Date post: | 30-Oct-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | otilia-ottie |
View: | 148 times |
Download: | 2 times |
of 47
1
Proteine, Peptide i Aminoacizi
Proteinele reprezint dup ap constituenii cei mai importani ai organismelor vegetale i animale. n aceste organisme, proteinele ndeplinesc roluri multiple i variate: intr n structura celulelor din diverse esuturi i organe, sunt constitueni principali ai enzimelor, au rol n aprare, sunt hormoni ce intervin n reglarea proceselor metabolice.
Indiferent de originea lor, de specia de la care provin, proteinele sunt constituite din 20
aminoacizi deosebii structural unii de alii, ceea ce confer proteinelor o diversitate i o complexitate extraordinar. Deoarece numeroase proprieti ale proteinelor se datoresc faptului c sunt constituite din aminoacizi, este necesar n prealabil prezentarea aminoacizilor care intr n constituia lor, precum i unele proprieti ale acestora.
n afara faptului c reprezint unitile funcionale ale lanurilor polipeptidice i proteice,
L--aminoacizii i derivaii lor particip la desfurarea unor funcii biologice diverse, cum ar fi transmiterea impulsului nervos, biosinteza porfirinelor, purinelor, pirimidinelor, ureei, etc.
Polimeri mici ai aminoacizilor numii peptide joac roluri importante n sistemul neuro-endocrin, acionnd ca hormoni, regulatori ai secreiei hormonale, neuromodulatori, neurotransmitori. n
timp ce proteinele conin numai L--aminoacizi, microorganismele pot sintetiza peptide care
conin att L-- ct i D--aminoacizi. Unele dintre aceste polipeptide au o valoare terapeutic acionnd ca antibiotice (bacitracina, gramicidina S) sau ca ageni antitumorali (bleomicin). Alte peptide microbiene pot fi toxice. De exemplu microcistina i nodularina, peptide secretate de cianobacterii, sunt letale n doze mari, n timp ce n doze mici induc apariia unor tumori hepatice. Oamenii i organismele superioare sunt incapabile s sintetizeze n cantiti suficiente pentru
funcionarea normal a organismului 10 din cei 20 L--aminoacizi, astfel nct este important ca hrana s conin cantiti suficiente din aceti aminoacizi eseniali.
1. Aminoacizii
Aminoacizii reprezint o clas de compui difuncionali cu o semnificaie biologic deosebit,
datorit faptului c ei sunt unitile de baz care intr n alctuirea proteinelor. Deoarece cele dou
grupri funcionale dintr-un aminoacid sunt una cu caracter acid i cealalt cu caracter bazic, aceti
compui sunt amfoteri, iar molecula lor exit preponderent sub form desare intern sau amfion
(zwitterion). De exemplu glicina, cel mai simplu aminoacid se prezint mai curnd ca afion dect ca
specie neionizat.
H3NCH
2COO
+ -H
2NCH
2COOH
amf ion (zwitterion) f orma neionizata
Aminoacizii i datoreaz importana faptului c au capacitatea de a forma o legtur amidic ntre
dou molecule de aminoacid. O astfel de legtur se numete legtur peptidic, iar compuii rezultai
se numesc peptide.
2
glicil-glicina
dipeptida
H3NCH
2C
+ -O
NHCH2COO
legatura peptidica
n funcie de numrul aminoacizilor componeni putem ntlni di-, tri-, tetra-, oligopeptide. Pe
msur ce numrul aminoacizilor componeni crete, se obin polimeri care alctuiesc clasa
polipeptide. Proteinele sunt polipeptide a cror secven de aminoacizi este determinat genetic.
1.1. Aminoacizi care intr n constituia proteinelor (aminoacizi proteinogeni)
Prin hidroliza acid, bazic sau enzimatic a proteinelor, rezult -aminoacizi, care reprezint
unitile chimice de baz ale macomoleculelor proteice.
C
COOH
NH2 H
R
L--aminoacid
(conf iguratie S)
f ormula perspectiv ica proiectie Fischer
HNH2
R
COOH
Din cei peste 300 aminoacizi naturali, numai 20 sunt cei care intr n alctuirea proteinelor,
acest lucru fiind determinat prin codul genetic, care este universal pentru toate vieuitoarele. Structura
celor 20 aminoacizi este prezentat n Tabelul 1, mpreun cu abrevierile acceptate n mod
convenional (de trei litere i de o liter). Ambele tipuri de abrevieri pot fi utilizate pentru a reprezenta
succesiunea aminoacizilor n peptide i proteine.
3
Tabelul 1. -Aminoacizi naturali care intr n alctuirea proteinelor. Structurile prezentate sunt cele care predomin la pH-ul fiziologic (pH = 7,3 pentru om).
Nume
Simbol
Formul structural
pKa1
(-COOH)
pKa2
(-NH2)
pKa3
(R)
Abundena
medie n
structura
proteinelor
Aminoacizi cu lan alifatic monoamino monocarboxilici
Glicin
Alanin
Valin*
Leucin*
Izoleucin*
Gly
(G)
Ala
(A)
Val
(V)
Leu
(L)
Ile
(I)
-
+
H CH
NH3
COO
-
+
CH3
CH
NH3
COO
-
+
CH
NH3
COO
CH3
CH3CH
-
+
CH
NH3
COOCH3CHCH
2
CH3
-
+
CH
NH3
COOCH3CH
2CH
CH3
2,4
2,4
2,2
2,3
2,3
9,8
9,9
9,7
9,7
9,8
7,5%
9.0%
6.9%
7.5%
4.6%
Aminoacizi cu grupri hidroxil (OH)
Serin
Treonin*
Tirozin*
Ser
(S)
Thr
(T)
-
+
HOCH2
CH
NH3
COO
-
+
CH3CH C
H
NH3
COO
OH
Vezi mai jos
2,2
9,2
9,2
9,1
13
13
7.1%
6.0%
4
Aminoacizi cu sulf
Cistein
Metionin*
Cys
(C)
Met
(M)
-
+
HSCH2
CH
NH3
COO
-
+
CH3SCH
2CH
2CH
NH3
COO
1,9
2,1
10,8
9,3
8,3
2.8%
1.7%
Aminoacizi monoaminodicarboxilici i amidele lor
Aspartat acid aspartic
Glutamat acid glutamic
Asparagin
Glutamin
Asp
(D)
Glu
(E)
Asn
(N)
Gln
(Q)
-
+
OOCCH2 CH-COO
NH3
-
-
+
OOCCH2CH
2 CH-COO
NH3
-
-
+
H2NCCH
2 CH-COO
NH3
O
-
+
H2NCCH
2CH
2 CH-COO
NH3
O
2,0
2,1
2,1
2,2
9,9
9,5
8,8
9,1
3,9
4,1
5.5%
6.2%
4.4%
3.9%
Aminoacizi cu grupri bazice
Lizin*
Arginin*
Histidin*
Lys
(K)
Arg
(R)
His
(H)
-
+
CH-COO
NH3
+H
3NCH
2CH
2CH
2CH
2
-
+
CH-COO
NH3
NH2
+
H2NCNHCH
2CH
2CH
2
-
+
CH
NH3
COO
NHN
CH2
2,2
1,8
1,8
9,2
9,0
9,3
10,8
12,5
6,0
7.0%
4.7%
2,1
5
Aminoacizi cu resturi fenil
Fenilalanin*
Tirozin
Phe
(F)
Tyr
(Y)
-
+
CH-COO
NH3
CH2
-
+
CH-COO
NH3
CH2
OH
2,2
2,2
9,2
9,1
10,1
3,5%
3,5%
Aminoacizi heterociclici
Histidin*
Prolin
Triptofan*
His
Pro
(P)
Trp
(W)
Vezi mai sus
N
H H
CO
O
+
-
-
+
CH
NH3
COO
NH
CH2
2,0
2,4
10,6
9,4
4,6
1,1
*Aminoacizi eseniali
Aminoacizii naturali care intr n compoziia poteinelor difer doar prin substituentul R ataat la
carbonul . Marea varietate a acestor substitueni laterali este ceea ce confer proteinelor diversitatea
lor structural i n consecin marea lor diversitate funcional. Codul genetic specific 20 L--
aminoacizi care intr n constituia proteinelor. Unele proteine conin i ali aminoacizi care apar
datorit modificrii biochimice a unui aminoacid deja prezent n protein. Astfel de transformri includ
conversia unei peptidil-lizine sau peptidil proline n peptidil-hidroxilizin i respectiv peptidil-
hidroxiprolin, metilarea, formilarea, acetilarea, fosforilrea, etc. a diverselor resturi aminoacil. Astfel
de modificri mresc gradul de complexitate al proteinelor producnd modificri ale solubilitii,
stabilitii, ca i asupra interaciilor cu alte proteine.
Toi cei 20 de aminoacizi au o serie de caracteristici stucturale comune:
- au o grupare amino n poziie , cu excepia prolinei, care conine o grupare imino, membr a
unui ciclu pirolidonic;
6
- cu o singur excepie, glicina, toi aminoacizii au atomul de carbon chiral (centru de
chiralitate), avnd deci activitate optic;
- atomul de carbon are configuraie S (cu excepia cisteinei, explicai de ce!); n proiecie
Fischer gruparea NH2 este orientat spre stnga, deci aminoacizii naturali sunt L--aminoacizi;
- prezena simultan a celor dou grupri, carboxilic si amino, nvecinate spial, face posibil
formarea legturii peptidice, legtur cu mare importan biologic.
Cu excepia glicinei, atomul de carbon din poziia este chiral, deci unii aminoacizi sunt dextrogiri iar
alii sunt levogiri. Toi au aceeai configuraie cu L-glicerinaldehida, deci fac parte din seria L.
Exist un numr de -aminoacizi liberi cu roluri importante n procesele metabolice. De
exmplu ornitina, citrulina i argininosuccinatul particip la sinteza ureei; tirozina ia parte la formarea
hormonilor tiroidieni; glutamatul este implicat n biosinteza unor substane neurotransmitoare. Exist
i D-aminoacizi care se ntlnesc n natur: D-serina i D-aspartatul se gsesc n esutul cerebral; D-
alanina i D-glutamatul se gsesc n pereii celulari ai bacteriilor gram-negative, etc.
1.2. Aminoacizi care nu intr n constituia proteinelor
n afara celor 20 aminoacizi care intr n structura proteinelor, n natur exist o serie de aminoacizi
care sunt constitueni ai altor biomolecule sau produi intermediari n diferite procese biochimice.
Tabelul 2. Aminoacizi neproteinogenici
Formul
Denumire
Rol biologic
H2N-CH2-CH2-COOH
H2N-(CH2)3-COOH
H3C-NH-CH2-COOH
CH2
COO
N(CH3)
3
+
-
H2N-CH2-CH2-SO3H
-alanin
Acid -aminobutiric
(GABA)
sarcozin
betain
taurin
component a dipeptidelor carnozin i anserin a acidului pantotenic i coenzimei A
transmiterea impulsului nervos; agent de
blocare a sinapselor
utilizat n tratamentu cancerului
rol lipolitic
component a acizilor biliari
7
CH
NH2
COOHH2N-(CH
2)
3
CH
NH2
COOHHN-(CH2)
3NH
2C
O
ornitin
citrulin
intermediar al cilului ureogenetic
intermediar al cilului ureogenetic
1.3. Proprietile aminoacizilor
Gruprile COOH i cea NH2 pot exista att n forma neutr, cat i n form ionizat.
R-COOH R-COO- + H+
R-NH3+ R-NH2 + H
+
Aminoacizii pot fi ncrcai pozitiv, negativ, sau pot avea sarcina net zero. Dei ambele grupri R-
COOH i R-NH3+ sunt slab acide, R-COOH este mult mai tare dect R-NH3
+. La pH-ul fiziologic (pH
= 7,3-7,4) gruprile carboxil se gsesc preponderent n stare ionizat R-COO-, iar gruprile amino
predominant ca R-NH3+.
Moleculele care conin un numr egal de grupri ionizabile cu sarcini opuse se numesc amfioni sau
zwitterioni.
+NH
2
OH
R H
O
H3N
O
R H
O amf ion
(zwitterion)
A B
Aminoacizii din fluidele biologice (snge, majoritatea esuturilor) trebuiesc scrii ca amfioni. Structura
B nu poate exista ntr-o soluie apoas deoarece la orice pH suficient de mic pentru a protona gruparea
carboxil, gruparea amino va fi i ea protonat. Analog, al un pH suficient de mare pentru ca gruparea
amino neprotonat s predomine, gruparea caroxil va dona i ea un proton, transformndu-se n
carboxilat, -COO-. Formula B se folosete ns de multe ori atunci cnd reaciile nu implic echilibre
acido-bazice. Mai jos este prezentat efectul pH-ului asupra gradului de ncrcare electric a acidului
aspartic.
8
NH3
OH
O
OH
O
NH3
O
O
OH
O
NH3
O
O
O
O
NH2
O
O
O
O
+ +
-
+
-
-
-
-
H+ H+ H+
pKa1=2,09
(-COOH)
pKa2=3,86
(-COOH)
pKa3=9,82
(-NH3+)
Tria aminoacizilor este exprimat de indicele pKa (Tabelul 1). Gruparea imidazol din histidin i
gruparea guanidino din arginin exist sub forma unor hibrizi de rezonan cu sarcina pozitiv
distribuit ntre cei doi atomi de azot (histidin) sau cei trei atomi de azot (arginin).
NN
R
H
H NN
R
H
H
+ +
RNH-C-NH2
+NH
2
RNH=C-NH2
+RNH-C=NH
2
+NH
2NH
2
O specie molecular care are un numr egal de sarcini pozitive i negative este neutr din punct de
vedere electric (form izoelectric). Valoarea pH-ului la care moleculele de aminoacid sunt au suma de
sarcini negative egal cu suma sarcinilor pozitive este cunoscut ca pH-ul izoelectric (pI) al
aminoacidului respectiv. La pH-ul izoelectric, sarcina net a unui aminoacid este zero. n cazul
unui aminoacid monoamino monocarboxilic,
pI =
pKa1 + pKa2
2
De exemplu, pI pentru alanin este:
= 6,02pI =
2,35 + 9,69
2
n mediu puternic
bazic (pH > 11) sarcina net = - 2
n mediu puternic
acid (pH < 1) sarcina net = +1
pH 3,
sarcina net = 0
pH 6-8,
sarcina net = - 1
9
Pentru acizii polifuncionali, pI este tot o medie ntre pKa-urile aflate de o parte i de alta a pI-ului. De
exemplu, pI pentru acidul aspartic este:
pI =
pKa1 + pKa2
2= 3,02
2,09 + 3,96
2=
iar pentru lizin,
pI =
pKa2 + pKa3
2= 10
9,2 + 10,8
2=
Calcule similare se folosesc i pentru acizii poliprotici (de exemplu proteinele), indiferent de numrul
gruprilor disociabile prezente.
Valoarea pKa a unei grupri disociabile este un parametru care depinde de natura mediului care
nconjoar gruparea respectiv. Vecintatea unei grupri disociabile poate influena pKa-ul gruprii.
Valorile pKa ale gruprilor R (prezentate in Tabelul 1) reprezint valori determinate n soluii apoase
pure ale aminoacizilor respectivi. Aceste valori ne dau doar o idee asupra valorilor pKa ale acelorai
aminoacizi cnd sunt prezeni ntr-o protein. Un mediu polar favorizeaz o form ncrcat electric
(R-COO- sau R-NH3
+), pe cnd un mediu nepolar favorizeaz apariia formelor nencrcate electric (R-
COOH i R-NH2). Aadar, un mediu nepolar mrete valoarea pKa gruprii carboxil (fcnd-o un acid
mai slab) dar n acelai timp scade pKa-ul unei grupri amino (fcnd-o un acid mai tare). Existena
unor grupri adiacente ncrcate electric poate s accentueze sau s diminueze efectele solventului. Prin
urmare, pKa-ul unei grupri funcionale este dependent de poziia sa n molecula de protein. n funcie
de vecintile unei grupri, pKa-ul su se poate schimba chiar cu cteva uniti de pH. Diferene de 2-3
uniti de pH fa de valorile pKa prezentate n Tabelul 1. sunt frecvente n special n situsurile active
ale enzimelor. Ca un exemplu extrem, un reziduu de acid aspartic ngropat n structura unei enzime
numit tioredoxin are pKa > 9, observndu-se un salt mai mare de 6 uniti de pH.
Solubilitatea i punctul de topire al aminoacizilor: dovad a caracterului lor ionic.
Prezena gruprilor ncrcate electric in structura lor face ca aminoacizii s fie solubili n solveni polari
(ap, etanol), dar insolubili n solveni nepolari (benzen, hexan, eter). Aminoacizii sunt substane
solide, albe, cristalizate. Anumii aminoacizi sunt mai greu solubili n ap (tirozina, cisteina). Datorit
acestei insolubiliti, cisteina n anumite condiii formeaz o calculoz renal cisteinuria.
Aminoacizii nu absorb n domeniul vizibil, aa nct sunt substane incolore. Tirozina, fenilalanina i
mai ales triptofanul prezint un maxim de absorbie n UV (250-290 nm), prin urmare prezena
10
triptofanului n structura unei proteine i confer acesteia proprietatea de a absorbi lumina ultraviolet
n jurul valorii de 280 nm.
Gruprile -R sunt importante pentru proprietile unui aminoacid. De multe ori glicina,
cel mai mic aminoacid (R = H), este gsit n locurile unde lanul proteic se ndoaie puternic, deoarece
ea poate ptrunde n locurile inaccesibile celorlali aminoacizi. Gruprile R hidrofobe din fenilalanin,
tirozin i triptofan se gsesc n special spre interiorul proteinelor citosolice. Gruprile R ncrcate
electric din aminoacizii cu caracter bazic sau acid stabilizeaz conformaia unei molecule proteice prin
intermediul legturilor ionice. Astfel de grupri funcioneaz ca tafete de sarcin n timpul catalizei
enzimatice. Histidina, de exemplu, joac un rol unic n cataliza enzimatic, datorit pKa-ului protonului
imidazolic care i permite s funcioneze la pH-ul fiziologic att ca acid ct i ca baz. Gruprile OH
din serin sau SH din cistein sunt buni ageni nucleofili i pot funciona ca atare n cataliza
enzimatic. n acelai timp, gruparea OH (alcool secundar) din treonin, dei un bun nucleofil, nu se
bucur de aceeai importan n cataliza enzimatic. Gruprile OH din serin, treonin i tirozin pot
participa la reglarea activitii unor enzime a cror activitate enzimatic depinde de gradul de
fosforilare a acestor grupri.
Gruprile funcionale determin reactivitatea chimic a aminoacizilor. Gruprile
funcionale ale aminoacizilor prezint majoritatea reaciilor caracteristice gruprii respective. Astfel,
gruparea carboxil din aminoacizi se poate esterifica, poate forma amide, anhidride, cloruri acide, azide;
gruprile amino se pot acila, gruprile OH i SH se pot oxida, esterifica, etc.
Aminoacizii dau o reacie de culoare cu ninhidrina, reacie des utilizat pentru detectarea i
cuantificarea aminoacizilor. Ninhidrina formeaz un produs purpuriu cu gruparea -amino din -
aminoacizi i un produs galben cu gruparea imino din prolin i hidroxiprolin. n urma reaciei cu
ninhidrina, numai azotul gruprii amino apare n produsul final.
11
OH
OH
O
O
O
O
O
NH2
O
O
N CH
R
O
O
..
O
O
NH2
O
O
N CHR
..
OH
HO
O
N CHR
O
+ RCH
O
O
O
O
OO
O
N
H
O
OO
O
N
+ H2O
+ RCHCOO-
C ....-
+ H2O
..
..-
+ CO2
-
+ H2O
produs colorat
ninhidrina
aminoacid
+ HO-
+ HO-
Reacii ale gruprii carboxil cu importan biologic
Formarea de amide constituie un proces de mare importan biologic, avnd loc n mod
continuu n organism.
NH3
OO
OH
O
NH3
OO
NH2
O
NH3
O
O
OH
O
NH3
O
O
NH2
O
+ +
++
NH3 H2O
NH3 H2O
Glu
Asp
Gln
Asn
- -
- -
12
-Aminoacizii se pot decarboxila, formnd aminele respective. Reaciile de decarboxilare a
aminoacizilor sunt catalizate de enzime numite aminoacid decarboxilaze care aparin clasei liazelor i
folosesc drept coenzim piridoxal fosfatul (derivat de la vitamina B6).
NH
3
O
R
O R NH2
+
aminoacid decarboxilaza+ CO
2
-
Multe amine produse n organism prin decarboxilarea aminoacizilor au aciuni remarcabile, sau sunt
intermediari n diverse reacii metabolice.
Tabelul 3. Exemple de amine biogene formate prin decarboxilarea aminoacizilor n organism
Aminoacidul
de origine
Denumirea
aminei
Formul Rol biologic
Glu
Cys
Ser
Lys
Tyr
His
acid -aminoglutaric
cisteamin
etanolamin
cadaverin
tiramin
histamin
HOOC-(CH2)3-NH2
HS-CH2-CH2-NH2
HO-CH2-CH2-NH2
H2N-(CH2)5-NH2
HO-C6H4-(CH2)2-NH2
NH
N
CH2-CH
2-NH
2
mediator chimic; transmiterea
impulsului nervos
component al coenzimei A
component al fosfolipidelor
diamin toxic
hipertensiv, contracia uterului
mediator chimic; transmiterea
impulsului nervos
Reacii ale gruprii amino
Alchilarea aminoacizilor poate avea loc in vitro n prezena iodurii sau sulfatului de metil, sau
poate avea loc in vivo sub aciunea unei substane specializate pentru aceast reacie: metionina activat
sau S-adenozil-metionina (SAM).
13
CH2
COO
NH2
CH2
COO
N(CH3)3+
Gly betaina
SAM- -
Betaina se administreaz n cazurile de insuficien hepatic.
Dezaminarea este o reacie prin care aminoacizii se transform n cetoacizi, intermediari
metabolici de mare importan.
-CH
COO
NH2
Rdeaminaza
-R
-C
O
COO
-aminoacid -cetoacid
NAD+ NADH + H+
Cea mai important reacie a aminoacizilor o constituie formarea legturii peptidice (legturile
ncercuite).
+
NH
NH
O
OSH
O
O
NH3
alanil-cisteinil-glicina
1.4. Aminoacizi eseniali
Biosinteza proteinelor specifice unui organism este direct corelat cu aportul de aminoacizi
exogeni provenii din alimentaie. Sinteza tuturor celor 20 -aminoacizi ce intr n constituia
proteinelor nu poate fi fcut n totalitate dect de plante i microorganisme. n cursul evoluiei,
organismele umane i animale au pierdut capacitatea de a sintetiza 8 aminoacizi, pe care nu i pot
obine dect prin aport exogen din proteinele de natur vegetal sau microbian.
Aminoacizii care sunt absolut necesari pentru creterea i dezvoltarea organismelor umane i
animale i care sunt furnizai prin alimentaie se numesc aminoacizi eseniali (indispensabili, vezi
Tabelul 1). Lipsa acestor aminoacizi din alimentaie provoac tulburri foarte grave.
Doi aminoacizi, histidina i arginina, sunt indispensabili organismelor n cretere, sinteza lor
endogen nefiind suficient pentru a acoperi nevoile mai mari din periodele de cretere (aminoacizi
semieseniali). Ceilali aminoacizi pot fi sintetizai n organism printr-o serie de reacii care au ca
14
puncte de plecare diveri metabolii; ei sunt aminoacizi neeseniali (dispensabili) i prin urmare pot
lipsi din hran. Carena n anumii aminoacizi prin aport alimentar insuficient se manifest printr-o
simptomatologie complex, ca de exemplu:
carena n lizin: determin ncetinirea creterii;
carena n triptofan: determin tulburri vasculare i modificarea tabloului leucocitar;
carena n tirozin: determin atrofierea tiroidei i hipofizei;
carena n tioaminoacizi: determin atrofierea testiculelor, degradarea ovarelor i sterilitate.
2. Peptide
2.1. Clasificarea i nomenclatura peptidelor.
Peptidele sunt substane naturale sau sintetice constituite dintr-un numr restrns de aminoacizi
care se obin formal prin condensarea intermolecular a unei grupri carboxil de la un aminoacid cu
gruparea amino de la aminoacidul urmtor. Peptidele alctuite din 2-10 aminoacizi se definesc ca
oligopeptide (di-, tri-, tetra-, etc.). Peptidele alctuite din 10-50 aminoacizi se definesc ca polipeptide.
Ca origine, peptidele prezente n organismul uman pot proveni fie din aminoacizi, prin biosintez, fie
ca produi intermediari n procesele biochimice de degradare i biosintez a proteinelor. Cu excepia
peptidelor ciclice, o polipeptid conine o grupare NH2 liber (captul N-terminal) i o grupare
carboxil liber (captul C-terminal).
NH2
NN COOH
R
RO
O RH
Hn
aminoacid N-terminal aminoacid C-terminal
Prin convenie, structura unei peptide este prezentat cu aminoacidul N-terminal n stnga i cu
aminoacidul C-terminal n dreapta. Pentru a denumi o peptid se specific n ordinea de succesiune -
ncepnd cu aminoacidul N-terminal numele radicalilor aminoacizilor, iar la sfrit se adaug numele
15
ntreg al aminoacidului C-terminal. Deoarece denumirile devin complicate, de multe ori se prefer
abrevierile prezentate n Tabelul 1.
H3NCH
2C NHCHCOO
CH3
O+ -
H3NCH
2C NHCHC
CH2C
6H
5
O+
NHCH2COO
-O
glicilalanina
Gly -Ala, sau GA
H3NCH
2C NHCHC
CH2OH
O+
NHCHC-
O
NHCHCOO
CH2C
6H
5CH
2SH
O
glicilserilf enilalanilcisteina
Gly -Ser-Phe-Cy s, sau GSFC
Exerciiu: denumii tripeptida a
Dac se utilizeaz codul de abreviere cu trei litere (Tabelul 1), aminoacizii se pot separa prin cratime;
dac se utilizeaz codul de o liter, cratimele se omit. Cnd este cunoscut doar identitatea
aminoacizilor fr a fi cunoscut i ordinea lor, aminoacizii se separ prin virgule. n pentapeptida
reprezentat mai jos, aminoacidul N-terminal este valina, iar histidina este aminoacidul C-terminal.
Aminoacizii sunt numerotai ncepnd cu aminoacidul N-terminal. Astfel, restul de glutamat este Glu 4,
deoarece este al patrulea aminoacid de la captul N-terminal.
Glu, Cys, His, Val, Ala 1Val-2Cys-3Ala-4Glu-5His
2.2. Structura legturii peptidice
Datorit delocalizrilor electronice, legtura peptidic are aproximativ 40% caracter de legtur
dubl. Atomii de carbon din doi aminoacizi adiaceni se gsesc n poziie trans unul fa de cellalt
datorit mpiedicrilor sterice care determin stabilitatea configuraiei trans n detrimentul configuraiei
cis.
Pentapeptida conine aminoacizii indicai,
dar ordinea lor nu este cunoscut Pentapeptida conine aminoacizii
n ordinea indicat
a
16
N
R
R
H
O
..N
R
R
H
O
+
-
Din cauza caracterului parial de dubl legtur, rotaia liber in jurul legturii peptidice este
mpiedicat. Atomii de carbon i azot care aparin legturii peptidice, precum i ceilali doi atomi de
care acetia sunt legai direct formeaz un plan rigid. Aceast coplanaritate local influeneaz modul
n care un lan polipeptidic se poate plia, cu implicaii directe asupra structurii tridimensionale a
polipeptidelor i proteinelor.
N
R
OH
NN
R
R
H
OH
O
NN
R
R
H
OH
O
NN
R
R
H
OH
O
Singurul tip de legtur covalent care mai apare n structura unei peptide n afara legturii peptidice
este legtura disulfidic. Aceasta poate lua natere ntre dou resturi de cistein.
2 HSCH2CHCO
NH3+
-O
OCCHCH2S SCH
2CHCO
O O--
NH3
NH3+ +
Disulfurile, R-S-S-R se formea n urma oxidrii slabe a tiolilor, iar legtura disulfidic poate fi uor
redus pentru a regenera tiolii.
2R SH S S RR
configuraie trans
oxidare slab
cistein cistin
reducere
oxidare
Figura 1. Fragment dintr-un lan polipeptidic. Planul definit de fiecare legtur peptidic
este reprezentat ca un patrulater haurat. Gruprile R legate de C- alterneaz de o parte i de alta a scheletului polipeptidic
17
Cnd o astfel de legtur apare ntre dou resturi de cistein, se poate forma o bucl, aa cum se
formeaz de exemplu n hormonul hipofizar oxitocin.
S S
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2
Dac resturile de cistein se afl n lanuri diferite, legturile disulfidice fac lagtura ntre cele dou
lanuri, ca n cazul insulinei.
Gly -Ile-Val-Glu-Gln-Cy s-Cy s-Thr-Ser-Ile-Cy s-Ser-Leu-Ty r-Gln-Leu-Glu-Asn-Ty r-Cy s-Asn
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cy s-Gly -Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Ty r-Leu-Val-Cy s-Gly -Glu-Arg-Gly -Phe-Phe-Ty r-Thr-Pro-Ly s-Ala
S
S
S
S
S S
Insulina este un hormon secretat de pancreas care controleaz nivelul glucozei din snge prin reglarea
metabolismului glucozei. Insulina este o polipeptid dimer alctuit dintr-un lan mai scurt ( lanul A,
21 aminoacizi) i unul mai lung (lanul B, 30 aminoacizi). n structura sa ntlnim att puni disulfidice
intracatenare, ct i puni disulfidice intercatenare.
Legtura peptidic este nencrcat electric indiferent de pH. Peptidele sunt ins ncrcate
electric la pH-ul fiziologic datorit gruprii amino libre de la captul N-terminal i datorit gruprii
carboxil libere de la captul C-terminal, ca i datorit eventualelor resturi de aminoacid cu grupri
bazice sau acide. Prin urmare, polipeptidele sunt polielectrolii. Ca i n cazul aminoaciziilor, pKa-urile
gruprilor ionizabile depind mult de natura mediului care le nconjoar. Peptidele sunt i ele
caracterizate de pI, (pH-ul izoelectric, pH-ul la care suma sarcinilor pozitive este egal cu suma
sarcinilor negative). n Tabelul 34 sunt prezentai parametrii ctorva peptide simple n soluie apoas.
Tabel 4. Valorile pKa pentru cteva peptide sintetice
Peptida pKa1
COOH
pKa2 +NH3
pI
Gly-Gly
Gly-Ala
Ala-Gly
Gly-Gly-Gly
Ala-Ala-Ala-Ala
3.14
3.15
3.17
3.23
3.42
8.25
8.23
8.18
8.09
7.94
5.70
5.69
5.68
5.66
5.68
oxitocin
lan A:
lan B:
legtur intracatenar
legturi intercatenare
18
2.3. Oligopeptide cu rol biologic.
n organismul uman au fost identificate i caracterizate peptide care ndeplinesc importante
funcii biochimice. Principalele dipeptide naturale sunt carnozina i anserina, cu structuri
asemntoare. Ambele dipeptide sunt considerate atipice nefiind constituite numai din -aminoacizi.
Ele sunt componente specifice esutului muscular, carnozina fiind prezent n muchiul mamiferelor,
iar anserina n muchiul pectoral al psrilor. Ambele iau natere prin condensarea histidinei cu -
alanina, diferena constnd n faptul c anserina conine o grupare metil n ciclul imidazolic.
N
N
CH3
NH
H3N
O
O
O
N
N
H
NH
H3N
O
O
O+ +
- -
Ambele dipeptide au rolul de substane tampon meninnd pH-ul fiziologic n timpul contraciei
musculare. Carnozina exercit o aciune hipertensiv i este un stimulator al secreiei glandulare. Joac
un rol activ n transportul acidului fosforic n cursul procesului de glicoliz i n formarea
creatinfosfatului. Sub form de carnozinfosfat este donor de grupri fosfat n contracia muscular.
Glutationul este o tripeptid prezent n toate celulele de origine vegetal i animal. Este un
tripeptid atipic, format din glutamat, cistein i glicin.
NN
O
H O
HSH
O O
O
NH3
O
- -
+
carnozin
-alanilhistidin
anserin
-alanil-N-metilhistidin
glutation
-glutamilcisteinilglicin
19
Prezena unei grupri tiolice libere, provenit de la cistein, confer glutationului proprieti
reductoare. Hidrogenul gruprii tiolice poate fi cedat unei substane acceptoare de hidrogen cu unirea
a dou molecule de glutation, formndu-se glutation oxidat.
G-SH + HS-G G-S-S-G
Funcia principal a glutationului este de a detoxifia organismul de diveri ageni oxidani toxici care
apar n diferite procese biochimice redox. Agenii oxidani sunt implicai n procesele de mbtrnire
sau de inducere a diferitelor cancere, iar glutationul are capacitatea de a-i reduce, diminundu-le astfel
potenialul toxic.
Encefalinele sunt pentapeptide sintetizate de corp pentru a controla durerea. Ele au fost
denumite i analgezice naturale. Aceti compui diminueaz senzaiile de durere prin legarea de
anumii receptori cerebrali. O parte din structura lor tridimensional este probabil similar cu cea a
morfinei, deoarece se leag de aceeai receptori.
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
Bradikinina, vasopresina i ocitocina sunt nonapeptide cu rol hormonal. Bradikinina inhib
inflamarea esuturilor. Vasopresina controleaz tensiunea arterial prin reglarea pe care o exercit
asupra contraciei muchilor netezi, fiind n acelai timp i antidiuretic. Ocitocina provoac contraciile
n timpul naterii i stimuleaz secreia laptelui la femeile lehuze. Vasopresina i ocitocina posed o
legtur disulfuric intracatenar, iar cruparea carboxil C-terminal este preponderent sub form
amidic. n ciuda rolului fiziologic diferit, vasopresina i ocitocina difer structural doar prin doi
aminoacizi.
S S
S S
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg
Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2
glutation redus
glutation oxidat
leucin-encefalin metioninin-encefalin
bradikinin
vasopresin
ocitocin
20
n Tabelul 5 sunt consemnate i alte polipeptide cu roluri biologice foarte divers, n special
hormonal.
Tabelul 5. Hormoni polipeptidici
Denumire Numr de aminoacizi Roluri biologice
insulina
glucagonul
corticotropina
gastrina I
gastrina II
secretina
hormonul melanocit
()
hormonul melanocit
()
51
29
39
17
17
27
13
18
aciune hipoglicemiant
aciune hipergicemiant
stimuleaz biosinteza hormonilor corticosteroizi
stimularea secreiei gastrice
stimularea secreiei gastrice
controleaz secreia pancreasului
stimuleaz producerea de pigment n celulele melanocite ale pielii
stimuleaz producerea de pigment n celulele melanocite ale pielii
Antibioice cu structur polipeptidic. Exist o serie de polipeptide naturale eliberate de
microorganisme (bacterii) dintre care unele manifest aciune antibiotic, prezentnd un larg interes n
chimioterapia modern. Din aceast catgorie fac parte gramicidine, tirocidiine, bacitracine, polimixine,
actinomicine, kapreomicine, walinomicine, etamicine, etc. Caracteristica esenial a acestor substane
este prezena n lanul peptidic al acestora, alturi de aminoacizii din seria L, a unor aminoacizi din
seria D, formnd uneori o structur ciclic. Frecvent n structura acestora se ntlnesc acizii L-aspartic
i L-glutamic.
Gramicidina S este un antibiotic decapeptidic cu structur ciclic. Conine aminoacizii L-
ornitin (L-Orn), D-ornitin (D-Orn) i D-fenilalanin. (Ornitina este un aminoacid asemntor lizinei,
cu o grupare metilen mai puin).
21
L-ValL-Orn
L-Leu
D-Phe
L-ProL-Val
D-Orn
L-Leu
L-Phe
L-Pro
H3NCH
2CH
2CH
2CHCOO
NH3
-+
+
3. Structura proteinelor
Proteinele sunt biocomponente structurale i funcionale de nsemntate primordial pentru
procesul vieii i care prezint cel mai inalt grad de complexitate, varietate i specificitate. Denumirea
de protein deriv de la cuvntul grecesc proteos, primul, n deplin acord cu rolul fundamental al
acestor substane n lumea vie. Proteinele ndeplinesc funcii extrem de variate, rolurile biologice fiind
diferite, n funcie de tipul proteinelor.
Din unirea unui numr mare de aminoacizi (de regul mai mare de 50) rezult lanurile
peptidice din constituia proteinelor. Aceste lanuri difer unele de altele sub raportul lungimii, naturii
i secvenei aminoacizilor constitutivi. De multe ori n constituia unei proteine nu intr un singur lan
polipeptidic, ci mai multe, iar acestea nu sunt desfurate n lungime ci rsucite sau cu catena dispus
in zigzag, n mai multe planuri. Pe de alt parte, datorit diverselor grupri funcionale libere din
radicalii aminoacizilor, lanurile se pot consolida prin stabilirea unor legturi intra- sau intercatenare.
innd seama de toate acestea, la moleculele proteice se ntlnete o organizare special, care const n
patru categorii de structuri sau niveluri de organizare: 1) Structura primar, determinat de
succesiunea aminoacizilor n catena polipeptidic i de poziia punilor disulfurice. 2) Structura
secundar descrie fragmente cu conformaie regulat din constituia lanului proteic i cum acesta se
pliaz n spaiu. 3) Structuta teriar descrie structura tridimensional a ntregii molecule proteice. 4)
Structura cuaternar descrie modul n care lanurile proteice individuale se aranjeaz n spaiu n
raport cu alte poteine.
ornitin
gramicidin S
22
Proteinele ndeplinesc cele mai diverse funcii n organism. Exist o reea proteic intracelular
cu rol structural care asigur forma i integritatea celular. Filamentele de actin i miozin formeaz
aparatul contractil al muchiului. Hemoglobina transport oxigen, n timp ce anticorpii ndeprteaz
agenii strini celulei. Enzimele catalizeaz practic toate reaciile din organism. Receptorii confer
celulei capacitatea de a sesiza diferite semnale hormonale sau produse de ali mesageri chimici. Un
scop primordial al medicinii moleculare l constituie identificarea acestor proteine a cror prezen,
absen sau deficien este asociat cu anumite stri fiziologice sau boli. Determinarea structurii
primare a proteinelor ofer datele necesare identificrii precum i informaia necesar identificrii i
clonrii genei care o codific.
3.1. Purificarea proteinelor
Pentru a putea determina secvena aminoacizilor dintr-o protein, este esenial ca aceasta s fie
n prealabil izolat n stare pur. O celul conine mii de proteine diferite, fiecare n cantiti diferite.
Izolarea unei anumite proteine n cantitate suficient pentru a putea fi analizat poate presupune mai
multe etape succesive de purificare. Metodele clasice se bazeaz pe diferenele de solubilitate a
proteinelor n funcie de pH (precipitare izoelectric), n funcie de polaritate (precipitare cu etanol sau
aceton) sau n funcie de trie ionic (precipitare cu sulfat de amoniu). Ulterior precipitrii
difereniale, proteinele se purific prin metode cromatografice i electroforetice.
La separrile cromatografice se realizeaz partiia moleculelor ntre dou faze: una mobil i
cealalt staionar. Pentru separarea moleculelor mici (aminoacizi, monozaharide) faza staionar poate
fi hrtie cromatografic (cromatografie pe hrtie) sau un strat subire de celuloz, silicagel sau oxid de
aluminiu (cromatografia n strat subire)
Cromatografia pe coloan. Cromatografia pe coloan a proteinelor utilizeaz ca faz
staionar o coloan de particule sferice de celuloz, acrilamid sau silicagel. De obicei, suprafaa
acestor sfere este mbrcat cu grupri funcionale, astfel nct s se permit interacii ntre faza
staionar i moleculele proteice, interacii bazate pe ncrcarea electric, hidrofobicitate sau legare de
ligand. Un amestec proteic se aplic pe coloan, dup care faza mobil este trecut (eluat) prin aceast
coloan, antrennd diferit moleculele proteice. Pe masur ce eluantul trece prin coloan, antreneaz
diferenial moleculele proteice.
23
Cromatografia de partiie. Separarea prin cromatografie pe coloan depinde de afinitatea
relativ a diferitelor proteine pentru o anumit faz staionar sau pentru o anumit faz mobil.
Asocierea dintre fiecare protein i faza staionar este slab i tranzitorie. Proteinele care
interacioneaz mai puternic cu faza staionar sunt reinute pe coloan mai mult i sunt eluate mai
trziu. Durata asocierii unei proteine cu faza staionar depinde att de natura fazei staionare ct i
mobile. Separarea optim a unei proteine dintr-un amestec depinde de compoziia acestor dou faze.
Cromatografia de excluziune sau gel filtrarea separ proteinele n funcie de raza Stokes,
adic diametrul sferei pe care molecula e protein o ocup n soluie. Raza Stokes depinde de masa
molecular a proteinei i de forma sa (o protein alungit ocup un volum mai mare dect o protein
sferic cu aceeai mas). Cromatografia de excluziune folosete ca faz staionar granule poroase.
Proteinele cu raz Stokes prea mare pentru a putea ptrunde prin porii granulelor (proteinele excluse)
ramn n faza mobil i sunt eluate primele, naintea proteinelor care pot penetra prin pori (proteinele
incluse). Astfel, proteinele pot fi separate n ordinea razelor lor Stokes.
Figura 2. Componentele unui aparat cromatografic.
R: rezervorul fazei lichide (furnizat gravitaional sau cu ajutorul unei pompe). C: coloana care
conine faza staionar. F: colectorul de fracii care culege porii de eluat n eprubete separate.
R
C
F
24
Cromatografia de absorbie. n cromatografia de absorbie, amestecul proteic este aplicat pe
coloan n condiiile n care proteina de interes se asociaz strns cu faza staionar. Moleculele
neaderente sunt eluate primele i se arunc, dup care proteinele sunt eliberate succesiv prin ruperea
legturilor care stabilizeaz complexul protein-faz staionar, de cele mai multe ori folosind un eluent
cu gradient cresctor de concentraii de anumite sruri. Compoziia fazei mobile este schimbat gradat
astfel nct moleculele s fie eliberate n ordinea afinitii lor pentru faza staionar.
Cromatografia cu schimbtori de ioni. n cromatografia cu schimbtori de ioni, proteinele
interacioneaz cu faza staionar n funcie de ncrcarea lor electric. Proteinele care au o incrctur
pozitiv la un anumit pH vor adera la faza staionar ncrcat negativ cu grupri funcionale de tip
carboxilat sau sulfat (schimbtori cationici). Invers, proteinele care au o incrctur negativ la un
anumit pH vor adera la faza staionar ncrcat poztiv cu grupri funcionale de tip amine teriare sau
cuaternare (schimbtori anionici). Proteinele, care sunt poli-ioni, concureaz impotriva ionilor mono-
sau divaleni n legarea de suportul staionar schimbtor de ioni. De exemplu, proteinele se leag de
DEAE (dietilaminoetil)-celuloz prin nlocuirea contraionilor (de obicei Cl- sau AcO-) care
neutralizeaz amina protonat. Proteinele legate sunt apoi ndeprtate selectiv ridicnd gradat
concentraia de ioni din faza mobil. Proteinele sunt eluate n ordine invers forei de interacie cu faza
staionar. Deoarece sarcina net a unei proteine depinde de pH, eluarea secvenial a proteinelor se
poate face i prin modificarea pH-ului n faza mobil. Pentru a fi purificat, o protein poate suferi mai
multe runde de ion-cromatografie la pH-uri diferite, astfel nct proteine care de exemplu sunt co-eluate
la un anumit pH, pot fi separate folosind ulterior alt pH.
Cromatografia prin interacii hidrofobe. Acest tip de cromatografie separ proteine pe baza
tendinei lor de a se asocia cu o faz staionar acoperit cu grupri hidrofobe (fenil-Sepharose, octil-
Sepharose). Proteinele cu fragmente hidrofobe expuse la suprafa ader la faza staionar prin
interacii hidrofobe, care sunt mrite prin folosirea unei faze mobile cu trie ionic mare. Proteinele
neaderente sunt eluate primele, dup care polaritatea fazei mobile este sczut gradat prin scderea
B A
Figura 3. Cromatografia de excluziune. A.Un amestec de
molecule mari (ptarte) i mici (cercuri) se aplic pe o coloan de gel filtrare. B. Dup intrarea n coloan, moleculele mici ptrund n porii fazei staionare, n timp ce moleculele mai mari sunt excluse. C. Pe msur ce faza mobil nainteaz prin coloan moleculele mari curg mpreun cu ea, n timp ce moleculele mici rmn din ce
n ce mai n urm.
C
25
concentraiei ionice. Dac interaciile dintre protein i faza staionar sunt prea puternice, se pot
aduga n faza mobil etanol sau glicerol pentru a micora polaritatea fazei mobile i slbi interaciile
hidrofobe.
Cromatografia de afinitate. Cromatografia de afinitate se folosete de selectivitatea pe care
majoritatea proteinelor o manifest fa de anumii liganzi. De exemplu, enzimele pot fi purificate
utiliznd o faz staionar de care sunt legate substratele, produii de reacie, coenzimele sau inhibitorii
enzimelor respective. Teoretic, numai proteinele care interacioneaz cu ligandul imobilizat vor adera
la faza staionar. Proteinele aderente sunt ulterior eluate fie cu o soluie de ligand sau, mai puin
selectiv, prin ruperea legturilor protein-ligand cu uree, clorhidrat de guanidin, soluii tampon cu pH
slab acid sau soluii concentrate de ioni. Printre cele mai performante faze staionare sunt cele utilizate
pentru purificarea proteinelor recombinante (modificate genetic), cum ar fi faze staionare cu ioni de
Ni2+
ce leag proteinele cu coad polihistidinic, sau faze staionare cu glutation care leag proteinele
recombinante legate de un fragment de glutation-S-transferaz.
Peptidele pot fi purificate prin HPLC. Fazele staionare utilizate n coloanele cromatografice
clasice sunt materiale poroase a cror compresibilitate mare limiteaz scurgerea fazei mobile.
Cromatografia n faz lichid la presiune ridicat (High-Pressure Liquid Chromatography, HPLC)
utilizeaz granule necompresibile de silicagel sau alumin ca faz staionar i presiune de pn la
cteva mii de psi. Umplutura necompresibil a coloanei permite att viteze mari de eluie ct i
rezoluie crescut. HPLC poate separa amestecuri complexe de lipide i peptide a cror proprieti
difer doar puin. Pentru separarea peptidelor, se utilizeaz HPLC cu faz inversat (reversed-phase
HPLC) n care faza staionar este hidrofob (oligomeri alifatici cu 3-18 atomi de carbon). Amestecul
peptidic este eluat cu un gradient apos al unui solvent organic miscibil cu apa (acetonitril, metanol).
Puritatea unei proteine se determin prin electroforez. Electroforeza separ molecule
ncrcate electric n funcie de viteza cu care acestea migreaz ntr-un cmp electric aplicat. Cea mai
utilizat metod pentru determinarea puritii unei proteine este SDS-PAGE, sau cromatografia n gel
de poliacril amid n prezena dodecilsulfatului de sodiu (SDS). (PAGE = PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis). Pentru SDS-PAGE, acrilamida este nti co-polimerizat cu o cantitate mic de N,N'-
metilen bis-acrilamid, formnd o reea poroas prin care vor migra moleculele supuse electroforezi.
SDS denatureaz proteina i se leag de ea ntr-un raport de o molecul SDS la dou legturi peptidice.
Numrul mare de molecule SDS ataate face ca molecula proteic s capete o ncrctur negativ,
astfel nct proteinele vor migra prin gelul electroforetic n funcie numai de masa lor molecular.
Proteinele individuale migate n gel pot fi vizualizate cu anumii colorani, cum ar fi Coomasie blue.
26
3.2. Determinarea structurii primare a proteinelor
Dup purificarea unei proteine, urmtorul pas este reducerea legturilor disulfidice eventual
prezente, de obicei cu 2-mercaptoetanol, urmat de o reacie cu acid iodacetic, care impiedic
reformarea punilor disulfidice.
NHCH
O
CH2
S
S
CH2
NHCH
O
NHCH
O
CH2
SH
NHCH
O
SH
CH2
SCH2CH
2OH
SCH2CH
2OH
NHCH
O
CH2
SCH2COOH
NHCH
O
SCH2COOH
CH2
C
C
C
C
+
ICH2COOH
C
C
+ 2 HI
2 HSCH2CH2OH
Urmtorul pas const n determinarea felului i numrului de aminoacizi componeni. Pentru aceasta, o
prob de protein se hidrolizeaz:
proteina aminoacizi6 N HCl
100oC
24 hr
Acest tratament distruge toate legturile amidice, inclusiv cele din Asn i Gln. Numrul de Asn i Gln
se determin prin alte metode. Hidroliza acid distruge nucleul indolil din Trp, aa c pentru
determinarea Trp se folosete separat hidroliza n mediu bazic. Amestecul de aminoacizi obinut prin
hidroliz este trecut printr-un analizor de aminoacizi care determin numrul i tipul de aminoacizi.
Identificarea aminoacidului N-terminal
Exist cteva metode de determinare a aminoacidului N-terminal. Metoda Sanger utilizeaz
proprietatea gruprii NH2 de a reaciona cu 2,4-dinitrofluorbenzen dnd derivai 2,4-dinitrofenil
galbeni.
27
+ H2NR..
NO2
FO2N
NO2
O2N
F
NH2R
.. +-
NO2
NHRO2N
- HF
Reactantul Sanger reacioneaz uor cu aminoacidul N-terminal al unei proteine, transformnd
gruparea amino n grupare arilamino. Dup hidroliz, aminoacidul N-terminal rmne legat de gruparea
2,4-dinitrofenil putnd fi uor separat de ceilali aminoacizi i identificat. Principalul dezavantaj al
acestei metode este ca nu poate fi aplicat secvenial ca metoda Edman.
NO2
FO2N
R
proteina
O
NO2
O2N
R
proteina
O NO2
O2N
R
O
+ H2NCHC
HNCHCH3O
+
HNCHCOH + aminoacizi
Metoda Edman. Fenilizotiocianatul (PITC) sau reactivul Edman reacioneaz selectiv cu
aminoacidul N-terminal, iar derivatul tiazolinonic rezultat poate fi clivat n condiii acide blnde.
Derivatul tiazolinonic este extras cu un solvent organic i n prezena acidului trece intr-un derivat de
feniltiohidantoin (PTH) mai stabil, genernd un nou capt N-terminal. Se pot face astfel mai multe
serii succesive de degradri Edman pe aceei prob de protein. Din pcate nu se poate realiza
secvenializarea complet a unei proteine, deoarece se acumuleaz produi secundari care denatureaz
rezultatele. Secvenializarea Edman a fost automatizat, utilizndu-se o matrice solid pentru
imobilizarea peptidei i HPLC pentru a identifica derivaii PTH. Secveniatoarele moderne pot efectua
pna la 50 degradrii succesive, pe o prob de civa picomoli.
28
N C S
f enil izotiocianat
(PITC)
(reactiv Edman)
H2NCHC NHCHC NHCHC
O O O
R R' R"
..
N C
S
HNCHC NHCHC NHCHC
O O O
R R' R"
..
HF
N
S
N
O
R+
NHCHC NHCHC
O O
R' R"
H F
.. ....
HN
HN S
R O
+
H3NCHC NHCHC
O O
R' R"
++
deriv at tiazolinonic
peptida f ara acidul N-terminal original
NH N
S
R O
PTH-aminoacid
Determinarea aminoacidului C-terminal. Aminoacidul C-terminal se identific pin hidroliza
cu o enzim numit carboxipeptidaz, care catalizeaz specific hidroliza aminoacidului C-terminal.
Carboxipeptidazele sunt exopeptidaze (enzime care catalizeaz hidroliza unei legturi peptidice aflate
la marginea lanului peptidic).
29
NH
NH
NH
COO
R"
R'
R
O
O
-carboxipeptidaza N
H
NH
COO
R"
R'O
H3N COO
R
--
+
+
Pe msur ce primul aminoacid este ndeprtat, enzima atac urmtorul aminoacid, pn cnd ntreaga
protein este hidrolizat. Prin determinarea vitezei de apariie a diverilor aminoacizi n hidrolizat se
pot identifica astfel primii 3-4 aminoacizi de la captul C-terminal.
Fragmentarea lanurilor proteice. Metoda Edman poate fi utilizat fr probleme pentru
secvenializarea primelor 20-30 resturi de aminoacizi, numai c moleculele proteice au minim 50
aminoacizi (foarte multe de ordinul sutelor). n consecin, majoritatea proteinelor necesit clivare
nainte de a putea fi secvenializate. Acest lucru se face prin hidroliz parial n mediu slab acid,
cnd numai anumite legturi peptidice sunt atacate. Fragmentele rezultate se separ, se purific (prin
reversed-phase HPLC) i se secvenializeaz. Secvena proteinei originale se poate deduce aliniind
secvenele fragmentelor i cautnd poriunile care coincid.
Proteinele pot fi fragmentate i cu endopetidaze (enzime care catalizeaz hidroliza unei legturi
peptidice aflate n interiorul lanului peptidic). Tripsina, chimotripsina, elastaza sunt endopeptidaze
care hidrolizeaz specific anumite legturi peptidice. De exemplu, tripsina catalizeaz scindarea
legturilor peptidice n care sunt implicate lizina sau arginina.
Peptida X
Peptida Z
Peptida Y
Poriunea C-terminal a peptidei X
Poriunea N-terminal a peptidei Y
Figura 3.4. Secvena de aminoacizi a peptidei Z, care coincide parial cu cea a peptidelor X i Y,
demonstreaz c peptidele X i Y se regsesc n proteina original n ordinea XY i nu YX.
30
+
+C NH
2
NH2
O
OO
O
NH
NH
NH
NH
NH
NH
R
R'O
O CH2
CH2
CH2
CH2
NH3
R"
CH2
CH2
CH2
NH
R"'
C- Ly s C-Arg
Principalii ageni de clivare specific a proteinelor sunt prezentai n Tabelul 3.4.
Tabelul 4. Specificitatea agenilor de clivare a proteinelor
Reactiv Specificitate
Reactivi chimici
Reactiv Sanger
Reactiv Edman
CNBr (bromcian)
Hidroxilamin Acid slab
Exopeptidaze*
Carboxipeptidaza A
Carboxipeptidaza B
Endopeptidaze
Tripsin* Chimotripsin* Elastas* Endopeptidaz Lys-C Endopeptidaz Arg-C Endopeptidaz Asn-N
nltur aminoacidul N-terminal nltur aminoacidul N-terminal Met-X
Asn-Glz
Asp-Pro
nltur aminoacidul C-terminal (nu i Arg sau Lys) nltur aminoacidul C-terminal (doar Arg i Lys)
Arg-X, Lys-X
aminoacid hidrofob (Phe, Tyr, Trp)-X
Gly-X, Ala-X
Lys-X
Arg-X
X-Asn
Glu-X, mai ales cnd X este hidrofob
*Clivarea nu are loc cnd prolina e implicat n legtur.
Mecanismul clivrii cu bromcian (BrCN) este prezentat mai jos:
31
NHCHCNHCH C NHCHC
O
R
O O
R'
CH2
CH2
S
CH3
.. ..
Br NC
NHCHCNHCH C NHCHC
O
R
O O
R'
CH2
CH2
S
CH3
NC + Br
+
+
..
.. -
NHCHCNHCH C NHCHC
O
R
O
R'
N+ CH3SC
O
+NHCHCNHCH C O
O
R
O
R'
O
NHCHC
H3O+
H3O+
NHCHCNHCH COH
O
R
OCH2
CH2
OH
Detectarea modificrilor covalente prin spectrometria de mas. Spectrometria de mas, care
face distincie ntre specii moleculare exclusiv pe baza masei lor, poate fi utilizat pentru a depista
modificrile posttranslaionale (care survin dup ce proteina a fost biosintetizat la nivel ribozomal) ale
aminoacizilor dintr-o protein. Astfel, pot fi detectate grupri hidroxi, fosfat, etc. fiecare grupare
contribuind cu un increment specific la masa aminoacidului modificat (Tabelul 3.5).
Tabelul 5. Creterea de mas produs de modificrile posttranslaionale
Modificare Creterea de mas (Da)
Fosforilare
Hidroxilare
Metilare
Acetilare
Miristilare
Palmitilare
Glicozilare
80
16
14
42
210
238
162
Spectrometrele de mas convenionale sunt utilizate pentru determinarea moleculelor cu mas
molecular pn la 1000 Da, dar exist i spectrometre speciale pentru analiza compuilor cu mase
32
moleculare mari. Iniial, analizarea polipeptidelor i proteinelor prin spectrometrie de mas a fost mult
ngreunat de dificultatea cu care aceti compui pot fi volatilizai. ntre timp, tehnici de felul MALDI
(Matrix Assisted Laser Desorption) i dispersie prin electropulverizare (electrospray dispersion) permit
ca pna i polipeptide mari (> 100 000 Da) s fie detectate cu o acuratee extraorinar ( 1 Da).
Utiliznd dispersia prin electropulverizare, peptidele scoase dintr-un cromatograf HPLC sunt imediat
introduse n spectrometrul de mas pentru analiz. Aici, peptidele sunt fragmentate prin bombardare cu
atomi de heliu, iar masele diverselor fragmente sunt nregistrate. Deoarece legrura peptidic este mult
mai labil dect legturile C-C, cele mai abundente fragmente vor diferi ntre ele cu uniti echivalente
de 1-2 aminoacizi. Deoarece cu excepia leucinei i izoleucinei masele individuale ale
aminoacizilor sunt unice, secvena unei polipeptide poate fi dedus din masele fragmentelor
componente.
Amestecurile complexe de peptide pot fi acum analizate fr o purificare anterioar utiliznd
echivalentul a dou spectrometre de mas legate n serie (spectrometria de mas n tandem).
Biologia molecular a revoluionat metodele de determinare a structurii primare a
proteinelor. Cunoaterea secvenei de ADN care codific o protein permite deducerea structurii
primare a proteinei respective. Pn n prezent, genomurile multor specii, inclusiv genomul uman, au
fost secvenializate complet, bazele de date fiind accesibile liber pe Internet. Algoritmuri computerizate
de cutare permit identificarea fragmentelor de ADN (ORF, open reading frame) care codific proteine
prezumptive. Invers, secvene scurte de aminoacizi pot fi utilizate pentru a identifica secvena de ADN
codificator.
n timp ce genomul uman a fost complet descifrat, proteomul (totalitatea seturilor de proteine
caracteristice unei specii, sintetizate de celule n diferite condiii) este departe de a fi neles, iar
bioinformatica este metoda care va avea un rol de baz n descifrarea sa.
33
3.3. Nivele Superioare de Organizare a Structurii Proteinelor
Proteinele catalizeaz reaciile metabolice, induc mobilitatea celular, alctuiesc frnghiile i cablurile ce confer integritate structural prului, oaselor, tendoanelor, dinilor. n natur, forma urmeaz funciei. Varietatea structural a proteinelor umane reflect deci diversitatea i sofisticarea funciilor lor biologice. Maturarea unei polipeptide nou-sintetizate ntr-o protein funcional presupune plierea lanului polipeptidic ntr-un aranjament spaial specific numit conformaie. n timpul maturrii, modificri postranslaionale pot avea loc cu adugarea unor grupri chimice noi sau cu ndeprtarea unui fragment peptidic cu rol tranzitoriu. Deficienele genetice sau nutriionale care afecteaz maturarea proteinelor pot avea efecte majore asupra strii de sntate. Exemple din prima categorie includ maladia Creutzfeldt-Jakob, maladia Alzheimer i encefalopatia spongiform bovin (boala vacii nebune). Scorbutul este o deficien nutriional
provocat de lipsa vitaminei C, care perturb maturarea anumitor proteine structurale (colagenul).
3.3.1. Clasificarea proteinelor. Oamenii de tiin au clasificat iniial proteinele pe baza unor
proprieti cum ar fi solubilitatea, forma sau prezena n structura lor a unor componente neproteice. De
exemplu, proteinele care pot fi extrase din celule utiliznd soluii cu pH-uri i trii ionice fiziologice
sunt proteine solubile, celelalte fiind considerate proteine insolubile.
n funcie de forma lor, pot fi proteine globulare i proteine fibrilare. Proteinele globulare au
o form aproximativ sferic sau ovoidal avnd raportul axial (raportul dintre cea mai mare
dimensiune i cea mai mic dimensiune) mai mic dect 3. Majoritatea enzimelor sunt globulare, cu un
volum intern mare care furnizeaz un spaiu amplu pentru a se putea forma caviti cu geometrii,
ncrcri electrice, hidrofilicitate sau hidrofobicitate specifice, necesare pentru a lega substratele
enzimatice i pentru a promova cataliza. Prin contrast, majoritatea proteinelor structurale adopt
conformaii alungite. Acestea sunt proteine fibrilare i au raportul axial 10 sau mai mare.
n funcie de produii rezultai la hidroliz, proteinele pot fi proteine simple sau
heteroproteine (holoproteine). La hidroliz acid, bazic sau enzimatic proteinele simple pun n
libertate numai -aminoacizi. Heteroproteinele au o compoziie complex fiind formate dintr-o parte
proteic (apoproteina) i o parte neproteic (componenta prostetic). Componenta prostetic poate fi
de natur chimic diferit (glucide, lipide, acizi nucleici, porfirine, metale). n cazul heteroproteinelor,
legarea gruprii prostetice de apoprotein se face prin legturi chimice covalente sau necovalente care
le confer stabilitate.
Lipoproteinele i glicoproteinele conin lipide i respectiv carbohidrai legai covalent.
Mioglobina, hemoglobina, citocromii conin ioni metalici strns asociai, fiind denumite
metaloproteine, etc. Odat cu dezvoltarea i aplicarea tehnicilor de determinare a structurii primare a
proteinelor au aprut scheme de clasificare mai precise, bazate pe similariti sau pe gradul de
34
omologie privind secvena sau structura. Cu toate acestea ns, muli termeni din vechea clasificare
rmn n continuare n uz.
Natura modular a sintezei i organizrii spaiale a proteinelor este materializat n conceptul de
nivele de structur: structura primar, care este determinat de succesiunea aminoacizilor n lanul
polipeptidic; structura secundar, care este dat de plierea unor fragmente polipeptidice scurte (3-30
resturi de aminoacizi) n uniti ordonate geometric; structura teriar, sau asamblarea
tridimensional a unitilor structurale secundare pentru a forma uniti funcionale mai mari cum ar fi
polipeptida matur i domeniile sale; structura cuaternar, dat de numrul i tipul de lanuri proteice
i aranjamentul lor spaial.
PROTEINE
HETEROPROTEINE
PROTEINE FIBRILARE
PROTEINE GLOBULARE
GREU
SOLUBILE
INSOLUBILE Actin Miozin
Fibrinogen
Albumine
Globuline
Histone
Protamine
Figura 4. Clasificarea proteinelor
Lipoproteine
Glicoproteine
Fosfoproteine
Nucloproteine
Metaloproteine
Cromoproteine
Colagen
Elastine
Keratine
Scleroproteine PROTEINE SIMPLE
35
3.3.2. Structura secundar a proteinelor
Datorit rigiditii legturii peptidice rotaia liber este permis numai n jurul a dou din cele
trei tipuri de legturi din scheletul polipeptidic: C-Ccarbonil i C-N.
C
N
C
C
N
C
C
N
O
H
R' H
O
H
H R"
O
H
Unghiul de rotaie n jurul legturii C-N este denumit phi (), iar unghiul de rotaie n jurul legturii
C-Ccarbonil este denumit psi (). Pentru orice aminoacid diferit de glicin, majoritatea combinaiilor -
sunt interzise din cauza mpiedicrilor sterice. Conformaiile care implic prolina sunt chiar mai
restricionate, din cauza absenei rotaiei libere n jurul legturii C-N.
Regiuni cu structur secundar ordonat apar atunci cnd o serie succesiv de aminoacizi
adopt unghiuri i similare. Exist dou categorii de structuri secundare, -helix i -pleated
sheet (planuri pliate). Segmente extinse de aminoacizi (de exemplu buclele) posed o gam variat
din aceste unghiuri.
3.3.2.1. Structura -helix
Scheletul polipeptidic dintr-un -helix este rsucit n mod egal n jurul fiecrui C cu un unghi
de aproximativ -57 i un unghi de aproximativ -47. O spir complet a helixului conine n
medie 3,6 resturi de aminoacizi, iar nalimea spirei este de 0,54 nm.
36
Gruprile R din fiecare rest de aminoacid inclus ntrpun -helix sunt ndreptate spre exterior.
Proteinele naturale conin numai -aminoacizi, motiv pentru care -helixul spre dreapta este
mai stabil dect cel spre stnga, i numai -helixuri orientate spre dreapta exist n natur. Diagramele
schematice convenionale ale proteinelor reprezint -helixurile prin cilindri sau panglici spiralate
(Fig. 5B). Stabilitatea -helixurilor deriv din legturile de hidrogen care se formeaz ntre atomii de
Figura 5. Structura -helix. A. Aranjarea catenei polipeptidice n jurul axei unui -
helix. B. Reprezentarea convenional a unui -helix
B
0,54
nm
0,15
nm
A
Figura 6. Vedere de sus i de-a lungul axei unui -helix. Gruprile R sunt orientate n afara helixului.
37
oxigen din carbonilul peptidic i atomul de hidrogen de la azotul peptidic care aparine aminoacidului
din poziia a patra. Capacitatea de a forma un numr maxim de legturi de hidrogen precum i
interaciile van der Waals din miezul acestei structuri compacte face ca -helixul s fie foarte stabil.
Deaorece resturile de prolin nu au hidrogen la atomul de azot peptidic i prin urmare nu pot forma
legturi de hidrogen, prolina nu poate fi inclus ntr-un -helix dect n prima spir. Cnd este
prezent n alt parte, prolina perturb -helixul. i glicina, din cauza dimensiunilor sale reduse
produce rupturi n -helix.
Multe -helixuri au grupri R predominant hidrofobe pe o parte a axei helixului i grupri R
predominant hidrofile pe cealalt parte. Aceste helixuri amfipatice sunt bine adapate pentru a forma
interfee ntre regiuni polare i regiuni nepolare, cum ar fi miezul intern al proteinei i nveliul su
apos. Grupuri de helixuri amfipatice pot forma canale cu pori care permit anumitor molecule polare s
treac prin interiorul hidrofob al membranelor celulare.
3.3.2.2. Structura -pleated sheet (planuri pliate). Al doilea tip de structur secundar
regulat ntlnit n structura proteinelor este structura -sheet. Resturile aminoacil dintr-o structur -
sheet sunt dispuse n zig-zag formnd un aranjament de tip foaie pliat, n care gruprile R ale
aminoacizilor adiaceni sunt orientate n direcii opuse. n contrast cu aranjamentul compact din -
helix, scheletul peptidic din -sheet este foarte extins. Ca i n cazul -helixului, structura -sheet i
Figura 7. Legturile de hidrogen dintre O i H stabilizeaz
structura polipeptidic ntr-o conformaie -helix.
38
datoreaz marea stabilitate legturilor de hidrogen care se formeaz ntre atomii de oxigen carbonilici i
atomii de hidrogen din legturile peptidice, doar c aceste legturi se formeaz ntre atomi aparinnd la
dou catene diferite.
Structurile -sheet care se afl n interacie pot fi aranjate paralel (segmentele polipeptidice
adiacente merg n aceeai direcie NC) sau antiparalel (segmentele polipeptidice adiacente merg n
direcii opuse, una NC, cealalt NC).
Figura 9. Reprezentarea unei catene polipeptidic cu structuri -sheet n orientarea antiparalel (A i B) i paralel (B i C).Gruprile R sunt omise pentru claritate.
N
C
B A
Figura 8. A. Aranjarea catenei polipeptidice ntr-o structur de tip
-pleated sheet. B. Reprezentarea convenional a unei structuri
-pleated sheet.
39
Ambele structuri permit un numr maxim de legturi de hidrogen ntre fragmentele catenare. Structura
-sheet nu este perfect plan, ci are o uoar rsucire spre dreapta. Mnunchiuri de segmente cu
structuri -sheet formeaz miezul multor proteine globulare. Schematic, structura -sheet este
reprezentat ca o sgeat orientat de la captul N-terminal spre captul C-terminal.
3.3.2.3. Bucle i cotituri. Aproximativ jumtate din resturile de aminoacizi care intr n
constituia unei proteine globulare se gsesc n structuri -helix i -sheet, restul aflndu-se n bucle
(loops), cotituri(turns) ndoituri (bends) i alte conformaii mai laxe. Cotiturile se refer la
segmente peptidice scurte care unesc dou uniti de structur secundar, de exemplu dou catene
adiacente cu structur -sheet. Cotiturile (-turns) implic patru aminoacizi, din care primul este
legat de al patrulea rest prin legturi de hidrogen, rezultnd o cotitur de 180. Prolina i glicina sunt
deseori prezente n cotiturile .
Buclele sunt segmente care conin mai muli aminoacizi dect numrul minim necesar pentru a
conecta dou uniti adiacente de structur secundar. Dei au conformaii neregulate, buclele au roluri
biologice importante. De exemplu, pentru multe enzime, buclele care unesc domeniile responsabile de
legarea substraturilor i a produilor de reacie conin aminoacizi care particip la cataliz. Laitmotivele
helix-bucl-helix (helix-loop-helix) reprezint locul de legare de ADN a unor proteine (factori care
activeaz sau inhib transcripia ADN n ARN). Motivele structurale de tipul helix-bucl-helix sunt
C
C
N
C
C
N
C
C
N
C
O H
OC O
H
H
H
H
CH3
H
H2C
H
CH2OH
H
COOH
Figura 10. O cotitur care leag dou segmente antiparalele cu structur -sheet. Linia punctat indic legtura de hidrogen dintre primul i al patrulea aminoacid din segmentul Ala-Gly-Asp-Ser.
40
intermediare ntre structura secundar i cea teriar, fiind uneori denumite structuri supersecundare.
Deoarece multe din bucle sunt orientate spre exteriorul moleculei proteice, ele alctuiesc situsuri uor
accesibile (epitopi) pentru a fi recunoscute i legate de ctre anticorpi.
Buclele nu au regularitate structural; ele totui exist preponderent n anumite conformaii
stabilizate prin legturi de hidrogen, puni electrostatice sau interacii hidrofobe cu alte regiuni ale
proteinei. Nu toate regiunile unei proteine sunt ns organizate n structuri ordonate.
Proteinele conin i zone dezorganizate, de cele mai multe ori aflate spre captul C-terminal,
caracterizat printr-o flexibilitate conformaional mare. De multe ori, aceste regiuni dezorganizate pot
adopta o conformaie organizat atunci cnd se leag de exemplu de un ligand. Aceast flexibilitate
conformaional confer acestor regiuni capacitatea de a aciona ca regiune reglatoare, care atunci cnd
leag un ligand duce la modificrea structurii i funciei proteinei.
3.3.3. Structura teriar i cuaternar a proteinelor
Structura primar i secundar nu pot explica n totalitate proprietile fizico-chimice i
biologice ale unei proteine. Termenul de structur teriar se refer la ntreaga conformaie
tridimensional a unei proteine. Ea indic n spaiul tridimensional modul n care fragmentele cu
structur secundar - -helixurile, -sheet, cotiturile, ndoiturile i buclele - se asambleaz pentru a
forma regiuni distincte, i cum aceste regiuni se raporteaz spaial una la alta. O regiune distinct este
un fragment din structura proteinei suficient pentru a executa o anumit funcie fizic sau chimic, cum
ar fi legarea unui substrat ori a unui ligand. Alte regiuni pot avea rolul de a lega o protein de o
membran sau de a interaciona cu o molecul care i moduleaz funcia. Unele proteine (triozofosfat
Figura 11. n catena unei proteine putem ntlni fragmente cu structuri secundare diferite.
-helix
-sheet
cotitur
bucl
41
izomeraza sau mioglobina) au o singur regiune funcional. Altele, cum ar fi protein kinazele au dou
regiuni distincte. Protein kinazele catalizeaz transferul unei grupri fosfat de pe molecula de ATP la
gruparea OH a unui rest de aminoacid hidroxilat dintr-o protein sau peptid. Fragmentul N-terminal,
care este bogat n structuri -sheet leag ATP-ul, n timp ce regiunea C-terminal care este bogat n
zone de -helix, se leag de substratul proteic. Gruprile care catalizeaz transferul gruprii fosfat se
afl localizate n bucla care face legtura dintre cele dou regiuni.
n unele cazuri, proteinele sunt ansambluri de mai multe lanuri polipeptidice, numite
protomeri. Structura cuaternar definete numrul i felul protomerilor, precum i relaia spaial
dintre ei. Interaciunile prin care se realizeaz agregatul molecular i care stabilizeaz structura
cuaternar se realizeaz de regul prin fore necovalente: legturi electrostatice, de hidrogen, hidrofobe
si van der Waals.
Proteinele monomere sunt alctuite dintr-un singur lan polipeptidic i nu au structur cuaternar.
Proteinele dimere sunt alctuite din dou lanuri polipeptidice.
Figura 12. Structura teriar este modul n care structurile secundare se organizeaz pentru a forma o protein sau un protomer al unei proteine complexe (oligomere).
-sheet
-helix
Figura 13. Numai proteinele cu dou sau mai multe lanuri polipepdidice au structur cuaternar
42
Homodimerii conin dou copii ale aceluiai lan polipeptidic, n timp ce heterodimerii conin
dou lanuri polipeptidice diferite. Literele greceti , , sunt folosite pentru a face distincie ntre
protomeri, iar indicii arat numrul din fiecare. De exemplu 4 desemneaz o protein
homotetrameric, iar 22o protein pentameric cu trei tipuri de protomeri, doi , doi i unul
Datorit faptului c proteinele, chiar cele mici, conin mii de atomi, reprezentarea unei proteine
cu indicarea fiecrui atom este deosebit de dificil. De regul se utilizeaz diagrame simplificate care
s prezinte caracteristicile principale ale proteinei.
3.3.3.1. Factorii care stabilizeaz structura teriar i cuaternar
Structura teriar i cuaternar a proteinelor este stabilizat prin interacii necovalente. Dintre
acestea, interaciile hidrofobe orienteaz majoritatea catenelor laterale ale aminoacizilor nepolari spre
interiorul moleculei de protein, punndu-i la adpost de contactul cu apa. Alte interacii importante
sunt legturile de hidrogen sau punile electrostatice dintre ionii carboxilat ai resturilor glutamil i
aspartil i gruprile ncrcate pozitiv ale resturilor lizil, arginil i histidil. Dei mai slabe dect
legturile covalente, numrul mare al acestor interacii confer un grad mare de stabilitate
conformaiilor funcionale ale proteinelor.
HIV-proteaz
insulin
Figura 14. Reprezentarea structurii cuaternare a ununi homodimer (HIV-proteaz ) i a unui heterodimer (insulin).
43
Unele proteine conin legturi disulfurice (-S-S-) care leag gruprile tio- a dou resturi
cisteinil. Formarea legturilor disulfurice presupune oxidarea gruprilor tiolice i necesit oxigen.
Legturile disulfurice intracatenare confer un plus de stabilitate conformaiei proteinei, pe cnd
legturile disulfurice intercatenare stabilizeaz structura cuaternar a anumitor proteine oligomere.
3.3.3.2. Denaturarea proteinelor
Denaturarea reprezint distrugerea organizrii structurii teriare i cuaternare a unei proteine.
Acest lucru poate fi realizat de orice factor care rupe legturile implicate n meninerea structurii
tridimensionale a unei proteine. Legturile care determin structura teriar sau cuaternar a unei
proteine sunt n general legturi slabe, i din acest motiv proteinele pot fi uor denaturate. Conformaia
total dezorganizat a unei proteine complet denaturate se numete conformaie ntmpltoare
(random coil).
Denaturarea proteinelor poate fi reversibil sau ireversibil. Agenii care provoac denaturarea
proteinelor sunt de natur fizic (temperaturi de peste 60C, agitare, raze X, radiaii ultraviolete,
ultrasunete) i chimic (acizi, baze, sruri ale metalelor grele, solveni organici, ageni tensioactivi).
HN
OHCH
2
O C
S S CH2
CH2
(CH2)4NH
3
+OCCH
2
O
-
S
CH2
S
H2C
CH2CNH
O
HOCH
2
H
CHCH2CH
3
CH3
CH
CH3
CH3
OC
Legturi disulfidice
Interacii hidrofobe
Atracii electrostatice
Legturi de hidrogen ntre grupri peptidice
Legturi de hidrogen ntre grupri funcionale
Figura 15. Tipuri de interacii care stabilizeaz structura teriar a proteinelor
H3N+
-Helix
Legturi de hidrogen
Legturi de hidrogen
Legturi de hidrogen ntre o grupri funcionale i legturi peptidice
Structur- sheet COO-
44
Consecinele denaturrii sunt: pierderea activitii biologice, diminuarea solubilitii, creterea
numrului de grupri SH libere, pierderea capacitii de a se combina cu apa, modificarea vscozitii
i a presiunii osmotice, creterea susceptibilitii la hidroliza enzimatic.
3.3.3.3. Determinarea experimental a structurii tridimensionale a proteinelor
Cristalografia cu raze X. De la determinarea structurii mioglobinei n 1960, structura a mii de
proteine a fost ntre timp determinat prin cristalografie cu raze X. Etapa cheie n acest proces l
constituie precipitarea proteinei n condiiile n care ea formeaz cristale regulate care difract razele X.
Acest lucru se poate realiza prin tratarea unor picturi fine de soluie proteic cu diverse combinaii de
pH-uri i ageni de precipitare (sruri, polietilenglicol). O structur tridimensional detaliat poate fi
dedus combinnd datele structurii primare cu modul de difracie a unui mnunchi monocromatic de
raze X. Apariia unor algoritmuri i programe computerizate au fcut ca interpretarea spectrelor de
difracie s fie din ce n ce mai simpl; inconvenientul major rmne greutatea de a obine proteina n
stare cristalin. Exist o serie de dovezi, printre care pstrarea proprietilor catalitice ale enzimelor,
care sugereaz ca structurile determinate prin cristalografie reflect structura proteinelor din soluii. O
metod complementar cristalografiei cu raze X este spectroscopia de rezonana magnetic nuclear
(RMN).
Modelarea molecular. Un instrument ajuttor la determinrile empirice de structur
tridimensional a proteinelor este reprezentat de utilizarea tehnologiilor de calcul n modelarea
molecular. n prezent exist dou tipuri de tehnici de modelare. n prima, structura tridimensional a
unei proteine este folosit ca punct de pornire n construirea unui model de structur tridimensional
posibil pentru o protein omoloag. n a doua, sunt utilizate programele soft pentru a manipula un
model static furnizat de cristalografie. n astfel de programe se simuleaz schimbrile conformaionale
ce ar avea loc n diferite condiii (schimbri de pH, temperatur, trie ionic, ligand). n paralel,
oamenii de tiin studiaz i bazele de date ce conin structuri cunoscute, n ncercarea de a concepe un
program soft care s prevad conformaia tridimensionl a unei proteine direct din structura sa primar.
3.3.3.4. Boli neurologice cauzate de modificri n conformaia proteinelor Prionii. Encefalopatiile spongiforme transmisibile sau bolile prionilor sunt maladii neurodegenerative fatale
caracterizate prin modificri spongiforme i pierderi ale funciilor neuronilor cauzate de depunerea unor agregate proteice insolubile (prioni) n celulele nervoase. Acest tip de maladii include boala Creutzfeldt-Jakob la oameni, cpierea la oi i encefalopatia spongiform bovin la vaci (boala vacii nebune). Sursa i mecanismul transmiterii prionilor au fost mult vreme necunoscute, mai ales c nu s-a putut identifica nici o gen viral sau bacterian care sa i codifice. n momentul de fa se crede c maladiile prionice sunt de fapt maladii ale conformaiilor proteice transmise pe calea alterrii conformaiei, de unde i proprietile fizice neobinuite ale proteinelor endogene ale organismului bolnav. Proteina PrP, protein uman nrudit cu prionii, este o glicoprotein codificat de o gen aflat pe cromozomul 20. n mod normal, este monomeric i
bogat n zone -helix. PrPc este un tip de proteine prionice patologice ce pot servi ca inductori pentru modificrile
45
conformaionale ale PrP normale n PrPsc. PrPsc este bogat n structuri -sheet cu multe catene hidrofobe provenite de la aminoacizii nepolari ndreptate spre faza apoas, condiii n care mai multe moclecule de PrPsc se asociaz puternic, formnd agregate rezistente la aciunea proteazelor. Deoare un prion patologic sau o molecu nrudit poate induce modificri conformaionale n lan, bolile prionice se pot transmite prin intermediul strict al proteinei, fr implicarea moleculelor de ADN sau ARN.
Maladia Alzheimer. Caracteristica principal a maladiei Alzheimer o constituie replierea sau plierea incorect a
unei proteine cerebrale, numit -amiloid. n timp ce cauzele maladiei ramn necunoscute, este clar c plcile senile
caracteristice i fasciculele neurofibrilare conin agregate de -amiloid, o polipeptid de 4,3 kDa rezultat din clivarea de ctre o proteaz a unei proteine mai mari (proteina precursoare de amiloid). La pacienii cu maladie Alzheimer se observ o
cretere semnificativ a nivelului de -amiloid, aceast protein suferind i modificri conformaionale de la forma bogat
n -helixuri la cea bogat n structuri -sheet, devenind astfel capabile de autoagregare. Se pare ca mediatorul acestei transformri conformaionale este apolipoproteina E.
3.3.3.5. Structura colagenului
Maturare proteinelor de multe ori implic ruperea i/sau formarea de legturi covalente, un
proces numit modificare posttranslaional. Multe proteine sunt biosintetizate iniial ca precursori
mai mari numii proproteine. De multe ori segmentele proteice care dispar ulterior servesc iniial
pentru orientarea proteinelor ctre anumite compartimente celulare sau faciliteaz transportul prin
membranele celulare. n alte cazuri acestea au rolul de a inhiba activitatea potenial duntoare a unei
proteine; astfel, proteaze de tipul tripsinei si chimotripsinei rmn inactive pn cnd aceste proteine
ajung la destinaia final, moment n care fragmentele protectoare sunt ndeprtate prin proteoliz
selectiv. Alte modificri chimice pot avea loc adugnd noi funcionaliti proteinei. Maturarea
colagenului se face prin ambele aceste procese.
Colagenul este o protein fibroas. Colagenul este cea mai abundent protein fibroas,
reprezentnd mai mult de 25% din masa proteic uman. Alte proteine fibroase sunt keratina i
miozina. Aceste proteine reprezint baza structural a celulelor (citoscheletul) i a esuturilor.
Rezistena i elasticitatea pielii este dat de o reea de fibre de colagen i keratin, n timp ce oasele i
dinii au la baz o reea de colagen asemntoare armturilor de oel din betonul armat. Colagenul intr
i n alctuirea esuturilor conjunctive (tendoane, cartilagii, ligamente). Marele grad de rezisten
elastic a colagenului necesar pentru a duce la ndeplinire aceste roluri structurale deriv din
secvenele repetate de aminoacizi i din structura secundar foarte regulat.
Moleculele de colagen formeaz un triplu helix. Tropocolagenul este alctuit din trei fibre,
fiecare avnd cca 1000 resturi de aminoacizi, mpletite ntr-o conformaie unic, numit triplu helix. O
fibr matur de colagen are aspectul unui baston lung, cu un raport axial de aproximativ 200. Este
alctuit dintr-o mpletitur de trei catene polipeptidice rsucite spre stnga. Aceast mpletitur se
rsucete spre dreapta pentru a forma triplul helix al colagenului. Sensurile opuse de rsucire al acestui
super helix i al componentelor sale fac ca fibra de colagen s fie deosebit de rezistent (acelai
principiu se aplic la cablurile de susinere a podurilor suspendate).
46
Triplul helix al colagenului are 3,3 resturi de aminoacizi pe spir. Gruprile R din fiecare caten sunt
aranjate att de compact, nct pentru a putea ncpea, fiecare al treilea aminoacid trebuie s fie o
glicin. Colagenul este de asemenea bogat n prolin i hidroxiprolin, existnd secvena repetitiv
Gly-X-Y, n care Y este de obicei prolin sau hidroxiprolin. Triplul helix este stabilizat prin legturi
de hidrogen care se formeaz intercatenar. Gruprile OH ale hidroxiprolinei de asemenea particip la
formarea legturilor de hidrogen intercatenare. Un plus de stabilitate este conferit de legturi covalente
ncruciate (att intra ct i intercatenare) ntre resturi de lizin modificate chimic posttranslaional.
Colagenul este sintetizat sub forma unui precursor mare. Colagenul este sintetizar iniial
sub forma unei polipeptide numit procolagen, n care numeroase resturi prolil si lizil sunt hidroxilate
de prolilhidrolaz i lizilhidrolaz, enzime care necesit acid ascorbic (vitamina C) pentru o bun
funcionare. Resturile hidroxiprolil i hidroxilizil nou formate confer un plus de stabilitate prin
formarea unor noi legturi de hidrogen. n plus, glucozil- i galactozil transferaze ataeaz resturi de
glucoz sau galactoz la gruprile hidroxi de la anumite resturi de hidroxilizin. Ulterior acestor
transformri, partea central a procolagenului se asociaz cu alte molecule formnd triplul helix. Acest
proces este nsoit de ndeprtarea prin proteoliz selectiv a prii globulare amino-terminale precum i
a extensiilor carboxi-terminale. Anumite resuri lizil sunt modificate de lizil oxidaz, o cupru-protein
care transform gruparea amino n grupare aldehidic. Aceste grupri aldehidice se condenseaz cu
gruprile amino ale lizinelor nemodificate, formnd baze Schiff (en-imine) care sunt ulterior reduse,
cu formare de legturi simple C-N. Aceste legturi covalente leag ncruciat catenele polipeptidice,
conferind fibrei de colagen o extraordinare rezisten i rigiditate.
3.3.3.6. Anumite insuficiene genetice i nutriionale perturb maturarea colagenului. Cel mai bine cunoscut defect n biosinteza colagenului este scorbutul, care este provocat de lipsa vitaminei C din
alimentaie. Aceast caren perturb buna funcionare a prolil- i lizil- hidrolazelor. Rezult un deficit n numrul resturilor de hidroxiprolin i hidroilizin care submineaz stabilitatea conformaional a fibrelor de colagen, ducnd la sngerarea
Triplu helix de colagen -Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-
Structura primar
Figura 16. Structura colagenului.
47
gingiilor, umflarea ncheieturilor, nevindecarea rnilor, i n cele din urm la moarte. Sindromul Menkes, caracterizat prin ntrzierea creterii, reflect o deficien de cupru n alimentaie, care duce la o proast funcionare a liziloxidazei, enzim care catalizeaz o reacie cheie n procesul de formare a legturilor ncruciate ce contribuie la rezistena fibrei de colagen.
Deficiene genetice n biosinteza colagenului includ cteva forme de osteogenez imperfect caracterizate prin fragilitatea oaselor. n sindromul Ehlers-Dahlos, un grup de boli ale esutului conjunctiv, apar defecte n genele care codific procolagen-N-peptidaza sau lizilhidrolaza, defecte care provoac anormaliti ale pielii i fragilizri ale ncheieturilor.