anca vartolomei (zlavog vartolomei)

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE“GRIGORE T. POPA”, IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

ESTIMAREA APORTULUI DE OCRATOXINA A PRIN CONSUM DE ALIMENTE. IMPLICAŢII ÎN

PATOLOGIA UMANĂ ŞI ANIMALĂ

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Coordonator ştiinţific,Prof. Dr. RODICA CUCIUREANU

Doctorand,ANCA VARTOLOMEI

(ZLĂVOG VARTOLOMEI)

IAŞI, 2013

2

Prin decizia Rectorului nr. 23922/30.10.2013 a fost numită comisia pentru susţinerea publică a tezei de doctorat intitulată „Estimarea aportului de ocratoxină A prin consum de alimente. Implicaţii în patologia umană şi animală”, elaborată de farmacist Anca Vartolomei (Zlăvog Vartolomei), coordonator ştiinţific Prof. Dr. Rodica Cuciureanu, în vederea conferirii titlului de Doctor în Ştiinţe Medicale, domeniul Farmacie.

Comisia de doctorat are următoarea componenţă:

PREŞEDINTE: Prof. Dr. Monica HăncianuUniversitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de Farmacie

COORDONATOR ŞTIINŢIFIC: Prof. Dr. Rodica CuciureanuUniversitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de Farmacie

REFERENŢI OFICIALI:Prof. Dr. Daniela Lucia MunteanUniversitatea de Medicină şi Farmacie Tg. Mureş, Facultatea de Farmacie

Prof. Dr. Doina MiereUniversitatea de Medicină şi Farmacie „Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Conf. Dr. Nela BibireUniversitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” Iaşi, Facultatea de Farmacie

Rezumatul păstrează numerotarea din teză pentru cuprins, tabele şi figuri.

3

CUPRINS

Introducere. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1Motivaţia cercetării . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6Obiective . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6PARTE GENERALĂCapitolul IOcratoxine – aspecte generale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

I.1.Ocratoxine- structură chimică . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7I.2.Biosinteza ocratoxinei A (OTA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

I.2.1.Fungi producători de ocratoxine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8I.2.2.Mecanismul biosintezei ocratoxinei A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

I.3.Toxicocinetica ocratoxinei A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15I.3.1.Absorbţie, transport şi distribuţie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15I.3.2.Metabolizarea ocratoxinei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16I.3.3.Eliminare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 18

I.4.Mecanismele actiunii toxice . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19I.5.Ocratoxicoze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 23

I.5.1.Ocratoxicoza porcină . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23I.5.2.Ocratoxicoza aviară . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24I.5.3.Ocratoxicoza la rumegătoare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25I.5.4.Ocratoxicoza umană . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Capitolul IIExpunerea organismului uman la ocratoxină prin consum de alimente contaminate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

II.1. Contaminarea fungică a alimentelor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29II.2.Nivelul contaminării alimentelor cu OTA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30II.3.Expunerea organismului uman la ocratoxină . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Capitolul IIIReglementări legislative privind conţinutul OTA în produsele alimentare. . . . . . . 38Capitolul IVDetecţia şi cuantificarea ocratoxinei A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

IV.1. Extracţia ocratoxinei din probe . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 40IV.2. Determinarea cantitativă a ocratoxinei A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

PARTE PERSONALĂCapitolul VDeterminarea ocratoxinei Aprin metode (HPLC) LC/MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . 48

V.1.Introducere. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . 48V.2.Validarea unei metode HPLC de determinare a ocratoxinei A (OTA) . . . . . . . 49

V.2.1.Protocol de validare analitică a metodelor analitice . . . . . . . . . . . . . . . . . 49V.2.2.Studiul analitic al ocratoxinei prin cromatografie de lichide cuplată cu spectrometria de masă . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50V.2.3.Metoda rapidă de dozare a ocratoxinei prin LC/MS/MS . . . . . . . . . . . . . 55

V.2.3.1.Protocol analitic . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55V.2.3.1.1.Materiale şi metoda analitică prezentare . . . . . . . . . 55V.2.3.1.2.Prepararea soluţiei stoc şi a soluţiei de lucru . . . . . . 56V.2.3.1.3.Prepararea soluţiilor standard de calibrare şi a probelor de control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57V.2.3.1.4.Condiţii de lucru LC/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4

V.2.3.1.5.Determinarea concentraţiei de ocratoxină – referinţă 58V.2.3.2.Procedura de validare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

V.2.3.2.1.Specificitatea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58V.2.3.2.2.Curba de calibrare (Liniaritate) . . . . . . . . . . . . . . . . 58V.2.3.2.3.Precizia si acurate�ea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58V.2.3.2.4.Limita de cuantificare inferioară . . . . . . . . . . . . . . . 58

V.2.3.3.Raport de validare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59V.2.3.3.1.Specificitatea . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59V.2.3.3.2.Liniaritatea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60V.2.3.3.3.Limita inferioară de cuantificare . . . . . . . . . . .. . . . . 61V.2.3.3.4.Precizia şi acurateţea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

V.2.3.4.Discuţii (la metoda validată) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61V.3.Determinarea OTA din probe de produse alimentare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

V.3.1. Determinarea ocratoxinei A din cereale şi derivate, seminţe oleaginoase, leguminoase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

V.3.1.1. Probe de analizat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62V.3.1.2. Extracţia ocratoxinei din probele de analizat . . . . . . . . . . . . . . 62V.3.1.3. Rezultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63V.3.1.4. Discuţii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 67

V.3.2. Determinarea ocratoxinei A din cafea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 69V.3.2.1. Probe de analizat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69V.3.2.2. Extracţia ocratoxinei din probele de analizat . . . . . . . . . . . . . . 69V.3.2.3. Rezultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69V.3.2.4. Discuţii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

V.3.3. Determinarea ocratoxinei A din bere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 71V.3.3.1. Probe de analizat . . . . . . . . . .... . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71V.3.3.2. Extracţia ocratoxinei din probele de analizat . . . . . . . . . . . . . . 71V.3.3.3. Rezultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 72V.3.3.4. Discuţii . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 73

V.4.Metoda sensibilă de dozare a ocratoxinei prin LC/MS/MS . . . . . . . . . . . . .. . . . 75V.4.1.Protocol şi raport analitic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . 75

V.4.1.1.Materiale şi metoda analitică – prezentare . . . . . . . . . . . . . . . . 76V.4.1.1.1.Prepararea soluţiei stoc şi a soluţiei de lucru . . . . 76V.4.1.1.2.Prepararea soluţiilor standard de calibrare şi a probelor de control . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

V.4.1.2.Condiţii de lucru LC/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77V.4.2.Rezultatele validării şi concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

V.4.2.1.Specificitatea. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 77V.4.2.2.Liniaritatea. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 78V.4.2.3.Limita inferioară de cuantificare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79V.4.2.4.Precizia şi acurateţea. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80V.4.2.5.Analiza probelor de alimente utilizând metoda validată . . . . . . 80

V.4.3.Discuţii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 83V.5.Concluzii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . 83

Capitolul VIDeterminarea ocratoxinei A prin metoda imunoenzimatică . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

VI.1.Introducere. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . 85VI.2.Standardizarea unei metode imunoenzimatice ELISA pentru determinarea ocratoxinei A. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

VI.2.1Principiul metodei. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . 88

5

VI.2.2.Material şi metodă. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 89VI.2.2.1.Reactivi şi echipamente . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 89VI.2.2.2.Protocol experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 89

VI.2.2.2.1.Liniaritatea metodei (Curba de calibrare) . . . . . . . 90VI.2.2.2.2.Limita minimă de detecţie şi de cuantificare . . . . 91VI.2.2.2.3.Stabilirea procentului de recuperare . . . . . . . . . . . 92VI.2.2.2.4. Prelucrarea şi interpretarea statistică a datelor . . . 93

VI.2.3.Rezultate şi discuţii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 95VI.3.Determinarea OTA din probe de lapte. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

VI.3.1.Probe de analizat. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . 97VI.3.2.Pregătirea probelor. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 97VI.3.3.Mod de lucru. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . 97VI.3.4.Rezultate. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 99VI.3.5.Discuţii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 100

VI.3.5.1. Lapte uman. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 100VI.3.5.2.Lapte praf şi produse pentru copii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103VI.3.5.3.Lapte de bovine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

VI.3.6.Concluzii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 105VI.4.Determinarea ocratoxinei A din probe de sânge uman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

VI.4.1.Probe de analizat. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . 106VI.4.2.Protocol experimental. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . 106

VI.4.2.1.Principiul metodei. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106VI.4.2.2.Material şi metodă. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

VI.4.2.2.1.Pregătirea probelor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107VI.4.2.2.2.Mod de lucru . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

VI.4.2.3.Rezultate. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 108VI.4.2.4.Interpretarea şi analiza statistică a rezultatelor . . . . . . . . . . . 109VI.4.2.5.Discuţii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 115VI.4.2.6.Concluzii. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 123

Capitolul VIIEstimarea aportului de OTA prin consum de alimente pe baza concentraţiei micotoxinei în sânge şi lapte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

VII.1. Introducere. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 125VII.2.Estimarea aportului zilnic de ocratoxină prin consum de alimente pe baza concentraţiei sanguine a acestei micotoxine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128

VII.2.1. Material şi metode . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128VII.2.2. Rezultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129VII.2.3. Discuţii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

VII.3.Estimarea aportului zilnic de ocratoxină de către nou-născut prin consum de lapte matern. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

VII.3.1. Introducere. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134VII.3.2. Material şi metodă. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134VII.3.3. Rezultate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135VII.3.4. Discuţii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

VII.4.Concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136Capitolul VIIIConcluzii generale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

6

Introducere

Micotoxinele sunt „metaboliţi ai fungilor care, după ingestie,inhalare sau absorbţie prin piele alterează capacitatea de reacţie a organismului şi provoacă îmbolnăviri sau chiar moartea la om, la animale, inclusiv la păsări (Pitt, 1996). Încă din antichitate erau cunoscuţi fungii şi efectele nocive ale acestora asupra organismului uman şi animal. Prima descriere a unei îmbolnăviri datorate micotoxinelor -ergotismul-(micotoxicoză provocată de alcaloizii elaboraţi de Claviceps purpurea) a fost făcută de Plinius, în sec.VII î.e.n.

Episodul britanic al „bolii X” a curcilor (în 1960 au murit în Marea Britanie peste 100.000 de animale de curte hrănite cu făină de arahide) a reprezentat momentul abordării ştiinţifice sistematice a micotoxinelor şi micotoxicozelor. Ca urmare, până în prezent au fost descrise, analizate şi chiar sintetizate câteva sute de micotoxine (Coman, 1985).

Astăzi, se consideră că micotoxinele ar putea fi considerate responsabile de numărul mare de decese din Europa occidentală în secolul al XIII-lea; înlocuirea secarei cu grâul în alimentaţie a constituind o sursă importantă de micotoxine produse de Fusarium (Miller, 1991). Concentrarea acestor toxine în cereale au fost la originea numeroaselor decese care au avut loc în Siberia în timpul celui de al II-lea război mondial.

Micotoxinele sunt prezente în numeroase produse care stau la baza alimentaţiei omului şi animalelor (Coker, 1997). Pătrunderea micotoxinelor în organismul uman (ingestie, inhalare, absorbţie cutanată) poate provoca intoxicaţii acute sau cronice care se manifestă la nivelul aparatelor digestiv, cardiovascular, respirator, excretor etc. În ultimii ani a fost confirmată acţiunea carcinogenă, mutagenă, teratogenă şi imunosupresoare a unora dintre micotoxine.

Capacitatea unor micotoxine de a modifica reacţiile imunitare şi, prin aceasta de a reduce rezistenţa la infecţii este considerat efectul nociv cel mai important aupra organismului. Micotoxinele reţin atenţia în întreaga lume şi prin prisma pierderilor economice legate, în primul rând, de efectele asupra sănătăţii umane, asupra productivităţii animale şi asupra comerţului naţional şi internaţional. În ţările în curs de dezvoltare unde produsele alimentare (porumb, arahide) sunt mai susceptibile de a fi contaminate, este probabil ca morbiditatea crescută şi decesele premature să fie asociate cu prezenţa micotoxinelor în alimente.

Contaminarea produselor alimentare cu fungi micotoxinogeni şi elaborarea micotoxinelor este o formă de alterare biologică a alimentului,

7

de modificare a calităţii acestuia în măsură de a deveni nociv pentru sănătate, deci impropriu consumului uman. În cadrul acestui proces complex: infecţie fungică, toxinogeneză, consum de alimente contaminate, alterarea sănătăţii există posibilităţi de a se interveni, în diferite etape, în scopul reducerii riscurilor pentru consumatori, deci asigurarea securităţii alimentare a populaţiei.

Infecţia fungică, ca primă etapă în bioalterare, este condiţionată de factori biologici, chimici, fizici, de macroclimat şi de microclimat: umiditate, temperatură, prezenţa unor dăunători (microorganisme, insecte) etc. Prezenta mucegaiurilor nu inseamna neaparat sinteza de micotoxine, producerea acestora fiind conditionată de mai multi factori fizici si chimici: temperatura, umiditate, aerare, etc (D’Mello et al., 1997).

Contaminarea cu fungi, dezvoltarea lor şi producerea de micotoxine poate avea loc în câmp (cultivare, recoltare), în timpul depozitarii sau în ambele perioade.

Prezenţa frecventă a boabelor agresate (strivite) în masa de cereale favorizează dezvoltarea fungilor, deoarece acestea sunt vulnerabile în faţa atacului fungic.

În general, în câmp cerealele sunt atacate de fungi a căror dezvoltare optimă impune o umiditate crescută, iar în depozite sunt atacate de fungii care rezistă la umiditate mai scăzută.

Fungii (mucegaiurile) sunt ciuperci eucariote microscopice filamentoase, capabile să se dezvolte pe substraturi nutritive variate, mai ales pe produse alimentare - constituie un ansamblu heterogen cuprinzând în jur de 20000 de specii aparţinând la trei clase: Zygomycetes, Deuteromycetes şi Ascomycetes. Dezvoltarea mucegaiurilor pe produsele alimentare poate modifica proprietăţile senzoriale ale acestora, dar şi caracterisicile lor chimice; de cele mai multe ori, consecinţa directă a dezvoltării mucegaiurilor pe alimente este îndepărtarea acestora din circuitul alimentar, ceea ce, la scară mondială, reprezintă pierderi anuale de 5-10 % din producţie (EFSA, 2006).

Aspectul inestetic al prezenţei mucegaiurilor a fost considerat mult timp prejudiciul major al contaminării fungice a produselor alimentare; abia în anul 1959 a fost stabilit în Franţa, primul diagnostic de micotoxicoză tipică în urma consumării de către vacile de lapte a furajelor puternic mucegăite. În anul 1960, moartea a peste 100 000 de curcani în Anglia (hrăniţi cu făină de arahide mucegăită) a confirmat capacitatea mucegaiurilor dezvoltate pe alimente de a sintetiza substanţe toxice pentru animale şi om – micotoxinele (Coman, 1985). Mucegaiurile, sub formă de filamente sau conidii, sunt prezente în toate elementele de mediu; solul şi vegetalele reprezintă habitatul primar al fungilor. Fenomenele

8

meteorologice (curenţii de aer, precipitaţiile), activităţile umane, animalele (mai ales insectele) sunt factori de dispersie a conidiilor. Concentraţia populaţiilor de conidii atmosferice prezintă variaţii în funcţie de aria geografică, anotimp, climă, etc (1 m3de aer poate conţine între 250 şi 1500 conidii). Flora fungică micotoxinogenă este constituită majoritar din 5 genuri: Aspergillus, Penicillium şi Cladosporium, Fusarium şi Alternaria. În atmosfera necontrolată, contaminarea cu aceşti fungi reprezintă un risc permanent şi inevitabil; vegetalele, seminţele şi fructele sunt, practic natural contaminate.

Literatura de specialitate conţine numeroase date care confirmă că, practic toate alimentele permit dezvoltarea fungilor şi sunt susceptibile de a fi contaminate cu micotoxine (Berthier, 1998). Specialiştii sunt unanim de acord (Jelinek, 1989; Pohland et al., 1992; Duarte et al., 2009; Magnoli et al., 2007; Lombaert et al., 2002; Copetti et al., 2011; Iamanaka et al., 2005; Thirumala-Devi et al., 2000; Majerus et al., 2000; MacDonald et al., 1999; Otteneder şi Majerus, 2000; Castella et al., 2002; Araguás et al., 2005; Turconi, 2004) că numeroase grupe de produse alimentare pot fi contaminate cu micotoxine: produse vegetale(cereale legume, fructe), produse de origine animală (lapte şi derivate, carne şi derivate).

Prezenţa, practic generalizată a aflatoxinelor în oleaginoase este o problemă sanitară majoră, agravată de faptul că, produsele puternic contaminate nu sunt eliminate din lanţul alimentar, ci sunt utilizate adesea ca hrană pentru animale sau chiar pentru om, în zonele slab dezvoltate economic. Cerealele sunt produsele alimentate a căror contaminare fungică şi producţie de micotoxine poate avea loc înainte de recoltare, după recoltare (uscare, depozitare) sau chiar după procesare. Principalele micotoxine sunt: aflatoxinele, sterigmatocistina, ocratoxina A, vomitoxina, zearalenona, toxina T-2 (Jelinek, 1989). Mucegaiul poate apărea pe culturile în creştere sau după recoltare în timpul depozitării sau prelucrării. În timp ce mucegaiul poate fi considerat ca patogen al plantelor, ingestia de toxine poate duce la îmbolnăviri la om şi animale. Micotoxinele, cum ar fi aflatoxinele şi ocratoxina A, sunt cunoscute a fi cancerigene.

Procesul culinar şi panificaţia nu reprezintă o metodă de detoxifiere a făinurilor contaminate. O problemă sanitară o constituie concentrarea micotoxinelor în tegumentul boabelor de cereale, subproduse (tărâţe) utilizate frecvent în hrana animalelor.

Carnea şi derivatele reprezintă un mediu puţin propice pentruacumularea toxinelor fungice; excepţie face ocratoxina care se acumulează în ţesuturile şi în organele de porcine. Această toxină pune probleme serioase siguranţei alimentului în colectivităţile în care carnea de porc este consumată preferenţial.

9

Motivaţia cercetării

Aprofundarea cunoştinţelor privind mecanismele de acţiune toxică a ocratoxinei şi confirmarea potenţialului cancerigen al acesteia, justifică necesitatea abordării temei ca subiect al tezei de doctorat. Corelaţiile cunoscute între aportul de ocratoxină prin consum de alimente şi patologii specifice cum ar fi nefropatia endemică balcanică, maladie care a fost diagnosticată şi în România reprezintă un motiv în plus pentru cunoaşterea conţinutului în OTA al produselor alimentare. Estimarea aportului zilnic de ocratoxină prin consum de alimente este destul de dificilă datorită frecvenţei în care micotoxina este prezentă în acestea, dar şi prin heterogenitatea obiceiurilor alimentare. În prezent, în condiţiile în care toxicocinetica OTA în organism este cunoscută, aportul zilnic de OTA poate fi estimat pe baza valorilor acesteia în lichidele biologice (lapte uman, sânge). Prezenţa OTA în laptele uman reprezintă un important factor de risc pentru sănătatea noului născut care în primele luni de viaţă se hrăneşte exclusiv cu acest aliment.

Aceste aspecte privind importanţa evaluării conţinutului OTA în produsele alimentare au permis stabilirea obiectivelor de cercetare pentru realizarea tezei de doctorat.

Obiective de cercetare

Obiectivele cercetărilor personale care au condus la realizarea tezei de doctorat:

1. Validarea unor metode specifice şi sensibile pentru determinarea ocratoxinei A din probe de produse alimentare, lapte uman şi sânge;

1.1.Validarea a 2 metode HPLC /MS pentru determinarea OTA din alimente;

1.2. Stabilirea parametrilor de performanţă a unei metode imunoenzimaticeindirecte de determinare a OTA din probe de lapte şi de ser uman;

2. Determinarea conţinutului în ocratoxină A pentru probe de cereale, cafea, bere, mirodenii prin metodele HPLC validate;

3. Determinarea ocratoxinei A din probe de lapte de bovine, lapte uman şi sânge uman prin metoda ELISA standardizată;

4. Estimarea aportului alimentar de OTA pe baza valorilor acesteia în sângele uman şi în laptele matern.

10

PARTE PERSONALĂ

Capitolul V

DETERMINAREA OCRATOXINEI A PRIN METODE (HPLC) LC/MS/MS

ObiectiveValidarea unor metode specifice şi sensibile pentru determinarea

ocratoxinei A din probe de produse alimentare, lapte uman şi sânge;1.1. Validarea a 2 metode HPLC/MS pentru determinarea OTA din

alimente şi aplicarea acestora la detecţia micotoxinei în probe de produse alimentare;

1.2. Stabilirea parametrilor de performanţă a unei metode imunoenzimatice indirecte de determinare a OTA din probe de lapte şiser uman şi aplicareaacesteia la analiza unor probe de lapte şi de sânge uman.

5.2. Validarea unei metode HPLC/MS de determinare a ocratoxinei A (OTA)

5.2.3.3. Raport de validare5.2.3.3.1. Specificitatea

Nu au fost observate interferenţe la timpul de retenţie al (1.5 minute) (Fig. V.11). În fig. V.12 este prezentată cromatograma unei probe cu ocratoxină la limita de cuantificare (4.5 ng/mL).

Fig. V.11. Cromatograma unei probe blank

PRIN

Validarea unor metode specifice şi sensibile pentru determinarea ocratoxinei A din probe de produse alimentare, lapte uman şi sânge;

/MS pentru determinarea OTA din alimente şi aplicarea acestora la detecţia micotoxinei în probe de produse

1.2. Stabilirea parametrilor de performanţă a unei metode imunoenzimatice indirecte de determinare a OTA din probe de lapte şi de ser uman şi aplicareaacesteia la analiza unor probe de lapte şi de sânge

terminare a

Nu au fost observate interferenţe la timpul de retenţie al ocratoxinei (Fig. V.11). În fig. V.12 este prezentată cromatograma unei

11

Fig. V.12. Cromatograma unei probe cu ocratoxină, la limita de cuantificare a metodei analitice (4,5 ng/mL

5.2.3.3.2.LiniaritateaCurbele de calibrare au fost liniare – cu precizie şi acurateţe

corespunzătoare - în intervalul de concentraţii 4,5-360 ng/Coeficienţii de corelare au fost mai mari decat 0,996. Concentraţiile recalculate pe baza curbei de calibrare demonstrează că rezidualii nu au o anume tendinţă raportat la concentraţie.

Tabel V.6Acurateţea concentraţiilor pentru curbele de calibrare din zile diferite

(n=5)

Acurateţea %

Concentraţianominală ng/mL

Curba 1 Curba 2 Curba 3 Curba 4

4,50 6,9 -11,3 -4,2 -9,00 -3,7 4,6 5,4 1018,00 -6,2 3,8 5,6 845,00 4,1 2,9 8,2 -90,00 -2,9 2,3 1,5 3180,00 -3,3 -2,4 -5,8 -360,00 2,2 0,2 -6,4 -

Parametrii curbelor de calibrarePanta 26195,08 28385,25 29945,00 29390Intercept -8609,78 28196,56 8334,48 17776r 0,99941 0,99987 0,99624 0,99905

ă, la limita de mL)

cu precizie şi acurateţe 360 ng/mL (Tabel V.6). 996. Concentraţiile re-

calculate pe baza curbei de calibrare demonstrează că rezidualii nu au o

librare din zile diferite

Acurateţea %

Curba 4 Curba 5

-5,8 -2,010,4 -8,88,3 5,6-3,8 5,53,3 5,7-5,3 -5,7-2,4 1,0

29390,97 29079,4717776,18 19079,43

99905 0,99925

12

O curbă de calibrare tipică a ocratoxinei este prezentată în fig. V.13:

Fig. V.13. Curba de calibrare tipică a ocratoxinei

5.2.3.3.3.Limita inferioară de cuantificare:Limita inferioară de cuantificare (cel mai scăzut nivel la care acurateţea şi precizia nu depăşesc +/-20%) a fost de 4,5 ng/mL ocratoxină. Precizia şi acurateţea pentru determinări în aceeaşi zi au fost de 7,6% şi 12%. Precizia şi acurateţea pentru determinări în zile diferite au fost de 2.6% �i 7,2% (Tabelele V.7. şi V.8).

Tabel V.7Precizia şi acurateţea pentru determinări efectuate în aceeaşi zi (n=5)

Concentraţia nominală

ng/mL

Concentraţia măsurată ng/mL (±

D.S.)

Precizia %

Acurateţea %

4,50 5,04 0,39 7,6 12,09,00 9,52 0,49 5,1 5,8

45,00 49,49 0,91 1,8 10,0180,00 192,08 2,97 1,5 6,7

13

Tabel V. 8Precizia şi acurateţea pentru determinări efectuate în zile diferite

(n=5)

Concentraţia nominală ng/mL

Concentraţia măsurată ng/mL (±

D.S.)

Precizia %

Acurateţea %

4,50 4,83 0,12 2,6 7,29,00 9,07 0,88 9,7 0,8

45,00 46,79 2,09 4,5 4,0180,00 177,67 7,34 4,1 -1,3

5.2.3.3.4. Precizia şi acurateţeaPrecizia şi acurateţea pentru cele trei niveluri testate au fost mai mici decât +/- 15%, atât pentru determinările în aceeaşi zi cât şi pentru cele din zile diferite (Tabelele V.7 şi V.8).

5.3. Determinarea OTA din probe de produse alimentare

5.3.1. Determinarea ocratoxinei A din cereale şi derivate, seminţe oleaginoase, leguminoase

5.3.1.1. Probe de analizatProbele de analizat: cereale (grâu, porumb, hrişcă, orz, ovăz), făină

(grâu, porumb, secară), fasole, mazăre, soia, susan, seminţe floarea soarelui, nuci, alune au fost achiziţionate din reţeaua comercială din Iaşi şi din pieţele alimentare ale oraşului Iaşi, de la producători individuali. Au fost analizate 27 probe de cereale, 21 probe de derivate de cereale, 18 probe de seminţe oleaginoase, nuci şi arahide, 12 probe de leguminoase (soia, fasole, mazăre, năut).

5.3.1.3. Rezultate Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de analizat

sunt inserate în figurile V.14 – V.20.

14

Fig. V.14. Valorile concentraţiei de OTA în probele de cereale (1

Prelucrarea şi interpretarea statisticăDatele obţinute în urma determinărilor au fost prelucrate statistic

utilizând softul MedCalc. Pentru fiecare lot de probe s-au efectuat atât teste de statistică descriptivă cât şi inferenţială, rezultatele fiind redate sub formă de tabele sumative şi grafice.

Testele statistice aplicate au fost testul t (Sudent) pentru o probăpentru probele cu distribuţie normală şi alternativa sa neparametrică, pentru probele a cărei distribuţie nu a putut fi normalizată.

Tabel V. 9Prelucrarea statistică a datelor pentru OTA din probele de cereale

Descrierea statisticăParametrul statisticMedia ± ES 54,78 ± 16,11Mediana 23,12Deviaţia standad 77,28Varianţa 5971,74Coeficient Skewness 2,91 (P<0,0001)Coeficient Kurtosis 9,34 (P=0,0002)Amplitudine 340,03Valoarea minimă 6,43Valoarea maximă 346,46Număr probe 23

0

20

40

60

80

Poru

mb

boab

e*

Poru

mb

boab

e*

Poru

mb

boab

e*

Poru

mb

boab

e*

Poru

mb

boab

e*

Hrişcă*

Hrişcă*

Hrişcă*

*

Hrişcă*

*

Grâ

u*

Grâ

u*

Grâ

u*

Grâ

u*

Grâ

u*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

64.61

20.3

64.61

35.6938.15

20.9211.54

23.12

8.98

42.46

66.46

12.87

34.43

8.65

Con

cent

rati

a O

TA

(μ

g/kg

)

Nr. probei

Fig. V.14. Valorile concentraţiei de OTA în probele de cereale (1-16)

prelucrate statistic au efectuat atât teste

de statistică descriptivă cât şi inferenţială, rezultatele fiind redate sub formă

t (Sudent) pentru o probă,pentru probele cu distribuţie normală şi alternativa sa neparametrică, pentru

datelor pentru OTA din probele de cereale

54,78 ± 16,1123,1277,28

5971,742,91 (P<0,0001)9,34 (P=0,0002)

340,036,43

346,4623

Grâ

u*

Grâ

u*

15 16

8.650 0

15

Interval de confidenţă (95%) 21,36-88,19Test D’Agostino Pearson

p <0,0001Analiza statisticăTestul t-Student

T (t Stat) t (t critic) p (T<=t)12,53 2,07 < 0,0001

Dimensiunea lotului de testare a fost de 27 de probe, pentru 4 dintre ele valorile obţinute pentru OTA au fost < LOD, de aceea aplicarea testelor statistice s-a făcut excluzând aceste probe, dimensiunea finală a eşantionului de probe analizat fiind de 24.

Fig. V.15. Dispersia valorilor individuale pentru lotul de probe de cereale

Fig. V. 16. Dispersia valorilor individuale, după normalizarea distribuţiei

0

50

100

150

200

250

300

350

Co

nce

ntr

atia

OT

A c

erea

le µ

g/k

g

1

10

100

1000

Co

nce

ntr

atia

OT

A c

erea

le µ

g/k

g

16

Atât valoarea p<0,0001 obţinută în urma aplicării testului D’Agostino Pearson cât şi plotarea valorilor individuale (Fig. V.15) arată că datele nu au o distribuţie normală, de aceea au fost logaritmictransfomate, obţinându-se o valoare p de acceptare a normalităţii de 0,35 pentru o medie geometrică de 30,57 (inteval de confidenţă 19,57-47,73), permiţând aplicarea testului statistic în varianta parametrică.

Tabel V. 10.Tabel sintetic al conţinutului de OTA în probele analizate

Produsul alimentar

Nr. de probe

analizate

Probe pozitive*

Incidenţa (%)

Interval de concentraţii

OTA(μg/kg)

Media contaminării

(μg/kg)**

Cereale 27 23 85,14 6,43-346,46 54.77

Derivatede cereale

31 15 48,38 0,19-78,54 22,26

Alimente bogate în grăsimi (seminţe)

27 26 96,29 3,26-3217,53 77,83*

Leguminoase 19 11 57,89 6,32-81,84 34,1

Total 104 75 72,11 0,19-3217,53 47,24

** media contaminării probelor pozitive* a fost exclusă la medie proba cu 3217,53 μg/kg

5.3.1.4. DiscuţiiRezultatele cercetărilor proprii privind prezenţa ocratoxinei A în

diferite categorii de produse alimentare scot în evidenţă nivelul deosebit de ridicat de poluare al acestora. Astfel, procentul de probe pozitive în cazul celor 27 de probe de cereale analizate este de 85,14%. Intervalul de concentraţii în care OTA a fost evidenţiată variază de la 6,43 până la 346,46 µg/kg. Pentru derivatele din cereale (făină, tărâţe, etc) concentraţiile de OTA sunt, în general concordante cu cele ale materiilor prime. S-a confirmat observaţia conform căreia, conţinutul de micotoxină este mai ridicat în tărâţea de grâu decât în făină şi decât în produsul integral. Concentraţii mari de ocratoxină şi un procent foarte ridicat de probe pozitive s-au obţinut şi în cazul probelor de leguminoase şi de produse

17

bogate în grăsimi. Astfel procentul de probe de leguminoase pozitive a fost de 72,11% cu intervale de concentraţie de 6,32 – 81,84 µg/kg.

Aceste rezultate sunt concordante ca nivel de concentraţii de OTA determinate cu cele obţinute de alţi autori. În privinţa procentelor de probe contaminate trebuie recunoscută incidenţa mai mare a contaminării pentru probele recoltate în România. Astfel, Kabak (2009) a raportat că OTA a fost evidenţiată în 42 din cele 110 probede grâu analizate, cu o incidenţă de 38%. Nivelurile de contaminare în probe pozitive au variat între 11 şi 250 μg/kg; media de OTA în probele de grâu pozitive a fost de 55 μg/kg. Valorile raportate de Zaied et al. (2009) sunt concordante cu cele obţinute anterior de Maaroufi et al. (1995). Nivelul de contaminare OTA depăşeşte cu mult limita maximă stabilită în regulamentul UE (5 μg/kg) (Regulamentul CE, 2002 şi Regulamentul Comisiei CE, 2005), în 38% din eşantioanele de grâu pozitive. De altfel, contaminarea cerealelor şi a produselor derivate cu OTA este o problemă la nivel mondial (Fazekas et al., 2002). Şi în alte ţări din jurul Mării Mediterane cerealele au prezentat niveluri ridicate de contaminare cu OTA, cum ar fi Maroc (Zinedine et al., 2006), Italia (Solfrizo et al., 1998) şi Spania (Araguas et al, 2005).

5.3.2. Determinarea ocratoxinei A din cafea5.3.2.1. Probe de analizat

În cercetările personale realizate am analizat 12 probe de cafea boabe sau măcinată, de diferite origini. Probele au fost achiziţionate dinreţeaua comercială a oraşului Iaşi.

5.3.2.3. RezultateRezultatele obţinute la determinarea OTA din cele 12 probe de cafea

sunt inserate în Tabelul V.11.

Tabel V.11Conţinutul în OTA al probelor de cafea analizate

Nr. probei

Tipul probeiConţinut în ocratoxină

(µg/kg)1 Cafea boabe vrac 3,242 Cafea boabe vrac 3,563 Cafea boabe vrac 4,984 Cafea boabe ambalată 2,845 Cafea boabe ambalată < LOQ6 Cafea boabe ambalată 2,45

18

7 Cafea măcinată ambalată (vid) 5,238 Cafea măcinată ambalată (vid) < LOQ9 Cafea măcinată ambalată (vid) 3,1410 Cafea măcinată ambalată 4,1311 Cafea măcinată ambalată 1,9612 Cafea măcinată ambalată 2,06

5.3.2.4.DiscuţiiProcentul de probe pozitive a fost de 83,33%; pentru probele

pozitive concentraţia de OTA a variat între 1,96 şi 4,98 µg/kg. Concentraţia de 4,98 µg OTA/kg a fost determinată înt-o probă de cafea boabe vrac. Nici una dintre probe nu a depăşit limita stabilită de către Uniunea Europeanăde 5µg OTA/kg.

Rezultatele obţinute de noi sunt în totală concordanţă cu datele publicate de alţi autori. Astfel, Drunday et al., (2013) au evidenţiat capozitive 21 din cele 24 de probe (87,50%) de cafea măcinată de 8 mărci diferite. Concentraţia micotoxinei variază între 0,98 şi 4.64 µg/kg.

Valoarea medie a concentraţiei OTA pentru probele pozitive a fost de 2,07 ± 0.61 µg/kg. Nu s-au evidenţiat diferenţe semnificative între tipurile de cafea.

Niveluri similare OTA în cafeaua măcinată au fost raportate şi de alţi autori. Astfel, Van der Stegen et al. (1997) au analizat nivelurile OTA în diferite tipuri de cafea, din 8 ţări europene (Belgia, Finlanda, Franţa, Germania, Italia, Ţările de Jos, Elveţia şi Regatul Unit). Nivelurile de OTA pentru cafeaua prăjită măcinată au variat între 0,5 – 8,2 µg/kg. Comisia Europeană (2002) a studiat aportul alimentar de OTA prin intermediul produselor alimentare pentru din numeroase ţări (Danemarca, Finlanda, Franţa, Germania, Norvegia, Suedia, Ţările de Jos, Regatul Unit, Italia, Grecia, Spania, şi Portugalia) pe baza contaminării alimentelor şi a datelor de consum. Nivelurile de OTA determinate pentru cafeaua prăjită au ajuns chiar la 13,1 µg/kg în unele ţări. Procentul de probe pozitive pentru OTA în cafeaua prăjită comercial variază între 7-100%, în timp ce nivelurile de OTA au variat 0,1-17 µg/kg, după datele raportate de JECFA (2008). Astfel, rezultatele noastre în ceea ce priveşte contaminarea cafea rămân în intervalele de contaminare depistate în Spania şi în alte ţări.

Datele din literatură confirmă contribuţia semnificativă a cafelei la aportul total de OTA prin consum de alimente, alături de cereale, băuturi alcoolice (vin) şi mirodenii.

19

5.3.3. Determinarea ocratoxinei A din bere �i vin

5.3.3.1. Probe de analizatÎn cercetările personale realizate am analizat 23 probe de bere şi 7

probe de vin, de diferite origini, de producţie românească. Probele au fost achiziţionate din reţeaua comercială a oraşului Iaşi şi de la producători individuali (vin).

5.3.3.3. RezultateValorile concentraţiei OTA în probele de bere şi de vin sunt inserate

în Tabelele V.13 şi V.14.

Tabel V. 13Concentraţia OTA în probele de bere analizate

Nr. probei

Denumirea probeiConcentraţie OTA (µg/L)

1 Bere blondă pasteurizată 0,0422 Bere blondă pasteurizată 0,0493 Bere blondă pasteurizată 0,0294 Bere blondă dozator 0,0365 Bere blondă dozator 0,0286 Bere blondă dozator 0,827 Bere blondă dozator 0,0158 Bere la cutie 0,0189 Bere la cutie 0,01610 Bere la cutie 0,01111 Bere la cutie 0,04812 Bere la cutie 0,02713 Bere la cutie 0,03814 Bere la cutie 0,02915 Bere la cutie 3,1616 Bere blondă dozator 2,7917 Bere blondă dozator 18,2718 Bere blondă dozator <LOQ19 Bere blondă dozator 0,4020 Bere blondă dozator <LOQ21 Bere blondă dozator <LOQ22 Bere blondă dozator 1,4923 Bere blondă dozator 0,69

20

Tabel V. 14Concentraţia OTA în probele de vin analizate

Nr. probei

Denumirea probeiConcentraţie OTA (µg/L)

1 Vin alb vrac* 0,542 Vin alb vrac* 0,323 Vin alb vrac* < LOQ4 Vin alb demisec** 0,425 Vin alb demisec** 0,376 Vin alb demisec** < LOQ7 Vin alb demidulce** 0,23

*= procurat de la producători individuali**= achiziţionat din reţeaua comercială

5.3.3.4. DiscuţiiRezultatele obţinute de noi în urma determinării OTA din cele 23

probe de bere de producţie românească sunt în totală concordanţă cu cele raportate de numeroşi autori din majoritatea zonelor lumii. Conform datelor obţinute de noi după analiza celor 23 probe de bere, procentul de probe pozitive a fost de 86,95 %. Nivelul concentraţiilor determinate este cuprins între 0,011 şi 18, 27 µg/L, cu o medie de 1,22±0,8.

Astfel, se poate concluziona faptul că OTA a fost detectată în berea din toată lumea (mai mult de 50% de eşantioane analizate redau niveluri de 0,2 ng/mL), ceea ce înseamnă că berea nu este un factor relevant pentru expunerea la OTA a populaţiei (< 3% în raport cu Doza săptămânală tolerată (TWI) de 100 ng/kg corp). Deoarece nu există o limită prescrisă pentru această băutură, nu poate exista nici o acţiune de reglementare cu privire la conţinutului ridicat de OTA.

Rezultatele obţinute la determinarea OTA din cele 8 probe de vin analizate au evidenţiat un procent de 75% de probe pozitive. Valorile conţinutului de OTAau variat între 0,23 şi 0,54 µg/L.

În ceea ce priveşte contaminarea vinului cu OTA, după prima semnalare privind prezenţa acestei micotoxine în vin (Zimmerli şi Dick, 1996) mai multe studii au fost efectuate pentru aevalua relevanţa prezenţei acesteia în vin şi produsele obţinute din struguri (Battilani et al., 2006). Uniunea Europeană a convenit un nivel maxim de 2,0 µg OTA/kg pentru vin (Comisia Europeană, 2005). Primele date privind apariţia ocratoxinei A

21

în vinul comercializat în Spania sunt relatate de Burdaspal şi Legarda (1999); cele mai multe dintre probele analizate erau de producţie internă.

Vinurile de desert au prezentat cel mai înalt nivel de incidenţă (aproximativ 73%), urmate de cele rozé, vinurile roşii şi albe. Studii suplimentare privind apariţia ocratoxinei A în vin au fost raportate de numeroşi autori (López de Cerain et al., 2002; Belli et al., 2004; Blesa et al., 2004; Mateo et al., 2006; Hernández et al., 2006). Procentul de contaminare al probelor a fost de 51,5%. Cea mai mare concentraţie OTA a fost de 15,25 µg/L în vinul de desert. Excluzând vinurile de desert, cele mai înalte concentraţii OTA au fost mai mici de 4.5 µg/L. În Italia, incidenţa ocratoxinei A a fost mai mare în vinurile roşii (78,4%), urmate de cele rosé şi de vinurile de desert şi albe. Cel mai înalt nivel de 7,63 µg/L a fost găsit în vinul roşu. Vinurile de desert sunt destul de predispuse să fie contaminate cu OTA ca în cazul vinurilor spaniole (Visconti et al., 1999; Cerutti et al., 2000; Pietri et al., 2001; Brera et al., 2005; Bacaloni et al., 2005). În Germania, concentraţia de 7,0 µg/L a fost gasită în vinul roşu italian exportat în Germania (Majerus şi Otteneder, 1996; Majerus et al., 2000).

Tabel V,22Conţinutul de OTA în probele de seminţe analizate

ProbaMasă probă (g)

Concentraţie (ng/mL)

Cantitate în probă (pg/g)

Alune vrac** 25 1,12 6,699Fiesta, arahide prăjite cu sare**

25 0,41 2,461

Alune vrac** 25 0,70 4,183Alune vrac** 25 0,00 0,000Alune de pădure** 25 0,40 2,394Migdale crude** 25 0,44 2,638Nuci caju** 25 0,00 0,000Mix arahide şi porumb picant**

25 0,53 3,160

Mix stafide, arahide, alune de pădure**

25 3,07 18,418

Miez de nucă** 25 0,69 4,167Miez de nucă* 25 0,00 0,000Miez de nucă* 25 0,00 0,000Castane comestibile vrac** 25 0,00 0,000** achiziţionat din reţea comercială*achiziţionat de la producător particula

22

V.5. Concluzii

Rezultatele cercetărilor personale incluse în acest capitol au permis formularea unor concluzii privind metodele HPLC/MS de determinare a ocratoxinei A.

Validarea unei prime metode HPLC/MS de dozare a OTA a confirmat respectarea cerinţelor privind performanţele metodei. Astfel, curba de calibrare este liniară în domeniul de concentraţii 4,5-360 ng/mL; coeficientul de corelare are valoarea de 0,999408.

Ecuaţia dreptei : y = 26195,086890x+ 8609,786246Precizia şi acurateţea metodei sunt corespunzătoare pentru intervalul

de concentraţii 4,5-360 ng/mL; precizia şi acurateţea pentru determinări în aceeaşi zi au fost de 7,6% şi 12%. Precizia şi acurateţea pentru determinări în zile diferite au fost de 2,6% şi 7,2%.

Limita inferioară de cuantificare, LOQ (cel mai scăzut nivel la care acurateţea şi precizia nu depăşesc +/-20%) a fost de 4,5 ng ocratoxină/mL.

Metoda validată a fost aplicată la determinarea ocratoxinei A din cereale şi derivate, seminţe oleaginoase, leguminoase. Au fost analizate 27 probe de cereale, 21 probe de derivate de cereale, 18 probe de seminţe oleaginoase, nuci şi arahide, 12 probe de leguminoase (soia, fasole, mazăre, năut).

Rezultatele cercetărilor proprii privind prezenţa ocratoxinei A în diferite categorii de produse alimentare scot în evidenţă nivelul deosebit de ridicat de poluare al acestora. Astfel, procentul de probe pozitive în cazul celor 104 probe analizate este de 72,11%. Intervalul de concentraţii în care OTA a fost evidenţiată variază de la < LOD a metodei până la 3217,53mcg/kg. Pentru derivatele din cereale (făină, tărâţe etc) concentraţiile de OTA sunt, în general concordante cu cele ale materiilor prime. S-a confirmat observaţia conform căreia, conţinutul de micotoxină este mai ridicat în tărâţea de grâu decât în făină şi decât în produsul integral. Concentraţii mari de ocratoxină şi un procent foarte ridicat de probe pozitive s-au obţinut şi în cazul probelor de leguminoase şi de produse bogate în grăsimi.

Prin metoda HPLC validată au fost analizate şi 12 probe de cafea, 23 probe de bere fabricată în România şi 7 probe de vin.

În cazul probelor de cafea, procentul de probe pozitive a fost de 83,33%; pentru probele pozitive concentraţia de OTA a variat între 1,96 şi 4,98 µg/kg. Concentraţia de 4,98 µg OTA/kg a fost determinată înt-o probă de cafea boabe vrac. Nici una dintre probe nu a depăşit limita stabilită de către Uniunea Europeană de 5µg OTA/kg.

23

Analiza probelor de bere a condus la un procent de 86,95% probe pozitive. Valorile concentraţilor ocratoxinei au variat între < LOQ şi 18,27 mcg/L. Rezultatele obţinute la determinarea OTA din cele 8 probe de vin analizate au evidenţiat un procent de 75% de probe pozitive. Valorile conţinutului de OTA au variat între 0,23 şi 0,54 µg/L.

Validarea celei de-a doua metodă HPLC/MS/MS a fost necesară în încercarea de a creşte sensibilitatea detecţiei ocratoxinei în probe de alimente, având în vedere faptul că metoda dezvoltată anterior, deşi cu durată scurtă de analiză a unei probe poate fi aplicată doar pentru probele mai puternic contaminate cu ocratoxină, dar nu şi pentru cele cu niveluri mai scăzute de micotoxină şi chiar pentru evidenţierea OTA în probe biologice.

Curbele de calibrare au fost liniare – cu precizie şi acurateţe corespunzătoare - în intervalul de concentraţii 0,45-36,0 ng/mL. Limita inferioară de cuantificare (cel mai scăzut nivel la care acurateţea şi precizia nu depăşesc +/-20%) a fost de 0,045 ng/mL ocratoxină. Ecuaţia dreptei : y = 69044,272951x + 8752,771743. Coeficietul de corelare = 0,998764.

Precizia şi acurateţea pentru determinări în aceeaşi zi au fost de 4,9% şi -6,0%. Precizia şi acurateţea pentru determinări în zile diferite au fost de 5,1% şi -9,7%.

Metoda HPLC/MS/MS validată a fost aplicată la determinarea OTA din 36 probe de pâine, cereale pentru mic dejun, mirodenii, produse oleaginoase (alune, nuci, migdale).

24

Capitolul VI

DETERMINAREA OCRATOXINEI A PRIN METODA IMUNOENZIMATICĂ

ObiectiveCercetările experimentaleprezentate în acest capitol au urmărit: Standardizarea unei metode imunoenzimatice ELISA pentru

determinarea ocratoxinei; Aplicarea metodei standardizate la determinarea OTA din probe

de lapte (lapte uman, lapte de bovine integral şi lapte praf, formule pentru copii) şi probe de sânge uman;

6.2. Standardizarea unei metode imunoenzimatice ELISA pentru determinarea ocratoxinei A

6.2.1. Principiul metodeiDeterminarea cantitativă a ocratoxinei A în probele de ser uman şi

lapte utilizează o metodă imunoenzimatică directă, de tip competitiv, în fază solidă; diagrama reacţiei imunoenzimatice ELISA este prezentată în fig. VI.1. Anticorpi cu înaltă afinitate pentru ocratoxina A sunt tapetaţi în microgodeuri de polistiren. Standardele (calibratorii) sau probele sunt adăugate în godeurile corespunzătoare şi dacă ocratoxina A este prezentă aceasta se va lega de anticorpii tapetaţi pe suprafaţa godeurilor. În continuare este adăugată ocratoxina A conjugată enzimatic cu peroxidaza din hrean (HRP) şi se leagă de anticorpii care nu au fost încă ocupaţi de ocratoxina A prezentă în standard sau în probă. După o perioadă de incubare a reacţiei, acest conţinut este eliminat, godeurile sunt spălate şi este adăugat substratul cromogen tetrametilbenzidina (TMB); în prezenţa peroxidazei (HRP) se dezvoltă o culoare albastră Intensitatea culorii este direct proporţională cu cantitatea de conjugat legată şi invers proporţională cu cantitatea de ocratoxină A prezentă în standard sau în probă. Reacţia este stopată prin adăugarea unei soluţii acide care produce virarea culorii din albastru în galben. Intensitatea culorii se determină spectrofotometric la 450 nm cu filtru de referinţă de 630 nm.

25

6.2.2.2. Protocol experimentalStabilirea parametrilor de performanţă ai metodeiParametrii de performanţă ai metodei (liniaritate, specificitate

analitică, reproductibilitate, regăsire, limită de detecţie) au fost stabiliţi prin aplicarea acesteia pe lapte uman şi lapte de bovine.

6.2.2.2.1. Liniaritatea metodei (Curba de calibrare)Relaţia de proporţionalitate inversă între concentraţia ocratoxinei şi

absorbanţă (liniaritatea metodei) a fost stabilită pentru concentraţii de ocratoxină A cuprinse între 0 şi 0,4 ng/mL (Tabel VI.2, Fig. VI. 3).

Tabel VI.2Curba de calibrare pentru determinarea Ocratoxinei A

Nr. crt.

StandardConcentraţie

(ng/mL)Absorbanţa

r = -0.9781yc=2.801 Panta =-3.3442

1 STD 1 0,40 1,48002 STD 2 0,20 2,00603 STD 3 0,10 2,60704 STD 4 0,05 2,72205 STD 5 0,02 2,74106 STD 6 0,00 2,7520

Fig. VI.3. Curba de calibrare pentru determinarea ocratoxineiA

y = -3,4306x + 2,8249

R2 = 0,9681

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

C onc e ntra ţia ng /mL

Abs

orb

anţa

26

Tabel VI.4Limita minimă de detecţie şi limita minimă de cuantificare pentru

determinarea ocratoxinei A din probe de lapte şi ser uman.

Tip probă

ConcentraţiaMedie

(ng/mL)(n = 20)

Deviaţia standard

(DS)

Limita minimă de

detecţie(ng/mL)

Limita minimă de cuantificare(ng/mL)

Lapte 0,0079 0,0039 0,0197 0,0474

Ser 0,0067 0,0022 0,0133 0,0289

6.2.2.2.3. Stabilirea procentului de recuperareStabilirea procentului de recuperare s-a realizat prin îmbogăţirea

probelor de lapte cu ocratoxina A 0,2ng/mL; după un repaus de 24 de ore probele au fost extrase şi analizate. Operaţia de îmbogăţire şi de extracţie a fost repetată de 3 ori pentru fiecare probă. Soluţia de spălare tampon PBS/Tween a fost îmbogăţită şi extrasă în acelaşi mod ca şi probele de control.

Rezultatele obţinute sunt consemnate în tabelul VI. b.

Tabel VI.5bStabilirea procentului de recuperare

Proba testată% Ao

Standard 0,02 ng/mL

% Aoprobe

%Ao probe

< 2x DS

Coeficient de variaţie

(%)ng/mL

Ser uman 87,8 99,7 96,3 1,7 <0,08

Ser de porc 86,9 100,2 97,4 1,4 <0,08

Lapte uman 86,5 92,3 89,3 1,6 <0,08Lapte de bovine 85,9 91,1 88,9 1,2 <0,08

6.2.2.2.4. Prelucrarea şi interpretarea statistică a datelorDatele obţinute au fost prelucrate statistic în vederea eliminării

erorilor de determinare şi totodată pentru validarea rezultatelor studiului. S-a efectuat în acest scop descrierea statistică a eşantioanelor de probe pentru obţinerea descriptorilor de interes (medie, mediană, eroare standard a mediei - ES, deviaţie standard, varianţă, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient Kurtosis).

27

Pentru evidenţierea încadrării rezultatelor determinărilor în parametrii de variaţie faţă de medie s-a efectuat analizaplicarea de teste statistice care să stabilească gradul de diferenţă între probe (valoare p) şi s-a estimat intervalul de confidenţă a mediilor pentru reprezentare grafică: segmente dispuse de o parte şi de alta a mediei. Suprapunerea segmentelor sugerează absenţa unei diferenţe semnificative între medii.

Prelucrarea şi reprezentarea grafică a datelor s-module de lucru ale softurilor MedCalc şi Microsoft Office 2007.

Testele statistice aplicate: pentru probele cu valori normal distribuite au fost t-Student pentru probe independente cu varianţe egale şi tpentru probe independente cu varianţe inegale, iar pentru cele a căror distribuţie nu a putut fi normalizată - testul Mann-Whitney.

Coeficientul Skewness (coeficient de asimetrie) este un indicator folosit în analiza distribuţiei unei serii de date pentru a indica deviaţia distribuţiei empirice în raport cu o distribuţie simetrică în jurul mediei.

Interpretare: > 0 - distribuţia este înclinată spre stânga, având mai multe valori extreme spre dreapta.< 0 - distribuţia este înclinată spre dreapta, având mai multe valori extreme spre stânga.= 0 - media este egală mediana, distribuţia este simetrică în jurul mediei.

Coeficientul Kurtosis (coeficient de aplatizare) este un indicator folosit în analiza distribuţiei unei serii de date pentru a indica gradul de aplatizare sau de ascuţire a unei distribuţii.

Interpretare: > 3 - distribuţie leptokurtică, mai ascuţită decât o distibuţie normală; având mai multe valori concentrate în jurul mediei şi cozi mai groase ceea ce înseamnă probabilităţi ridicate pentru valorile extreme.< 3 - distribuţie platikurtică, mai plată decât o distibuţie normal având valori dispersate pe un interval mai mare în jurul mediei. Probabilipentru valori extreme este mai mică decât în cazul unei distribuţii normale.= 3 - distribuţie mezokurtică - exemplu distribuţia normală.

Estimarea intervalului de confidenţă al mediei se face pornind de la relaţia:

μ = ± · t (0,05, n-1)

Plecând de la această relaţie se poate calcula limita inferioară (cea superioară (LS) a intevalului de confidenţă, concluzia estimării fiind că intervalul LI-LS include media populaţiei din care a fost extrasă proba, cu o probabilitate de 95%.

Pentru evidenţierea încadrării rezultatelor determinărilor în a efectuat analiza comparativă prin

aplicarea de teste statistice care să stabilească gradul de diferenţă între a estimat intervalul de confidenţă a mediilor pentru

reprezentare grafică: segmente dispuse de o parte şi de alta a mediei. egmentelor sugerează absenţa unei diferenţe semnificative

-a realizat utilizând module de lucru ale softurilor MedCalc şi Microsoft Office 2007.

ori normal distribuite Student pentru probe independente cu varianţe egale şi t-Student

pentru probe independente cu varianţe inegale, iar pentru cele a căror Whitney.

ficient de asimetrie) este un indicator folosit în analiza distribuţiei unei serii de date pentru a indica deviaţia distribuţiei empirice în raport cu o distribuţie simetrică în jurul mediei.

având mai multe valori extreme

distribuţia este înclinată spre dreapta, având mai multe valori extreme

media este egală mediana, distribuţia este simetrică în jurul mediei.are) este un indicator

folosit în analiza distribuţiei unei serii de date pentru a indica gradul de

distribuţie leptokurtică, mai ascuţită decât o distibuţie normală; având i concentrate în jurul mediei şi cozi mai groase ceea ce

distribuţie platikurtică, mai plată decât o distibuţie normal având valori dispersate pe un interval mai mare în jurul mediei. Probabilitatea pentru valori extreme este mai mică decât în cazul unei distribuţii normale.

exemplu distribuţia normală.al mediei se face pornind de

de la această relaţie se poate calcula limita inferioară (LI) şi ) a intevalului de confidenţă, concluzia estimării fiind că

include media populaţiei din care a fost extrasă proba, cu o

28

LI = - · t (0,05, n-1)

LS = + · t (0,05, n-1)

Testul t (Student) pentru probe independente Pentru a putea aprecia caracterul real sau accidental al variaţiilor

valorii medii a diferiţilor parametri studiaţi în cadrul metodelor experimentale realizate, s-a impus calcularea, pentru fiecare caz în parte, a testului de semnificaţie (t).

Pe baza valorilor t obţinute şi cea a gradelor de libertate, sindicele de probabilitate p. Variaţiile care au valori ale lui p ≤ 0,05 au fost considerate semnificative conform tabel VI. 6.

Tabelul VI. 6Semnificaţia ştiinţifică a valorii p

Valoarea p Semnificaţia statistică Simbol> 0,05 nesemnificativ NS<0,05 semnificativ *< 0,01 distinct semnificativ **< 0,001 foarte semnificativ ***

6.2.3.Rezultate şi discuţii

Stabilirea parametrilor de performanţă ai metodei imunoenzimatice aplicate a condus la următoarele rezultate:

Metoda este liniară în intevalul de concentraţii 0,0 – 0,5 ng/a) ecuaţia dreptei de calibrare: y= -3,4306x + 2,8249b) coeficientul de corelaţie (r) = 0.9839c) eroarea standard a dreptei de regresie: ES = 0,1052Limita de detecţie pentru lapte= 0,0197 ng/mLLimita de cuantificare pentru lapte = 0,0474 ng/mLLimita de detecţiepentru ser = 0,0133 ng/mLLimita de cuantificare pentru ser = 0,0289 ng/mL

6.3. Determinarea OTA din probe de lapte

6.3.1. Probe de analizatS-au analizat:- 12 probe de lapte matern; probele au fost obţinute de la mame

internate la clinica “Elena Doamna”; probele au fost recoltate a treia zi

Pentru a putea aprecia caracterul real sau accidental al variaţiilor valorii medii a diferiţilor parametri studiaţi în cadrul metodelor

mpus calcularea, pentru fiecare caz în parte, a

obţinute şi cea a gradelor de libertate, s-a stabilit ≤ 0,05 au fost

SimbolNS******

Stabilirea parametrilor de performanţă ai metodei imunoenzimatice

0,5 ng/mL

12 probe de lapte matern; probele au fost obţinute de la mame internate la clinica “Elena Doamna”; probele au fost recoltate a treia zi

29

după naştere. Pentru acest studiu am primit aviz de la comisia de etică a cercetării a UMF, Iaşi.

- 15 probe de lapte de bovine integral; probele au fost achiziţionate de la producători individuali de pe raza localităţii Tg. Frumos;

- 8 probe de lapte praf achiziţionate din reţeaua comercială a oraşului Iaşi; reconstituirea laptelui din lapte praf s-a realizat prin omogenizarea a 1 g probă cu 3 mL apă distilată;

Succesiunea etapelor de reacţie pentru determinarea ocratoxinei Aîn probele de lapte de bovine, lapte matern, lapte praf reconstituit este descrisă în tabelul VI.8.

Tabel VI.8Etapele de reacţie pentru determinarea OTA

BLANKS1

(0.0

ng/mL)

S2

(0.02

ng/mL)

S3

(0.05

ng/mL)

S4

(0.1 ng/mL)

S5

(0.2ng/mL)

S6

(0.4

ng/mL)

Probă

S1 (0.0

ng/mL)

- 100µL - - - - - -

S2 (0.02

ng/mL)

- - 100µL - - - - -

S3 (0.05

ng/mL)

- - - 100µL - - - -

S4 (0.1

ng/mL)

- - - - 100µL - - -

S5 (0.2

ng/mL)

- - - - - 100µL -

S6 (0.4

ng/mL)

- - - - - - 100µL

Probă - - - - - - - 100µL

Diluent dereacţie

- 200µL 200µL 200µL 200µL 200µL 200µL 200µL

Se transferă 100 µL din conţinutul fiecărui godeu cu amestec de reacţie din plăcuţa de microtitrare în godeul corespunzător al plăcuţei de reacţie tapetată cu anticorpi anti OTA.

Incubare 30 minute la temperatura camerei (22ºC).

Spălare Se elimină conţinutul godeurilor. Godeurile se spală de 3 ori cu soluţie tampon de spălare PBS-Tween (pauza dintre spălări este de 60 secunde). După ultima spălare se absoarbe surplusul de umiditate prin tamponare pe hârtia de filtru.

Conjugatenzimatic

- 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL

30

BLANKS1

(0.0

ng/mL)

S2

(0.02

ng/mL)

S3

(0.05

ng/mL)

S4

(0.1 ng/mL)

S5

(0.2ng/mL)

S6

(0.4

ng/mL)

Probă


Spălare Se execută 3 spălări succesive cu soluţie tampon de spălare PBS-Tween. După ultima spălare se absoarbe surplusul de umiditate prin tamponare pe hârtia de filtru.

Soluţie substrat TMB

- 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL


Stopare reacţie cu soluţie acidă

- 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL

Se omogenizează prin 2-3 pipetări succesive.

Se citeşte densitatea optică la λ = 450 nm, cu filtru de referinţă de 630 nm.

6.3.4. Rezultate Rezultatele obţinute la determinarea ocratoxinei a din probele de

lapte sunt consemnate în fig. VI.5., fig. VI.6. şi VI.7.

Fig. VI. 5. Rezultatele obţinutela determinarea OTA din probele de lapte uman

19,7

80 80 80

280

40

80 80

160

120

80 80

0

50

100

150

200

250

300

2987

59

2987

60

2987

61

2987

62

2987

63

2987

64

2987

65

2987

66

2987

67

2987

68

2987

69

2987

70

LD Conţinut în ocratoxinǎ ng/L

31

Fig. VI. 6. Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte

Tabel VI. 9Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte de

bovine

Nr.crt.

Cod probă Probăocratoxină (ng/L)

1 298775 lapte de bovine -Boureni2 298776 lapte de bovine - Ion Neculce3 298778 lapte de bovine - Braiesti4 298779 lapte de bovine - Braiesti5 298780 lapte de bovine - Tirgu Frumos6 298781 lapte de bovine - Cristesti7 298782 lapte de bovine - Sacaresti8 298783 lapte de bovine - Cristesti9 298784 lapte de bovine - Prigoreni10 298785 lapte de bovine - Tirgu Frumos11 298786 lapte de bovine - Tirgu Frumos12 298787 lapte de bovine - Strunga13 298788 lapte de bovine - Prigoreni14 298789 lapte de bovine - Buznea15 298791 lapte de bovine - Braiesti

050

100150200250300350400450500

1 2 3 4 5 6 7

0.12 0.12 0.04 0.04 0.04 0 0.08

360 360

120 120 120

0

240

Conţinut în ocratoxină ng/mL Conţinut în ocratoxină ng/kg

Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte

Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte de

Conţinut în ocratoxină (ng/L)

808080120404040

<LOD4040120200404080

8

0.16

240

480

Conţinut în ocratoxină ng/kg

32

6.3.5. Discuţii

6.3.5.1. Lapte umanOTA a fost detectată în 11 din cele 12 probe de lapte uman analizate

(91,67%). Concentraţia OTA în probele pozitive a fost cuprinsă între 40 şi 280 ng/L.

Din analiza datelor obţinute la determinarea OTA din cele 12 probe de lapte uman analizate rezultă un procent de 91,67% probe pozitive. Numai pentru una dintre probe (9,09%) concentraţia OTA este sub limita de detecţie a metodei ELISA aplicate. Intervalele de concentraţii ale OTA determinate sunt: mai puţin de 50 ng/L = 1 probă (9,09%); 51-100 ng/L = 7 probe (63,64%); 101- 200 ng/L = 2 probe (18,18%) şi 201 – 300 ng/L = 1 probă (9,08%).

Aceste date sunt concordante cu numerose alte date publicate în literatura de specialitate.

6.3.5.2.Lapte praf şi produse pentru copiiRezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte praf

arată că 7 din cele 8 probe analizate (87,5%) sunt contaminate cu OTA. Concentraţiile de ocratoxină au variat între <LOD (14,28%) şi 480 ng/L. Astfel, 6 probe de lapte praf au prezentat valori de 120-360 ng/Kg. Pentru o singură probă concentraţia de OTA a fost de 480 ng/kg. Datele din literatură raportează valori diferite ale OTA în preparatele pentru copii. De asemenea, sunt semnalate situaţii în care ocratoxina A poate fi prezentă în preparatele pentru copii alături de alte micotoxine (aflatoxina M1).

6.3.5.3.Lapte de bovineRezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte de

bovine integral au confirmat prezenţa toxinei în 14 din cele 15 probe analizate (93,33%). Concentraţiile de ocratoxină au variat între <LOD a metodei (6,66%) şi 200 ng/L. Astfel, un procent de 50% dintre probe prezentau un conţinut de OTA mai mic de 50 ng/mL, 4 probe (28,57%) aveau între 50 şi 100 ng OTA/L, iar 2, un conţinut de OTA de 120 ng/L. Pentru una singură dintre probele analizate s-a obţinut o valoare de 200 ng/L. Valorile concentraţiilor de OTA determinate de noi sunt, în general, concordante cu datele raportate de alţi autori. Astfel, Bascarán et al. (2007) au constatat că nici una dintre cele 12 probe analizate nu conţinea OTA peste limita de cuantificare a metodei (0,5 ng/L). Rezultate similare au fost raportate de Valenta şi Goll (1996), care nu au găsit OTA în nici una dintre cele 121 de probe de lapte de bovine analizate provenite dintr-o regiune de

33

nord a Germaniei. Cu toate acestea, OTA a fost raportată ca prezentă într-un procent mic din probele de lapte din Suedia şi Norvegia: 12% şi respectiv 14% din probe (intervalul de detecţie = 10-58 ng/L) (Breitholtz Emanuelsson et al., 1993; Skaug, 1999), în intervalul de 10-50 ng/L (Breitholtz-Emanuelsson et al., 1993; Skaug, 1999). Motivul ar putea fi o contaminare mai mare al furajelor din ţările scandinave (Valenta şi Goll,1996) sau existenţa altor căi posibile de expunere la OTA, cum ar fi inhalarea de particule din aer care conţin micotoxine, aşa cum a fost sugerat de către Skaug (1999). González-Osnaya et al. (2008) au determinat OTA din 61 probe de lapte achiziţionate de la diferite supermarket-uri din Valencia (Spania). Nici una dintre probe nu conţinea OTA deasupra nivelului de detecţie. Totuşi, cantităţi mici de OTA în lapte sunt de o importanţă pentru consumatorii de cantităţi mari de lapte, datorită faptului că concentraţii scăzute de OTA pot contribui la o parte semnificativă din totalul consumului de toxină.

6.3.6. Concluzii Rezultatele cercetărilor personale inserate în acest capitol au permis

formularea concluziilor pe baza căror apreciem validitatea metodei analitice standardizate şi calitatea rezultatelor obţinute. Stabilireaparametrilor de performanţă ai metodei imunoenzimatice aplicate a condus la următoarele rezultate :

Metoda este liniară în intevalul de concentraţii 0,0 – 0,5 ng/mLa) ecuaţia dreptei de calibrare: y = -3,4306x + 2,8249b) coeficientul de corelaţie (r) = 0.9839c) eroarea standard a dreptei de regresie: ES = 0,1052Limita de detecţiepentru lapte = 0,0197 ng/mLLimita de cuantificare pentru lapte = 0,0474 ng/mLLimita de detecţie pentru ser = 0,0133 ng/mLLimita de cuantificare pentru ser = 0,0289 ng/mLMetoda standardizată a fost aplicată pentru determinarea OTA din

12 probe de lapte matern, 15 probe de lapte de bovine şi 8 probe de lapte praf.

OTA a fost detectată în 11 din cele 12 probe de lapte uman analizate (91,67%). Concentraţia OTA în probele pozitive a fost cuprinsă între 40 şi 280 ng/L. Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte praf arată că 7 din cele 8 probe analizate (87,5%) sunt contaminate cu OTA. Concentraţiile de ocratoxină au variat între <LOD a metodei (14,28%) şi 480 ng/L.

Rezultatele obţinute la determinarea OTA din probele de lapte integral au confirmat prezenţa toxinei în 14 din cele 15 probe analizate

34

(93,33%). Concentraţiile de ocratoxină au variat între <LOD a metodei (6,66%) şi 200 ng/L. Astfel, un procent de 50% dintre probe prezentau un conţinut de OTA mai mic de 50 ng/mL, 4 probe (28,57%) aveau între 50 şi 100 ng OTA/L, iar 2, un conţinut de OTA de 120 ng/L. Pentru una singură dintre probele analizate s-a obţinut o valoare de 200 ng/L.

6.4. Determinarea ocratoxinei A din probe de sânge uman

6.4.1. Probe de analizatS-au analizat 38 probe de sânge uman recoltat de la voluntari

sănătoşi din judeţul Iaşi. Determinarea ocratoxinei s-a realizat prin metoda imunoenzimată directă de tip competitiv, în fază solidă. Parametrii de performanţă ai metodei o recomandă pentru aplicare la determinarea ocratoxinei în lichide biologice în care micotoxina se găseşte în concentraţii foarte mici.

Pentru selectarea voluntarilor şi recoltarea probelor s-a obţinut avizul de etica de la Comisia de etică a cercetării din cadrul UMF „Grigore T. Popa” Iaşi (Anexa I).

6.4.2.3. RezultateRezultatele obţinute la determinarea ocratoxinei din probele de

sânge uman sunt consemnate în tabelul VI.13 şi fig. VI. 7.

Tabel VI.13Distribuţia concentraţiei de OTA în probele de sânge

SerProbe positiven /(%)

Frecvenţa de distribuţie a OTA (ng/L)Media

(ng/mL)≤ 0,10n (%)

>0,100 – 0,500n/(%)

> 0,500– 1,00n/(%)

=1,000n/(%)

Nr. / % 38/(100) 7/(18,42) 27/(71.05) 3/(7,89) 1/2,63) 0,22 ± 0,19

35

Fig. VI.7. Distribuţia OTA in probele de ser analizate.

6.4.2.4. Interpretarea şi analiza statistică a rezultatelor*Datele obţinute au fost prelucrate statistic în vederea obţinerii

descriptorilor de interes: medie, mediană, eroare standard a mediei deviaţie standard, varianţă, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient Kurtosis.

Dispersia valorilor individuale pentru cele două loturi de interes sunt consemnate în figura VI.8. iar dispersia valorilor individuale pentru cele două loturi de interes, după normalizarea distribuţiei sunt consemnate în figura VI.9.

Fig. VI.8. Dispersia valorilor individuale pentru cele doua loturi de interes

18,42%

71,05%

7,89%2,63%

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Female Male

Fig. VI.7. Distribuţia OTA in probele de ser analizate.

*Datele obţinute au fost prelucrate statistic în vederea obţinerii descriptorilor de interes: medie, mediană, eroare standard a mediei - ES, deviaţie standard, varianţă, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient

e pentru cele două loturi de interes sunt consemnate în figura VI.8. iar dispersia valorilor individuale pentru cele

după normalizarea distribuţiei sunt consemnate în

cele doua loturi de interes

<0,10 ng/L

0,1-0,49 ng/L

0,5-0,99 ng/L

≥ 1 ng/L

36

Fig. VI.9. Dispersia valorilor individuale pentru cele două loturi de interes, după normalizarea distribuţiei

6.4.2.5. DiscuţiiAu fost analizate 38 de probe de sânge recoltate de la voluntari,

bărbaţi (23,68%) şi femei (76,32%), cu vârste cuprinse între 20 şi 66 de ani.

Procentul de probe pozitive a fost de 100%; domeniile de concentraţii între care a variat conţinutul de ocratoxină A a fost cuprins între < 0,10 ng/mL şi 1,00 ng/mL. Astfel, 7 probe (18,42%) au concentraţii de OTA mai mici de 0,1 ng/mL, 3 probe (7,89%) conţin între 0,5 şi 1,00%, iar un procent de 71,05% (27 de probe) prezintă concentraţii de micotoxină cuprinse între 0,5 şi 1,00 ng/mL.

Nu s-au constatat diferenţe semnificative între valorile serice ale ocratoxinei la barbaţi şi la femei: concentraţia medie pentru probele recoltate de la bărbaţi a fost 0,24 ± 0,20 ng/mL faţă de 0,17 ± 0,15 ng/mL, la femei (p=0,3527). Rezultatele obţinute de noi în urma determinării concentraţiei ocratoxinei A în probe de sânge uman sunt în concordanţă cu date raportate de alţi autori. Astfel, în studiul realizat de Giuseppe (2012), OTA a fost detectată în 324 din cele 341 probe de sânge analizate. Limita de detecţie a metodei a fost de 0,025 ng/mL. Un procentaj de 62% din probe conţin o concentraţie mai mică de 0,20 ng OTA/mL, iar 17 probe (5.2%) au prezentat concentraţii mai mari de 0,50 ng/mL. Concentraţiile OTA în probele pozitive variază între 0,029 şi 2,91 ng/mL. Autorul a

0.01

0.1

1

Female Male

37

semnalat o diferenţă semnificativă a fost observată între bărbaţi şi femei, în funcţie de vârstă.

6.4.2.6. ConcluziiMetoda imunoenzimatică standardizată în vederea aplicării la

determinarea OTA din probele de sânge uman a confirmat o reproductibilitate corespunzătoare cerinţelor impuse de ghidurile de validare. Limita minimă de detecţie a fost de 0,0133 ng/mL, iar limita minimă de cuantificare de 0,0289 ng/mL.

Remarcăm o valoare a limitei de cuantificare apropiată de cea a metodei HPLC/MS/Ms, validată şi aplicată de noi.

Metoda a fost aplicată pe 38 de probe de sânge recoltate de la voluntari, bărbaţi (23,68%) şi femei (76,32%), cu vârste cuprinse între 20 şi 66 de ani.

Procentul de probe pozitive a fost de 100%; domeniile de concentraţii între care a variat conţinutul de ocratoxină A a fost cuprins între < 0,10 ng/mL şi 1,00 ng/mL. Astfel, 7 probe (18,42%) au concentraţii de OTA mai mici de 0,1 ng/mL, 3 probe (7,89%) conţin între 0,5 şi 1,00%, iar un procent de 71,05% (27 de probe) prezintă concentraţii de micotoxină cuprinse între 0,5 şi 1,00 ng/mL.

Nu s-au constatat diferenţe semnificative între valorile serice ale ocratoxinei la barbaţi şi la femei: concentraţia medie pentru probele recoltate de la bărbaţi a fost 0,24 ± 0,20 ng/mL faţă de 0,17 ± 0,15 ng/mL, la femei (p=0,3527).

38

Capitolul VII

ESTIMAREA APORTULUI DE OTA PRIN CONSUM DE ALIMENTE PE BAZA CONCENTRAŢIEI MICOTOXINEI ÎN

SÂNGE �I LAPTE

ObiectiveCercetările personale incluse în acest capitol au urmărit: Estimarea aportului de ocratoxină prin consum de alimente

contaminate la un grup de voluntari sănătoşi, pe baza concentraţiei sanguine a acestei micotoxine;

Estimarea aportului de ocratoxină la nou născut prin consum de lapte matern.

7.2. Estimarea aportului zilnic de ocratoxină prin consum de alimente pe baza concentraţiei sanguine a acestei micotoxine;

7. 2.1. Material şi metodeProtocolul de lucru şi rezultatele de la determinarea concentraţiilor

serice ale OTA la cei 38 de voluntari a fost prezentat în capitolul VI al tezei de doctorat.

Aportul zilnic de OTA la om poate fi estimat în mai multe moduri: determinarea micotoxinei în produsele alimentare şi calculul

aportului OTA pe baza consumului zilnic estimat din fiecare categorie de produse alimentare. Consumul individual de alimente, eventual contaminate (g aliment/persoana/zi) se calcuează pe baza datelor din chestionare care conţin întrebări legate de frecvenţa şi cantitatea consumului de produse alimentare, precum şi gramajul porţiilor consumate.

determinarea micotoxinei în sânge şi estimarea cu ajutorul unor formule matematice a nivelului OTA prezente în alimentele ingerate. Valorile rezultate sunt comparate cu doza zilnică tolerabilă (DZT), recomandată de SCF de 5 ng/kg corp/zi (UE, 2002).

39

Calcularea aportului de ocratoxinei A pe baza nivelului plasmatic al micotoxinei

Valoarea medie a nivelului de OTA în plasmă poate fi exprimat ca aportul alimentar continuu conform ecuaţiei Klaassen (Thuvander et al., 2004):

Ecuaţia Klaassen: K0= Clp x Cp

A , în care:

K0 = Aportul alimentar continuu (ng/kg corp/zi);Clp = Clearance-ul plasmatic (mL/kg corp/zi);Cp = Concentraţia plasmatică a OTA (ng/mL);A = Biodisponibilitatea ocratoxinei.Şi Scott (2005) a utilizat concentraţia plasmatică sanguină pentru a

estima consumul alimentar de OTA folosind ecuaţia Klaassen:

Ecuaţia Klaassen: K0= 0,99 X Cp

0,5 = 1, 97 x Cp , în care:

K0 = aportul alimentar continuu (ng/kg corp/ zi);0,99 = Clearance-ul renal (mL/kg corp/ zi);0.5 = Biodisponibilitatea ocratoxinei;Cp = concentraţia plasmatică (ng/mL).

Această ecuaţie simplificată presupune un „model mono-compartimental” de distribuţie a OTA, dar trebuie remarcat faptul că OTA urmează la om un „model bi-compartimental” constând dintr-o fază de eliminare rapidă, urmată de o fază de eliminare lentă (Studer-Rohr et al., 2000).

Doza zilnică de OTA ingerată poate fi estimată pe baza concentraţiei acesteia în probele de plasmă conform ecuaţiei lui Breitholtz et al. (1991):

DZ = Cp ×1.34

unde Cp reprezintă concentraţia OTA în plasmă. Valoarea 1,34 rezultă din înlocuirea clearance-ului renal cu cel total în ecuaţia Klaassen:

Ecuaţia Klaassen, modificată de Breitholtz et al. (1991) :

K0= 0,99 x Cp

0,5 = 1, 34 x Cp , în care:

unde K0 = aportul alimentar continuu (ng/kg corp/ zi);

40

0,67 = Clearance-ul total (mL/kg corp/ zi);0.5 = Biodisponibilitatea ocratoxinei;Cp = concentraţia plasmatică (ng/mL).

7. 2.2. RezultateRezultatele obţinute la estimarea expunerii la OTA pe baza valorilor

concentraţiilor sanguine ale OTA sunt înserate în tabelele VII. 1., VII. 2. şi VII. 3.

Tabel VII.2.Aportul zilnic de OTA estimat pe baza valorilor sanguine ale

micotoxinei (probe 20-38)

Nr. crt.

Concentraţia OTA în sânge (ng/mL)

Aport OTAng/kgc/zi)(1)

Aport OTAng/kgc/zi)(2)

20* 0,16 0,2144 0,316821* 0,08 0,1072 0,158422* 0,08 0,1072 0,158423* 1,00 1,3400 1,980024* 0,16 0,2144 0,216825* 0,28 0,3752 0,554426* 0,12 0,1608 0,237627* 0,16 0,2144 0,316828* 0,12 0,1608 0,237629* 0,08 0,1072 0,158430** 0,04 0,0536 0,079231** 0,12 0,1608 0,237632** 0,12 0,1608 0,237633** 0,16 0,2144 0,316834** 0,56 0,7504 1,108835** 0,24 0,3216 0,475236** 0,12 0,1608 0,237637** 0,08 0,1072 0,158438** 0,12 0,1608 0,2376

*= femei**= bărbaţi(1) = valori calculate după formula Klaassen modificată (Breitholtz)(2) = valori calculate după formula Klaassen

41

7.2.3. DiscuţiiValorile estimate ale aportului zilnic de OTA, calculate pe baza

ecuaţiilor Klaassen, respectiv Breitholtz variază în limite destul de apropiate. Aplicarea relaţiei Breitholtz a condus la valori ale aportului cuprinse între 0,0536 (ng/kgc/zi) şi 1,3400 (ng/kgc/zi). Pentru valori ale clearance-ului renal al OTA de 0,99 şi biodisponibilitate de 50%, valoarea expunerii este mai mare şi anume de 0,0792–1,9800 ng/kgc/zi. Chiar pentru cea mai mare valoare a nivelului OTA în sânge, de 1 ng/mL, valoarea expunerii este mult mai mică decât doza zilnică tolerabilă (14 ng/kgc), indiferent de metoda de calcul (1,34 şi respectiv 1,98 ng/kgc/zi). Aceste valori sunt concordante cu numeroase date publicate în literatura de specialitate

Astfel, Assaf et al. (2004) au calculat un aport zilnic de estimat OTA la populaţia libaneză din concentraţia medie a tuturor probelor de plasmă în conformitate cu ecuaţia descrisă de Breitholtz et al. (1991) Valoarea găsită (0,23 ng/kg corp/zi) este mult mai mică decât aportul zilnic tolerabil estimat (TDI) de OTA la om sugerat de legislaţia canadiană (1,2–5,7 ng/kg corp) sau de către Comitetul mixt FAO/WHO de experţi pentru aditivii alimentari (Codex Alimentarius Commision) (14 ng/kg corp) (1999). Cea mai mare valoare a concentraţiei OTA în sânge (0,87 ng/mL) conduce la un aport estimat la 1,16 ng/kg corp/zi, care este sub TDI.

Palli et al. (1999) au realizat un studiu în care au determinat nivelurile serice de OTA pentru un grup de 138 de adulţi sănătoşi (vârsta 35-65 ani). 97% din probele recoltate au fost pozitive, cu valori variind între 0,12 şi 57,2 ng/mL. După excluderea unui singur subiect cu o valoare de vârf de 57,2 ng/mL, valorile medii şi mediane au fost de 0,56 şi respectiv 0,48 ng/mL, printre restul de 137 subiecţi; cea mai mare valoarea a fost de 2,84 ng/mL.

În cercetările noastre procentul de probe cu mai mult de 1 ng/mL a fost de 2,63%; Palli et al. (1999) au raportat 9,5% din participanţi cu o valoare mai mare de 1,0 ng/mL; 84,7% au variat între 0,2 şi 1,0 ng/mL şi 5,8% au fost sub 0,2 ng/mL. În studiul nostru procentul de probe cu mai puţin de 0,2 ng/mL a fost de 42,1%.

Pentru a realiza evaluarea riscului de OTA autorii au aplicat o formulă matematică de calcul combinată cu modelul de evaluare Monte Carlo.

42

Abordarea matematică a evaluării riscului la OTA aplică ecuaţia:Y = x·c/W,

în care:Y = valoarea DZ de OTA (ng/kg corp);x = consumul de alimente (g/zi);c = concentraţie OTA în diferite alimente (ng/g);W = este greutatea corporală (kg).Valorile DZ obţinute şi comparate cu valorile PTDI propuse de

EFSA (2006), JECFA (2008) şi Comitetul ştiinţific pentru alimentaţie (European Commission, 1998) permit evaluarea marjei de siguranţă (margin of safety, MOS), conform ecuaţiei:

MOS = DI/ADI,în care:

DI = aportul zilnic (Daily Intake, DI);ADI = aportul zilnic acceptat (Acceptable Daily Intake, ADI).Efecte nocive ale OTA pentru organismul uman ar putea fi speculate

în cazul în care MOS ≥ 1. În evaluarea riscului la OTA variabilitatea şi incertitudinea

consumului de produse alimentare şi nivelurile de contaminare nu au fost luate în considerare, rezultând o supraevaluare a expunerii. Pentru a obţine estimări mai realiste de expunere a fost aplicată o metodă probabilistică completă - modelul Monte-Carlo. Valorile medii ale dozei zilnice pentru persoane de sex masculin, feminin şi în total au fost de 1,149; 1,047 şi respectiv 1,074 ng/kg corp/zi. Toate DZ au fost sub cele trei standarde de referinţă. Unele dintre valorile DZ cu procentaj de 95% (≥ 50%) 97.5% şi 99% erau încă sub cele mai recente DZT propuse de către EFSA şi JECFA, dar peste limita (5 ng/kg corp/zi), propusă de Comitetul ştiinţific, care de asemenea, a sprijinit rezultatele de la evaluarea punctuală.

Date din mai multe ţări indică faptul că în mod constant oamenii sunt continuu expuşi la OTA, şi nu există nici o îndoială că acest compus este toxic. OTA a demonstrat proprietăţi teratogene şi imunotoxice; un efect nefrotoxic este evident la toate speciile de mamifere testate (IARC, 1991), precum şi genotoxicitate (Kuiper-Goodman, 1996). Având în vedere aceste caracteristici, controale regulate ar trebui să fie puse în aplicare, precum şi expunerea la OTA ar trebui să fie păstrată la un nivel minim, evitându-se consumul de alimente contaminate. Autorităţile naţionale, precum şi producătorii şi organizaţiile lor ar trebui să cadă de acord asupra definirii nivelurilor maxime admise de OTA şi micotoxine în alimente.

43

7.3. Estimarea aportului zilnic de ocratoxină de către nou-născut prin consum de lapte matern

ObiectiveEstimarea aportului zilnic de ocratoxină de către nou-născut şi

copilul foarte mic prin consum de lapte matern

7.3.2. Material şi metodeLa determinarea concentraţiilor ocratoxinei A în 12 probe de lapte

matern, am obţinut rezultate surprinzătoare în sensul că 11 dintre acestea erau pozitive cu concentraţii de OTA cuprinse între 40 şi 280 ng/L. Aceste valori pot fi utilizate pentru estimarea aportului de OTA de către nou nascut la o masă la care copilul nou născut (cu greutatea de 3,5kg) consumă în jur de 40 mL de lapte. Pe baza frecvenţei meselor (7 mese/zi) se poate calcula aportul zilnic de ocratoxină.

Pentru copilul a cărui vârstă este de 30 de zile, cu greutatea medie de 4,2 kg consumul mediu de lapte la o masă este de 90 mL. Şi în aceste condiţii aportul de OTA se poate calcula pe baza valorilor OTA în laptele recoltat la 3 zile după naştere, deoarece timpul de înjumătăţire a OTA în organismul uman este de peste 35 de zile.

7.3.3. RezultateRezultatele obţinute în urma calculului estimativ al aportului de

OTA, la nou născut, respectiv la copilul de o lună prin consum de lapte matern sunt inserate în tabelul VII. 4.

Tabel VII.4.Estimarea aportului de OTA prin consum de lapte matern

Nr. crt. Cod probăConţinut în OTA (ng/mL)

Aport de OTA (ng/kg)

Copil nou născut Copil 30 zile

La o masăAport zilnic

La o masă

Aport zilnic

1 298759 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

2 298760 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

3 298761 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

44

4 298762 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

5 298763 0,28 3,20 22,40 5,92 41,50

6 298764 0,04 0,45 3,19 0,84 5,92

7 298765 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

8 298766 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

9 298767 0,16 1,82 12,79 3,38 23,71

10 298768 0,12 1,37 9,59 2,54 17,78

11 298769 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

12 298770 0,08 0,91 6,39 1,69 11,85

7.3.4.DiscuţiiRezultatele obţinute de noi după calculul estimativ al aportului de

OTA de către copilul nou născut, respectiv copilul de o lună evidenţiază o expunere zilnică la micotoxină cuprinsă între 0,45 şi 12,79 ng/kgc pentru copilul nou născut; expunerea pentru copilul cu vârsta de 30 de zile, la care consumul de lapte matern este în medie de 90 mL la o masă este cuprinsă între 5,92 şi 23,71ng/kgc/zi. Aceste rezultate sunt concordante cu cele raportate de alţi autori. Astfel, Galvano et al., (2008), Turconi et al. (2004) au arătat o incidenta a probelor de lapte uman contaminate de 74% şi respectiv 85,7%. Micco et al., (1991) a raportat o concentraţie OTA în probele de lapte uman pozitive variind de la 0,10 la 12,00 ng/mL. Având în vedere valorile OTA găsite în şi presupunând o ingerarea de lapte de 40 mL la o masă în primele zile de viaţă şi o greutate corporală de 3,5 kg, aportul de OTA depăseste TDI (0,2 ng/kg corp). Kuiper-Goodman şi Scott au raportat un aport zilnic de OTA pentru un procent de 10,5% din nou-născuţi, cu o valoare maximă de 0,86 ng/kgc.

Doza săptămânală tolerabilă (DST) de 120 ng/kg corp propusă de EFSA (TDI = 17.1 ng/kg corp) este depăşită pentru nou născutul alimentat cu laptele care conţine 0,28 ng OTA/mL. Pentru ceilalţi copii aportul zilnic estimat nu depăşeşte valoarea TDI fixată la 17,1 ng/kgcorp/zi.

7. 4. Concluzii

Valorile estimate ale aportului zilnic de OTA, calculate pe baza ecuaţiilor Klaassen, respectiv Breitholtz variază în limite destul de apropiate. Aplicarea relaţiei Breitholtz a condus la valori ale aportului cuprinse între 0,0536 (ng/kgc/zi) şi 1,3400 (ng/kgc/zi), Pentru valori ale clearance-ului renal al OTA de 0,99 şi biodisponibilitate de 50%, valoarea

45

expunerii este mai mare şi anume de 0,0792–1,9800 (ng/kgc/zi). Chiar pentru cea mai mare valoare a nivelului OTA în sânge, de 1 ng/mL, valoarea expunerii este mult mai mică decât doza zilnică tolerabilă (14 ng/kgc), indiferent de metoda de calcul (1,34 şi respectiv 1,98 ng/kgc/zi). Aceste valori sunt concordante cu numeroase date publicate în literatura de specialitate. Pe baza aportului zilnic de OTA se poate calcula marja de siguranţă pentru riscul de expunere la această micotoxină, folosind relaţia:MOS = DI/ADI.

Efecte nocive ale OTA pentru organismul uman ar putea fi speculate în cazul în care MOS ≥ 1.

Rezultatele obţinute de noi după calculul estimativ al aportului de OTA de către copilul nou născut, respectiv copilul de o lună evidenţiază o expunere zilnică la micotoxină cuprinsă între 0,45 şi 12,79 ng/kgc pentru copilul nou născut; expunerea pentru copilul cu vârsta de 30 de zile, la care consumul de lapte matern este în medie de 90 mL la o masă este cuprinsă între 5,92 şi 23,71 ng/kgc/zi.

46

Bibliografie

Araguas C., Gonzalez-Peans E., Lopez de Cerain A., Study on ocratoxin A in cereal derived products from Spain, Food Chemistry, 2005, 92: 459- 464;

Assaf H., Betbeder A.M., Creppy E.E., Pallardy M., Azouri H., Ocratoxin A levels in human plasma and foods in Lebanon, Human andExperimental Toxicology, 2004, 23: 495–501;

Bacaloni A.,Cavaliere C., Faberi A., Pastorini E., Samperi R., Laganà A., Automated on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry method for the determination of ocratoxin A in wine and beer, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53: 5518–5525;

Bascaŕan V., Herńandez de Rojas A., Chouciňo P., Delgado T., Analysis of ocratoxin A in milk after direct immunoaffinity columnclean-up by high-performance liquid chromatographywith fluorescence detection, Journal of Chromatography A, 2007, 1167: 95–101;

Battilani P., Magan N., Logrico A., European research on ocratoxin A in grapes and wine, Int. J. Food Microbiol, 2006, 111: S2–S4;

Bellí N., Marin S., Duaigues A., Ramos A.J., Sanchis V.,Ocratoxin A in wines, musts and grape juices from Spain, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 84: 591–594;

Berthier J., Valla G., Moisissures – Mycotoxines et aliments: du Risque à la Prévention, Université Claude Bernard, Lyon I, 1988, 16-28;

Blesa J., Berrada H., Soriano J.M., Molto J.C., Manes J., Rapid determination of ocratoxin A in cereals and cereal products by liquid chromatography, J. Chromatogr. A., 2004, 1046 (1-2): 127-31;

Breitholtz-Emanuelsson A., Olsen M., Dahlb¨ack A., Hult K., Plasma ocratoxinA levels in three Swedish population surveys using ion-pair HPLC technique, Food Additive and Contaminants, 1991, 8: 183–192;

Breitholtz-Emanuelsson A., Olsen M., Oskarsson A., Palminger I. şi Hult K.,Ocratoxin-A in cows milk and in human-milk with corresponding human blood-samples, Journal of AOAC International, 1993, 76(4): 842–846;

Brera C., Soriano J.M., Debegnach F., Miraglia M., Exposure assessment to ocratoxin A from the consumption of Italian and Hungarian wines, Microchemical Journal, 2005, 79: 109–113;

Burdaspal P.A., Legarda T.M., Ocratoxina A en vinos, mostos y zumos de uva elaborados en España y otros países europeos, Alimentaria, 1999, 299: 107–113 (Jan–Febr);

Castella G., Larsen T.O., Cabanes J., Schmidt H., Alboresi A., Niessen L., Farber P., Geisen R., Molecular characterization of ocratoxin A producing strains of the genus Penicillium, Systematic and Applied Microbiology, 2002, 25: 74–83;

47

Cerutti G., D'amato A., Zuchetti M., Sulla presenza di ocratossina A, nitrato e nitrito nei vino, Imbottigliamento, 2000, 23: 39–43;

Codex Alimertarius Commission, Position paper on ocratoxin A, CX/FAC 99/14. Joint FAO/WHO(JECFA)Food Standards Programme, The Hague, The Netherlands, 1999, 22-26 March;

Coker R.D.,Mycotoxins and their control: constrains and opportunities. NRI Bulletin 73.Chatham , UK: Natural Resources Institute, 1997;

Coman I., Popescu O.,Micotoxineşimicotoxicoze, Editura Ceres,Bucureşti, 1985;Copetti M.V., Pereira J.L., Iamanaka B.T., Pitt J.I., and Taniwaki M.H.,

Ochratoxigenic fungi and ocratoxin A in cocoa during farm processing, International Journal of Food Microbiology, 2011, 143: 67–70;

D’Mello J.P.F., Porter J.K., MacDonald A.M.C., Placinta C.M., Fusariummycotoxins, In: D’Mello J.P.F. (Ed), Handbook of Plant and Fungal Toxicants, CRC Press, Boca Raton, 1997, pp. 28-301;

Drunday V., Pacin A., Occurrence of Ocratoxin A in coffee beans, ground roasted coffee and soluble coffee and method validation, Food Control,2013, 30 (2): 675-678;

Duarte S.C., Pena A., Lino C.M., A review on ocratoxin A occurrence and effects of processing of cereal and cereal derived food products, Food Microbiology, 2009, 27: 187- 198;

EFSA, Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a request from the commission related to ocratoxin A in food, EFSA J, 2006, 365: 1–56;

European Commission, Opinion on ocratoxin A, expressed on 17 September 1998, Scientific Committee on Food;

European Commission, Commission Directive 2002/26/CE of 13 March 2002, Official Journal of the European Communities, 2002, No. L 075 of 16/03/2002, pp. 0038–0043;

European Commission, Commission Regulation No. 123/2005 of 26 January 2005 amending Regulation 466/2001 as regards ocratoxin A, Official Journal of the European Union, 2005, L25: 3–5;

Fazekas B., Tar A.K., Zomborszki-Covács M.,Ocratoxin A contamination of cereal grains and coffee in Hungary in the year 2001, Acta Vet.Hungarica, 2002, 50: 177–188;

Galvano F., Ritieni A., Piva G., Pietri A., Mycotoxins in the human food chain. In: Duarte-Diaz D.E., The mycotoxin blue book, Nottingham University Press, Nottingham, 2005: 187–224;

Giuseppe R., Bertuzzi T., Rossi F.,Rastelli S., Mulazzi A., Capraro J., De Curtis A., Iacoviello L., Pietri A., Plasma ocratoxin A levels, food consumption, and risk biomarkers of a representative sample of men and women from the Molise region in Italy, Eur. J. Nutr., 2011 (2012), 11: 5-265;

González-Osnaya L., Soriano J.M., Moltó J.C. şi Maňes J., Simple liquid chromatography assay for analyzing ocratoxin A in bovine milk, Food Chemistry, 2008, 108: 272–276;

48

Hernández M.J., Valme García-Moreno M., Durán E., Guillén D., Barroso C.G., Validation of two analytical methods for the determination of ocratoxin A by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to fluorescence detection in musts and sweet wines from Andalusia, Analytica Chimica Acta, 2006, 566: 117–121;

Iamanaka B.T., Taniwaki M.H., Manezes H.C., Vicente E., and Fungaro M.H.P., Incidence of toxigenic fungi and ocratoxin A in dried fruits sold in Brazil, Food additives and contaminants, 2005,22, 12: 1258-1263;

IARC,Ocratoxin A. In: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, pp. 489–521, IARC Scientific Publ., 1991, No. 56. Lyon, France: IARC

JECFA, Ocratoxin A (addendum). In: Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants. Prepared by the sixty-eighth meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, June 19-28, 2008, Geneva, Switz. WHO Food Additive Series, vol. 59. Geneva, Switz.: Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), World Health Organization (WHO), 2008, 357-429, 454

Jelinek C.F., Pohland A.E., Wood G.E., Worldwide occurrence of mycotoxins in foods and feeds – an update, Assoc Off Anal Chem, 1989, 72(2): 223-230;

Kabak, B.,Ocratoxin A in cereal-derived products in Turkey: occurrence and exposure assessment, Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(2): 348-352;

Kuiper-Goodman, T., Risk assessment of ocratoxin A: an update, Food Additives and Contaminants, 1996, 13: 53–57;

Lombaert G.A., Pellaers P., Chettiar M., Lavalee D., Scott P.M., and Lau B.P.Y., Survey of Canadian retail coffees for ocratoxin A, Food Additivesand Contaminants, 2002, 19, 9: 869-877;

López de Cerain A., González-Peñas E., Jiménez A.M., Bello J., Contribution to the study of ocratoxin A in Spanish wines, Food Additives and Contaminants, 2002, 19: 1058–1064;

Maaroufi K., Achour A., Betbeder A.M. el al., Foodstuffs and human blood contamination by the mycotoxin ocratoxin A: correlation with chronic interstitial nephropathy in Tunisia, ArchToxicol, 1995, 69: 552-558;

MacDonald S., Wilson P., Barnes K., Damant A., Massey R., Mortby E., Shepherd M.J., Ocratoxin A in dried vine fruit: method development and survey, Food Additives and Contaminants, 1999, 16: 253-260;

Magnoli C.E., Astoreca A.L., Chiacchiera A.M., Dalcero A.M., Occurrence of ocratoxin A and ochratoxigenicmycroflora in corn and corn based foods and feeds in some South American countries, Mycopathologia, 2007, 163: 249-260;

Majerus P., Bresch H., Otteneder H.,Ocratoxin A in wines, fruit juices and seasonings, Archiv für Lebensmittelhygiene, 2000, 51: 95–97;

Majerus P., Otteneder H., Nachweis und Vorkommen von Ocratoxin A in Wein und Traubensaft, Deutsche Lebesnmittel-Rundschau, 1996, 92: 338–390;

49

Mateo R., Medina A., Mateo F., Valle-Algarra F.M., Gimeno-Adelantado J.V., Jiménez M.,Optimization of the methodology for the determination of ocratoxin A in wine and study of its occurrence in wines consumed in Spain, Proceedings of the 29th World Congress of the Vine and Wine (CD Edition), Logroño (Spain), 2006;

Micco C., Miraglia M., Brera C., Corneli S., Ambruzzi A., Evaluation of ocratoxin A level in human milk in Italy, Food Addit. Contam., 1995, 12: 351–354;

Miller J.D., Significance of grain mycotoxins for health and nutrition. 126-135. In: Fungi and Mycotoxins in Stored Products., 1991, Champ B R, Highley E, Hocking A D, Pitt J I (eds). ACIAR Proceedings No. 36. Canberra, Australia;

Otteneder H., Majerus P., Occurrence of ocratoxin A (OTA) in wines: influence of the type of wine and its geographical origin, Food Additivesand Contaminants, 2000, 17: 793±798;

Palli D., Miraglia M., Saieva C., Masala G., Cava E., Colatosti M., Corsi A.M., Russo A., Brera C., Serum levels of ocratoxin A in healthy adults in Tuscany: correlation with individual characteristics and between repeat measurements, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 1999, 8: 265–269;

Pietri A., Bertuzzi T., Pallaroni L., Piva G., Occurrence of ocratoxin A in Italian wines, Food Additives and Contaminants, 2001, 18: 647–654;

Pitt J.I., What are mycotoxins? Australian Mycotoxin Newsletter, 1996, 7, 4: 1-14;

Pohland A.E., Nesheim S., Friedman L.,Ocratoxin A. A review, Pure & Appl. Chem., 1992, 64 (7): 1029-1046;

Scott P.M., Biomarkers of human exposure to ocratoxin A, Food Additives and Contaminants, 2005, 22: 99–107;

Skaug M.A., Analysis of Norwegian milk and infant formulas for ocratoxin A, Food Additives and Contaminants, 1999, 16(2): 75–78;

Solfrizzo M., Avantaggiato G., Viscont A., Use of various clean-up procedures for the analysis of ocratoxinA in cereals, J. Cromatogr. A., 1998, 815: 67-73;

Studer-Rohr I., Schlatter J., Dietrich D.R., Kinetic parameters and intraindividual fluctuations of ocratoxin A plasma levels in humans, Arch Toxicol, 2000, 74: 499-510;

Thirumala-Devi K., Mayo M.A., Reddy G., Reddy S.V., Delfosse P., Reddy D.V.R., Production of polyclonal antibodies against ocratoxin A and its detection in chilies by ELISA, Journal of Agriculture and FoodChemistry, 2000, 48: 5079–5082;

Thuvander A., Paulsen J.E., Axberg K., Johansson N., Vidnes A., Enghardt-Barbieri H., Tressou J., Leblanc J.-Ch., Feinberg M., Bertail P., Statistical methodology to evaluate food exposure toa contaminant and influence of sanitary limits: application toocratoxin A,Regul. Toxicol.Pharmacol., 2004, 40: 252–263;

50

Turconi G., Guarcello M., Livieri C., Comizzoli S., Maccarini L., Castellazzi A.N., Pietri A., Piva G., Roggi C., Evaluation of xenobiotics in human milk and ingestion by the newborn- an epidemiological survey in Lombardy (Northern Italy), European Journal of Nutrition, 2004, 43(4):191-197;

Valenta H. şi Goll M., Determination of ocratoxin-A in regional samples of cow milk in German, Food Additives and Contaminants, 1996, 13: 669–676;

Van der Stegen G., Jorrisen U., Pittet A., Saccon M., Steiner W., Vincenzi M., Winkler M., Zapp J., Schlatter C., Screening of European coffee final products for occurrence of ocratoxin A (OTA), Food Addit. And Contam., 1997, 14: 211-216;

Visconti A., Pascale M., Centonze G., Determination of ocratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1999, 864, 1: 89-101;

Zaied C., Abid S., Zorgui L., Bouaziz C., Chouchane S., Jomaa M., Bacha H., Natural occurrence of ocratoxin A in Tunisian cereals, Food Control, 2009, 20: 218-222;

Zimmerli B., Dick R.,Ocratoxin A in table wine and grape-juice: Occurrence and risk assessment, Food Addit Contam, 1996, 13: 655–668;

Zinedine A, Brera C., Elakhdari S., Catano C., Debegnach F., Angelini S., De Santis B., Faid M., Benlemlih M., Minardi V., Miraglia M., Natural occurrence of mycotoxins in cereals and spices commercialized in Morocco, Food Control, 2006, 17: 868–874

51

Anexa 1 – Avizul de etica de la Comisia de etică a cercetării din cadrul UMF „Grigore T.Popa” Iaşidin 24.01.2012

52

Anexa 2 – Lucrările publicate în timpul studiilor de doctorat (din tema tezei de doctorat)

In extenso

1. Vartolomei A., Vlase L., Cuciureanu M., Cuciureanu R., Popa D.S., Determination of ocratoxin A in food by LC-MS/MS, Revista Farmacia, 2014, 1 (in press);

2. Zlavog Vartolomei A., Cuciureanu M., Schiriac E., Popa (Morariu) I., Diaconu C., Cuciureanu R., Estimation of ocratoxin A in the human blood of romanian population, Revista Medico-Chirurgicala a Societatii de Medici si Naturalisti Iasi, 2013, 117 (4) (in press)-;

Date post:	02-Feb-2017
Category:	Documents
Upload:	donhan
View:	251 times
Download:	0 times

anca vartolomei (zlavog vartolomei)

Documents