stationare si

aflate in miscare care se termina pe suprafata (0 0 1) materialelor cu structuri similare cu MgAl 2O4 . Cand

vectorii Burger ai dislocarilor sunt inclinati in raport cu planul cristalin (0 0 1), aceste dislocari creaza

sabloane de evaporare de forma unor spirale duble. Spiralele duble de evaporare iau nastere printr-un proces

sinergistic de rotatie al unor perechi de denivelari de inaltime de 2-Å , ce isi au originea in punctele terminale

de dizlocare. Dizlocarile, ai caror vectori Burger sunt dispusi in planul cristalografic (0 0 1), nu formeaza

spirale cand se termina pe suprafata (0 0 1), dar pot crea zone logitudinale denivelate. Prezenta acestor zone

logitudinale denivelate legate de prezenta dizlocarilor de la suprafata , vor forma noi denivelari cu asepct de

« V ». Studiul acestor fenomene de suprafata ce apar in cazul filmelor subtiri spinel pot fi investigate cu

ajutorul AFM , intr-o maniera nedistructiva.

B2.3.2. Microscopie confocala cu baleiaj laser

Microscopia confocală oferă un număr de avantaje faţă de microscopia convenţională de câmp optic larg,

incluzând abilitatea de control asupra adâncimii câmpului, eliminare sau reducere a informaţiei de fundal din

planul focal (informaţie ce duce la degradarea imaginii), şi capacitatea de colectare de secţiuni optice seriale

din grosimea probelor. Cheia de bază a principiului confocal este folosirea tehnicilor de filtrare spaţială în

eliminarea luminii sau strălucirii ce nu aparţine zonei de focalizare a probelor, ce depăşesc în grosime planul

focal iminent. În ultimii ani a avut loc o extraordinară creştere în popularitate a microscopiei confocale,

datorată în parte uşurinţei cu care imagini de o extrem de înaltă calitate pot fi obţinute de la probe preparate

pentru microscopia clasica, precum şi a numărului în creştere de aplicaţii. În fapt, tehnologia confocală se

dovedeşte a fi unul dintre cele mai importante progrese atinse vreodată în microscopia optică.

Microscoapele confocale moderne, pot fi considerate drept sisteme electronice complet integrate în

care microscopul optic joacă un rol central într-o configuraţie care conţine unul sau mai mulţi detectori

electronici, un calculator (pentru afişarea observaţiilor, procesare, stocare şi ieşiri) şi câteva sisteme laser

combinate cu dispozitive de selecţie a lungimii de undă şi un ansamblu de baleiaj laser. În majoritatea

cazurilor integrarea între diverse componente este atât de minuţioasă încât adesea este referit în mod colectiv

drept sistem de imagistică video sau digitală capabil să producă imagini electronice.

Lumina coerentă emisă de sistemul laser (sursa de excitare) trece printr-o apertură pinhole care este

situată în planul conjugat (confocal) cu punctul de scanare de pe probă şi o a doua apertură pinhole

poziţionată în faţa detectorului (un tub fotomultiplicator). În timp ce laser-ul reflectat de o oglindă

dicromatică scanează proba într-un plan focal stabilit, puncte de pe probă emit fluorescenţă secundară (în

acelaşi plan focal) care trece înapoi prin oglinda dicromatică şi sunt focalizate ca punct confocal la apertura

detectorului pinhole (adesea lumina reflectata de proba nu are aceeasi lungime de unda cu radiatia incidenta ;

daca este aceeasi lungime de unda vorbim despre reflexie, în caz contrar, mai general este fluorescenta).

Cantitatea semnificativă de emisie fluorescentă care apare în puncte de sub şi de deasupra planului focal nu

este confocală cu pinhole (numite raze de lumină în afara focalizării figura 20) şi formează discuri Airy

Fig. 20  Principiul microscopiei confocale

extinse în planul aperturii. Pentru că doar o mică cantitate de emisie fluorescentă din afara focalizării este

livrată prin apertura pinhole, o mare parte din această lumină ce nu aparţine obiectului nu este detectată de

fotomultiplicator şi nu contribuie la imaginea finală. Oglinda dicromatică, filtrul barieră şi filtrul de excitare

asigură funcţii similare cu componentele identice din epi-fluorescenţa de câmp larg. Refocalizarea

obiectivului într-un microscop confocal deplasează punctele de excitare şi de emisie pe probă într-un nou

plan care devine confocal cu apertura pinhole a sursei de lumină şi a detectorului.

În microscopia tradiţională epi-fluorescenţă de câmp larg, întreaga probă este supusă unei iluminări

intense de la o sursă necoerentă, lampă de descărcare în arc cu Xenon sau Mercur, iar imaginea rezultată, de

emisie fluorescentă secundară poate fi observată direct în ocular sau proiectată pe o suprafaţă de placă

fotografică tradiţională sau matrice de detectori electronici. Spre deosebire de acest concept simplist,

mecanismul formării imaginii în microscopia confocală este fundamental diferit. Aşa cum s-a discutat mai

sus, microscopul cu fluorescenţă confocală constă în multiple surse de excitare laser, detectori electronici

(uzual fotomultiplicatori), şi achiziţie computerizată, procesare, analiză, expunere de imagini.

Capul de scanare este în centrul sistemului confocal şi este responsabil de rasterizarea excitaţiei

pentru baleiaj, precum şi de colectarea semnalului fotonic de la probă – necesar la obţinerea imaginii

finale.Un cap de scanare tipic conţine intrări de la sursele laser externe, seturi de filtre de fluorescenţă şi

oglinzi dicromatice, un sistem de oglinzi de scanare în rastru acţionate galvanometric, aperturi pinhole

variabile - în scopul generării imaginii confocale, detectori tub fotomultiplicator acordabili pentru diverse

lungimi de undă de fluorescenţă.

În scanarea confocală epi-iluminare, sursa de lumină laser şi detectorii fotomultiplicatori sunt ambele

separate de proba de către obiectiv, care funcţionează şi ca un condensor bine reglat. Componentele filtrante

de fluorescenţă internă (precum filtrele de excitare sau barieră internă sau oglinzile dicromatice) şi filtrele de

densitate neutră sunt conţinute în unitatea de scanare. Filtrele de interferenţă şi densitate neutră sunt găzduite

în turete rotative sau alunecătoare ce pot fi introduse în calea luminii de către operator. Raza de excitare laser

este conectată la unitatea de scanare cu un cuplor de fibră optică urmat de un expandor care permite

fascicolului laser subţire să umple complet apertura din spatele obiectivului (o cerinţă critică în microscopia

confocală). Lumina laser expandată ce trece prin obiectivul microscopului formează un spot intens limitat

difractiv ce scanează în rastru prin intermediul oglinzilor cuplate, acţionate galvanometric, planul probei

(scanare punctuală).

Una dintre cele mai importante componente ale capului de scanare este apertura pinhole, care se

comportă ca un filtru spaţial la planul imaginii conjugate poziţionat direct în faţa

fotomultiplicatorului.Câteva aperturi de diametre variabile sunt de obicei incluse într-o turetă rotativă ce

îngăduie operatorului să ajusteze valoarea pinhole (şi grosimea secţiunii optice).

Atunci când subliniem diferenţele şi similitudinile între microscoapele confocale şi de câmp larg,

este adesea folositor să comparăm calitatea şi geometria iluminării probei folosită de fiecare tehni-că.

Obiectivele microscoapelor tradiţionale epifluorescente de câmp larg focalizează un con larg de iluminare pe

un volum mare al probei, care este iluminat uniform şi simultan. O majoritate a emisiei fluorescente este

direcţionată înapoi spre microscop, e adunată de obiectiv (depinzând de apertura numerică) şi e proiectată în

ocular sau detector. Rezultatul este o cantitate semnificativă de semnal datorat luminii emise de fundal şi

autofluorescenţei provenită din arii de sub şi de deasupra planului focal, care reduce semnificativ rezoluţia şi

contrastul imaginii.

Sursa de iluminare laser în microscopia confocală este la început expandată pentru a umple apertura

din spatele microscopului, şi apoi focalizată prin sistemul de lentile într-un spot foarte mic în planul focal.

Mărimea punctului de iluminare variază între 0.25 si 0.8 μm în diametru, depin-zând de apertura numerică a

obiectivului şi 0.5-1.5 μm adâncime la cea mai puternică intensitate. Mărimea spotului confocal este

determinată de design-ul microscopului, lungimea de undă a radiaţiei laser incidente, caracteristicile

obiectivului, setările unităţii de scanare şi probă. Întreaga adâncime a probei este iluminată pe o arie largă, la

microscopul de câmp larg, în timp ce eşantionul este scanat cu un spot fin de iluminare centrată în planul

focal al microscopului confocal.

În microscopia cu baleiaj laser, imaginea unei probe extinse este generată prin baleiajul fascicolului

laser pe o arie fixă în rastru controlată de două oglinzi oscilante de mare viteză acţionate de motoa-re

galvanometrice. Una dintre oglinzi mută fascicolul de la stânga la dreapta pe axa laterală X, în timp ce,

cealaltă translatează raza pe direcţia Y. După fiecare scanare de-a lungul direcţiei X, raza este rapid

transportată înapoi la punctul de plecare şi incrementată poziţia pe Y pentru începerea unei noi scanări într-

un proces numit en. Flyback.În timpul acestei operaţii (flyback), informaţie-imagine nu este achiziţionată. În

această maniară, aria de interes de pe probă într-un singur plan focal este excitată de ilumi-narea laser de la

unitatea de scanare.

În vreme ce fiecare linie de scanare parcurge proba în planul focal lateral, emisia fluorescentă este

colectată de obiectiv şi trece înapoi prin sistemul optic confocal. Viteza oglinzilor de scanare este foarte mică

comparativ cu viteza luminii, astfel încât emisia secundară urmează un drum optic pe axa optică care este

identic cu raza de excitare originală.

Întoarcerea emisiei fluorescente prin sistemul de oglinzi galvanometrice este referită ca descanare.

După ce trece de oglinzile de scanare emisia fluorescentă trece direct prin oglinda dicromatică şi e focalizată

pe apertura pinhole a detectorului. Spre deosebire de tiparul de scanare rastru al luminii de excitare ce

parcurge proba, emisia fluorescentă rămâne într-o poziţie stabilă la apertura pinhole, dar fluctuaţiile datorate

intensităţii spotului de iluminare ce parcurge proba produc variaţii în excitare.

La microscoapele confocale moderne, două tehnici fundamentale, diferite, au fost dezvoltate.

Baleiajul cu un singur fascicol, una dintre cele mai populare metode-implementată în majoritatea

microscoapelor cu baleiaj laser comerciale, foloseşte o pereche de oglinzi galvanometrice controlate de

computer pentru scanarea în rastru a probei la o rată de aproximativ un cadru pe secundă. Rate mai ridicate

de scanare (aproape de viteza video) pot fi atinse folosind dispozitive acusto-optice sau oglinzi oscilante. În

contrast, microscoapele multifascicol cu baleiaj laser sunt echipate cu un disc Nipkow conţinând o matrice

de microlentile şi pinholes. Aceste instrumente folosesc adesea lămpi cu descărcare în arc pentru iluminare-

în locul laserilor- pentru a reduce deteriorarea probei şi a îmbunătăţi detecţia nivelelor joase de fluorescenţă

în timpul achiziţiei în timp real de imagini. Altă caracteristică importantă a microscoapelor multifascicol este

abilitatea de capturare de imagini cu o matrice detector precum C.C.D. camera (charge-coupled device)

La majoritatea pachetelor soft de microscopie confocală, secţionarea optică nu este restricţionată la

planul perpendicular lateral (X-Y), dar poate fi colectată şi afişată în planuri transversale. Secţiuni verticale

în planurile X-Z şi Y-Z (paralele la axele optice ale microscopului) pot fi generate de majoritatea softurilor

confocale cu mare uşurinţă. De aceea, proba apare ca şi cum ar fi fost secţionată cu un plan perpendicular pe

axele laterale. În practică, secţiunile verticale sunt obţinute prin combinarea scanării X-Y luată cu ajutorul

soft-ului în lungul axei z, iar apoi proiectând o imagine a intensităţii luminoase aşa cum ar fi apărut dacă

hard-ul microscopului ar fi putut efectua secţionarea verticală fizică.

Avantajele adiţionale ale microscopiei confocale includ posibilitatea ajustării electronice a măririi

(zoom) prin varierea ariei scanate de laser fără necesitatea de a schimba obiectivul. Această facilitate este

cunoscută ca factor de zoom şi este uzual angajată în ajustarea rezoluţiei imaginii spaţiale prin modificarea

perioadei de eşantionare a baleiajului laser. Sporirea factorului de zoom reduce aria baleiată a probei

simultan cu rata de baleiaj. Rezultatul este un număr mai mare de eşantioane pe o lungime comparabilă, care

sporeşte atât rezoluţia spaţială a imaginii cât şi mărirea imaginii afişate pe monitorul computerului gazdă.

Zoom-ul confocal este tipic angajat să potrivească rezoluţia digitală a imaginii cu rezoluţia optică a

microscopului atunci când la achiziţia de date sunt folosite obiective de mărire şi apertură mică.

Discretizarea datelor secvenţiale analogice colectate de fotomultiplicatorul microscopului confocal (sau un

detector similar) facilitează algoritmii de procesare computerizată a imaginii prin transformarea fluxului

continuu de tensiune în incrementări discrete digitale care corespund variaţiilor în intensitatea luminii. În

plus faţă de beneficiile şi viteza sporite de procesare digitală a datelor, imaginile pot fi imediat preparate

pentru imprimare sau publicare. În experimente controlate cu atenţie, măsurări cantitative ale intensităţii

fluorescenţei spaţiale (fie statice sau ca o funcţie de timp) pot fi de asemenea obţinute din date digitale.

Un rol important este jucat de filtrele folosite; spre deosebire de filtrele dicroice clasice microscopul

Leica utilizează un sistem de filtre acordabile, câte unul pentru fiecare fotomultiplicator, ceea ce asigura

achiziţia imaginilor pe 4 canale independente. Aceste filtre au la baza o prismă care descompune raza (după

trecerea sa prin pinhole) în componentele sale spectrale (în domeniul 400-750nm); în continuare aceasta este

dirijată spre fiecare fotomultiplicator. Aceştia dispun de câte o apertura reglabilă care permite selecţia

spectrului dorit cu o rezoluţie de 4nm şi selectarea oricărei porţiuni a spectrului. Practic se obţine un sistem

de filtre reglabil ca lărgime care poate fi centrat pe orice lungime de undă din spectrul vizibil şi care poate fi

ajustat în timp real.

Investigaţii pe filme subtiri de spinel

Microscopia confocală bazată pe baleiajul de fascicul laser este o metodă care permite observaţia

tridimensională precisă prin intermediul secţiunilor optice. Aceasta metodă este foarte des folosită în modul

fluorescenţă la observaţii de natura biologică, dar nu este mai puţin adevărat că este folosită în modul

reflexie pentru investigaţii asupra unei game largi de materiale, inclusiv minerale. Pentru exemplificare,

Sridhar şi colectivul au folosit microscopia confocală cu baleiaj laser pentru observarea directă a disoluţiei

particulelor mici de MgO în calciu aluminat. Studiul disoluţiei în condiţii dinamice este destul de complicat

pentru că există trei direcţii cu flux de materie. În aceste condiţii, observaţia prin secţiuni optice poate izola

unul din cele trei tipuri de fluxuri.

Microscopia confocală cu baleiaj laser (CLSM) în modul reflexie este o metodă adecvată pentru

caracterizarea din punct de vedere topografic (morfologic) a diverselor suprafeţe destinate diferitelor

aplicaţii. Spre deosebire de AFM, CLSM are avantajul de a culege date de pe o suprafaţă largă de analiză,

date ce pot proveni din volumul probei. În plus CLSM poate urmări variaţii mari ale profilului de adâncime,

variaţii care depăşesc limitele AFM. CLSM este o alternativă reală la investigaţiile de tip SEM ori AFM.

Faţă de AFM, CLSM are avantajul baleiajului din câmp îndepărtat, lucru care permite investigarea unor

categorii dificile de probe.

Microscopia confocală cu baleiaj laser (CLSM) permite investigarea incluziunilor fără alterarea

probei. CLSM poate contribui la dezvoltarea cunoştinţelor despre concentraţia şi aglomerarea de incluziuni.

De asemenea, CLSM poate oferi informaţii despre grosimea stratului subţire, în măsura în care acesta este

transparent pentru fasciculul laser.

B2.4 Infrastructura CMMPI

1. Difractometru de raze X

Difractometrul cu care este echipat Centrul de Microscopie – Microanaliză şi Procesarea Informaţiei este un

difractormetru de înaltă rezoluţie HRD3000 produs de ItalStructures având ca pricipale caracteristici:

Stabilitate ridicată a generatorului de raze X dotat cu un microprocesor controlat de PC.

Dispozitiv de optică paralelă

Goniometru de mare precizie cu poziţionare cu motoare secvenţiale

Un al doilea monocromator pentru radiaţia de Cu

5 grade de libertate, toate motorizate

Cu ajutorul lui se pot efectua măsurători tipice cristalografice de determinare difractogramelor, spaţierii între

planele cristalografice sau calculul constantelor de reţea atât pnetru pulberi cât şi pnetru filme subţiri,

aparatul având în dotare un dispozitiv special pentru investigarea filmelor subţiri. Deasemenea softul de care

dispune difractometrul poate calcula dimensiunea cristalitelor din probele investigate.

2. Microscopul cu forte atomice Quesant 350

Moduri de lucru :

- contact, intermitent.

3. Microscopul confocal cu baleiaj laser

Microscopul Leica TCS SP2 este un microscop confocal cu posibilităţi de spectrometrie, având prevăzută şi

o extensie pentru conectarea unui laser exterior, putându-se profita astfel de avantajele microscopiei

confocale, multifoton şi în fluorescenţă prezentate mai sus cu ajutorul software- lui disponibil.

Microscopul Leica TCS SP2 este construit pornind de la un microscop optic dotat cu o serie de

accesorii :

- pinhole cu deschidere variabila (până la 600 mm).

- 5 fotomultplicatoare cu sensibilitate în domeniul spectral 400nm-800nm.

- filtre de selecţie a lungimii de unda cu o rezoluţie de 4nm.

- sistem de scanare cu o viteza de 3fps la o rezoluţie de 512x512 pixeli, capabil de o rezoluţie

maxima de 1024x1024 pixeli şi posibilitatea de a realiza zoom optic de 32x.

- 3 laseri (Argon – 478 şi 488 nm, Krypton – 568 nm, HeNe – 633nm).

- port exterior de intrare pentru un laser suplimentar.

Fig. 21 Imagine CLSM a unei suprafete de LiNbO3 implantată cu ioni de Cu la 60 keV, 10uA/cm2 şi o

fluenţă de 21017ioni/cm2..

Drumul optic prin capul de scanare al microscopului: lumina este cuplată în sistem prin intermediul unei

fibre optice, trece prin pinhole şi este apoi trimisă de o oglindă dicroică pe sistemul de scanare. După ce

aceasta ajunge pe probă exista mai multe modalităţi de preluare a luminii rezultate:

- lumina transmisă este preluata de fotomultiplicatorul aflat dedesubtul probei

- lumina reflectata va fi descanată de sistemul de baleiaj, va trece prin pinhole-ul de achiziţie şi

va ajunge, prin intermediul unui sistem de filtre, pe unul din cei 4 fotomultiplicatori

- lumina rezultată din excitarea mostrei de către raza laser (fluorescenta) urmează acelaşi drum ca

lumina reflectata

Un rol important este jucat de filtrele folosite; spre deosebire de filtrele dicroice clasice microscopul Leica

utilizează un sistem de filtre acordabile, câte unul pentru fiecare fotomultiplicator, ceea ce asigura achiziţia

imaginilor pe 4 canale independente. Aceste filtre au la baza o prismă care descompune raza (după trecerea

sa prin pinhole) în componentele sale spectrale (în domeniul 400-750nm); în continuare aceasta este dirijată

spre fiecare fotomultiplicator. Aceştia dispun de câte o apertura reglabilă care permite selecţia spectrului

dorit cu o rezoluţie de 4nm şi selectarea oricărei porţiuni a spectrului. Practic se obţine un sistem de filtre

reglabil ca lărgime care poate fi centrat pe orice lungime de undă din spectrul vizibil şi care poate fi ajustat în

timp real.

Sistemul astfel rezultat îmbină în mod optim detecţia spectrometrică cu microscopia confocală având

o flexibilitate şi eficienţa sporite faţă de sistemele clasice.

O facilitate suplimentara a microscopului o reprezintă posibilitatea cuplării unui laser exterior.

Acesta este utilizat în cadrul centrului pentru microscopie multifoton şi generare de armonici folosind un

laser în impulsuri Spectra-Tsunami Ti:Safir cu o putere maxima de 5W , o frecvenţă a impulsurilor de

80MHz tunabil în domeniul spectral 700-1050nm.

Un rol esenţial în utilizarea optimă a microscopului Leica este deţinut de software; acesta realizează

controlul tuturor parametrilor hardware ai sistemului (deschiderea pinhole-ului, reglarea sistemului de filtre

pe lungimile de undă dorite, viteza de scanare, zoom, amplificarea fotomultiplicatorilor, reglajul puterii

laserilor, etc.) oferind posibilitatea realizării unor măsurători şi prelucrări complexe a datelor obţinute:

– reconstituiri 3D ale suprafeţelor

– obţinerea de secţiuni optice pe orice direcţie şi în interiorul mostrei

– măsurători spectrometrice în domeniul vizibil cu o rezoluţie de 4nm

– prelucrări statistice ale datelor obţinute bazate pe morfologia mostrei şi parametrii optici măsuraţi

– urmărirea şi înregistrarea parametrilor de interes şi a evoluţiei mostrei în timp real