50
| Date post: | 08-Feb-2016 |
| Category: |
Documents |
| Upload: | cristina-ionescu |
| View: | 309 times |
| Download: | 10 times |
Antibiograma: testarea sensibilităţii in vitro a microorganismelor faţă de antibiotice .
Termenii de antibiotic si chimioterapic se folosesc ca sinonimi.
Introducerea unui antibiotic in terapie este o mare responsabilitate medicala, cerind respectarea unor conditii.
o Antibiograma se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen.
o In cazuri de extrema urgenta, se poate administra un antibiotic (inainte de efectuarea antibiogramei) dar numai dupa recoltarea produselor patologice.
o Tratamentul se realizeaza in functie de rezultatele date de antibiograma, alegand antibioticul cel mai eficace, adica fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.
o Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul cu antibiotice este de durata mai lunga; aceasta deoarece agentul patogen poate sa cistige rezistenta fata de antibioticul utilizat.
o Apoi in cursul tratamentului datorita dezechilibrului din populatiile microbiocenozelor, poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o bacterie din aceste microbiocenoze.
metode calitative
metoda difuzimetrica Kirby Bauer - clasicametoda cu antibiotic incorporat in mediu
semisolid - moderna
metode cantitativemetoda dilutiilor in mediu lichid - clasicametoda E test – moderna
se bazeaza pe efectul bactericid sau bacteriostatic al antibioticelor fata de microorganism.
în cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a
căror susceptibilitate nu este predictibilă (condiţie:existenţa standardizării privind specia,
antibioticul de testat)
se decide de către microbiolog în funcţie de:
- felul produsului din care s-a izolat germenul,
- specia bacterianăCând relevanţa unui izolat este incertă,
medicul microbiolog se consultă cu medicul
curant si se ia o decizie în comun pe baza datelor clinice.
Se testează sensibilitatea unei tulpini bacteriene izolate în cultură pură si identificate.
Este metoda utilizată de rutină pentru testarea susceptibilităţii izolatelor clinice.
Fiind o metodă calitativă, nu permite cuantificarea nivelului de rezistenţă, rezultatele fiind exprimate in:sensibil,intermediar si rezistent.
Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi Petri, pe care s-a insamintat in panza cultura bacteriana; apoi pe suprafata mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a antibioticului ( in imediata vecinatate a discului realizindu-se o concentratie mai mare de antibiotic care descreste pe masura indepartarii de acesta ).
Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu stabileste concentratia minima infibitorie (CMI), da informatii pretioase asupra sensibilitatii speciei testate fata de antibioticele utilizate si este folosita mai frecvent in laboratorele clinice.
În efectuarea si interpretarea antibiogramelor calitative se urmăresc standarde internaţionale.
În prezent standardul acceptat în cele mai multe ţări (inclusiv România) este cel american, elaborat de CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) dar unele laboratoare folosesc standardul european Eucast.
Mediul de testare universal recomandat este Muller-Hinton agar.
Acest mediu nesuplimentat a fost ales pentru mai multe motive:
a demonstrat o bună reproductibilitate de la un lot la altul
conţine puţini inhibitori de sulfonamide şi trimetoprim
este un bun mediu de cultură pentru majoritatea germenilor nepretenţioşi, patogeni
este folosit cu succes de mulţi ani, demonstându-şi calităţile.
Formula mediului este: Extract de carne……………………..300,0g Hidrolizat de cazeină…………………17,5g Amidon…………………………………1,5g AD……………………………………..1000ml
Germenii pretenţioşi, cum sunt Haemophilus, Neisseria şi Streptococcus nu pot creşte satisfăcător pe acest mediu nesuplimentat, dar ei pot fi testaţi prin metoda difuzimetrică, prin suplimentarea mediului de bază Muller-Hinton cu factori de creştere specifici (adăugarea de sânge defibrinat sau chocolatizat, adăugarea de factori X şi V), incubarea în atmosferă de CO2 şi prelungirea perioadei de incubaţie.
Pt. Mycobacterium tuberculosis se foloseste mediul Lowenstein Jensen
Grosimea mediului, de 4 mm, este importantă, deoarece AB difuzează în mediu atât în suprafaţă cât şi în profunzime, deci, o grosime mai mare duce la false rezistenţe (zone de inhibiţie eronat mai mici), în timp ce o grosime mai mică de 4 mm duce la creşteri false ale zonelor de inhibiţie, deci false sensibilităţi.
Fiecare lot de mediu nou preparat trebuie testat pentru asigurarea unui pH mediu de
7,2-7,4 la temperatura camerei; valori scăzute ale pH-ului pot altera rezultatele pentru aminoglicozide şi macrolide (false rezistenţe), sau ale penicilinelor (false sensibilităţi).
Plăcile cu mediu pot fi stocate la frigider mai multe zile, în pungi de plastic pentru a evita deshidratarea, iar înainte de utilizare vor fi introduse în incubator (10-30 min) pentru echilibrare termică şi îndepărtarea condensului format.
se suspensionează 2-3 colonii izolate în ser fiziologic
turbiditatea suspensiei se controlează nefelometric sau comparând cu tuburi etalon (conţin suspensii de particule latex/sulfat de Ba având turbiditate determinată);
se ajustează la 0.5 McFarland (1,5x108 ufc/ml).
Inocularea gelozei Muller-Hinton cu această suspensie se va realiza în răstimpul a 15 min. de la preparare, pentru a preveni modificarea turbidităţii prin începerea creşterii bacteriene.
se alege un mediu corespunzător speciei bacteriene testate
· Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor· Mueller-Hinton cu sânge pentru pretenţiosi (de
ex. streptococi)· medii speciale (pentru Haemophilus spp .
neisserii)se introduce un tampon în suspensia bacteriană,
se stoarce pentru îndepărtarea excesului de lichid
se sterge uniform toată suprafaţa mediului de 3x
Scopul final al inoculării mediului este realizarea unei creşteri bacteriene uniforme, sub formă de colonii confluente (sau semiconfluente după standardul francez, ce utilizează un inocul mai slab).
se aleg antibioticele care trebuie testate in funcţie de specia bacteriană testată si în funcţie delocalizarea infecţiei –
se depun discurile de antibiotic la l .5 cm distanţă de marginea cutiei Petri si la 2.5-3 cm distanţă unul faţă de celălalt .
15 min. temperatura camerei
Unele antibiotice încep să difuzeze în mediu imediat după aplicare, astfel că odată aplicate pe mediu ele nu mai pot fi mutate.
Aplicarea discurilor se poate face fie individual, cu pense sterile, fie cu dispensere speciale care permit aplicarea concomitentă a 8-16 discuri, în funcţie de mărimea placii Petri utilizate (pe o placă Petri rotundă de 90 mm încap 6 discuri, pe una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm, 12 discuri, iar pe plăcile pătrate de 120/120 mm, 16 discuri).
în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera obisnuită sau in atmosferă de CO2 (de ex.
streptococi, neisserii.)35°C-37°C16-18 ore (în cazul germenilor
pretenţiosi până la 20-24 de ore)24 de ore în cazul testării vancomicinei
apare o cultură bacteriană confluentă, în jurul microcomprimatelor apar zone de inhibiţie (lipsa creșterii bacteriene)
se citesc diametrele zonelor de inhibiţie se compară diametrele citite cu
diametre standard in funcţie de antibiotic, cantitatea de antibiotic din comprimat, specia bacteriană testată
Diametrul zonei de inhibiţie completă este măsurat, incluzând şi diametrul discului, cu ajutorul unei rigle gradate, sau şubler.
Aspectul zonei de inhibitie trebuie sa fie clar si cu contur net.
In situatia in care se observa chiar si o singura colonie in interiorul zonei de inhibitie, se va considera rezistenta la acel antibiotic, indiferent de diametrul zonei de inhibitie .
rezultatul se raportează: sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau rezistent (R) la antibioticul testatfiecare rezultat de antibiogramă se
interpretează!nu se comunică diametrele citite (metodă
calitativă)
compoziţia mediului (conţinut de cationi, timidină)
pH (optim: 7,2-7,4) grosimea gelozei (standard: 4 mm) inoculul - 0,5 McFarlandmicrocomprimate (valabilitate, conţinut,
condiţii de păstrare)timpul, temperatura de incubare citirea diametrelor (lumină
refractată/reflectată, colonii izolate, prezenţa unui văl, margini
crenelate) loturile noi de medii de cultură se testează cu
tulpini de referinţă.
PrincipiuGaleria ATB permite determinarea
sensibilităţii microbiene la un set de agenti antibacterieni / antifungici , incorporate într-un mediu semisolid. Este alcătuită din 16 perechi de godeuri, din care 2/4 nu conţin antibiotice/antifungice şi sunt martori de creştere.
Celelalte perechi de godeuri conţin diferite antibiotice în cite două concentraţii (c = concentratie mai mica şi C = concentratie mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpină testată ca fiind sensibilă, intermediară sau rezistentă.
Din tulpina de testat este preparată o suspensie care este transferată în mediul de cultură cu care este inoculată galeria ATB.
- Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa 24-48 ore de incubare la 37C.
Citire si interpretare Dacă nu există creştere la nici o
concentraţie înseamnă tulpină sensibilă, daca exista creştere numai în godeul cu concentraţia mai mică c înseamnă sensibilitate intermediară, daca exista creştere în ambele godeuri (c şi C) semnifică rezistenţă la respectivul agent antimicrobian.
Urmareste derminarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data, indicand cc. de antibiotic necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale.
Tehnica-la dilutii crescande de AB facute direct in mediu de cultura lichid, se insamanteaza cantitati egale de cultura bacteriana , stabilindu-se dilutia maxima de antibiotic in prezenta careia tulpina este inhibata.
-pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire- mediul de cultura utilizat este bulionul
glucozat 2%
Se utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1 ml in fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al doi-lea tub si asa mai departe pana pana in tubul 9 din care se arunca 1 ml.
Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din cultura de testat.
Tubul 10 este martorIncubare 18-20 h la 370C
CitireUltimul tub limpede reprezinta limita
sensibilitatii germenului fata de antibioticul utilizat sau CMI= Concentratia Minima Inhibitorie.
Daca se adauga un indicator de ph cresterea bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin virarea culorii indicatorului de ph-ului.
Metoda dilutiilor in medii lichide este tehnica cea mai precisa de determinare a sensibilitatii microorganismelor la antibiotice si chimioterapice si in plus permite determinarea concentratiilor bacteriostatice si bactericide ale substantelor testate
Se realizeaza cu analizorul MiniAPI conform indicatiilor din prospect specifice fiecarui tip de germene, respectiv utilizandu-se urmatoarele galerii de antibiograma: ATB Staph, ATB Strep, ATB GN, ATB Enterococ. Se urmaresc indicatiile de realizare a inocului, de incubare si de interpretare specifice, descrise in inserturi.
Principiul este cel al unei antibiograme prin microdilutii cu puncte de ruptura.
Citirea se face automat prin softul analizorului MiniAPI, inclusiv interpretarea in sistem Expert.
Este varianta perfectionata a metodei difuzimetrice prin care se determina CMI a unui antibiotic.
Metoda foloseste in locul microcomprimatelor cu antibiotic cate un epsilometru pentru fiecare antibiotic ( fasii de material plastic, gadate, imbibate cu cate un antibiotic). Gradatiile indica valorile CMI in mcg/ml. Pe suprafata mediului insamantat se depun radial la distante convenabile epsilometrele si se incubeaza.
Zonele de inhibitie apar de-a lungul epsilometrului si au forma ovalara. Valoarea CMI se citeste pe epsilometru si corespunde gradatiei aflate la intersectia cu limita de inhibitie.
Testarea sensibilităţii la antifungice este în prezent standardizată numai pentru metodele cu macro şi microdiluţie şi respectiv E-test. Deaceea în laboratoarele clinice obişnuite se practică fie antifungigrama pe galerii automate de tipul Candifast, ce au ca principiu metoda microdilutiilor, fie E-testul.
Dozarea chimioterapicelor si antibioticelor din umorile organismului este necesara pentru evaluarea in vivo a eficientei unui tratament cu chimioterapice sau antibiotice.
Astfel se poate stabili daca concentratia substantei se mentine in umorile organismului la un nivel activ, permite controlul modului si ritmului de administrare ajuta la aprecierea corespondentei intre eficacitatea in vivo si in vitro a substantei utilizate, etc.
Antibiograma este una dintre cele mai utile determinari de laborator care aduce informatii pretioase privind atitudinea medicului in terapia cu antibiotice.
Antibiogramele se vor repeta ori de cite ori o dicteaza evolutia clinica dupa tratamentul cu antibiotice si eventual se vor utiliza asociatii de antibiotice pentru a obtine un efect terapeutic mai promt si prevenirea instalarii rezistentei bacteriei la antibiotice si chimioterapice.
