MODUL III 7. Metabolism 48 7.1. Considera]ii generale 48 7.2. Procese generale `n anabolism 48 7.3. Procese generale `n catabolism 49 7.4. Metabolismul intermediar al glucidelor 52
MODUL IV – Lucr\ri practice
1. Acizii organici din plante. Forme de aciditate 57 2. Oze (monoglucide) 58 3. Oligozide 62 4. Dozarea glucidelor reduc\toare prin metoda iodometric\ 65 5. Determinarea polarimetric\ a amidonului prin
metoda Ewers – Grossfeld 66 6. Analiza calitativ\ a gliceridelor 67 7. Determinarea indicilor ce caracterizeaz\ lipidele 68 8. Reac]ii calitative pentru aminoacizi 72 9. Metoda Sorensen de dozare a aminoacizilor 74 10. Analiza calitativ\ a proteinelor 75 11. Dozarea azotului total [i a proteinei brute 81 12. Dozarea acidului ascorbic (vitaminei C) 84 13. Determinarea activit\]ii catalazei 86 Bibliografie 88 Cuprins 89
3
Introducere
Dezvoltarea [i realiz\rile remarcabile ale biochimiei - multe `ncununate cu Premiul Nobel - au impus-o cu autoritate ca unul din cele mai dinamice domenii `n ansamblul [tiin]elor contemporane. Obiectivele esen]iale ale biochimiei se refer\ la organizarea chimic\ a organismelor vii sub raportul structurii, func]iei [i propriet\]ilor biomoleculelor, la natura [i mecanismele reac]iilor biocatalitice asociate structurilor celulare [i infracelulare, la procesele biochimice ale metabolismului, la reglarea [i controlul biochimic al activit\]ii celulare. Biochimia vegetal\ pune la dispozi]ia studen]ilor [i speciali[tilor un material documentat cât mai aproape de specialitatea lor. Prin con]inutul s\u acest material urm\re[te `nsu[irea cuno[tin]elor de biochimie absolut necesare altor discipline care se bazeaz\ pe datele biochimice, cât [i pentru rezolvarea unor probleme practice cu care se confrunt\ viitorul specialist. Biochimia este [tiin]a care studiaz\ materia vie [i fenomenele specifice acesteia sub raportul organiz\rii moleculare, a compozi]iei [i constitu]iei chimice, precum [i a proceselor de transformare (biosintez\ [i degradare) a acestor biomolecule prin care se genereaz\ [i se utilizeaz\ energia necesar\ manifest\rilor vitale. Rezult\ astfel c\ abordarea biochimic\ a materiei vii implic\ dou\ aspecte: a) biochimia descriptiv\ (identificarea [i descrierea substan]elor din alc\tuirea materiei vii); b) metabolismul (cunoa[terea mecanismelor de transformare a materiei vii, transformare care st\ la baza vie]ii).
4
MODUL I
1. GLUCIDE 1.1. Considera]ii generale, clasificare Glucidele (hidra]i de carbon, zaharide) sunt substan]e universal r\spândite `n regnul vegetal [i animal. ~n organismele vegetale superioare, propor]ia lor este de peste 50% din substan]a uscat\. Sub aspect fiziologic [i biochimic sunt substan]e foarte importante. Ele au atât rol structural cât [i energetic, furnizând `n urma proceselor metabolice 50-70% din energia total\. Clasificarea glucidelor ~n func]ie de posibilitatea de hidroliz\ [i unele caracteristici structurale, glucidele se clasific\ `n urm\toarele grupe: oze [i ozide. Ozele sunt glucide simple care nu mai hidrolizeaz\. Ozidele sunt substan]e care sub influen]a enzimelor sau acizilor sufer\ scindare hidrolitic\, trecând numai `n oze (`n cazul holozidelor) [i `n oze [i substan]e neglucidice (agliconul), `n cazul heterozidelor. 1.2. Oze (monoglucide, monozaharide): structur\, izomerie, propriet\]i, reprezentan]i Ozele con]in o grupare carbonil [i mai multe grup\ri hidroxil, pot fi considerate produ[i de oxidare ale poliolilor aciclici. Dac\ se oxideaz\ gruparea de alcool primar se ob]ine o grupare func]ional\ de aldehid\ (aldoze), iar dac\ se oxideaz\ o grupare de alcool secundar se ob]ine o ceton\ (cetoze). ~n func]ie de num\rul atomilor de carbon din molecule, aldozele [i cetozele naturale pot fi: trioze, tetroze, pentoze, hexoze, heptoze, etc. 1.2.1. Structura [i izomeria ozelor ~n general, ozele au caten\ liniar\ aciclic\, doar câteva au catena ramificat\, de exemplu apioza (pentoz\ din p\trunjel).
Unele dintre propriet\]ile fizico-chimice ale ozelor nu pot fi explicate cu aceste structuri de exemplu reac]ia Schiff sau fenomenul de mutarota]ie. Aceste comport\ri ale ozelor au putut fi explicate, admi]ând pentru oze o structur\ ciclic\ (Tollens 1884 [i E. Fischer 1912). Ciclizarea este rezultatul adi]iei intramoleculare a unei grup\ri hidroxilice la gruparea carbonil. Teoretic, gruparea carbonil ar putea reac]iona cu oricare din grup\rile hidroxil, dar din cauza unghiurilor de valen]\ ale atomului de carbon, 109028', stabile sunt numai ciclurile cu 5 [i 6 atomi. Astfel, ciclizarea la aldoze se face `ntre gruparea carbonil de la C1 [i hidroxilii din pozi]ia 5 sau 6. ~n acest caz la C1 (aldoze) [i C2 (cetoze), apare o grupare hidroxil numit\ hidroxil glicozidic sau semiacetalic cu propriet\]i deosebite de ale celorlal]i hidroxili din molecul\.
C OH
OHCH2
CC OH
OH
2CH
HH
D - apioza D - riboza
HH
CH2
OHOHC
C
OH
H OCC OHH H OHC
C OH
OH
CC OH
OH
2CH
HH
HC
D - glucoza
OH2CHOC
C H
HH
CH2
OHOHC
C
OH
D - fructoza
HOHO
5
Astfel heterociclul cu 6 atomi se nume[te piranozic, deoarece deriv\ de la piran [i cel cu 5 atomi se nume[te furanozic deoarece provine de la furan. Monoglucidele cele mai importante se g\sesc libere, cel mai adesea ca piranoze, iar ca furanoze se afl\ `n compu[i (diglucide, poliglucide, acizi nucleici). Pentru redarea corect\ a valen]elor, W. N. Haworth a propus formulele perspectivice. Trecerea de la reprezentarea Tollens la structura Haworth se face ]inând cont de urm\toarele reguli: radicalii orienta]i la dreapta `n formula Tollens, se g\sesc sub planul hexagonal sau pentagonal `n structura Haworth, iar cei din partea stâng\ se g\sesc deasupra planului. Carbonii care nu se g\sesc `n ciclu se scriu deasupra planului. __________________________________________________________________ ♦ Sarcin\ de lucru:
Scrie]i formele piranozice [i furanozice ale glucozei [i fructozei. __________________________________________________________________
Izomeria ozelor
Ozele sunt compu[i care formeaz\ mai multe tipuri de izomerie. ~ncepând de la trioze `ntâlnim izomeria de compensa]ie func]ional\, izomerii fiind determina]i de natura grup\rii carbonilice. Propriet\]ile fizico-chimice ale aldozelor [i cetozelor cu acela[i num\r de atomi de carbon, sunt mult diferite. __________________________________________________________________
Activitate ♦ Indica]i ozele izomere de compensa]ie func]ional\ din: trioze, pentoze [i hexoze. __________________________________________________________________ Stereoizomeria ozelor a) Activitatea optic\. Ozele, cu excep]ie cetotriozele prezint\ activitate optic\ `ntrucât con]in `n molecula lor atomi de carbon substitui]i asimetric. Prezen]a acestor carboni determin\ apari]ia stereoizomerilor dextrogiri (+) care rotesc planul luminii polarizate spre dreapta [i levogiri (-) care rotesc planul luminii polarizate spre stânga. Cele dou\ forme stereoizomere diferite se numesc enantiomeri sau antipozi optici
C H
HH
CH 2
OHOHC
C
OH
H OCC OHH H OHC
C OH
C OHH
HC
OH
CC OH
OH
2CH
HH
HC
OH
CC
OH
2CH
HH
HC
OHC
2CHH
C O C
O
CH 2OH CH 2OHHO OH
Aldohexoza(forma carbonilica)
Aldohexoza (forma ciclica)
Cetohexoza (forma ciclica)
Cetohexoza(forma carbonilica)
HO HO HO HO
O OCH
2OHHO
OHOHOH
OHOHOH
OHCHCH
2
2
HO
H
H
HH H
H
H H
Forma piranozica Forma furanozica
6
___________________________________ Sarcin\ de lucru ♦ Prezenta]i num\rul stereoizomerilor pentru aldopentoze, cetopentoze, aldohexoze [i cetohexoze. ___________________________________
~n determinarea structurii ozelor au o deosebit\ importan]\ no]iunile de serie steric\ D [i serie steric\ L. Pentru stabilirea acestora se ia drept criteriu structura aldehidei glicerice care are un singur carbon asimetric. Ea va avea cele dou\ forme enantiomere (+) [i (-). Forma spa]ial\ `n care hidroxilul de la carbonul asimetric este `n partea dreapt\ se noteaz\ cu D, iar cealalt\ form\ cu L. Toate ozele care au configura]ia atomului de carbon asimetric cel mai `ndep\rtat de gruparea carbonil la fel cu D-aldehida gliceric\, fac parte din seria D iar cele care `l au `n partea stâng\ fac parte din seria L. ~n plante predomin\ ozele din seria steric\ D. b) Epimeria ozelor. Organismele vii sunt capabile s\ transforme o oz\ `n alta. Aceste transform\ri constau `n inversarea configura]iei unui atom de carbon asimetric, astfel glucoza este epimer\ cu manoza. Inversarea are loc la carbonul 2 la manoz\.
Epimeria poate avea loc atât la aldoze cât [i la cetoze. Asemenea transform\ri au loc sub ac]iunea enzimelor. __________________________________________________________________ Activitate
♦ Analiza]i o alt\ hexoz\ care poate fi epimer\ cu glucoza `n afar\ de manoz\.
Scrie]i cetopentozele epimere. __________________________________________________________________ c) Anomeria α [i β sau fenomenul de mutarota]ie. Prin ciclizarea ozelor, atomul de carbon din func]iunea carbonil devine asimetric. Hidroxilul glicozidic (semiacetalic) poate avea dou\ pozi]ii: `n dreapta carbonului `n formula Tollens sau sub plan `n formula perspectivic\. Aceast\ pozi]ie corespunde izomerului α . Izomerul β corespunde pozi]iei din stânga a hidroxilului sau deasupra planului.
H OHCC OH
CH2OH
HO* *
OH2CH
HO CC H
Aldehida D (+) Aldehida L (- glicerica glicerica
HO
D (+)- glucoza
C H
HH
CH 2
OHOHC
C
OH
H OCC OHH
HO
D (+)- manoza
C H
HH
CH 2
OHOHC
C
OH
H OCC OHHO
epimerizare
C
C
OH
OHH O
O
OHOH
HOHOH_
_
_
_O
OH
__
__
____
__
_
_ H
OH OHC
C
Forma α Forma β
7
Ace[ti izomeri se cunosc sub numele de anomeri. Formele α [i β au fost izolate `n stare pur\. Trecerea unei monoglucide din forma α `n form\ β, poart\ numele de mutarota]ie, fenomen ce const\ `n modificarea `n timp a valorii unghiului de rota]ie specific\, stabilindu-se un echilibru `ntre cele 2 forme izomere. De exemplu, la glucoz\, izomerul α rote[te cu +112,2º , izomerul β rote[te cu +18,7º. Cei doi izomeri α ↔ β la echilibru rotesc cu +52,2º. 1.2.2. Propriet\]ile fizice [i chimice ale ozelor a) Propriet\]i fizice. Ozele sunt substan]e solide cristalizate, u[or solubile `n ap\, greu solubile `n alcool, eter, cloroform. Au gust dulce, cu unele excep]ii. b) Propriet\]i chimice: sunt date de grup\rile func]ionale din molecul\. Reac]ii pe seama grupei carbonil (>C=O) Reducerea. Ozele sub ac]iunea hidrogenului activat catalitic se transform\ `n polioli. Pentozele se transform\ `n pentitoli iar hexozele `n hexitoli.
Reac]ii de oxidare Oxidarea se realizeaz\ mai u[or la aldoze [i mai greu la cetoze. Asfel, sub
ac]iunea oxidan]ilor slabi (apa de Cl sau Br), aldozele trec `n acizi aldonici.
Aceast\ reac]ie demonstreaz\ caracterul reduc\tor al aldozelor. Aceast\
proprietate este folosit\ `n chimia analitic\ pentru identificarea ozelor folosind urm\torii reactivi: Tollens, Fehling, Nylander, acid picric, etc. Prin oxidare mai energic\ a aldozelor, cu acid azotic concentrat se ob]in acizii dicarboxilici, numi]i acizi zaharici.
H - C = OH - C - OH
HO - C - HH - C - OHH - C - OH
CH2 - OH
D (+) glucoza
2
COOHH - C - OH
HO - C - HH - C - OHH - C - OH
COOH
+ O
Acid D (+) glucozaharic
H - C = OH - C - OH
HO - C - HH - C - OHH - C - OH
CH2 - OH
D (+) glucoza
+ H2
CH2 - OHH - C - OH
HO - C - HH - C - OHH - C - OH
CH2 - OH
+ H2
C = OHO - C - H
H - C - OHH - C - OH
CH2 - OH
CH2 - OH
Sorbitol D (-) fructoza
8
Dac\ oxidarea are loc cu protejarea func]iunii carbonil se ob]in acizi uronici. Ace[ti acizi se g\sesc `n structura unor poliozide neomogene sub form\ ciclizat\.
Reac]ii datorate grup\rii hidroxil a) Reac]ia de eterificare. Grup\rile hidroxil ale ozelor pot fi metilate - hidroxilul glicozidic reac]ioneaz\ direct cu metanolul, iar celelalte grup\ri necesit\ condi]ii mai energice, de exemplu prezen]a I - CH3, astfel formându-se metil-eterii. b) Reac]ia de esterificare - esterii pot fi ob]inu]i atât cu acizii anorganici cât [i cu acizii organici. Din punct de vedere biologic prezint\ importan]\ esterii acidului ortofosforic. __________________________________________________________________ ♦ Sarcin\ de lucru. Scrie]i esterii fosforici ai principalelor pentoze [i hexoze. __________________________________________________________________ 1.2.3. Reprezentan]i mai importan]i ai ozelor Trioze [i tetroze. Acestea apar `n natur\ `n special sub form\ de esteri fosforici `n metabolismul glucidelor.
H - C = OH - C - OH
CH2 - OH
D (+) glicerin aldehida
C = OCH2 - OH
CH2 - OH
dihidroxiacetona
H - C = OH - C - OH
CH2 - OHH - C - OH
D (+) eritroza
H - C = OH - C - OH
CH2 - OH+
OHHO - P = O
OH- H O2
H - C = OH - C - OH
CH2 - O - P = OOH
OH
D (+) glicerin aldehida ester D (+) glicerin- aldehid - 3 - fosfat
CH2 - OHO
OH
OHOHHO
CH3 - OH- H O2
+O
OH
OHO - CH3HO
ICH3+ 4
- 4 HI
CH2 - OHO
OMe
OMeO - CH3MeO
CH2 - OCH3
glucozametil glucopiranoza glucoza metilata
H - C = OH - C - OH
HO - C - HH - C - OHH - C - OH
CH2 - OH
D (+) glucoza
2
COOH
H - C - OHHO - C - H
H - C - OHH - C - OH
+ 1/2 O
Acid D (+) glucuronic
H - C = O
9
Pentoze. Al\turi de hexoze, constituie cele mai importante [i r\spândite oze. Se g\sesc mai mult sub form\ combinat\ de poliglucide (pentozani), intrând `n structura unor poliglucide neomogene cum sunt: hemicelulozele, substan]ele pectice, gumele etc
Riboza [i dezoxiriboza se g\sesc `n toate celulele vii, deoarece intr\ `n structura acizilor nucleici (ARN [i ADN). Le mai g\sim `n constitu]ia unor vitamine [i enzime. Forma cea mai `ntâlnit\ este cea furanozic\.
Xiloza se g\se[te sub form\ polimerizat\ `n xilanii care `nso]esc celuloza `n ]esuturile vegetale. Cantit\]i mari de xilani se g\sesc `n paie, coceni de porumb, tije de floarea soarelui. Structura cea mai `ntâlnit\ este cea piranozic\. Arabinoza este una din pu]inele pentoze din seria L care se g\se[te `n natur\.
Ribuloza este cea mai important\ cetopentoz\ deoarece pe ea se fixeaz\ CO2 `n procesul de fotosintez\. Hexoze. Sunt cele mai r\spândite oze atât `n stare liber\ cât [i `n form\ combinat\.
D(+) glucoza sau zah\rul de struguri, `n stare liber\ se g\se[te `n cantitate mic\ `n toate organele plantelor, predomin\ `n fructe [i `n special `n struguri. Forma de structur\ este piranozic\. Glucoza se g\se[te `n cantitate mare sub form\ combinat\ `n holozide: maltoz\, zaharoz\, celobioz\, lactoz\, amidon, celuloz\ [i `n heterozide. Pentru regnul animal ea reprezint\ glucida de circula]ie.
Galactoza se g\se[te `n cantitate mic\ `n organismul vegetal, de exemplu `n poliglucidele din semin]ele de in [i agar-agar. Manoza este r\spândit\ `n plante sub forma poliozidelor numite manani. Fructoza este cetohexoza cea mai r\spândit\ atât `n stare liber\ cât [i combinat\. Liber\ o g\sim `n fructe, mierea de albine, tomate, iar combinat\ `n
H - C = OH - C - OH
CH2 - OH
H - C - OHH - C - OH
H - C = OH - C - H
CH2 - OH
H - C - OHH - C - OH
H - C = O
HO - C - H
CH2 - OH
H - C - OH
H - C - OH
H - C = O
HO - C - H
CH2 - OH
H - C - OH
HO - C - H
D (+) riboza D (+) dezoxiriboza D (+) xiloza
L arabinoza
HO - C - HH - C - OH
CH2 - OH
C = O
H - C - OHCH2 - OH
CH2 - OHCH2 - OHC = O
H - C - OH
D xiluloza D ribuloza
H - C = O
H - C - OHHO - C - H
H - C - OH
H - C - OHCH2 - OH
D (+) glucoza
OOCH2 - OH
CH2 - OH
H - C - OH
HO OH
HH
H
HH
H HH
OH OH
OHOHOH
D (+) glucopiranoza D (+) glucofuranoza
10
zaharoz\ [i fructani. Liber\ ea are structur\ piranozic\ iar combinat\, structur\ furanozic\. Este cea mai dulce oz\. Heptoze. Sedoheptuloza este cea mai important\, se g\se[te `n cloroplaste [i particip\ `n fotosintez\ sub forma esterilor fosforici. 1.3. Oligozide ~n aceast\ grup\ se situeaz\ glucidele alc\tuite din 2 - 6 molecule de oz\, identice sau diferite (diholozide, triholozide, tetraholozide etc.) 1.3.1. Diholozide (dizaharide) Dintre oligozide, cele mai importante sunt diholozidele care rezult\ prin eliminarea unei molecule de ap\ `ntre dou\ oze. Leg\tura de tip eter se poate face `ntre un hidroxil glicozidic [i unul neglicozidic [i rezult\ dizaharide cu caracter reduc\tor, iar dac\ aceast\ leg\tur\ se face `ntre hidroxilii glicozidici, rezult\ dihazaride nereduc\toare. Dintre dizaharidele reduc\toare mai importante sunt: maltoza, celuloza, lactoza, gen]iobioza etc.
Maltoza numit\ [i zah\rul de mal], apare `n cantitate mare `n germenii de orz `ncol]it. Apare de asemenea la degradarea enzimatic\ a amidonului. Fermenteaz\ u[or, de aceea are rol important la fabricarea berii. Ea este format\ din dou\ molecule de α glucopiranoz\ legate 1 - 4 α glicozidic. Celobioza este format\ din 2 molecule de β glucopiranoz\. Resturile de glucoz\ sunt rotite cu 180° una fa]\ de alta. Ea constituie unitatea structural\ a unor poliozide cum ar fi celuloza.
Lactoza este format\ dintr-o molecul\ de β galactopiranoz\ [i una de α glucopiranoz\. Se g\se[te `n laptele mamiferelor (4,8% `n laptele de vac\). Sub ac]iunea unor bacterii lactice sufer\ fermenta]ia lactic\. Gen]iobioza este format\ dintr-o molecul\ de β glucopiranoz\ [i alta de α glucopiranoz\ legate 1 - 6. ~n cantitate mare se g\se[te `n triglucidul gen]ianoz\ [i glicozidul amigdalin\. Dizaharidele reduc\toare au ca reprezentan]i: zaharoza [i trehaloza.
O
CH2OHOH
OH
OH
O
CH2OH
OH
OHOH
O
CH2
OHOH
OH
OH
O
CH2OH
OH
OH
OH
O
O
lactoza gentiobioza
OCH2OH
HH
OHH
OH
OH
H
H OCH2OH
HH
H
OH
OH
H
H
OHOO
CH2OH
HH
H
OH
OH
H
H
OHOO
CH2OH
HH
H
OH
OH
HHO H
maltoza celobioza
H - C = OH - C - OH
HO - C - HHO - C - H
H - C - OHCH2 - OH
D (+) galactoza
H - C = O
H - C - OH
HO - C - HHO - C - H
H - C - OHCH2 - OH
D manoza
C = OHO - C - H
H - C - OHH - C - OH
CH2 - OH
CH2 - OH
D (-) fructoza
C = OHO - C - H
H - C - OH
H - C - OHCH2 - OH
CH2 - OH
D sedoheptuloza
H - C - OHOHO - CH2
HH
HOH OHHO
CH2 - OH
D fructofuranoza
11
Zaharoza este cel mai r\spândit diholozid din regnul vegetal, g\sindu-se `n semin]e, frunze, fructe etc. ~n cantitate mare se g\se[te `n r\d\cinile sfeclei de zah\r (16 - 20%) [i `n tulpinile trestiei de zah\r (14 - 16%). Este format\ dintr-o molecul\ de α glucopiranoz\ [i una de β fructofuranoz\ legate 1 - 2. Zaharoza este dextrogir\ (+66,5); `n plante ea are rol de substan]\ de rezerv\. Trehaloza este format\ din 2 molecule de α glucopiranoz\ legate 1 - 1. Se g\se[te `n drojdia de bere, `n diferite ciuperci, `n alge ro[ii [i `n licheni. 1.4. Poliozide (poliglucide) Poliozidele sunt substan]e macromoleculare formate dintr-un num\r mare de molecule de oze. Sunt substan]e optic active cu mas\ molecular\ mare. Ele se g\sesc atât `n regnul vegetal cât [i cel animal, cu un rol fiziologic important; unele constituie substan]e de rezerv\ [i de nutri]ie (amidonul, glicogenul), iar altele formeaz\ scheletul rigid al plantelor (rol de structur\) cum sunt: celuloza, hemiceluloza etc. Poliozidele formate dintr-un singur fel de oze sau deriva]i de oze se numesc omogene, iar cele formate din oze diferite se numesc neomogene. Ele sunt materii prime `n industria alimentar\, farmaceutic\, textil\ etc. 1.4.1. Poliglucide omogene Cele mai importante sunt glucanii (amidonul, celuloza, glicogenul). Amidonul este primul produs u[or vizibil al fotosintezei. El reprezint\ o glucid\ de rezerv\ [i este depozitat `n cantitate mare `n semin]e, fructe, tuberculi [i chiar p\r]ile lemnoase ale plantelor. Con]inutul cel mai ridicat de amidon `l g\sim la orez boabe (70 - 80%), cereale (40 - 65%), fasole (40 - 43%), cartofi (13 - 25%). Amidonul este o substan]\ alb\, granular\ cu aspect amorf, insolubil `n ap\ rece; `n ap\ cald\ la 60 - 800C formeaz\ o solu]ie coloidal\. Cu iodul d\ o colora]ie albastr\. Granulele de amidon sunt alc\tuite din dou\ componente: amiloza (20 - 30%) [i izoamiloza (amilopectina) repartizat\ `n granule `n propor]ie de 70 - 80%. Atât amiloza cât [i izoamiloza la hidroliz\ total\ trec `n molecule de α glucoz\. ~n amiloz\ resturile de α D glucoz\ sunt legate `ntre carbonii 1 - 4, având un grad de polimerizare cuprins `ntre 250 - 3000 molecule. ~n izoamiloz\ resturile de α glucoz\ sunt legate 1 - 4 [i 1 - 6. Ramifica]iile apar cam dup\ 25 resturi de α glucoz\. Izoamiloza are un grad mai mare de polimerizare decâ amiloza.
Cea mai important\ reac]ie a amidonului este hidroliza. Aceasta are loc `n prezen]a enzimelor prin `nc\lzire. Hidroliza are loc treptat, mai `ntâi cu formare de poliozide numite dextrine, apoi maltoz\ iar `n final glucoz\.
O
O
O
CH2OH
CH2OHHO
OH
HO
HO
HO
HOH2C
Zaharoza
HOHO
OH
CH2OH
O
O
HO
HO
OHO
HOH2C
Trehaloza
12
Celuloza are rol de substan]\ de structur\, constituind partea principal\ a pere]ilor celulari. Cea mai mare cantitate de celuloz\ se g\se[te `n bumbac, `n propor]ie de 99,8% [i `n lemn 30 - 40%.
Celuloza are aceea[i formul\ molecular\ ca [i amidonul (C6H10O5)n. Molecula de celuloz\ este format\ din resturi de β glucoz\ legate 1 - 4 β glicozidic, `n care resturile de glucoz\ sunt rotite unul fa]\ de altul cu 1800. Unitatea structural\ a celulozei este celobioza. Masa molecular\ a celulozei are valori mari, ceea ce indic\ un grad mare de polimerizare, de ordinul miilor. ~n stare pur\ celuloza este o substan]\ alb\ cu aspect amorf f\r\ gust. Este insolubil\ `n ap\ [i `n al]i solven]i, este solubil\ `n reactivul Schweizer (hidroxid tetra amoniacocupric).
Test de autoevaluare:
1. Monoglucidele sunt compu[i cu func]iuni mixte:
a) o grupare carbonil [i mai multe grup\ri hidroxil; b) o grupare hidroxil [i mai multe grup\ri carbonil; c) o grupare carboxil [i mai multe grup\ri hidroxil; d) o grupare carbonil [i o grupare amin\.
2. Monoglucidele pot prezenta urm\toareke tipuri de izomerie: a) izomerie optic\; b) izomerie geometric\; c) izomerie de pozi]ie; d) izomerie de caten\.
3. Izomeria optic\ poate determina: a) conforma]ia scaun – baie; b) activitatea optic\ dextrogir\ [i levogir\; c) fenomenul de mutarota]ie; d) epimeria.
4. Urm\torii reprezentan]i ai monoglucidelor - glucoza, fructoza, manoza, galactoza – sunt:
a) trioze
OCH2OH
OH
HOO
CH2OH
OH
HO HO
OH
CH2OHO
HO
OH
CH2OHOO
OO
O
O
Fragment de celuloza
13
b) tetroze; c) pentoze; d) hexoze.
5. Caracterul reduc\tor al aldozelor se pune `n eviden]\ cu: a) reac]ia Selivanov; b) reac]ia Tollens; c) reac]ia Molisch; d) reac]ia de formare a osazonelor.
6. Amidonul este un: a) monoglucid; b) diglucid; c) triglucid; d) poliglucid.
7. Amidonul poate fi recunoscut cu ajutorul: a) solu]iei de iod `n iodur\ de potasiu; b) reac]iei cu acidul picric; c) solu]iei concentrate de hidroxid de sodiu; d) reactivului Selivanov.
8. Propriet\]ile celulozei sunt: a) este solubil\ `n ap\; b) este solubil\ `n reactiv Schweitzer; c) este solubil\ `n eter etilic; d) este solubil\ `n cloroform.
9. Diferen]ele dintre amidon [i celuloz\ sunt: a) formula molecular\; b) oza care intr\ `n structura lor; c) rolul lor `n plante; d) caracterul reduc\tor.
2. LIPIDE 2.1. Considera]ii generale Lipidele constituie o grup\ de esteri naturali r\spândite `n toate organismele vegetale [i animale. Ele `ndeplinesc atât rol plastic cât [i energetic, participând la formarea membranei celulare [i la transportul `n lichide biologice a unor substan]e liposolubile. ~n plante ele sunt depozitate `n anumite organe vegetale cum sunt: semin]e, fructe, pulp\ etc. Legumele au un con]inut redus de lipide 0,1 - 1,6%. Fructele [i cerealele au 0,1 - 2%. Bogate `n lipide sunt: alunele, nucile, migdalele, ricinul, m\slinele, cu un con]inut care variaz\ `ntre 30 - 60%, semin]ele de floarea soarelui 40 - 50%, soia - 20%. Lipidele se pot clasifica `n func]ie de provenien]a lor (vegetale [i animale), de structura lor [i de rolul `ndeplinit `n organismele vii. ~n func]ie de structur\ ele se pot clasifica `n lipide simple (substan]e ternare formate din C, H [i O) [i lipide complexe care con]in pe lâng\ C, H, O [i P, N, S. Toate lipidele se clasific\ `n func]ie de natura alcoolului. → Lipide simple - gliceride - steride Lipide - ceride - etolide → Lipide complexe - glicerofosfolipide
- sfingolipide.
2.2. Constituen]ii chimici din structura lipidelor Unit\]ile structurale ale lipidelor sunt acizii gra[i [i unii alcooli, de a c\ror natur\ chimic\ depind propriet\]ile lipidelor. 2.2.1. Acizii gra[i - care intr\ `n constitu]ia lipidelor sunt acizi monocarboxilici (R - COOH) cu num\r par de atomi de carbon. Ei se pot clasifica `n : acizi gra[i aciclici satura]i [i nesatura]i, acizi gra[i ramifica]i, hidroxila]i [i ciclici. ~n organismele vegetale se `ntâlnesc, `n mod frecvent, acizi gra[i cu 4 - 30 atomi de carbon. ~n plantele superioare predomin\ cantitativ urm\torii acizi satura]i aciclici: 1. CH3-(CH2)10 - COOH - acidul lauric (C12) 2. CH3-(CH2)12 - COOH - acidul miristic (C14) 3. CH3-(CH2)14 - COOH - acidul palmitic (C16) 4. CH3-(CH2)16 - COOH - acidul stearic (C18) Acizii gra[i nesatura]i predomin\ fa]\ ce cei satura]i mai ales `n plantele superioare. Ei pot avea una sau mai multe duble leg\turi. 1. CH3-(CH2)5-CH= CH - (CH2)7 - COOH - acidul palmitoleic (C16) 2. CH3-(CH2)7-CH=CH - (CH2)7 - COOH - acidul oleic (C18) 3. CH3-(CH2)4-CH=CH - CH2 - CH = CH - (CH2)7 - COOH - acidul linoleic 4. CH3 - CH2 - CH = CH - CH2 - CH = CH - CH2 - CH= CH-(CH2)7-COOH - acidul linolenic (C18) 5. CH3-(CH2)4 - (CH = CH - CH2)4 - (CH2)2 - COOH - acidul arahidonic (C20) Acizii linoleic, linolenic [i arahidonic formeaz\ acizii gra[i esen]iali ("AGE"), care sunt absolut necesari pentru buna dezvoltare a organismului animal. Ei intr\ `n constitu]ia vitaminei F, intr\ `n structura fosfolipidelor, componentele de baz\ ale membranelor celulare, ale mitocondriilor [i ale ]esutului nervos. Alcoolii din constitu]ia lipidelor nu sunt prea numero[i, dar sunt destul de diferi]i sub aspectul structurii moleculare, astfel ei pot fi: aciclici [i ciclici, mono [i polihidroxilici, satura]i [i nesatura]i, azota]i [i neazota]i.
15
__________________________________________________________________ Subiect de analiz\ ♦ {tiind c\ acizii gra[i au acelea[i propriet\]i cu acizii organici, scrie]i reac]iile cu alcoolii, hidroxizii alcalini [i reac]ia de adi]ie a hidrogenului [i halogenilor la dubla leg\tur\; comenta]i produ[ii ob]inu]i. __________________________________________________________________ 2.3. Lipide simple. Lipidele simple sunt compu[ii organici `n compozi]ia c\rora intr\ C, H, O (subst. ternare). Din punct de vedere chimic sunt esteri ai acizilor gra[i cu diferi]i alcooli. Clasificarea se face `n func]ie de natura alcoolului `n : gliceride, steride, ceride [i etolide. 2.3.1. Gliceride (acil gliceroli) Gliceridele sunt esteri naturali ai glicerolului cu acizii gra[i. Se g\sesc atât `n regnul vegetal cât [i `n cel animal, fiind cele mai r\spândite lipide. ~n semin]ele de floarea soarelui avem 30%; `n nuci - 59%; m\sline - 50%; soia - 20% etc. ~n majoritatea gliceridelor vegetale sunt predominan]i acizii gra[i nesatura]i, ceea ce explic\ aspectul lor uleios. Din cei satura]i, cei mai `ntâlni]i sunt acizii palmitic [i stearic. Gliceridele vegetale sunt amestecuri de monogliceride, digliceride [i trigliceride care pot fi omogene [i neomogene (mixte). ~n plante predomin\ cele mixte, adic\ glicerolul este esterificat cu acizi gra[i diferi]i.
Propriet\]i fizice [i chimice Propriet\]ile fizice depind mult de natura acizilor gra[i constituen]i; astfel trigliceridele acizilor inferiori [i ale acizilor nesatura]i sunt lichide uleioase la temperatura obi[nuit\. Trigliceridele celorlal]i acizi sunt semisolide. Trigliceridele prezint\ puncte duble sau triple de topire, care `n general sunt coborâte. Sunt insolubile `n ap\, solubile `n solven]i organici (aceton\, eter, cloroform). Propriet\]ile chimice. Aceste propriet\]i sunt determinate de caracterul lor de esteri, natura acizilor gra[i constituen]i [i prezen]a glicerolului. Hidroliza gliceridelor. Hidroliza se realizeaz\ greu, fie sub ac]iunea catalizatorilor chimici (acizi, baze), fie sub ac]iunea temperaturilor ridicate [i a presiunilor mari. ~n organismele vii reac]ia are loc sub ac]iunea enzimelor numite lipaze (esteraze). ~n cazul hidrolizei realizat\ `n cataliz\ bazic\, se ob]ine glicerolul [i s\rurile acizilor gra[i numite s\punuri. Aceast\ reac]ie este caracterizat\ de indicele de saponificare, care reprezint\ cantitatea de hidroxid de potasiu exprimat\ `n miligrame necesare saponific\rii unui gram de gr\sime. Acesta se deosebe[te de indicele de aciditate care caracterizeaz\ reac]ia de hidroliz\ [i reprezint\ tot cantitatea de KOH exprimat\ `n miligrame, care `ns\ neutralizeaz\ acizi gra[i liberi dintr-un gram de gr\sime.
CH2 O C ROCH OH
CH2 OH CH2 OH
CH2 O C RO
CH2 O C RO
CH2 O C RO
CH O C RO
CH2 O C RO
monoglicerida diglicerida triglicerida omogena
OCH2 O C R2
CH2 O C R1
O
CH2 O C R3
Otriglicerida mixta
16
Hidrogenarea gliceridelor nesaturate se realizeaz\ pe seama dublelor leg\turi din molecul\. Adi]ia hidrogenului se face la cald 2000C [i `n prezen]a catalizatorilor (Ni, Pt). Gliceridele nesaturate uleioase, trec `n gliceride solide sau semisolide. Procesul este utilizat la fabricarea margarinei. Halogenarea gliceridelor care con]in `n molecul\ acizi gra[i nesatura]i are loc la nivelul dublelor leg\turi. ~n practic\, pentru a determina gradul de nesaturare, se determin\ indicele de iod, care reprezint\ cantitatea de iod exprimat\ `n grame care adi]ioneaz\ la 100g gr\sime. CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH + I2→CH3-(CH2)7-CH-CH-(CH2)7-COOH
acid oleic I I
acid diiod stearic ~n func]ie de valoarea indicelui de iod uleiurile pot fi sicative cum este uleiul de in (Ii = 173 - 203), semisicative - uleiul de bumbac, rapi]\, mu[tar (Ii = 95 - 120) [i nesicative uleiul de m\sline, migdale (Ii = 79 - 90) __________________________________________________________________ Sarcin\ de lucru ♦ Analiza]i cei 3 indici care caracterizeaz\ gliceridele [i stabili]i rolul lor pentru stabilitatea [i valorificarea acestor gr\simi. __________________________________________________________________ Râncezirea gliceridelor. Acest proces reprezint\ o alterare a gliceridelor `n prezen]a aerului, luminii [i vaporilor de ap\. Din punct de vedere chimic râncezirea reprezint\ o `nsumare de reac]ii de hidroliz\ [i oxidare. Acizii gra[i rezulta]i `n urma hidrolizei par]iale sufer\ o oxidare cu formare de aldehide, cetone, hidroxiacizi cu miros [i gust nepl\cut. Cel mai r\spândit tip de râncezire `l `ntâlnim la acizii gra[i nesatura]i la nivelul dublelor leg\turi cu formare de peroxizi sau hidroperoxizi-substan]e instabile care se descompun u[or. Râncezirea poate fi evitat\ dac\ se p\streaz\ gr\simile la rece, intuneric, ferite de umezeal\.
2.4. Lipide complexe Sunt compu[i larg r\spândi]i `n natur\, se g\sesc `n cantit\]i mici `n toate celulele, atât la plante cât [i la animale. ~n cantitate mare se afl\ `n ]esuturile [i organele cu activitate biochimic\ [i fiziologic\ intens\: creier 30%, ficat 10%, inim\ 7%. ~n plante, `n cantitate mare se afl\ `n semin]ele plantelor leguminoase [i cereale 1 - 2%. 2.4.1. Glicerofosfolipide, numite [i fosfolipide, con]in `n molecula lor glicerol, acizi gra[i, acid fosforic, mezoinozitol etc.
Acizii fosfatidici sunt substan]e formate dintr-o molecul\ de glicerol `n care dou\ func]iuni hidroxil sunt esterificate cu acizii gra[i, iar cea de a treia este esterificat\ cu acid fosforic Acizii fosfatidici sunt cele mai simple fosfatide, se g\sesc mai frecvent `n organismele vegetale, `n cantit\]i mai mari `n ]esutul frunzei. Inozitol fosfolipide - con]in mezoinozitolul care esterific\ restul de acid fosforic din acizii fosfatidici. Se g\sesc atât `n regnul vegetal cât [i `n cel animal. Predomin\ `n germenii de grâu, boabe de soia, arahide, pere, boabe de porumb, semin]e de in, bacterii, creier etc. 2.4.2. Gliceroaminofosfolipide.
Colinfosfolipide sau lecitine - sunt cele mai r\spândite lipide complexe. Ele pot fi considerate ca provenind de la acizii fosfatidici prin esterificarea restului fosforic cu aminoalcoolul colina. Lecitinele se g\sesc `n cantitate mare `n g\lbenu[ (10%), `n creier (6%), m\duva oaselor (5%), semin]ele de soia (8%), semin]ele de leguminoase [i cereale (2%). Propriet\]ile fizice sunt determinate de natura acizilor gra[i din structura lor. Toate lecitinele sunt insolubile `n aceton\. Au un caracter bipolar. Acidul fosforic [i colina sunt componentele hidrofile iar acizii gra[i componentele hidrofobe. ~n solu]ie se comport\ ca amfion pe seama func]iunii bazice din colin\ [i a func]iunii acide din acidul fosforic. Colaminfosfolipide sau cefaline sunt glicerofosfatide care `nso]esc lecitinele; au structur\ asem\n\toare cu acestea, se deosebesc prin aminoalcoolul care este colamina.
CH2 O CO R1
CH O CO R2
CH2 O PO3H2 CH2 O PCH O CO R2
CH2 O CO R1
O
OHO
OH OH
OHOH
OH
Acid fosfatidic Inozitolfosfatida
O OH
O
CH2 O CO R1
CH O CO R2
CH2 O P CH2 CH2 +N(CH3)3 OH- CH2 O P CH2 CH2 +N(CH3)3
CH O CO R2
CH2 O CO R1
O
O- O
CH2 OH
CH2 +N(CH3)3OH-
colina lecitina amfionul lecitinei
colamina
CH2 NH2
CH2 OH
O O-
O
CH2 O CO R1
CH O CO R2
CH2 O P CH2 CH2 +NH3CH2 O P CH2 CH2 NH2
CH O CO R2
CH2 O CO R1
O
OH O
cefalina amfionul cefalinei
18
S-au identificat `n germenii de grâu, semin]e de floarea soarelui, in, lupin etc. ~n cantitate mare se g\sesc `n creier, de unde au fost extrase pentru prima dat\. Propriet\]ile lor sunt asem\n\toare cu ale lecitinelor, difer\ `ns\ prin solubilitatea `n diferi]i solven]i organici, fiind greu solubile `n alcool metilic, alcool etilic, eter etilic.
Test de autoevaluare:
1. Lipidele simple sunt: a) esteri; b) eteri; c) compu[i cu func]iuni mixte; d) compu[i macromoleculari.
2. Propriet\]ile chimice ale gliceridelor sunt: a) reac]ia de hidroliz\; b) reac]ia cu albastru de metilen; c) reac]ia cu reac]ivul Fehling; d) reac]ia cu reactivul Tollens.
3. Dintre lipidele complexe fac parte: a) etolidele; b) acil glicerolii; c) colaminfosfatidele; d) lecitinele.
3. PROTIDE 3.1. Defini]ie, clasificare Prin protide se desemneaz\ o grup\ foarte important\ de substan]e, `n care sunt inclu[i aminoacizii [i to]i compu[ii care la hidroliz\ formeaz\ aminoacizi (peptide [i proteine). Peptidele rezult\ prin combinarea unui num\r restrâns de aminoacizi. Proteinele au caracter macromolecular, rezultând prin condensarea unui num\r mare de aminoacizi. Protidele naturale reprezint\ o form\ superioar\ de organizare a materiei, reprezint\ treapta la care apare via]\. ~n plante, protidele se g\sesc `n cantit\]i care variaz\ `ntre 2-35% din substan]a uscat\. Num\rul elementelor constituente este `n mod constant patru [i anume: carbon, oxigen, hidrogen [i azot; pe lâng\ acestea mai putem `ntâlni [i alte elemente cum sunt: sulful, fosforul [i unele metale (Fe, Cu, Co). Elementul caracteristic [i principal pentru protide este azotul care se g\se[te `n propor]ie de 16%. 3.2. Aminoacizi 3.2.1. Constitu]ie general\ [i clasificare Aminoacizii reprezint\ unitatea structural\ de baz\ din structura protidelor. De[i `n natur\ se cunosc peste 200 aminoacizi, `n structura protidelor organismele utilizeaz\ un num\r restrâns de aminoacizi (20-22).
Aminoacizii sunt substan]e organice cu func]iuni chimice mixte, func]ia
carboxil (-COOH) care imprim\ caracter acid [i func]ia amin\ (-NH2) care imprim\ caracter bazic.
To]i acizii au `n comun o caten\ principal\ H2N-CHR-(COOH), diferen]ierea f\cându-se prin catena lateral\ (R). Aminoacizii se pot clasifica dup\ diferite criterii: natura radicalului "R", num\rul func]iunilor amino [i carboxil, plus alte func]iuni existente `n molecul\. Aciclici - monoaminomonocarboxilici - monoaminodicarboxilici - diaminomonocarboxilici
- monoaminomonocarboxilici cu gruparea - OH (hidroxiaminoacizi)
Aminoacizi - monoaminomonocarboxilici cu sulf (tioaminoacizi)
Ciclici - aromatici - heterociclici 3.2.2. Structura chimic\ a aminoacizilor din protidele naturale Aminoacizii monoaminomonocarboxilici. Sunt aminoacizi simpli, catenele laterale (R) sunt nepolare, manifest\ o solubilitate redus\ `n ap\ [i prezint\ afinitate pentru radicalii de aceea[i natur\.
H2N C COOHR
H
20
Aminoacizi monoaminodicarboxilici. Sunt constituen]i ai tuturor proteinelor vegetale [i animale. Amidele lor se g\sesc de asemenea `n structura proteinelor, totodat\ reprezentând un mijoc de depozitare [i transport al azotului amoniacal. Aminoacizi diaminomonocarboxilici. Prezen]a unei a doua grup\ri func]ionale -NH2 (amino) le confer\ acestor aminoacizi un caracter bazic [i o cre[tere a gradului de solubilitate. Hidroxiaminoacizi [i tioaminoacizi
Aminoacizi aromatici [i heterociclici
CH2 COOH
NH2
glicocol (glicina)acid aminoacetic
H2N C H
COOH
CH3
L alanina
CH
COOH
H2N C H
H3C CH3
L valina
CH3H3C
H2N C H
COOH
CH
CH2
L leucina
CH2
HC
COOH
H2N C H
CH3
CH3
L izoleucina
CH2
COOHH2N C H
COOH
acid L aspartic (asparagic)
CONH2
H2N C HCOOH
CH2
asparagina
COOH
H2N C HCOOH
(CH2)2
CONH2
H2N C HCOOH
(CH2)2
acid L glutamic glutamina
H2N C HCOOH
CH2
CH2
H2C NH2 NH2H2C(CH2)3
COOHH2N C H
NH C NH2H2CCH2
CH2
COOHH2N C H
O
L ornitina L lizina L arginina
CH2
COOH
H2N C H
OH
OH
H2N C H
COOH
CH
CH3 SH
H2N C H
COOH
CH2- 2H+ 2H
CH2
COOH
H2N C H
S S CH2
COOH
H2N C HCH3
(CH2)2
COOH
H2N C H
S
L serina L treonina L cisteina L cistina L metionina
CH2 CH COOHNH2 NH2
CH2 CH COOH
OHNH
NH2
CH2 CH COOH CH2 CH COOHNH2NN H
L fenil-alanina L tirozina L triptofanul L histidina
21
Iminoacizi 3.2.3. Propriet\]i fizico-chimice ale aminoacizilor Propriet\]i fizice. Aminoacizii sunt substan]e cristalizate, incolore, majoritatea solubile `n ap\, insolubile `n solven]i organici. Aminoacizii au caracter amfoter pe seama celor dou\ func]iuni. Astfel, dizolva]i `n ap\ au structur\ de amfion. Datorit\ caracterului amfoter, aminoacizii formeaz\ s\ruri atât cu acizii cât [i cu bazele, deci `n mediul acid se comport\ ca o baz\, iar `n mediul bazic ca un acid. Datorit\ acestui caracter amfoter, aminoacizii au `n organism rol de substan]e tampon, proprietate ce o imprim\ [i proteinelor `n a c\ror constitu]ie se g\sesc. Aminoacizii pot s\ prezinte izomerie de pozi]ie, datorit\ locului ocupat de func]iunea amin\ fa]\ de cea carboxil. Atunci când aceast\ func]ie se leag\ de carbonul vecin func]iunii carboxil avem izomerul α. Aminoacizii care intr\ `n compozi]ia proteinelor sunt izomerii α. Cu excep]ia glicocolului, to]i aminoacizii con]in carboni asimetrici, deci pot s\ prezinte izomeri optici. Având izomerie optic\ α-aminoacizii apar]in [i seriilor sterice D [i L. α aminoacizii naturali apar]in seriei sterice L. Propriet\]i chimice. Aminoacizii sunt substan]e active, pot da reac]ii pe seama func]iunii carboxil, amin\, ambelor func]iuni [i datorit\ radicalului "R". a) Reac]iile aminoacizilor datorit\ func]iunii carboxil 1. Cu hidroxizii formeaz\ s\ruri. 2. Cu alcoolii, aminoacizii formeaz\ esteri. 3. Prin reac]ia cu hidrogenul, aminoacizii sunt redu[i pân\ la aminoalcooli.
C
CH2C
CN
H2
H2HCOOH
H H
COOHHH2
HO
C
CH2C
CN
H
L prolina L hidroxiprolina
RH3
+N CH COO- +
-
H+
H-
H3+N CH COOH
R
H2N CH COO-
R
O H2O+
R CH COOHNH2
+ NaOHNH2
R CH COONa + H2O
R CH COOHNH2
+ R' OHNH2
R CH COO R' + H2O
R CH COOHNH2
+
NH2
R CH CH2 OH + H2O2 H2
H2N CH COOHR R
H3+N CH COO-
22
4. Decarboxilarea aminoacizilor const\ `n eliminarea de dioxid de carbon sub ac]iunea enzimelor `n mediu biologic sau prin `nc\lzire puternic\ `n mediu neutru. Produ[ii rezulta]i sunt amine biogene cu rol farmacodinamic sau aminoacizi monocarboxilici.
b) Reac]iile aminoacizilor datorit\ func]iunii amin\ 1. Reac]iile cu acizii cu formare de s\ruri.
2. Func]iunea amin\ se poate acila, rezultând amide substituite. Aceast\ reac]ie are loc cu cloruri acide sau acizi. 3. Reac]ia cu aldehide cu formare de azometine sau baze Schiff. Aceast\ reac]ie este utilizat\ la dozarea cantitativ\ a aminoacizilor cunoscut\ sub numele de metoda Sörensen. 4. Reac]ia de dezaminare const\ `n eliminarea func]iunii amin\ [i aceasta se poate realiza pe mai multe c\i:
a) Cu acidul azotos, rezult\ hidroxiacizi [i azot liber; volumul de azot rezultat permite s\ se calculeze cantitatea de aminoacid (metoda Van Slyke de dozare a aminoacizilor).
b) Dezaminarea oxidativ\ conduce la formarea α cetoacizilor [i amoniacului.
c) Dezaminarea reductiv\ transform\ aminoacizii `n acizi gra[i
e) Dezaminarea desaturant\ determin\ formarea de acid nesaturat [i amoniac. Aceste dezamin\ri cu excep]ia celei cu acid azotos au loc `n organismele vii sub ac]iunea enzimelor, reprezentând o cale de metabolizare a aminoacizilor.
c) Reac]iile aminoacizilor pe seama ambelor func]iuni 1. Formarea leg\turilor peptidice se datoreaz\ reac]iei dintre func]iunea amino a unui aminoacid [i func]iunea carboxil a urm\torului aminoacid. Aceast\ reac]ie este important\ pentru organisme, deoarece astfel se sintetizeaz\ peptidele [i proteinele. 2. Reac]ia cu s\rurile unor metale grele (cupru, cobalt, nichel) cu formare de s\ruri complexe (compu[i cu leg\turi chelatice) care sunt stabile, greu solubile [i colorate. 3. Reac]ia cu ninhidrina cu formarea unei colora]ii albastru violet. Reac]ia serve[te atât la identificarea aminoacizilor, cât [i la dozarea lor cantitativ\ (folosind metoda colorimetric\). __________________________________________________________________ Activitate ♦ Enumera]i care dintre reac]iile aminoacizilor sunt utilizate `n laborator pentru identificarea sau dozarea lor cantitativ\. __________________________________________________________________
3.3. Peptide 3.3.1. Defini]ie, structur\, propriet\]i [i reprezentan]i Peptidele sunt substan]e naturale, constituite dintr-un num\r restrâns de aminoacizi. Dup\ num\rul de aminoacizi componen]i, peptidele pot fi: oligopeptide (2 - 10) [i polipeptide. Lan]ul polipeptidic are la un cap\t o func]ie amino liber\, iar la cel\lalt cap\t o func]ie carboxil. Structura [i func]iile peptidelor sunt determinate de secven]a aminoacizilor constituen]i. ~n func]ie de aceast\ secven]\ [i de num\rul lor, se pot prezenta sub forme izomere. O tripeptid\ are 6 forme izomere. Peptidele sunt substan]e solide, `n majoritatea lor cristalizate, iar solubilitatea `n ap\ este variabil\ (mai mare pentru cele cu num\r mic de aminoacizi [i scade pentru cele cu mas\ molecular\ mare care vor forma solu]ii coloidale). Sunt insolubile `n alcool absolut [i al]i solven]i organici. Peptidele ca [i
HOOC CH CH2 RNH2
RHOOC CH = CH NH3+
R1 CH COOHNH2 NH2
R2 CH COOH+ H2O_
NH2
R1 CH CO NH CH COOHR2
_ _ _
dipeptid
R CH COOHNH2
+ CuCl22 R CH NH2 H2N CH RCu
O = C O O C = O
_ _
_
_ _
_+ 2 HCl
NH2
R1 CH COOH R2 CH COOHNH2
R3 CH COOHNH2
+ +H2N
CHC
N
O
H
CH
R1
R2
CO
N
H
CHR3
COOH_ 2H2O
tripeptida
24
aminoacizii sunt substan]e amfotere. Nu sunt denaturate de c\ldur\, deci nu coaguleaz\ la temperaturi ridicate. Ele dau reac]ii pe seama func]iunilor amin\ [i carboxil libere. Pot da de asemenea reac]ii pe seama radicalilor [i pe seama leg\turii peptidice. Una din cele mai importante reac]ii pe seama leg\turii peptidice este reac]ia "biuretului" folosit\ [i la identificarea [i dozarea lor cantitativ\. Aceast\ reac]ie are loc `n prezen]a s\rurilor de cupru `n mediu alcalin cu formare de compu[i colora]i `n albastru violet. O alt\ reac]ie important\ este reac]ia de hidroliz\ `n prezen]a acizilor tari sau enzimelor (peptidaze), când rezult\ aminoacizii componen]i. Reprezentan]ii peptidelor. Cel mai important peptid este un tripeptid neproteic izolat pentru prima oar\ din drojdia de bere numit glutation. Se g\se[te `n toate organismele vii, `n plante predomin\ `n semin]e `n timpul `ncol]irii. El este format din: acid glutamic, cistein\ [i glicocol.
Glutationul este o substan]\ alb\, solid\, solubil\ `n ap\ [i alcool. Are activitate optic\ levogir\ (-850). Având dou\ grup\ri carboxil libere, are un pronun]at caracter acid (pH=2,8). ~n celule, glutationul se poate g\si sub form\ redus\ (G-SH) sau sub form\ oxidat\ (G-S-S-G). Trecerea lui dintr-o form\ `n alt\ constituie unul din cele mai importante sisteme redox din celule. De asemenea, glutationul se comport\ ca un activator al unor enzime. El mai poate ac]iona ca antioxidant, protejând unele substan]e cum sunt vitamina C [i hemoglobina. Insulina este o polipeptid\ cu rol hormonal secretat\ de pancreas. Ac]ioneaz\ asupra nivelului glucozei sanguine (glicemiei). Este format\ din 51 de aminoacizi. Multe bacterii produc peptide care au ac]iune antibiotic\ (gramicidinele, tirocidinele etc). __________________________________________________________________ Sarcin\ de lucru Analiza]i structura glutationului [i preciza]i: ♦ - din ce grup\ de aminoacizi fac parte cei trei constituen]i; - pe seama c\rei grup\ri se explic\ caracterul s\u reduc\tor. __________________________________________________________________ 3.4. Proteine 3.4.1. Caracterizare general\. Proteinele sunt substan]e cu structur\ macromolecular\ cu un grad `nalt de organizare structural\ rezultat\ prin condensarea unui num\r mare de aminoacizi (de la sute la zeci de mii de molecule). ~n organismele vegetale cantitatea de proteine este mult mai mare decât peptidele sau aminoacizii liberi. Dup\ structura lor proteinele se clasific\ `n dou\ grupe mari: - holoproteine, care la hidroliz\ pun `n libertate numai aminoacizi;
HO O C C H ( CH2)2 C O N H C H C O N H C O O HN H2 CH2 S H
__ ______
_
glutamil cisteinil glicocol
2 G - SH G - S - S - G- 2+ 2
H+
H+
glutation redus
diglutation oxidat
25
- heteroproteine (proteide) care la hidroliz\ pe lâng\ aminoacizi mai pun `n libertate [i compu[i cu structur\ neproteic\ numite componente prostetice (metale, acid fosforic, glucide, lipide, pigmen]i, acizi nucleici etc). 3.4.2. Structura proteinelor. Structura proteinelor st\ la baza modului lor de ac]iune `n organisme. Cu ajutorul metodelor moderne de analiz\ s-a ajuns la concluzia c\ substan]ele proteice au patru niveluri de organizare: primar, secundar, ter]iar [i cuaternar. Structura primar\ reflect\ structura de baz\ a proteinelor, celelalte structuri reflect\ organizarea spa]ial\ tridimensional\ a proteinelor. ~ntre aceste niveluri de organizare structural\ nu exist\ delimit\ri precise, ele interac]ionând `n cadrul unei structuri unice. Structura primar\ reflect\ structura de baz\ a proteinelor [i este determinat\ de felul, num\rul [i succesiunea aminoacizilor `n lan]ul polipeptidic. Grup\rile func]ionale >C=O [i >N-H implicate `n stabilirea leg\turii peptidice sunt coplanare, iar radicalii aminoacizilor (R1, R2...) sunt dispu[i alternativ deasupra [i dedesubtul planurilor leg\turilor peptidice `ntr-un trans repetabil. Problema stabilirii secven]ei aminoacizilor este dificil\. Structura tridimensional\ [i activitatea biologic\ a proteinelor sunt dependente [i controlate de secven]a aminoacizilor, secven]\ care este sub control genetic. Deci structura primar\ este coloana vertebral\ a oric\rei molecule proteice. Structura secundar\ se refer\ la aranjamentul spa]ial al catenelor polipeptidice [i la leg\turile chimice care o stabilizeaz\. Structura secundar\ este stabilizat\ `n spa]iu prin intermediul leg\turilor de hidrogen intracatenare [i intercatenare `ntre grup\rile >C=O [i >N-H din dou\ leg\turi peptidice diferite. Referitor la aceast\ structur\ a fost admis\ teoria lui Pauling [i Corey (1943), care au luat premiul Nobel `n 1953. Ei au elaborat dou\ modele, modelul α-helix [i modelul planurilor pliate sau β-conforma]iei.
Fig. 3.2. Fragment polipeptidic `n faza de pliere Fig. 3.1. Modelul α-helix Modelul α-helix (fig.3.1.) rezult\ prin spiralarea catenei polipeptidice `n jurul unui cilindru imaginar. Stabilitatea structurii spiralate este dat\ de num\rul mare de leg\turi de hidrogen intercatenare care se formeaz\ `ntre gruparea >C=O
H2NCH
CN
CHC
NCH
CN
CHCOOH
R H O R2 H
O R1 H O Rn
26
a unui aminoacid [i gruparea >N-H de la al patrulea aminoacid. Distan]a dintre spire este de 5,4Å. Modelul planurilor pliate (fig. 3.2.) reprezint\ de asemenea o structur\ ordonat\ [i stabilizat\ prin leg\turi de hidrogen intercatenare. Toate leg\turile peptidice particip\ la aceste leg\turi conferind structurii o mare stabilitate. Acest tip de structur\ o `ntâlnim la proteinele de tipul β-keratinei [i fibroinei. Structura ter]iar\ reprezint\ un nivel superior de organizare a macromoleculei proteice. Structura ter]iar\ este caracteristic\ proteinelor globulare. Aceast\ form\ de organizare rezult\ prin replierea catenelor polipeptidice. Leg\turile care stabilizeaz\ aceast\ structur\ sunt:
- leg\turi ionice care se stabilesc `ntre grup\ri ionice de semn contrar (-NH3
+) [i (-COO-). Sunt leg\turi slabe [i formarea lor depinde de pH-ul mediului; - leg\turi de hidrogen, diferite de cele existente la nivelul leg\turilor peptidice (-OH; - COOH); - leg\turi van der Waals, care se stabilesc `ntre radicalii de aminoacizi nepolari. Structura ter]iar\ prezint\ un grad mare de labilitate `n raport cu diferi]i factori fizici [i chimici; desfacerea leg\turilor din aceast\ structur\ implic\ procesul de denaturare al proteinelor, proces `nso]it de pierderea propriet\]ilor biologice. Structura cuaternar\ reprezint\ cel mai `nalt nivel de organizare al proteinelor care au deja o structur\ primar\, secundar\ [i ter]iar\ bine definit\. Structura cuaternar\ reprezint\ asocierea unor catene polipeptidice (denumite protomeri) `ntr-un ansamblu sau agregat denumit oligomer. Structura cuaternar\ este stabilizat\ prin leg\turi electrostatice [i de hidrogen. Hemoglobina este un tetramer, format\ din patru protomeri, dou\ catene α identice (141 aminoacizi) [i dou\ catene β identice (146 aminoacizi). Numeroase enzime cu rol `n metabolism se caracterizeaz\ printr-un nivel cuaternar de organizare. 3.4.3. Proteine vegetale. Reprezentan]i Clasificarea `n cele patru grupe se face `n func]ie de solubilitate [i rolul biologic. ~n organismele vii ele se g\sesc `n amestec. Albuminele sunt proteine cu masa molecular\ variabil\, `n majoritatea lor mic\, solubile `n ap\. Au un caracter slab acid, aproape neutru. Albuminele se g\sesc `n toate organele plantelor, `n amestec de multe ori cu globulinele. Exemplu de albumine avem: legumelina din semin]ele de leguminoase, leucozina din semin]ele de cereale, ricina din semin]ele de ricin, crotina din semin]ele de Croton tiglium. Acestea dou\ din urm\ se mai numesc [i toxalbumine [i sunt foarte toxice. Globulinele sunt proteine solubile `n solu]ii diluate de s\ruri (5-10% NaCl) [i insolubile `n ap\. La fierbere globulinele coaguleaz\ mai greu decât albuminele. Au un caracter slab acid, deoarece con]in o cantitate mai mare de acid asparagic [i glutamic. ~n semin]ele de leguminoase [i oleaginoase, globulinele reprezint\ 50% din totalul de proteine. Exemple de globuline: glicinina din semin]ele de soia, legumina din boabele de maz\re [i linte, edestina din boabele de grâu [i semin]ele de cânep\. Prolaminele sunt proteine cu un con]inut ridicat de acid glutamic [i prolin\ ceea ce le confer\ un caracter acid. Sunt solubile `n alcool 70%, din cauza prolinei, care este singurul aminoacid solubil `n alcool. Prolaminele se g\sesc `n cantitate mare `n semin]ele de cereale, al\turi de gluteline. Reprezentan]i ai acestor grupe sunt: gliadina din semin]ele de grâu, hordeina din orz, avenina din cele de ov\z. Prolaminele sunt s\race `n lizin\ [i triptofan, aminoacizi esen]iali, de aceea au o valoare sc\zut\ pentru alimenta]ia omului.
27
Glutelinele sunt proteine solubile `n solu]ii diluate de acizi sau baze. Au un caracter acid ca [i prolaminele datorit\ con]inutului ridicat de acid glutamic. Se g\sesc `n citoplasma plantelor verzi, `nso]ind `n majoritatea cazurilor prolaminele. Ca reprezentan]i avem: glutelina din semin]ele de grâu [i orizenina din orez. 3.5. Heteroproteine Heteroproteinele sunt substan]e formate dintr-o holoprotein\ [i o substan]\ neproteic\, numit\ grupare prostetic\. Clasificare lor se face `n func]ie de gruparea prostetic\, astfel avem: metaloproteine, fosfoproteine, lipoproteine, glicoproteine, nucleoproteine [i cromoproteine. 3.5.1. Cromoproteine Cromoproteinele sunt heteroproteine care au ca grupare prostetic\ un pigment. Sunt substan]e universal r\spândite, cu func]iuni importante pentru organism. Cromoproteinele se clasific\ pe baza structurii grup\rii prostetice [i a rolului pe care `l `ndeplinesc `n organisme. porfirinice - cu rol respirator Cromoproteine - f\r\ rol respirator neporfirinice - cu rol respirator - f\r\ rol respirator Cele mai r\spândite cromoproteine sunt cele cu structur\ porfirinic\. Acestea au drept grupare prostetic\ porfirinele care sunt substan]e cu structur\ complex\, tetrapirolic\. Cele patru cicluri pirol legate `ntre ele prin radicali metin formeaz\ porfina. Deriva]ii de substitu]ie `n pozi]iile 1-8 se numesc porfirine [i se g\sesc `n organismele vii, de multe ori sub form\ de complexe cu unele metale (Fe, Cu, Mg, Co). 3.5.1.1. Cromoproteine porfirinice cu rol respirator Hemoglobina este numit\ [i pigmentul respirator al vertebratelor. Este o cromoprotein\ format\ din 4% hem, care este gruparea prostetic\ [i 96% componenta proteic\ numit\ globina. Hemul este identic pentru toate speciile, globina variaz\ de la o specie la alta. Hemul reprezint\ combina]ia complex\ dintre porfirin\ [i fierul divalent care este hexacovalent. Cu 4 valen]e se leag\ de nucleele pirolice, cu o valen]\ de globin\ [i cu cea de a [asea se leag\ reversibil de oxigen. La nivelul pl\mânului oxigenul se combin\ cu hemoglobina [i formeaz\ oxihemoglobina care se transport\ prin sângele arterial la celule unde din cauza presiunii mici elibereaz\ oxigenul conform schemei:
Hb + O2↔HbO
NHC
NH
CH
HN
CHN
HCI
II
III
IV
1 2
3
4
56
7
8
HC
NHC
NH
CH
HN
CHNH3C
H2C
H3C CH=CH2
CH3
CH=CH2
H2C CH3
H2C
HOOCH2C
HOOCPorfina
Porfirina
28
Hemoglobina eliberat\ se combin\ cu CO2 din celule formând carbohemoglobina. Acest compus, transportat la nivelul pl\mânilor, elibereaz\ CO2 [i se recombin\ cu oxigenul. Leghemoglobina este heteroproteina din nodozit\]ile de pe r\d\cinile de leguminoase [i de pe alte plante. Gruparea prostetic\ a acestei cromoproteine este identic\ cu hemul din hemoglobin\. Leghemoglobina se formeaz\ `n citoplasma celulelor r\d\cinilor, `n procesul de simbioz\ al leguminoaselor cu bacteriile fixatoare de azot din genul Rhizobium. Cantitatea de azot fixat\ de nodozit\]ile leguminoaselor este propor]ional\ cu con]inutul de leghemoglobin\ din aceste nodozit\]i. Enzimele heminice sunt cromoproteine porfirinice cu rol `n procesele de oxidoreducere. Cele mai importante sunt: citocromii, peroxidazele [i catalazele. Citocromii sunt r\spândi]i `n toate celulele vegetale [i animale. ~n regnul vegetal, citocromii se g\sesc `n cantitate mare `n frunzele verzi [i `n drojdii. ~n procesele de oxidoreducere, au rolul de transportor de electroni.
Citocromii pot exista sub form\ redus\ (Fe2+) [i sub form\ oxidat\ (Fe3+). ~n celule predomin\ forma redus\. Citocromii se deosebesc `ntre ei prin mas\ molecular\, poten]ial redox, spectre de absorb]ie [i propriet\]i chimice. Ei au fost nota]i cu litere mici ale alfabetului, astfel avem: cit a, cit b, cit c etc. Peroxidazele catalizeaz\ reac]ii de felul: AH2 + H2O2 → A + 2H2O. Sunt foarte r\spândite `n plante. Ele descompun apa oxigenat\ care rezult\ `n urma proceselor metabolice `n celule [i care este toxic\. Catalazele - catalizeaz\ reac]ia de descompunere a apei oxigenate:
H202 + H2O2 → 2H2O+ O2 Catalazele se g\sesc [i `n regnul vegetal [i `n cel animal, dar predomin\ `n organismele animale. 3.5.1.2. Cromoproteine porfirinice f\r\ rol respirator Cloroglobina este cromoproteina care se g\se[te `n toate celulele [i ]esuturile verzi. Are ca grupare prostetic\ clorofila care este pigmentul verde din frunze. Cloroglobina este localizat\ `n cloroplastele celulare. ~n cloroplastele plantelor superioare aproximativ 69% reprezint\ componenta proteic\, 22% lipide, 7,5% clorofile, 0,5% carotenoide etc. Clorofila din plantele superioare [i din algele verzi este un amestec de dou\ clorofile: clorofila a [i clorofila b. Raportul dintre cele dou\ clorofile `n majoritatea plantelor este de 3:1. Ambele clorofile sunt porfirine care con]in magneziu. Clorofila b se deosebe[te de clorofila a prin aceea c\ are la C3 din ciclul pirolic II o grupare aldehid\ (-CHO) `n locul grup\rii metil (-CH3). Clorofila a este cel mai important pigment de pe planeta noastr\, deoarece poate s\ transforme energia luminoas\ `n energie chimic\ `n procesul de fotosintez\. Clorofilele a [i b sunt substan]e solide, cristalizate, insolubile `n ap\, solubile `n solven]i organici (aceton\, alcool, eter). ~n solu]ie alcoolic\ clorofila a are o culoare albastr\-verzuie, iar clorofila b o culoare galben-verzuie. Sunt substan]e destul de reactive.
Cit Fe + - +
e-
e- Cit Fe +2 3
29
Test de autoevaluare
1. Aminoacizii sunt compu[i cu func]iuni mixte:
a) func]ie amino [i func]ie carbonil; b) func]ie amino [i func]ie carboxil; c) func]ie amino [i func]ie hidroxil; d) func]ie amino [i func]ie tiol (-SH).
2. Aminoacizii se pot clasifica dup\ urm\toarele criterii:
a) natura radicalului; b) num\rul [i felul elementelor; c) tipurile de izomerie; d) apartenen]a la seria steric\.
3. Aminoacizii pot fi identifica]i prin:
a) reac]ia cu ninhidrina; b) reac]ia Tollens; c) reac]ia cu alcooli; d) reac]ia cu albastrul de metilen.
4. Aminoacizii dau reac]ii pe seama:
a) func]iei amino; b) func]iei hidroxil; c) func]iei tiol(-SH); d) func]iei carbonil.
TEME DE VERIFICARE PENTRU MODULUL 1 1. Glucide 1. Glucoza, manoza, galactoza [i fructoza sunt hexoze. S\ se indice: - structurile ciclice; - diferen]e de structur\; - forme anomere (α, β). 2. Ce condi]ie trebuie s\ `ndeplineasc\ ozele pentru a apar]ine la seriile sterice D [i L? 3. Scrie]i reac]iile care pun `n eviden]\ caracterul reduc\tor al aldozelor. 4. Maltoza, lactoza [i zaharoza sunt dizaharide. S\ se precizeze: denumirea [i structura ozelor rezultate la hidroliz\.
- semnul de rota]ie specific\ a amestecului de oze rezultat din hidroliza fiec\rui diglucid. 5. S\ se defineasc\ ce este un poliglucid [i s\ se fac\ o paralel\ `ntre structura amidonului [i cea a celulozei men]ionând: - asem\n\rile [i deosebirile structurale; - tipurile de leg\tur\ stabilite. 2. Lipide
1. S\ se indice acizii gra[i cu rol important `n organism (vitamin\ [i componente din structura membranelor celulare, ]esutului nervos, mitocondriilor).
2. Stearodipalmitina este o triglicerid\ mixt\. S\ se indice: - reac]iile de saponificare ale acestei trigliceride; - denumirea s\punurilor rezultate din reac]ie.
3. Analiza unei probe de glicerid\ eviden]iaz\ prezen]a acizilor stearic, oleic [i palmitic. S\ se indice: - structura gliceridei; - gradul s\u de consisten]\.
4. Prin hidroliza unui amestec de lipide complexe rezult\ urm\torii produ[i: -glicerol, acid palmitic, acid oleic, acid ortofosforic; -glicerol, acid stearic, acid linoleic, acid ortofosforic, mezoinozitol. S\ se stabileasc\ structurile chimice ale lipidelor [i denumirea lor.
5. Se dau urm\toarele tipuri de lipide: oleodistearina, colaminfosfatida [i colinfosfatida. S\ se indice: - structurile chimice ale acestor lipide;
- localizarea lor `n diferite ]esuturi. 3. Proteine
1. Comenta]i caracterul amfoter al aminoacizilor [i rolul lor `n organismele
vii, pe seama acestei propriet\]i. 2. Scrie]i reac]iile ce reprezint\ `n organismele vii c\ile de degradare ale
aminoacizilor. 3. Comenta]i structura [i rolul peptidelor `n organismele vii. 4. Care din cele patru trepte de structur\ ale proteinelor reprezint\ coloana
vertebral\ a moleculei proteice? Comenta]i aceast\ structur\. 5. Care grup\ de cromoproteine este mai important\? Enumera]i
reprezentan]i [i comenta]i rolul lor `n organismele vii.
31
MODUL II
4. ACIZI NUCLEICI
4.1. Caracterizare general\ Acizii nucleici sunt compu[i cu structur\ macromolecular\, polinucleotidic\, cu rol `n stocarea [i transmiterea informa]iei genetice. Denumirea de "acid nucleic" provine de la faptul c\ acidul dezoxiribonucleic "ADN" a fost izolat ini]ial din nucleii celulari. Acizii nucleici reprezint\ gruparea prostetic\ `n nucleoproteine. Acestea elibereaz\ prin hidroliz\ acizii nucleici [i proteine cu caracter bazic. Acizii nucleici la hidroliz\ pun `n libertate fragmente mai mici (oligonucleotide), iar acestea hidrolizeaz\ la mononucleotide, `n final ob]inându-se baze azotate, acid fosforic [i pentoze. 4.2. Componentele mononucleotidelor Pentoze. Pentozele care intr\ `n constitu]ia acizilor nucleici sunt riboza [i dezoxiriboza. Ambele apar]in seriei sterice D [i au configura]ia β-furanozic\. ~n pentoze atomii de carbon se numeroteaz\ cu numere prime. Componenta glucidic\ se leag\ β-glicozidic de bazele azotate din acizii nucleici. Prezen]a uneia din cele dou\ pentoze `n molecula acizilor nucleici determin\ clasificarea lor `n acizi ribonucleici (ARN) [i dezoxiribonucleici (ADN). Acidul fosforic intr\ `n molecula acizilor nucleici sub form\ de acid ortofosforic. El reprezint\ 8-14% din compozi]ia acizilor nucleici [i le imprim\ caracterul acid. Acidul ortofosforic esterific\ pentozele `n pozi]iile 2', 3' [i 5' la riboz\ [i 3' [i 5' la dezoxiriboz\. Acidul fosforic are rolul de a lega mononucleotidele `ntre ele prin leg\turi de tip fosfodiesterice [i se realizeaz\ `ntre grup\rile -OH din pozi]ia 3' [i 5' ale pentozelor vecine. Bazele azotate sunt combina]ii heterociclice cu caracter aromatic, con]in 2 sau mai mul]i atomi de azot [i deriv\ de la pirimidin\ sau purin\. Bazele pirimidinice:
H OHCC OH
OH
CC OH
OH
2CH
HH
D - riboza
O H HCC OH
OH
CC OH
OH
2CH
HH
D - dezoxiriboza
HOH2C OH
HHO OH HHO
H
OHHOH2C O
B-dezoxiribofuranozaB-ribofuranoza
HO P OOH
OH
_
acid ortofosforic
_
O C 5' pentoza II
O C 3' pentoza IHO P O
legaturi 3' - 5' fosfodiesterice
__
__
N
N
N
N
OH
HO
N
N
NH2
HO
N
N
OH
HO
CH3
pirimidina uracil citozina timina
1
2
3
4
5
6
32
Aceste baze sunt sintetizate de c\tre celulele vii. ~n stare liber\ se g\sesc `n cantit\]i mici, de obicei ca produ[i de hidroliz\ ai nucleotidelor. Uracilul este prezent `n ARN, citozina este prezent\ `n ARN [i ADN iar timina `n ADN. Bazele purinice au o structur\ biciclic\, ele deriv\ de la purin\ [i sunt adenina [i guanina; ambele intr\ atât `n structur\ ARN-ului cât [i a ADN-ului. Bazele azotate au caracter slab bazic [i cele care con]in oxigen pot exista `n mai multe forme tautomere `n func]ie de pH-ul mediului. 4.3. Nucleotide Nucleotidele sunt unit\]i monomere ale polinucleotidelor (acizi nucleici). Ele rezult\ de la hidroliza par]ial\ a acizilor nucleici sub ac]iunea enzimelor, dar se g\sesc [i `n stare liber\ `n toate celulele, `ndeplinind o serie de roluri biochimice. Sunt formate din trei componente chimice: baz\ azotat\ + pentoz\ + acid fosforic. Pentoza se leag\ prin leg\turi β-glicozidice `ntre C1 [i N1 al bazei pirimidinice sau N9 al bazei purinice. Acidul fosforic esterific\ riboza `n pozi]iile 2', 3' [i 5' [i dezoxiriboza `n pozi]iile 3' [i 5'. ~n func]ie de natura pentozei, nucleotidele pot fi: ribonucleotide [i dezoxiribonucleotide. ~n func]ie de natura bazei azotate pot fi purinice [i pirimidinice. Nucleotidele predominante din celul\ sunt cele cu radicalul acidului fosforic `n pozi]ia 5'. Un rol important `n organismele vii `l au nucleotidele polifosforice. Acestea con]in `n molecula lor dou\ sau trei resturi de acid fosforic legate `ntre ele prin leg\turi bogate `n energie (macroergice) notate cu ≈. Dac\ o leg\tur\ fosforic\ simpl\ elibereaz\ prin hidroliz\ 2-3 kcal/mol, o leg\tur\ macroergic\
elibereaz\ 7-12 kcal/mol.
Fig. 4.1. Structura chimic\ a adenozin 5' mono, di [i trifosfa]i
Nucleotidele polifosforice au un rol important `n organismele vii, deoarece particip\ `n procesele de conservare [i utilizare a energiei eliberate `n cadrul metabolismului celular. Reac]ia reversibil\ ADP + H3PO4 ↔ ATP reprezint\ cheia de baz\ a bioenergeticii; formarea ATP-ului reprezint\ procesul de `nmagazinare a energiei, iar scindarea ATP-ului reprezint\ procesul de eliberare a energiei. Un rol important al nucleotidelor polifosforice este cel de transportor macroergic al unor glucide `n sinteza poliglucidelor (ADP [i UDP), de asemenea particip\ `n biosinteza fosfogliceridelor (CTP). Ele mai intr\ `n constitu]ia unor coenzime NAD+ (nicotinamid-adenin-dinucleotid) [i FAD-ul (flavin-adenin-dinucleotid) implicate `n procesele de oxido-reducere ale respira]iei celulare. 4.4. Polinucleotide (acizi nucleici) Acizii nucleici sunt substan]e macromoleculare care pot s\ apar\ libere sau ca grupare prostetic\ `n nucleoproteine. Mononucleotidele reprezint\ unitatea lor structural\ de baz\. Lan]urile de dezoxiribonucleotide legate covalent formeaz\ acidul dezoxiribonucleic (ADN), iar ribonucleotidele formeaz\ acizii ribonucleici (ARN).
Acidul fosforic stabile[te leg\turi fosfodiesterice `ntre gruparea hidroxil din pozi]ia 3' a pentozei dintr-un mononucleotid [i hidroxilul din pozi]ia 5' a pentozei din mononucleotidul vecin. Astfel, catena principal\ const\ din grup\ri fosforice, alternând cu radicali din pentoz\, iar bazele azotate apar ca radicali laterali ai lan]ului polipeptidic (fig. 4.2.). Fig. 4.2. Reprezentarea simbolic\ a structurii polinucleotidului.
4.4.1. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) Acesta este localizat `n cea mai mare parte `n nucleul celular, reprezentând materialul genetic al cromozomilor. Cantitatea de ADN raportat\ la nucleul celular este o constant\ a fiec\rei specii. Macromolecula de ADN difer\ de la o specie la alta, dar este identic\ `n organele aceleia[i specii. Bazele azotate care intr\ `n structura lor sunt: citozina, timina, adenina [i guanina. Structura primar\ indic\ natura, propor]ia [i secven]a bazelor azotate purinice [i pirimidinice ale nucleotidelor care constituie macromolecula de ADN. Informa]ia genetic\ stocat\ `n ADN este codificat\ `n secven]a de baze azotate (nucleotide) existente de-a lungul catenelor polinucleotidice. Structura secundar\ se refer\ la organizarea tridimensional\ a lan]ului polipeptidic. Modelul de structur\ spa]ial\ a fost elaborat `n anul 1935 de c\tre J.D. Watson [i H.C. Crick, confirmat ulterior `n alte experien]e. Argumentele experimentale pe baza c\rora s-a elaborat modelul structurii spa]iale a ADN-ului sunt urm\toarele: num\rul bazelor purinice (A+G) este egal cu num\rul bazelor pirimidinice (C+T), din care cauz\ raportul A+G/T+C=1. Numai raportul A+T/G+C variaz\ dup\ natura speciei [i are valori de 1,3 - 1,5, dar este constant pentru aceea[i specie. Din punct de vedere structural [i energetic adenina [i timina din nucleotide se pot lega prin dou\ leg\turi de hidrogen iar guanina [i citozina prin trei leg\turi de hidrogen. Astfel, modelul elaborat pentru molecula de ADN este format din dou\ catene polinucleotidice r\sucite `ntr-o spiral\ dubl\ orientat\ spre dreapta, `n jurul unei axe comune simetrice [i orientate antiparalel formând un dublu helix.
U C 1' C 3' C 5'P
PG C 1' C 3' C 5'
PC C 1' C 3' C 5'
P
PA C 1' C 3' C 5'
34
Bazele azotate sunt plasate spre interiorul helix-ului, perpendicular pe axa lui vertical\, iar pentoza [i leg\turile fosfodiesterice sunt aranjate `n exterior. O tur\ complet\ a spiralei duble cuprinde 10 perechi de baze azotate [i are `n\l]imea (pasul) de 34 Å, iar diametrul helixului este de 20 Å. Arhitectura spa]ial\ este men]inut\ [i stabilizat\ prin leg\turi de hidrogen realizate `ntre bazele complementare (A=T [i G≡C). Datorit\ leg\turilor de hidrogen care determin\ asocierea specific\ a celor dou\ catene `ntr-o spiral\ dubl\, de[i nu sunt identice, fiecare lan] polinucleotidic devine replica complementar\ a celuilalt, explicând faptul c\ ADN-ul reprezint\ unicul substrat chimic al eredit\]ii. 4.4.2. Acizi ribonucleici (ARN) Acizii ribonucleici sunt [i ei constituen]i ai tuturor celulelor cu rol important `n biosinteza proteinelor. Macromolecula de ARN este format\ dintr-o singur\ caten\ polinucleotidic\ liniar\ mai scurt\ decât a ADN-ului (cu excep]ia unor virusuri), iar bazele azotate care se g\sesc frecvent `n ARN sunt: citozina, uracilul, adenina [i guanina. ~n cazul ARN-ului, se pare c\ pe lâng\ leg\turile fosfodiesterice C3' [i C5' exist\ [i leg\turi C3' [i C2'. Dup\ rolul pe care `l `ndepline[te `n biosinteza proteinelor, ARN-ul poate fi: ARN de transfer (ARNt), ARN mesager (ARNm) [i ARN ribozomal (ARNr). Acizii ribonucleici de transfer au masa molecular\ de ordinul 20 - 30 ⋅ 103 [i reprezint\ 10 - 15% din acizii ribonucleici. Se g\sesc `n citoplasm\ [i au rolul de a transporta aminoacizii activa]i spre centrul de sintez\ al proteinelor (ribozomi). Fixarea aminoacidului se face la un cap\t al lan]ului polinucleotidic, care este identic la to]i ARNt [i care are secven]a bazelor azotate: citozin\-citozin\-adenin\. Tot `n cadrul lan]ului polinucleotidic se afl\ anticodonul (triplet\ de baze azotate) care este complementar cu un alt triplet numit codon, dintr-o secven]\ de pe ARNm. Fiecare aminoacid din molecula proteinelor are cel pu]in un ARNt corespunz\tor. Acizii ribonucleici mesageri au o via]\ foarte scurt\, de ordinul minutelor. Lungimea medie a ARNm la plante este de aproximativ 1200 baze [i reprezint\ 5% din acizii ribonucleici. Ei sunt sintetiza]i `n nucleu pe un segment de ADN care le serve[te drept matri]\, iar secven]a bazelor lor nucleice este complementar\ cu cea a catenei de ADN din care s-au format. ~n acest fel informa]ia genetic\ din ADN este copiat\ enzimatic `n ARNm, procesul numindu-se transcrip]ie. ARNm transfer\ mesajul genetic codificat la nivelul ribozomilor citoplasmatici pentru a servi drept tipar la biosinteza proteinelor. Acizii ribonucleici ribozomali nu se g\sesc liberi ci asocia]i cu proteinele formând complexe ribonucleoproteice denumite ribozomi. Ribozomii sunt particule mici, submicroscopice care con]in 64% ARNr [i 35% proteine. ARNr reprezint\ 80% din totalul ARN-ului celular. ~n timpul sintezei proteinelor, ribozomii formeaz\ agregate numite polizomi `n care este `nglobat\ câte o molecul\ de ARNm
Test de autoevaluare
1. Din structura acizilor ribonucleici (ARN) face parte: a) arabinoza; b) xiloza; c) riboza; d) fructoza.
35
2. Molecula de ADN const\ din dou\ catene polinucleotidice: a) paralele; b) legate prin leg\turi fosfodiesterice; c) legate prin leg\turi de hidrogen `ntre G≡C [i T=A; d) r\sucite `n spiral\ `n jurul unei axe comune de simetrie.
5.1. Defini]ie [i clasificare Vitaminele sunt biocatalizatori esen]iali pentru organismele heterotrofe. Se mai numesc [i factori de cre[tere. Plantele autotrofe sintetizeaz\ vitaminele sau unele substan]e precursoare numite provitamine, care sunt folosite de organismele heterotrofe. ~n organismele animale, vitaminele se repartizeaz\ `n ]esuturi [i organe independent de rolul pe care `l au de `ndeplinit. Ele manifest\ un spectru larg de ac]iune, prezentând urm\toarele caracteristici: - sunt indispensabile cre[terii normale [i manifest\rii proceselor vitale ale organismului; - sunt componente esen]iale pentru evolu]ia normal\ a proceselor metabolice; - unele vitamine ac]ioneaz\ `n calitate de coenzime, asigurând efectul catalitic al enzimelor; - unele vitamine ac]ioneaz\ `n procesele de oxidoreducere; - exist\ o dispropor]ie `ntre cantit\]ile mici `n care ac]ioneaz\ `n organism [i efectele biochimice [i fiziologice pe care le produc; - lipsa lor `n organism duce la tulbur\ri metabolice care se cunosc sub denumirea de "avitaminoze" sau "hipovitaminoze". Cea mai folosit\ clasificare a vitaminelor este cea care ]ine cont de solubilitatea lor. Dup\ acest criteriu avem: - vitamine liposolubile (solubile `n lipide [i solven]ii acestora); - vitamine hidrosolubile. 5.2. Vitamine liposolubile Din aceast\ grup\ fac parte: retinolii (vitaminele A), calciferolii (vitaminele D), tocoferolii (vitaminele E), vitaminele K [i vitaminele F. Acestea sunt `n general termostabile [i pot fi stocate sub diverse forme `n anumite organe sau ]esuturi. Vitaminele A (retinoli) rezult\ pe cale biochimic\ din carotenoide care sunt provitaminele lor. Din β-caroten rezult\ dou\ molecule de retinol. Pentru organismele vii prezint\ importan]\ retinolul (vitamina A1) [i dehidroretinolul (vitamina A2). Aceste vitamine sunt distruse de radia]iile ultraviolete [i de cele luminoase. Rolul biologic al acestor vitamine: - particip\ la sinteza rodopsinei (substan]\ fotochimic\ activ\ `n procesul vederii); - particip\ `n fotosintez\ (absorb]ia radia]iilor luminoase). Avitaminoza se manifest\ prin uscarea celulelor epiteliale (piele, p\r, unghii) [i `ndeosebi a corneei ochilor (xeroftalmie). Vitaminele D (calciferoli) - au ca provitamine sterolii din care provin sub ac]iunea radia]iilor ultraviolete. Cea mai important\ vitamin\ D2 provine prin fotoizomerizarea sub ac]iunea razelor ultraviolete a ergosterolului. Cele mai mari cantit\]i exist\ `n uleiul de ficat de pe[te. Pentru organismul animal calciferolii au o ac]iune antirahitic\ (intervin `n metabolismul calciului [i fosforului).
H3C CH3
CH3
CH2OHCH3 CH3
vitamina A1
37
Vitaminele E (tocoferoli) se deosebesc `ntre ei prin num\rul radicalilor metil de pe nucleul benzenic. Cel mai important este α- tocoferolul. ~n cantitate mare `l g\sim `n plante cum ar fi uleiul de semin]e de porumb, grâu, ov\z, bumbac, soia, floarea soarelui etc. Activitatea biochimic\ a vitaminelor E se manifest\ prin: - asigurarea condi]iilor fiziologice pentru reproducerea normal\ (se mai
numesc vitaminele antisterilit\]ii); - protec]ia vitaminelor A, D, F [i a unor enzime fa]\ de agen]ii oxidan]i; - particip\ la procesul de fosforilare oxidativ\ [i formarea mononucleotidelor polifosforice.
α - tocoferolul Vitaminele K au `n structura lor nucleul naftochinonic. Diferen]ierea vitaminelor din aceast\ grup\ se face dup\ natura substituen]ilor de la nucleul chinonic. Vitamina K1 se g\se[te `n frunze, unde este aproape complet `nmagazinat\ `n cloroplaste. ~n organismele animale vitaminele K sunt produse de flora intestinal\ [i au un rol important `n coagularea sângelui, de aceea se mai numesc
[i antihemoragice. Rolul biologic al acestor vitamine se datoreaz\ sistemelor de oxido-reducere formate `n celule, asigurând astfel transportul hidrogenului pe cale neenzimatic\.
Vitaminele F se mai numesc [i antidermatitice [i sunt reprezentate de trei acizi gra[i nesatura]i `n amestec: linoleic, linolenic [i arahidonic). Deoarece nu pot fi sintetiza]i de organismul animal, ei sunt lua]i din hrana vegetal\, `n special din uleiuri vegetale. 5.3. Vitamine hidrosolubile Din aceast\ grup\ fac parte vitaminele integrate `n complexul B, vitamina C, vitamina PP, vitamina H etc. Sunt vitamine termolabile [i nu se acumuleaz\ ca rezerv\ `n organismul animal. Sunt instabile `n mediul alcalin [i stabile `n mediul acid. Vitamina B1 (tiamina) este o vitamin\ foarte r\spândit\ `n regnul vegetal. Este o substan]\ solid\ insolubil\ `n solven]i organici. Esterul tiaminei cu acidul pirofosforic numit pirofosfatul de tiamin\ (TPP), constituie coenzima unor enzime.
HO
CH2
CH3
CH3
CH3H3CH3C
vitamina D2
O
CH3
HO
H3CCH3
C16H33
CH3
O
O
CH3
C20H45
+ 2_ 2
H2H2
OH
OH
CH3
C20H45
Sistemul redox al vitaminei K
38
Activitatea sa biologic\ se bazeaz\ `n mare m\sur\ pe acest rol de coenzim\. Lipsa ei `n organismul uman produce astenie, tulbur\ri gastrointestinale, sl\bire [i atrofierea muscular\. Organismele vegetale sunt o surs\ bogat\ de tiamin\; `n
cantitate mare se g\se[te `n germenii de cereale [i `n frunzele tinere. Vitamina B2 (riboflavina) este o vitamin\ foarte r\spândit\ `n regnul vegetal [i animal, atât `n stare liber\ cât [i sub form\ de compu[i.
Riboflavina este rezistent\ `n absen]a luminii la ac]iunea oxidan]ilor [i acizilor. Prin reducere (proces reversibil) ea trece `n leucoriboflavin\. Reducerea are loc la atomii de azot din pozi]iile 1 [i 10. Datorit\ acestei propriet\]i particip\ `n procesele de oxido-reducere. Prin esterificarea OH-ului din pozi]ia 5' a ribitolului se ob]ine fosforiboflavina numit\ [i flavin-mononucleotid (FMN). Acesta combinat cu acidul adenilic formeaz\ flavin-adenin-dinucleotidul (FAD). Aceste dou\ substan]e FAD [i FMN particip\ `n structura unor oxido-reductaze cu rol important `n procesele de respira]ie, pe post de coenzime. Vitamina B6 (piridoxina) se prezint\ sub form\ de trei compu[i, to]i deriva]i de piridin\, diferen]ia]i dup\ func]iunea care se g\se[te la atomul de carbon C4. Ace[tia sunt: piridoxol, piridoxal, piridoxamin\. Func]iunea -OH din gruparea hidroximetilic\, substituit\ la atomul de carbon C5 `n piridoxal [i piridoxamin\, poate fi esterificat\ cu acid fosforic. Esterii fosforici sunt coenzimele unor enzime implicate `n metabolismul proteinelor. ~n organismul animal predomin\ piridoxalul [i piridoxamina, iar `n cel vegetal, toate cele trei forme se g\sesc `n cantit\]i aproximativ egale. Vitamina B3 (acidul pantotenic) este universal r\spândit\ `n organismele
vii, atât liber\ cât [i sub form\ de compu[i. ~n structura ei se g\se[te acidul pantoic, legat prin leg\tur\ peptidic\ de β-alanin\. ~n plante aceast\ vitamin\ se g\se[te mai mult sub form\ combinat\. ~n cantitate
mare se g\se[te `n l\pti[orul de matc\ 130 - 500 micrograme, grâu `ncol]it, drojdie de bere, soia, fasole, ou\, ficat etc. Rolul biologic al acidului pantotenic se datore[te faptului c\ este componenta structural\ a coenzimei A. ~n celule, aceast\ vitamin\ este transformat\ `n HS-CoA care particip\ la metabolismul intermediar al lipidelor [i protidelor, activând acizii gra[i [i aminoacizii.
N
NH3C NH2
CH2 N
S
CH3
CH2 CH2 OH
B1vitamina (tiamina)
N
NNH
N
O
OH3C
H3C
1
10
CH2 (CHOH)3 CH2OH CH2 (CHOH)3 CH2OH
10
1N
NHNH
NH
O
OH3C
H3C
+ 2_ 2
H2H2
Riboflavina Leucoriboflavina
N
HO
H3C
CH2OHCH2OH
N
HO
H3C
CHOCH2OH
N
HO
H3C
CH2NH2
CH2OH
Piridoxol Piridoxal Piridoxamina
HOH2C C C CO NH CH2 CH2 COOHOH
H
H3C
H3C
Acidul pantotenic
39
Vitamina PP (nicotinamida) numit\ [i vitamina antipelagroas\, este amida acidului nicotinic. Ac]iunea biochimic\ se datore[te particip\rii ei `n constitu]ia unor coenzime cu structur\ nucleotidic\. Cele mai importante sunt nicotinamid-adenindinucleotid (NAD+) [i nicotinamid-adenin dinucleotid fosfat (NADP+). Aceste coenzime intr\ `n structura unor enzime numite dehidrogenaze care
catalizeaz\ reac]ii de oxido-reducere. Rolul acestor enzime este de a transporta hidrogenul, aceasta f\cându-se pe seama nucleului nicotinic. Numeroase plante con]in `n frunze vitamina PP. Se mai g\se[te `n embrionul de grâu, `n drojdie, t\râ]e, lapte etc. Aceast\ vitamin\ are rolul de a preveni pelagra, boal\ ce apare `n urma unui consum `ndelungat de porumb.
Vitamina C (acidul L-ascorbic) numit\ [i vitamin\ antiscorbutic\, se g\se[te r\spândit\ `n regnul vegetal, aproape universal `n plantele superioare [i `n multe plante inferioare. Vitamina C este o substan]\ solid\, alb\, solubil\ `n ap\ [i alcool. Carbonii din pozi]iile 4 [i 5 sunt asimetrici, ceea ce duce la prezen]a izomeriei optice. Izomerul dextrogir este cel care are ac]iune fiziologic\ [i apar]ine seriei sterice L. Transformarea reversibil\ a acidului ascorbic `n acid dehidroascorbic are loc [i `n organismele vii. ~n plante s-a constatat c\ predomin\ forma redus\ (acid ascorbic). Sistemul redox acid ascorbic ↔ acid dehidroascorbic se pare c\ intervine [i `n procesul de fotosintez\, precum [i `n alte procese biologice. ~n plante, cantitatea cea mai mare de vitamina C o g\sim `n regiunile de cre[tere activ\. Sediul de sintez\ sunt cloroplastele. ~n cantitate mare o g\sim `n m\ce[e 2000 - 4500 mg%, nuci verzi 3000 mg%, m\rar 135 mg%,
citrice 55 mg%, mere 5 - 40 mg%. Acidul ascorbic `ndepline[te [i alte roluri ca: ac]iune antitoxic\, m\rirea rezisten]ei organismului fa]\ de infec]ii, favorizeaz\ transportul [i depozitarea fierului etc. Caren]a `n aceast\ vitamin\ provoac\ boala numit\ scorbut (sângerarea gingiilor).
C=OC OHC OH
HCHO C H
CH2OH
O O
CH2OHHO C H
HCC OC OC=O
+ 2_ 2H2H2
Acid L-ascorbic Acid L-dehidroascorbic
N
C NH2
O_
vitamina PP
40
Test de autoevaluare
1. Care din vitaminele de mai jos con]in `n structura lor un nucleu de piridin\? a) tiamina (B1); b) piridoxina (B6); c) acidul ascorbic (C); d) retinolii (A).
2. Tocoferolii intervin `n: a) coagularea sângelui; b) sunt antioxidan]i naturali; c) combaterea scorbutului; d) procesul vederii.
R\spunsuri corecte
1 – b; 2 – b.
REZUMAT CAPITOL 5
- A (retinoli) - D (calciferoli) liposolubile - E (tocoferoli) - K (antihemoragice) Vitamine - B1 (tiamin\) - B2 (riboflavin\) hidrosolubile - B6 (piridoxin\) - PP (nicotinamid\) - C (acid ascorbic)
41
6. ENZIME
6.1. Considera]ii generale Enzimele sunt substan]e organice care catalizeaz\ reac]iile de sintez\ [i de degradare din organisme. ~n general, enzimele ac]ioneaz\ asem\n\tor catalizatorilor neenzimatici: - ac]ioneaz\ `n cantit\]i extrem de mici, dar manifest\ o activitate extrem de intens\; - nu se consum\ [i nu se transform\ `n reac]iile catalizate; - catalizeaz\ reac]ii termodinamic posibile, adic\ reac]ii care corespund unei diminu\ri a energiei libere; - nu modific\ starea final\ de echilibru a reac]iilor ci numai viteza cu care se realizeaz\ acest echilibru. Reac]iile catalizate de enzime se numesc reac]ii enzimatice, iar substan]a care este transformat\ se nume[te substrat. ~n organismele vii sinteza enzimelor are loc `n toate celulele. 6.2. Natura [i structura chimic\ a enzimelor Studiul enzimelor ob]inute `n stare pur\ a dus la concluzia c\ ele sunt substan]e de natur\ proteic\. Unele sunt holoproteine, iar majoritatea sunt heteroproteine. Substratul (S) reprezint\ compusul chimic de care se poate lega o enzim\ (E) cu formarea unui complex activat enzim\-substrat S + E ↔ ES. Aceast\ fixare se face `n zone bine determinate de pe suprafa]a enzimei, numite "centri activi" sau "situsuri catalitice" care sunt formate din resturi de aminoacizi din catena polipeptidic\, apropia]i `n spa]iu `n urma plierii lan]ului de aminoacizi. Enzimele heteroproteice (cu structur\ binar\) sunt formate din dou\ componente: una proteic\ nedializabil\ [i termolabil\ numit\ apoenzim\ [i alta neproteic\, dializabil\ [i termostabil\ numit\ coenzim\. ~n procesul biochimic, apoenzima fixeaz\ substratul [i determin\ [i specificitatea de ac]iune, adic\
direc]ia reac]iei, iar coenzima particip\ `n mod esen]ial la transformarea enzimatic\. Aceste enzime prezint\ de obicei doi centri activi: unul situat `n fragmentul proteic (situsul catalitic), iar cel\lalt `n zona din molecul\ la care se ata[eaz\ coenzima.
Coenzimele sunt reprezentate de substan]e cu structur\ diferit\, multe din
acestea fiind vitamine sau deriva]i ai acestora, hormoni, metale etc. Situsul allosteric, apar]inând unei clase speciale de molecule proteice, se caracterizeaz\ sub aspect structural prin dou\ tr\s\turi generale distincte, `n strâns\ corela]ie [i anume: zone care sunt esen]iale pentru manifestarea activit\]ii catalitice (situs catalitic) sau pentru func]ia de reglare a unor secven]e de reac]ii (situs allosteric). O serie de enzime oligomere (formate din mai multe subunit\]i) denumite [i enzime allosterice care au rolul de reglare enzimatic\, con]in `n molecula lor, pe lâng\ situsul catalitic [i un al doilea situs numit "situs allosteric" (fig. 6.2.). ~n aceste mecanisme de reglare intervine cu rol determinant un efector allosteric (activator sau inhibitor) care se leag\ de situsul allosteric.
42
Fig. 6.2. Structura unei enzime allosterice 6.3. Specificitatea enzimelor O caracteristic\ esen]ial\ a enzimelor este marea lor specificitate, adic\ ele ac]ioneaz\ catalitic asupra unui singur substrat sau a unei grupe de substan]e cu caracter chimic comun [i catalizeaz\ numai anumite reac]ii. Deci specificitatea este de substrat [i de ac]iune. Specificitatea de substrat. Exist\ unele enzime care au specificitate absolut\. De exemplu ureaza (ureamid-hidrolaza) catalizeaz\ numai reac]ia de scindare a ureei `n dioxid de carbon [i amoniac.
Altele au `ns\ specificitate relativ\, de exemplu pepsina hidrolizeaz\ toate tipurile de proteine. Un caz deosebit este specificitatea stereochimic\, adic\ o enzim\ ac]ioneaz\ numai asupra unuia din izomerii unui substrat, preferându-l `n raport cu alt izomer. Se cunoa[te faptul c\ numai glucidele din seria steric\ D sunt asimilate [i aminoacizii din seria steric\ L. Specificitatea de ac]iune este `nsu[irea unor enzime de a alege, dintre toate reac]iile posibile, numai una pe care o vor cataliza. Pentru aceasta, energia de activare este atât de mult coborât\, `ncât se poate stabili echilibrul. De exemplu, un L-aminoacid poate suferi decarboxilarea numai sub ac]iunea decarboxilazelor, iar transaminarea numai sub ac]iunea transaminazelor. Deci fiecare enzim\ manifest\ o anumit\ specificitate de ac]iune; specificitatea enzimelor se datoreaz\ `n mare m\sur\ apoenzimei. 6.4. Factorii care influen]eaz\ viteza reac]iilor enzimatice Cei mai importan]i factori sunt: concentra]ia substratului, concentra]ia enzimei, temperatura, pH-ul mediului, efectorii. Influen]a concentra]iei substratului. Acesta este unul din cei mai importan]i factori care influen]eaz\ viteza reac]iei enzimatice. Dependen]a vitezei de reac]ie de concentra]ia substratului a fost redat\ matematic de c\tre Michaelis [i Menten. Dac\ se men]ine constant\ concentra]ia enzimei, m\rindu-se concentra]ia substratului, viteza de reac]ie cre[te, pân\ când la o anumit\ concentra]ie a substratului, toat\ cantitatea de enzim\ va fi transformat\ `n complex ES. Acestei concentra]ii, numit\ concentra]ie de saturare `i corespunde viteza maxim\ a reac]iei (Vmax.). Din acest moment viteza de reac]ie r\mâne constant\, oricât de mult s-ar m\ri concentra]ia substratului.
Varia]ia vitezei reac]iei `n func]ie de concentra]ia substratului se exprim\ grafic printr-o hiperbol\ (fig. 6.3.). Fig. 6.3. Varia]ia vitezei de reac]ie `n func]ie de
concentra]ia substratului
O = C(NH2)2 + H2O → CO2 + 2 NH3
43
Influen]a concentra]iei enzimei. ~ntr-un proces enzimatic viteza de reac]ie este dependent\ de concentra]ia enzimelor: V = K [E]. ~n condi]iile `n care concentra]ia substratului este constant\, viteza de reac]ie (V) ini]ial\ este direct propor]ional\ cu concentra]ii crescânde ale enzimei, `ntre anumite limite. Varia]ia vitezei de reac]ie `n func]ie de concentra]ia enzimei se exprim\ grafic printr-o hiperbol\ (fig. 6.4.)
Fig. 6.4. Influen]a concentra]iei enzimei
asupra vitezei de reac]ie.
Influen]a temperaturii. Enzimele au o mare sensibilitate fa]\ de varia]iile de temperatur\. Experimental s-a constatat c\ enzimele `nc\lzite peste 800C `[i pierd ireversibil proprietatea de catalizator biologic. Temperaturile joase nu numai c\ nu le distrug, dar chiar le conserv\. La o astfel de temperatur\ se realizeaz\ numai o oprire reversibil\ a activit\]ii. O dovad\ `n acest sens este rezisten]a la ger a unor semin]e `ncol]ite. Fiecare enzim\ are o temperatur\ optim\ la care activitatea sa este maxim\. Pân\ se atinge aceast\ temperatur\, pentru fiecare 100C, activitatea enzimei cre[te de 1,5 - 3 ori. ~n general, activitatea optim\ a enzimelor se manifest\ `n domeniul de temperatur\ de +350 [i +400C. Influen]a pH-ului. Concentra]ia ionilor de hidrogen influen]eaz\ viteza reac]iilor enzimatice datorit\ faptului c\ modific\ sarcina electric\ a moleculelor enzimei, a moleculelor substratului [i ale complexului ES. Fiecare enzim\ are un pH optim la care activitatea sa este maxim\: amilaza (6,2), catalaza (7,2), pepsina (1,8), zaharaza (5,7). La majoritatea enzimelor vegetale valoarea pH-ului optim este `n jur de 7. Influen]a efectorilor. Efectorii pot fi activatori [i inhibitori. Activatorii sunt substan]e care `n cantit\]i mici m\resc viteza reac]iilor enzimatice cum sunt: - unii ioni, `n special cationi Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ etc; - unele vitamine [i hormoni. Spre deosebire de activatori, inhibitorii sunt substan]e care `ncetinesc sau chiar `mpiedic\ o reac]ie enzimatic\. Ace[tia pot fi: - substan]e care formeaz\ combina]ii complexe cu metalele din structura enzimei sau cu metalele care activeaz\ enzima. Astfel, monoxidul de carbon [i cianurile blocheaz\ fierul din enzimele heminice;
- diferite substan]e care au structur\ asem\n\toare cu substratul sau cu enzima (antivitaminele, antibioticele);
- unele substan]e care pot bloca func]iunile chimice ale enzimelor, de a
c\ror prezen]\ depinde activitatea lor. Astfel: Cu2+ [i Mg2+ blocheaz\ func]iunea
tiol (-SH).
6.5. Nomenclatura [i clasificarea enzimelor
Criteriul dup\ care s-a stabilit ini]ial denumirea enzimelor a fost ad\ugarea sufixului "az\" la r\d\cina numelui substratului asupra c\ruia ac]ioneaz\ enzima sau la r\d\cina cuvântului care arat\ reac]ia pe care o catalizeaz\. Astfel, enzima care ac]ioneaz\ asupra lipidelor -lipaz\ etc. S-au acceptat [i denumiri uzuale, de exemplu pepsin\, tripsin\, emulsin\ etc.
44
Actuala clasificare [i nomenclatur\ a enzimelor se bazeaz\ pe principiile [i regulile stabilite de c\tre Comisia de Enzime a Uniunii Interna]ionale de Biochimie. Aceast\ comisie a prezentat un sistem numerotat codificat, criteriul esen]ial de clasificare constituindu-l tipul de reac]ie chimic\ catalizat\ de enzim\. Conform acestuia, fiecare enzim\ este codificat\ printr-un num\r format din 4 cifre desp\r]ite prin puncte. Toate enzimele cunoscute s-au `ncadrat `n 6 clase (grupe). Cele patru cifre prin care se identific\ o enzim\ vor reprezenta `n ordine: clasa, subclasa, subsubclasa [i pozi]ia pe care o de]ine enzima `n subsubclas\. Astfel, de exemplu, lactat dehidrogenaza apar]ine la clasa 1; subclasa 1; subsubclasa 1; pozi]ia 27, deci se codific\ 1.1.1.27. Clasele de enzime sunt:
1. Oxidoreductaze. Sunt enzimele care catalizeaz\ reac]iile de oxidoreducere, reac]ii de transfer de hidrogen (transhidrogenaze) sau electroni (transelectronaze), de la donor la acceptor sau combinarea substratului direct cu oxigenul molecular. Oxidoreductazele se `mpart `n subclase `n func]ie de natura donorului, `n subsubclase `n func]ie de natura acceptorului. Astfel, enzimele din aceast\ clas\ pot fi: dehidrogenaze, electronaze [i oxidaze. Dehidrogenazele sunt enzimele care catalizeaz\ transportul hidrogenului de la un substrat la un acceptor. ~n func]ie de natura acceptorului, dehidrogenazele pot fi anaerobe [i aerobe. Dehidrogenazele anaerobe transport\ hidrogenul de la un substrat la un acceptor oarecare; aceste enzime au drept coenzime NAD+ sau NADP+. Alcoolii, sub influen]a alcooldehidrogenazei sunt oxida]i la aldehide. Dehidrogenazele aerobe transport\ hidrogenul de pe un substrat pe oxigenul atmosferic. Acestea au drept coenzim\ FAD-ul.
S-H2 + FAD ↔ FADH2 + S ; FADH2 + O2 → FAD +H2O2 Aceste enzime particip\ la o serie de reac]ii metabolice (ex. acid succinic → acid fumaric): Transelectronazele sunt enzimele oxidoreduc\toare care transfer\ electroni de la substan]ele donoare pe un acceptor. ~n func]ie de natura acceptorului, transelectronazele pot fi: anaerobe, caz `n care nu este oxigenul
NAD+ (NADP+) NADH H+ (NADPH H+)+++ 2H
- 2H
R CH2 OH R CHO NADH H+
NAD+alcooldehidrogenaza_ __ ++
COOH
CH2
CH2
COOH
FADsuccinatdehidrogenaza
HOOC CH
CH COOH
FADH2+
45
acceptor [i aerobe când acceptorul este oxigenul. Transelectronazele se numesc citocromi. Aceste enzime sunt metaloproteine cu fier; transportul electronilor se face prin intermediul cationilor metalici care pot u[or s\ treac\ din forma redus\ `n forma oxidat\.
cit Fe2+ ↔ cit Fe3+ Citocromii se afl\ localiza]i `n mitocondrii, propor]ia lor `n celule este `n func]ie de capacitatea respiratorie a celulei. Oxidaze. Sunt enzime care catalizeaz\ reac]iile dintre anumite substraturi [i oxigenul molecular sau a peroxizilor, fiind caracterizate prin transfer de hidrogen sau electroni de pe un donor pe un acceptor care este oxigenul molecular. Oxigenazele sunt oxidoreductaze care catalizeaz\ reac]ii de introducere a oxigenului `n cursul scind\rii oxidative a unor leg\turi, de exemplu: - lipoxidazele catalizeaz\ formarea peroxizilor prin adi]ia oxigenului molecular la dublele leg\turi ale acizilor gra[i nesatura]i. Hidroperoxidaze. Sunt oxidoreductaze care au drept substrat peroxidul de hidrogen (H2O2) care se formeaz\ `n celule `n urma proceselor metabolice [i este toxic dac\ se acumuleaz\. Descompunerea lui este f\cut\ de c\tre peroxidaze [i catalaze (vezi 3.5.1.1.) 2. Transferaze. Acestea sunt enzime care catalizeaz\ transferul unor grup\ri din molecula unui substrat, donându-l moleculei altui substrat, acceptorul având reac]ia general\:
R - A + R' - B ↔ R - B + R' - A Grup\rile transferate sunt de natur\ chimic\ diferit\ ca: grup\ri cu un singur atom de carbon (metil, hidroximetil), grup\ri aldehid\, ceton\, radicali acil, glicozil, grup\ri cu azot, cu fosfor etc. Aciltransferazele sunt enzime care catalizeaz\ transferul radicalului acil (R-CO-), având drept coenzim\ Hs-CoA (coenzima A), denumit\ coenzim\ acilant\. Gruparea activ\ la care se leag\ radicalul acil [i care intervine `n reac]ia de transfer este gruparea tiol (-SH). Radicalul acil poate fi transferat pe diferi]i acceptori: oze, amine, aminoacizi.
R - COOH + HS - CoA + ATP → R - CO ∼ SCoA + AMP + PP R - CO ∼ SCoA + R' - H ↔ R - CO - R + HS - CoA
Glicoziltransferazele sunt enzimele care catalizeaz\ transferul de resturi glucidice de la donor la un acceptor (oze sau deriva]i de oze):
R-glicozil + R'-OH → R'-glicozil + R-OH Ca transportor specific al radicalului glicozil func]ioneaz\ unele nucleotide difosfa]i (ADP sau UDP). Astfel, biosinteza glucidelor decurge astfel:
UDP-oz\1 + oz\2 → oz\1 - oz\2 + UDP diglucid
Fosfotransferaze. ~n aceast\ grup\ se g\sesc enzimele care catalizeaz\ transferul grup\rilor fosfat sau pirofosfat de la un donor la un acceptor. Donori ai acestor grup\ri sunt nucleotidele polifosforice cum sunt ATP-ul. Drept acceptori care se pot fosforila sunt ozele, aminoacizii, unele vitamine, coenzime etc.
ATP + glucoz\ → glucoz\ - 6-fosfat + ADP ATP + riboflavin\ (B2) → FMN + ADP
ATP + NAD+ → NADP+ + ADP 3. Hidrolaze. Sunt enzimele care catalizeaz\ reac]iile de scindare a moleculelor unui substrat care se g\se[te `n solu]ie apoas\, iar moleculele de ap\ se fixeaz\ la produsele scindate conform reac]iei
R - R' + HOH ↔ R - OH + R' - H
46
Principalele leg\turi chimice care pot fi scindate prin hidroliz\ enzimatic\ sunt: leg\tura esteric\, glicozidic\, peptidic\. Esteraze. Ele reprezint\ subclasa care `ncadreaz\ enzimele ce catalizeaz\ hidroliza esterilor.
R1-COOR2 + HOH ↔ R1 - COOH + R2 - OH acid alcool Fosfoesterazele catalizeaz\ scindarea hidrolitic\ a esterilor acidului fosforic, cu formare de alcool [i acid fosforic.
R - O - PO3H2 + HOH ↔ R - OH + H3PO4 Glicozidazele sunt hidrolazele care catalizeaz\ scindarea hidrolitic\ a leg\turii glicozidice din ozide.
G - O - G1 + HOH ↔ G - OH + G1 - OH diglucid oz\ oz\ Peptidhidrolaze. ~n aceast\ subclas\ se `ncadreaz\ hidrolazele care catalizeaz\ scindarea leg\turii peptidice conform reac]iei: 4. Liaze. Liazele sunt enzimele care catalizeaz\ scindarea unui substrat la nivelul leg\turilor C - C; C - O; C - S; C - N (cu excep]ia leg\turii peptidice), prin reac]ii care nu sunt de hidroliz\, care determin\ formarea dublelor leg\turi sau reac]ii de adi]ie la dubla leg\tur\. C - C liazele sunt enzimele care ac]ioneaz\ asupra leg\turilor C - C [i au ca reprezentan]i decarboxiliazele [i aldehidliazele. Decarboxiliazele catalizeaz\ reac]iile de decarboxilare având ca substrat α-cetoacizi, aminoacizi etc. Aldehidliazele catalizeaz\ scindarea leg\turii C - C formând produ[i cu grup\ri carboxil. Astfel scindarea fructozei-1,6-difosfat este catalizat\ de fructoza-1,6-difosfatliaza (aldolaza) [i este scindat\ `n 2 molecule de triozofosfa]i. Fumarathidrolaza catalizeaz\ reac]ia de adi]ie a apei la dubla leg\tur\ din acidul fumaric cu formare de acid malic.
5. Izomeraze. Sunt enzimele care catalizeaz\ izomerizarea diferitelor
Dup\ tipul de izomerizare, aceste enzime formeaz\ mai multe subclase: racemaze, epimeraze cis-trans, transferaze intramoleculare (mutaze). Racemazele sunt enzimele care ac]ioneaz\ asupra aminoacizilor [i deriva]ilor lor catalizând trecerea formelor D `n L. Epimerazele sunt enzimele care ac]ioneaz\ asupra glucidelor [i catalizeaz\ reac]ia de epimerizare.
Cis-trans izomerazele sunt enzimele care catalizeaz\ trecerea formei cis a unui substrat `n forma trans. Transferazele intramoleculare (mutaze) sunt enzimele ce transfer\ intramolecular grup\ri acil, fosforil de la un atom la altul. Exemplu sunt fosfomutazele care catalizeaz\ transferul grup\rilor fosforice.
glucoz\-1-fosfat glucoz\-6-fosfat
6. Ligazele (sintetaze). Sunt enzime care catalizeaz\ reac]ii de sintez\ endoergice, energia utilizat\ provenind prin desfacerea de leg\turi macroergice din molecula de ATP sau a altor compu[i cu leg\tur\ macroergic\.
Ele se `mpart `n mai multe subclase `n func]ie de natura leg\turilor pe care le formeaz\. Prezint\ importan]\ leg\tura peptidic\ la sinteza proteinelor [i leg\tura ester la sinteza lipidelor.
Test de autoevaluare
1. Natura chimic\ a enzimelor este:
a) glucidic\; b) lipidic\; c) proteic\; d) polinucleotidic\. R\spuns corect: 1 – c.
CH3HC NH2
COOH COOH
CH3H2N CH
D alanina L alanina
acid fumaric (trans)CH COOH
HOOC CHHC COOHHC COOH
acid maleic (cis)
malat cis-transizomeraza
UDP-glucoza UDP-galactoza1,4-epimeraza
X + Y + ATP X - Y + ADP + H3PO4ligaze
48
REZUMAT CAPITOL 6
- dehidrogenaze - oxidoreductaze - electronaze - oxidaze - aciltransferaze - transferaze - glicoziltransferaze - fosfotransferaze - esteraze - hidrolaze - glicozidaze - peptidhidrolaze Enzime - C – C liaze - liaze - C – O liaze - C – S liaze - C – N liaze - racemaze - izomeraze - epimeraze - cis-trans izomeraze - mutaze - ligaze (sintetaze)
49
Teme de verificare pentru modulul 2
1. Acizi nucleici
1. Care sunt produ[ii de hidroliz\ ai mononucleotidelor? Comenta]i
structura compusului care determin\ clasificarea acizilor nucleici `n ARN [i ADN. 2. Se dau urm\toarele baze azotate simbolizate prin literele: A, T, G, U, C.
S\ se indice: - denumirea acestor baze azotate; - structura bazelor purinice; - care din bazele azotate intr\ `n structura ADN; - perechile de baze complementare.
3. Comenta]i rolul [i structura nucleotidelor polifosforice. 4. Se d\ urm\toarea secven]\ de nucleotide dintr-un lan] al ADN,
con]inând bazele azotate simbolizate prin literele: G - T - C. S\ se indice structura chimic\ a secven]ei de nucleotide corespunz\toare din lan]ul pereche de ADN. 5. Un fragment dintr-o caten\ de ADN bicatenar are urm\toarea secven]\ `n bazele azotate (nucleotide): A - T - G - C - T - A. S\ se stabileasc\ structura chimic\ a secven]ei corespunz\toare `n baze azotate (nucleotide) a fragmentului de ARNm sintetizat.
2. Vitamine [i enzime
1. S\ se men]ioneze vitaminele [i denumirea coenzimelor respective care particip\ la transferul enzimatic de hidrogen, cu precizarea grup\rilor chimice implicate `n reac]ia de transfer.
2. Ca vitamin\, acidul pantotenic particip\ `n structura unei coenzime implicat\ `n transferul de radicali acil. S\ se indice denumirea acestei coenzime [i reac]ia de transfer a radicalului acil.
3. S\ se precizeze care din vitaminele liposolubile [i hidrosolubile particip\ la reac]iile de oxidoreducere. ~n acest sens s\ se fac\ un tabel:
Denumirea vitaminelor
Reac]ia de oxidoreducere
4. Se dau urm\toarele coenzime: NAD+, NADP+, FAD, FMN, HS-CoA, TPP. S\ se indice denumirile acestor coenzime [i s\ se precizeze care din ele particip\ `n reac]iile de transfer a hidrogenului.
5. Se dau urm\toarele reac]ii enzimatice: a) R - CO - R' + HOH↔ R - COOH + R' - OH b) Fructoza-6-fosfat + ATP → Fructoza 1-6 difosfat + ADP c) UDP-glucoz\ ↔ UDP-galactoz\ d) 2citbFe2+ ↔ 2citc1Fe3+ e) glucoz\-1 fosfat ↔ glucoz\-6 fosfat f) acid succinic + FAD ↔ acid fumaric + FADH2
S\ se indice din ce clas\ de enzime fac parte enzimele care catalizeaz\ fiecare din reac]iile men]ionate.
50
MODUL III
7. METABOLISM 7.1. Considera]ii generale Metabolismul reprezint\ ansamblul transform\rilor fizice, chimice, biochimice, fiziologice [i energetice care se petrec datorit\ existen]ei [i dezvolt\rii organismelor `n interac]iunea acestora cu mediul `nconjur\tor. Metabolismul este o caracteristic\ a organismului viu care este din punct de vedere termodinamic un "sistem deschis", el realizeaz\ un schimb permanent de substan]e [i energie cu mediul `nconjur\tor, aceasta fiind condi]ia necesar\ existen]ei acestuia. Prin metabolismul intermediar, se `n]elege totalitatea transform\rilor de substan]e [i energie care au loc in interiorul organismului la nivelul diferitelor ]esuturi sau organe. Metabolismul cuprinde dou\ grupe mari de procese care sunt contradictorii. 1. Transform\rile anabolice sau anabolism, `n urma c\rora, din substan]e mai simple ca structur\ rezult\ substan]e cu structuri mai complexe. Sunt c\i de biosintez\ `n organism. 2. Transform\ri catabolice sau catabolism, `n urma c\rora substan]ele cu structuri complexe sunt degradate la substan]e mai simple. 7.2. Procese generale `n anabolism 7.2.1. Compu[i cu leg\tur\ macroergic\ Procesele de biosintez\ necesit\ absorb]ie de energie, sunt procese endoergice. Organismele `[i procur\ energia dup\ modul lor de via]\ [i anume: - organismele cu mod de via]\ autotrof, cum sunt plantele capabile de fotosintez\, `[i procur\ energia prin fotosintez\, când `nmagazineaz\ energia solar\ sub form\ de leg\turi chimice `n compu[i organici [i `n compu[i cu leg\turi macroergice; - organismele chimiotrofe (bacteriile) `[i sintetizeaz\ glucidele ca [i cele fotosintetizante din CO2 [i H2O, `ns\ folosesc energia necesar\ sintezei din reac]iile de oxidare a substan]elor anorganice. - organismele cu mod de via]\ heterotrof (animalele, plantele inferioare [i unele plante superioare f\r\ clorofil\) `[i procur\ `n cea mai mare parte energia din procesele catabolice care sunt reac]ii energetice. Leg\turile macroergice, notate cu o linie ondulat\ (∼) sunt bogate `n energie: astfel ele con]in peste 7000 cal/mol, fa]\ de o leg\tur\ chimic\ obi[nuit\ care are cca 3000 cal/mol. Reprezentan]i mai importan]i ai compu[ilor macroergici: - nucleotidele polifosforice (ATP,CTP,UTP,TTP) cel mai important fiind ATP-ul. Energia chimic\ eliberat\ `n reac]iile biochimice de degradare (catabolism) este conservat\ sub form\ de ATP (adenozintrifosfat) [i utilizat\ ulterior, `n reac]iile biochimice de sintez\ (anabolism).
ATP + H2O ↔ ADP + H3PO4 (DG = -7300cal/mol); - acilfosfa]ii, cel mai important fiind acidul 1,3 difosfogliceric. Acesta se formeaz\ `n cursul degrad\rii glucozei pe cale anoxibiotic\ - prin hidroliz\ elibereaz\ 11800 cal/mol.
O = C O PO3H2
H C OH
CH2 O PO3H2
H2O
HO C = O
H3PO4 G = - 11.800 cal/mol( )+ +CH2 O PO3H2
H C OH
acid 1,3 difosfogliceric acid 3 fosfogliceric
51
- enolfosfa]ii - acidul fosfoenol piruvic este un compus macroergic care se formeaz\ de asemenea `n procesul de degradare al glucozei. Energia rezultat\ prin hidroliz\ este de 14800 cal/mol.
- tioesterii forma]i pe baza coenzimei A (HS-CoA) `n care gruparea reactiv\ este gruparea tiol (-SH), de]in un rol important `n metabolism. R - CO ∼ SCoA + HOH → R - COOH + HS-CoA (DG = -7500cal/mol)
7.2.2. Aspecte generale ale form\rii leg\turilor macroergice `n cazul proceselor de biosintez\ ~n cazul proceselor anabolice, energia `nmagazinat\ `n leg\turile macroergice poate fi folosit\ chiar `n locul unde se g\se[te sau trebuie transferat\ acolo unde se desf\[oar\ procesul respectiv. Energia din aceste leg\turi poate fi folosit\ prin dou\ mecanisme:
1. Formarea unui compus intermediar `ntre compusul macroergic [i substratul care va participa la reac]ie. ~n felul acesta substratul se activeaz\, el fiind acceptorul de energie de la compusul macroergic care este donorul. Odat\ cu energia se transfer\ din compusul macroergic [i unele componente. Activarea func]iunilor hidroxil se face prin transfer de resturi fosforice. Acest tip de activare `l `ntâlnim la oze.
Activarea substratului prin transferul unui rest de mononucleotid. Aceasta este o activare mai puternic\ [i o `ntâlnim la oze, deriva]ii lor [i aminoacizi.
2. Activarea prin hidroliza compu[ilor macroergici: acest tip de activare este `ntâlnit\ `n multe reac]ii biochimice. Biosinteza amidelor, a proteidelor au loc cu scindarea mononucleotidelor polifosforice. Activarea func]iunii carboxil din acizii organici sau aminoacizi sub form\ de acil-CoA necesit\ scindarea ATP-ului. R - COOH + HS - CoA + ATP R – CO ∼ SCoA + AMP + P - O ∼ P 7.3. Procese generale `n catabolism 7.3.1. Considera]ii generale Prin oxidare, `n organism au loc transform\ri de degradare, unii compu[i rezulta]i intermediar pot fi folosi]i `n reac]ii de biosintez\ sau se pot acumula. Prin oxidare, se elibereaz\ [i o cantitate mare de energie utilizat\ ulterior de organism, pentru necesit\]ile lui. Aceste reac]ii de degradare oxidativ\ `n organism se fac
OCH2OH
OHOH
OHHO
CH2 OPO3H2
HO OHOH
OHOfosfokinaza
glucoza glucoza - 6 - fosfat
+ ATP + ADP
ATP R CH COOH R CH COO AMP P O PNH2 NH2
+ +
COOHC O PO3H2
CH2
H2O H3PO4
COOHC = OCH3
+ +
acid fosfoenolpiruvic acid piruvic
G = - 14.800 cal/mol( )
52
`ntr-un timp `ndelungat, f\r\ degaj\ri mari de energie [i f\r\ efecte termice vizibile. Moleculele organice complexe sunt scindate mai `ntâi `n fragmente care con]in doi atomi de carbon, cunoscute sub numele de "acetat activ". Degradarea ulterioar\ a acestora se realizeaz\ printr-o serie de reac]ii consecutive, eliberându-se de fiecare dat\ o molecul\ de CO2 sau 2 atomi de hidrogen. Carbonul nu se combin\ direct cu oxigenul, acesta provine din ap\. Produsul final, dioxidul de carbon, ia na[tere f\r\ modific\ri energetice importante, `n urma unor reac]ii de decarboxilare a acizilor organici. Hidrogenul din substrat nu se combin\ direct cu oxigenul, el trece la acesta prin intermediul transportorilor de hidrogen, produsul final fiind apa. Formarea apei este fenomenul principal de formare a energiei din care o mare parte este depozitat\ `n leg\turile chimice din ATP. Oxidarea biologic\ are loc `n toate celulele, ea se petrece la nivelul mitocondriilor, care con]in totalitatea transportorilor din lan]ul respirator. Aceast\ oxidare se refer\ deci la oxidarea hidrogenului [i carbonului, constituen]i ai substan]elor hidrocarbonate. Aceasta se poate realiza uneori [i f\r\ interven]ia oxigenului atmosferic. ~n acest caz, fenomenul de degradare se nume[te fermenta]ie. ~n ambele cazuri se elimin\ tot CO2. Cele dou\ moduri de via]\ ale celulei vii, respira]ia [i fermenta]ia nu difer\ decât prin originea oxigenului, `n fermenta]ie el fiind luat din moleculele organice supuse degrad\rii. 7.3.2. Oxidarea hidrogenului sau lan]ul respirator Este un proces complex, hidrogenul substratului ajunge indirect s\ se combine cu oxigenul prin intermediul transportorilor de hidrogen care sunt: NAD+, FAD, coenzima Q, citocromii b, c, c1, a [i a3. Coenzimele care particip\ `n procesul de oxidoreducere pot fi `n form\ redus\ sau oxidat\. Unele pot s\ preia atomii de hidrogen de la substrat, altele preiau numai electronii. Succesiunea lor `n lan]ul respirator este determinat\ de poten]ialul redox al grup\rilor prostetice. Coenzima ini]ial\ depinde de poten]ialul redox al substratului, iar cea final\ trebuie s\ fie capabil\ s\ transfere electronii oxigenului [i s\-l transforme `n O2-: acesta este citocromul a3 care este u[or autooxidabil. Schematizat, un lan] respirator poate fi prezentat astfel: Lungimea lan]ului respirator, dat de num\rul [i natura coenzimelor participante la transportul hidrogenului [i electronilor este dat de poten]ialul redox al substratului. Oxidarea fosforilant\ este procesul prin care energia eliberat\ odat\ cu transportul hidrogenului este utilizat\ pentru fosforilarea ADP la ATP. Leg\tura macroergic\ se poate forma numai `n unele etape ale lan]ului de oxidare [i anume `n acele etape `n care energia eliberat\ este mai mare decât energia de formare a leg\turii macroergice. ~n schema lan]ului respirator se formeaz\ 3 moli de ATP `n etapele: NADH2/FAD; CoQH2/cit c1Fe3+ [i cit a3Fe2+/oxigen. Ca o regul\ general\, la toate lan]urile de oxidare, când `ncep cu coenzimele NAD+ sau NADP se vor forma 3 leg\turi macroergice, iar cele care `ncep cu FAD vor forma doar dou\ leg\turi macroergice.
-2H NADH+ -2H -2H 2citFe
-2e
R NAD
-2e1/2O2 O + 2H
FAD CoQ 2e
-2H
O -2
RH2 H+ FADH2 CoQH2++ ++
+ -
2+
+32citFe
+22cit Fe
2cit Fe 3+a3
a3
2- + H2O
53
7.3.3. Oxidarea carbonului (ciclul Krebs) Carbonul este cel de-al doilea element din catenele hidrocarbonate care sufer\ oxidare la nivelul celulei. Din substan]ele complexe (glucide, lipide, proteine) pe c\ile catabolice specifice, catenele hidrocarbonate sunt scindate `n fragmente de câte doi atomi de carbon formând un radical acetil care este activat cu HSCoA (CH3 - CO ∼ SCoA). Acidul acetic activat este substan]a de plecare `n catabolismul final, indiferent de provenien]a sa. Aceast\ oxidare mai este cunoscut\ [i sub numele de ciclul lui Krebs sau ciclul acizilor tricarboxilici (ATC). ~n acest ciclu atomul de carbon este `mbog\]it `n oxigen pân\ ce se formeaz\ carboxilul (-COOH), care apoi prin decarboxilare elimin\ CO2. Acest ciclu reprezint\ cea mai mare parte a respira]iei celulare. Principala caracteristic\ a ciclului ATC este aceea c\ necesit\ un compus esen]ial, care intr\ `n ciclu [i se reg\se[te la sfâr[it, ini]iind un nou ciclu. Acest compus este acidul oxalil-acetic. El fixeaz\ o molecul\ de acid acetic activat [i d\ na[tere la un acid cu [ase atomi de carbon, care printr-o succesiune de reac]ii de oxidare pierde doi atomi de carbon sub form\ de CO2 [i regenereaz\ o molecul\ de acid oxalilacetic. Etapele ciclului Krebs care sunt prezentate au atât importan]\ metabolic\ cât [i energetic\. Prima reac]ie este cea de condensare `ntre acidul acetic activat [i acidul oxalil acetic cu formare de acid citric. Izomeria acidului citric. Acidul citric pierde o molecul\ de ap\ [i trece `n acid cis-aconitic care sub ac]iunea unei enzime numit\ aconitaz\ fixeaz\ o molecul\ de ap\ [i trece `n acid izocitric. Oxidarea acidului izocitric are loc `n prezen]a izocitrat dehidrogenazei cu NAD+ din mitocondrii cu transformarea grupei OH secundare `n grupare cetonic\ cu formarea acidului oxalil succinic, care este decarboxilat la acidul α cetoglutaric. Decarboxilarea oxidativ\ a acidului α cetoglutaric este realizat\ de un sistem enzimatic complex cu formare de succinil-CoA
HOOC H2C C COOH CH3 CO SCoA H2O HOOC CH2 C CH2 COOH H SCoA+ + +citratsintetazaO OH
Formarea acidului succinic. Succinil-CoA con]ine o leg\tur\ macroergic\ care este `n general utilizat\ pentru formarea de ATP din ADP [i fosfat anorganic. Oxidarea acidului succinic are loc `n prezen]a succinat dehidrogenazei care are drept coenzim\ FAD-ul cu formare de acid fumaric. Hidratarea acidului fumaric are loc la dubla leg\tur\ `n prezen]a fumarazei cu formarea acidului malic. Oxidarea acidului malic are loc `n prezen]a malat-dehidrogenazei cu NAD+ , la acid oxalilacetic. Bilan]ul energetic al ciclului ATC. Acest ciclu constituie o surs\ principal\ de energie pentru organism. Organismul utilizeaz\ aceast\ energie `n parte pentru men]inerea temperaturii corpului [i `n alt\ parte ca energie chimic\ cu formare de ATP câ[tigat\ prin fosforilare oxidativ\. Un mol de NADH+H+ este echivalent cu 3 moli de ATP, iar un mol de FADH2 este echivalent cu 2 moli de ATP (corespunde la o cantitate total\ de 12 moli ATP). 7.4. Metabolismul intermediar al glucidelor 7.4.1. Anabolismul intermediar al ozelor - Fotosinteza Prin fotosintez\ se `n]elege procesul de formare al substan]elor organice din substan]e anorganice, `n plantele verzi, cu ajutorul energiei luminoase. Este un proces biochimic de importan]\ principal\ pentru biosinteza catenelor hidrocarbonate [i acumul\rii de energie. Substan]ele care apar `n urma acestui proces sunt glucidele; cu toate c\ acest proces este complex, el poate fi redat astfel:
6CO2 + 6H2O hγ C6H12O6 + 6O2
Din punct de vedere chimic fotosinteza este un proces de oxido-reducere, astfel apa este oxidat\ iar CO2 este redus. Fotosinteza poate fi considerat\ ca sum\ a trei grupe de reac]ii care se petrec `n cloroplaste [i `n zona citoplasmei care le `nconjoar\. Ace[tia con]in pigmen]ii care absorb energia luminoas\ (clorofila a, b, pigmen]ii carotenoizi, xantofile). 1. Fotoliza apei este procesul care folose[te energia luminoas\ pentru descompunerea apei `n oxigen [i hidrogen. Procesul se produce cu un consum
succinil-CoA
+SCoACO CH2 CH2 COOH
ADP H3PO4 CH2 COOHCH2 COOH
ATP HSCoA+ + +
acid succinic
acid succinicCH2 COOHCH2 COOH
+ FADHOOC CH
HC COOH+ FADH2
acid fumaric
acid fumaricHC COOH
HOOC CH + H2O
acid malicHO CH COOH
HOOC CH2
HO CH COOHCH2 COOH
NAD+
CH2 COOHO C COOH
NADH H+++ +
acid malic acid oxalilacetic
55
mare de energie - 56 kcal/mol. Este considerat\ reac]ia primar\ a fotosintezei [i demonstreaz\ c\ oxigenul eliberat `n atmosfer\ provine din ap\. 2. Fotofosforilarea. Problema principal\ care se cere a fi cunoscut\ `n fotosintez\ este mecanismul prin care energia luminoas\ se transform\ `n energie chimic\. Arnon [i colaboratorii (1954) au constatat c\ `n timpul fotosintezei se formeaz\ `n cloroplaste o cantitate mare de ATP [i NADPH + H+. Deci o parte din energia luminoas\ se `nmagazineaz\ sub form\ de energie chimic\ `n compu[ii cu leg\tur\ macroergic\ conform reac]iilor:
n ADP + n H3PO4 ↔ n ATP Hidrogenul rezultat la fotoliza apei se combin\ cu NADP+
NADP+ + 2H ↔ NADPH + H+ deoarece formarea lui este cuplat\ cu fotoliza apei, ecua]ia total\ este:
2NADP+ + 2H2O hγPPNR 2NADPH + H+ + O2 clorofil\ PPNR este enzima care catalizeaz\ reac]ia (piridin-nucleotid reductaza fotosintetic\). NADPH + H+ format va fi folosit `n etapa a treia-reducerea CO2. Succesiunea reac]iilor `n faza luminoas\ a fotosintezei: - fotoactivarea pigmen]ilor din cloroplaste; - fotoliza apei `n care rezult\ energia ce este utilizat\ la formarea coenzimelor de baz\ a acestui proces prin fotofosforilarea fotosintetic\ a ADP-ului [i reducerea transhidrogenazei anaerobe NADP+. 3. Fixarea dioxidului de carbon (reducerea CO2). Acest proces nu mai necesit\ interven]ia luminii, el poate avea loc [i la `ntuneric. Acceptorul de CO2 este ribuloza care mai `ntâi este fosforilat\ [i transformat\ `n celul\ `n ribuloz\ 1,5 difosfat sub ac]iunea unei transfosfataze. Forma enolic\ izomerizeaz\ din nou `n forma ceto. Pe acest compus, sub ac]iunea enzimei carboxilaza care se afl\ `n cloroplaste [i este caracteristic\ asimila]iei clorofiliene, se fixeaz\ dioxidul de carbon formând un compus intermediar instabil care prin hidroliz\ se transform\ `n dou\ molecule de acid-3-fosfogliceric (APG).
CH2OHC = O
HC OHHC OH
CH2OH CH2 OPO3H2
HC OHHC OH
C = OCH2 OPO3H2
+-
2 ATP2 ADP
tautomerizare
CH2 OPO3H2
C OHC OH
HC OHCH2 OPO3H2
D (+) ribuloza Ribuloza 1,5 difosfat Forma enolica
CH2 OPO3H2
C = OHC OH
HC OHCH2 OPO3H2
HOOC C OHCH2 OPO3H2
COOHHC OH
CH2 OPO3H2
C = OHC OH
CH2 OPO3H2
2CO2+ +H2O
ester 3-cetopentitol 1,5 difosfat
produs intermediar acid 3-fosfogliceric
56
Transformarea acidului-3-fosfogliceric `n aldehid\ 3-fosfogliceric\ este un proces de reducere de importan]\ vital\, proces specific plantelor verzi, de care depinde `ntreg metabolismul substan]elor atât `n regnul vegetal cât [i pentru cel animal. Reducerea acidului la aldehid\ necesit\ o cantitate mare de energie. care este acumulat\ `n coenzimele formate `n faza luminoas\ a fotosintezei.
De la aldehida 3 fosfogliceric\ porne[te `ntregul proces de biosintez\ a glucidelor.
7.4.2. Formarea hexozelor Reac]iile de formare ale hexozelor plecând de la trioze au fost studiate de
Calvin cu ajutorul atomilor marca]i 14C. Aceste reac]ii se desf\[oar\ `n sens invers glicolizei.
1. 2. Aldehida 3-fosfogliceric\ se condenseaz\ cu dihidroxiacetonfosfatul [i
formeaz\ fructozo-1,6-difosfat; aceast\ reac]ie este catalizat\ de o aldolaz\. 3. Fructozo-1,6 difosfat `n reac]ie cu apa scindeaz\ o molecul\ de acid
fosforic, r\mânând fructozo-6-fosfat. 4. Fructozo-6-fosfatul va suferi o izomerizare, trecând `n glucozo-6-fosfat;
acest compus, `n urma unei izomeriz\ri intramoleculare, prin transferul restului de acid fosforic de la C6 la C1, va trece `n glucozo-1-fosfat. Transferul este catalizat de o enzim\ numit\ transferaz\. Glucozo-1-fosfatul este produsul de plecare `n biosinteza diglucidelor [i a poliglucidelor.
CH2 OPO3H2
HC OHCOOH NADPH H+
++
+ATP
__NADP+
ADP
HC OPO3H2
HC OHCH2 OPO3H2
OHHC = OHC OH
CH2 OPO3H2
+ H3PO4
acid 3-fosfogliceric aldehida 3-fosfoglicerica
57
Glucozo-6-fosfatul reprezint\ componenta intermediar\ `n catabolizarea monoglucidelor pe diferite c\i: glicoliz\, calea aerob\, calea pentozofosfa]ilor, calea acizilor uronici.
7.4.3. Transformarea reciproc\ a ozelor (interconversia) Organismele au posibilitatea de a transforma un glucid `n altul. Astfel,
hexozele pot trece din una `n alta. Aceast\ interconversie se poate realiza prin mai multe mecanisme.
I. Epimerizarea [i izomerizarea Aceast\ cale se `ntâlne[te la ozele care `[i p\streaz\ acela[i num\r de
atomi de carbon `n decursul transform\rii. Epimerizarea biochimic\ se realizeaz\ `n organism prin inversarea
configura]iei sterice la un atom de carbon. Izomerizarea biochimic\ realizeaz\ trecerea reversibil\ aldoz\ ↔ cetoz\. II. Transformarea printr-un mecanism de transfer a unor fragmente de doi
sau trei atomi de carbon de la o oz\ la alta ~n felul acesta de la hexoze se ajunge la trioze, tetroze, pentoze, heptoze.
Ca donori de fragmente de doi sau trei atomi de carbon func]ioneaz\ cetozele, iar aldozele sunt acceptori.
58
III. Scindarea oxidativ\ a unui atom de carbon sub form\ de dioxid de carbon
~n urma scind\rii se ajunge la o oz\ cu un atom de carbon mai pu]in; `n acest fel se transform\ hexozele `n pentoze.
Aceasta sufer\ un proces de hidroliz\ [i trece `n acidul 6-fosfogluconic. Acest acid sufer\ concomitent o reac]ie de decarboxilare [i una de
dehidrogenare, rezultând ribulozo-5-fosfat. Regenerarea ribulozo-5-fosfatului care particip\ din nou `n fixarea
dioxidului de carbon ne arat\ c\ fotosinteza este un proces ciclic.
59
MODUL IV – LUCR|RI DE LABORATOR
1. Acizii organici din plante. Forme de aciditate Produsele vegetale con]in o serie de acizi organici fic[i sau volatili; al\turi de ace[tia se mai `ntâlnesc s\ruri cu caracter acid, ca de exemplu fosfa]ii primari, unii aminoacizi liberi, mici cantit\]i de acizi minerali. ~ntr-un extract, dup\ condi]iile de lucru, se pot determina 3 forme de aciditate: aciditate actual\ sau real\, aciditate poten]ial\ [i aciditate total\. Aciditatea actual\ sau real\ se datoreaz\ ionilor de hidroniu liberi pe care `i con]ine solu]ia la un moment dat [i se determin\ prin m\surarea pH-ului. Aciditatea poten]ial\ a solu]iei este dat\ de ionii de hidrogen din moleculele de acid nedisociate [i care pot fi pu[i `n libertate prin deplasarea echilibrului `n sensul disocierii (ioniz\rii). Aciditatea total\ a solu]iei reprezint\ suma ionilor de hidrogen liberi [i a ionilor de hidrogen lega]i, care pot fi ioniza]i numai `n m\sura `n care cei liberi se consum\. Aciditatea total\ se determin\ prin titrare alcalimetric\, cuprinzând practic to]i componen]ii cu reac]ie acid\ care se neutralizeaz\ cu bazele. ~n cazul produselor vegetale, intereseaz\ numai aciditatea total\, deoarece cunoa[terea ei ne d\ indica]ii asupra gradului de maturare [i a calit\]ii lor pentru consum (cazul legumelor [i fructelor).
Determinarea acidit\]ii titrabile la fructe [i legume proaspete Principiul metodei Determinarea acidit\]ii totale se bazeaz\ pe reac]ia de neutralizare cu solu]ii alcaline pân\ la punctul de echivalen]\. Fiind vorba de o aciditate datorat\ `n primul rând acizilor organici care sunt acizi slabi, se vor folosi ca indicatori fenolftaleina sau albastrul de timol. Pentru solu]ii sau extracte puternic colorate, [i mai ales pentru cele tulburi, sunt recomandate metodele electrometrice. Reactivi 1. solu]ie de hidroxid de sodiu, 0,1n; 2. fenolftalein\, solu]ie alcoolic\ 1%. Modul de lucru ~ntr-un mojar se mojareaz\ cât mai repede 20 g produs vegetal, se trece totul cantitativ `ntr-un pahar de 200 ml, se adaug\ 50 ml ap\ distilat\ [i se fierbe timp de o or\, ad\ugându-se periodic apa pierdut\ prin evaporare. Se transvazeaz\ totul `ntr-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn [i se filtreaz\ `ntr-un balon uscat, printr-o hârtie de filtru uscat\. Din filtrat se iau cu pipeta 25 ml, se dilueaz\ pân\ la un volum de 50 ml cu ap\ distilat\ proasp\t fiart\ [i r\cit\, se adaug\ câteva pic\turi de fenolftalein\ [i se titreaz\ cu hidroxid de sodiu 0,1n pân\ la apari]ia colora]iei net roz. Calculul rezultatelor Exprimarea rezultatelor se face prin num\rul de mililitri de hidroxid de sodiu 0,1n care au neutralizat acizii din 100 g material vegetal. ~n cazul exprim\rii rezultatelor `n grame acid predominant, volumul de solu]ie 0,1n folosit la titrare se multiplic\ cu urm\torii factori de echivalen]\: - 0,0064 pentru exprimarea `n acid citric;
60
- 0,0067 pentru exprimarea `n acid malic; - 0,0060 pentru exprimarea `n acid acetic; - 0,0075 pentru exprimarea `n acid tartric; - 0,0045 pentru exprimarea `n acid oxalic; - 0,0090 pentru exprimarea `n acid lactic. Pentru exprimarea procentual\ a acidit\]ii se utilizeaz\ urm\toarea formul\:
100va
dtfnA ⋅
⋅⋅⋅⋅
=
`n care: A - aciditatea `n procente; n - num\rul de mililitri de solu]ie de hidroxid de sodiu 0,1n consuma]i la titrare; f - factorul solu]iei de hidroxid de sodiu 0,1n; t - cantitatea de acid (g) echivalent\ unui mililitru de solu]ie de hidroxid de sodiu 0,1n; d - volumul total al extractului (volumul balonului cotat); a - masa probei analizate (g); v - volumul extractului luat pentru titrare (ml).
2. Oze (monoglucide, monozaharide, monoze) Ozele sunt hidroxialdehide sau hidroxicetone. Ele pot fi considerate ca rezultând din poliolii alifatici prin oxidarea grupelor func]ionale hidroxil. Dintre ozele naturale, cele mai importante se consider\ a fi pentozele [i hexozele. Reac]ia Tollens Principiul reac]iei In prezen]a ozelor reduc\toare (aldoze), azotatul de argint, `n mediu alcalin, la cald, este redus la argint metalic care se depune pe pere]ii eprubetei sub forma unei oglinzi. Reac]iile care au loc sunt:
)-NO (NH 2 H Ag )-OH (NH 2 )-NO (Ag 2 342243 +++→+++ +++ OO
Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc 1-2 ml solu]ie azotat de argint 2%, se adaug\ apoi amoniac, pic\tur\ cu pic\tur\, pân\ se dizolv\ precipitatul format ini]ial, se mai adaug\ o pic\tur\ de hidroxid de sodiu concentrat [i apoi 2 ml solu]ie de glucoz\. Se omogenizeaz\ con]inutul [i apoi se `nc\lze[te u[or la flac\r\. Se observ\ depunerea argintului pe pere]ii eprubetei. Reac]ia Fehling Principiul reac]iei ~n mediu alcalin, ozele reduc hidroxidul cupric, cu formare de oxid cupros (Cu2O) care se depune sub forma unui precipitat ro[u-c\r\miziu. Mecanismul reac]iei este urm\torul: sulfatul de cupru din solu]ia Fehling I (solu]ie de CuSO4) reac]ioneaz\ cu hidroxidul de sodiu din solu]ia Fehling II (amestec de solu]ii de sare Seignette - tartrat dublu de sodiu [i potasiu - [i hidroxid de sodiu) (Cu2+ + SO4
2-) + 2(Na+ + OH-) = (2Na+ + SO42-) + Cu(OH)2
Hidroxidul cupric, de culoare albastr\, `n prezen]a glucozei sau a altor oze care au gruparea glicozidic\ liber\, la cald, este redus la hidroxid cupros, de culoare galben\.
Prin `nc\lzire, hidroxidul cupros se deshidrateaz\, transformându-se `n oxid cupros.
2CuOH = Cu2O + H2O Reactivi
1. glucoz\, solu]ie 2% 2. solu]ie Fehling I (40 g CuSO4 dizolvate `n 1000 ml ap\ distilat\) 3. solu]ie Fehling II (150 g NaOH + 200 g sare Seignette dizolvate `n 1000
ml ap\ distilat\) Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc cu pipeta 1-2 ml din solu]ia de analizat (glucoz\ 2%) [i apoi se adaug\ 1 ml licoare Fehling (amestec proasp\t preparat din solu]iile Fehling I [i Fehling II `n propor]ie de 1 : 1). Con]inutul eprubetelor se `nc\lze[te pân\ la fierbere. Se observ\ depunerea unui precipitat ro[u-c\r\miziu. Sarea Seignette are rolul de a men]ine ionii cuprici `n solu]ie, sub form\ de complex tartro-cupric. Reac]ia cu albastru de metil Principiul reac]iei Ozele reduc\toare sunt oxidate cu formarea acidului aldonic respectiv, iar solu]ia de albastru de metil este redus\ cu formarea leucoderivatului (derivat incolor).
Reactivi
1. glucoz\, solu]ie 1% 2. carbonat de sodiu, solu]ie 2% 3. albastru de metil, solu]ie 1%.
62
Modul de lucru La 2 ml solu]ie de glucoz\ 1% se adaug\ 3 pic\turi solu]ie carbonat de sodiu 2% [i 5 pic\turi solu]ie albastru de metil 1%. Amestecul astfel ob]inut se `nc\lze[te pe o baie de ap\. Se observ\ decolorarea treptat\ a con]inutului eprubetei. Forma redus\, incolor\, a colorantului, `n contact cu oxigenul din aer, cedeaz\ acestuia 2 atomi de hidrogen cu formare de ap\ [i reapari]ia formei colorate. Reac]ia cu acidul picric Principiul reac]iei Ozele reduc\toare reduc acidul picric `n mediu alcalin, la cald, transformându-l `n acid picramic.
Reactivi
1. glucoz\, solu]ie 1% sau alt glucid reduc\tor 2. acid picric, solu]ie 0,5% 3. hidroxid de sodiu, solu]ie 10%.
Modul de lucru Intr-o eprubet\ se introduc 1-2 ml solu]ie de analizat, se adaug\ 2 ml solu]ie de acid picric 0,5% [i 1 ml solu]ie de hidroxid de sodiu 10%. Prin fierbere, culoarea galben\ a acidului picric trece `n ro[u. Reac]ia Selivanov Principiul reac]iei Cetozele (fructoza), prin `nc\lzire `n prezen]a acidului clorhidric [i a rezorcinei, coloreaz\ solu]ia `n ro[u-vi[iniu sau ro[u. Reac]ia Selivanov este specific\ pentru cetoze, permi]ând identificarea acestora din amestecurile cu
CHOCHOH( )4CH2OH
+Cl
CH3 CH3
-N+
N
SN
CH3
CH3
+ H O2
CHOH( )4
COOH
CH2OH
+
N
H
SNH
CH3
CH3 +Cl-
N CH3
CH3
glucoza albastru de metil
acid gluconicleucoderivatul albastrului de metil
O
CH
CH2OH
OH( )4+ (CHOH)4
C
CH2OH
OH
NO2
NO2
NO2 + H2
OH
NH2O N2
NO2
+
OOH
acid picricaldohexoza
acid picramicacid aldonic
CH
63
aldoze, deoarece acestea din urm\ dau produsul colorat mult mai lent (aproape de 20 de ori).
Reactivi
1. fructoz\, solu]ie 1% 2. reactiv Selivanov: `n 100 ml solu]ie de acid clorhidric 20% se dizolv\ 0,05
g de rezorcin\ 3. acid clorhidric, solu]ie 20%: 45ml acid clorhidric, d = 1,19 se dilueaz\
pân\ la volumul de 100 ml. Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se pipeteaz\ 1 - 2 ml solu]ie Selivanov la care se adaug\ 2 - 3 pic\turi de solu]ie de fructoz\. Eprubeta se `nc\lze[te pe o baie de ap\ pân\ la fierbere, când apare complexul colorat. Reac]ia Molisch-Udranski Principiul reac]iei Glucidele dau cu alfa-naftolul, `n prezen]a acidului sulfuric concentrat, compu[i colora]i `n violet. Reac]ia este urm\toarea:
OC
C
C
C
CH2OH
OH
HOCH2
HHOHHOH
temperatura3 H2O
C C
C CO CHOHOCH2
HHOH
OH
OH
H
OHH+ - 2 H O2
rezorcina
OC C
CH
HOCH2
OH
OH
C
CH
HO 2 2+ H O
- H O2
OC
HOCH2
CO
OH
CH CH
OCC
fructoza (forma furanozica) hidroximetil-furfurol
produs colorat rosu-visiniu
OHHOCH2
CH
HOHC CHOH
CH
OHCHO
H SO2 4 conc.
- 3 H O2
CH CH
OC CHOCHOCH2
OH
OH
CH CH
HOCH2 C C CHO+
- H O2 OHOCH2 C
OH
C
C
aldoza hidroximetilfurfurol
O
alfa-naftol compus colorat rosu visiniu
64
Reactivi 1. solu]ie de glucid 1 - 2% (glucoz\) 2. solu]ie alcoolic\ proasp\t preparat\ de alfa-naftol 1% 3. solu]ie de acid sulfuric concentrat, d = 1,84.
Modul de lucru Se introduce `ntr-o eprubet\ aproximativ 1 ml din solu]ia de analizat, se adaug\ 3 - 4 pic\turi din solu]ia de alfa-naftol [i se agit\ con]inutul. Se prelinge cu aten]ie pe pere]ii eprubetei `nclinate, 1 ml de acid sulfuric concentrat, f\r\ a se agita ulterior eprubeta. La suprafa]a de separare a celor dou\ lichide apare un inel colorat `n vi[iniu.
3. Oligozide Dintre oligozide, diholozidele au importan]a biologic\ cea mai mare.
Caracterul reduc\tor [i nereduc\tor al diholozidelor Principiul reac]iilor Diholozidele `n care ozele se leag\ monocarbonilic (maltoza, lactoza, celobioza etc.) au propriet\]i reduc\toare. Diholozidele `n care ozele se leag\ dicarbonilic nu au propriet\]i reduc\toare. Reac]ia Fehling Reactivi
1. maltoz\, solu]ie 1% 2. lactoz\, solu]ie 1% 3. zaharoz\, solu]ie 1% 4. solu]ie Fehling I 5. solu]ie Fehling II.
Modul de lucru In trei eprubete se pipeteaz\ câte 4 ml licoare Fehling format\ din volume egale de solu]ie Fehling I [i II. Se fierbe con]inutul eprubetelor pe o baie de ap\. Se adaug\ apoi `n prima eprubet\ 2 ml solu]ie de zaharoz\, `n a doua, 2 ml solu]ie lactoz\, `n a treia, 2 ml solu]ie maltoz\, continuându-se fierberea. In eprubeta cu solu]ie de zaharoz\ nu apare precipitatul ro[u-c\r\miziu, a[a cum apare `n celelalte dou\ eprubete, cu lactoz\ [i maltoz\.
Hidroliza zaharozei (invertirea zaharozei) Principiul reac]iei Prin fierbere cu acid clorhidric diluat, zaharoza hidrolizeaz\ `n componen]ii s\i (glucoz\ [i fructoz\). Totodat\ se produce [i o inversiune `n activitatea optic\ a zaharozei. Inainte de fierbere cu acid clorhidric diluat, zaharoza este dextrogir\. Dup\ fierbere cu acid clorhidric diluat, amestecul este levogir, datorit\ fructozei. In urma acestui fapt, hidroliza zaharozei poart\ numele de invertire, iar amestecul, zah\r invertit, prezentând propriet\]i reduc\toare:
65
Reactivi 1. zaharoz\, solu]ie 2% 2. acid clorhidric diluat 1 : 1 3. carbonat de sodiu, cristale 4. solu]ie Fehling I 5. solu]ie Fehling II 6. hârtie de turnesol. Modul de lucru Intr-o eprubet\ se pipeteaza 2 ml solu]ie de zaharoz\, peste care se adaug\ 2-3 pic\turi de acid clorhidric diluat [i se fierbe. Peste solu]ia fierbinte se adaug\ cristale de carbonat de sodiu, pân\ la neutralizare (`n prezen]a hârtiei de turnesol) [i apoi licoarea Fehling, dup\ care se continu\ fierberea. Se va ob]ine un precipitat ro[u-c\r\miziu de oxid cupros, datorit\ func]iei aldehidice a glucozei.
Poliozide Sunt substan]e macromoleculare, greu solubile sau insolubile `n ap\, nu prezint\ caracter reduc\tor [i nici propriet\]ile specifice ozelor. Pentru poliozide este caracteristic\ reac]ia de hidroliz\, acestea prezentând [i unele reac]ii specifice.
Reac]iile amidonului Reac]ia amidonului cu iodul Principiul reac]iei Amidonul formeaz\ la rece cu o solu]ie de iod `n iodur\ de potasiu, o colora]ie albastr\ ce permite identificarea sa. Apari]ia acestei culori se datoreaz\ adsorb]iei iodului la suprafa]a micelelor aflate `n solu]ie. Colora]ia dispare la o temperatur\ mai mare de 60oC [i reapare la r\cire. Reactivi 1. amidon, solu]ie 1% 2. solu]ie de iod `n iodur\ de potasiu (1 g iod [i 2 g iodur\ de potasiu, se
completeaz\ cu ap\ pân\ la 100 ml) Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc 1 - 2 ml solu]ie de amidon [i se adaug\ câteva pic\turi de solu]ie de iod `n iodur\ de potasiu. Apare imediat o colora]ie albastr\. Se `nc\lze[te solu]ia la fierbere [i culoarea dispare imediat. R\cind solu]ia, culoarea albastr\ reapare.
OH
HOOH
H
H
OH
CH2OH
HH
O
O
H
OH
HO
H
H
CH2OH
HOCH2OH
HOOH
H
H
OH
CH2OH
HH
OH
O
H
OH
HO
H
H
CH2OH
HOCH2
HO+
+ H2O
66
Hidroliza amidonului Principiul reac]iei ~n prezen]a enzimelor sau pe cale chimic\ (`n mediu slab acid) macromoleculele de amidon se scindeaz\ pe rând `n molecule ce se pot identifica prin reac]ii de culoare. Schematic, hidroliza amidonului poate fi reprezentat\ astfel:
Amilodextrinele dau o colora]ie violet\ cu iodul `n iodur\ de potasiu; eritrodextrinele, o colora]ie ro[ie-brun\; acrodextrinele, maltodextrinele, maltoza [i glucoza nu coloreaz\ solu]ia de iod . Hidroliza se poate urm\ri [i efectuând reac]ia Fehling cu diferi]i produ[i de hidroliz\ ce se ob]in. Apari]ia [i cre[terea puterii reduc\toare a acestora ne indic\ faptul c\ se ob]in compu[i cu mas\ molecular\ din ce `n ce mai mic\. Reactivi 1. amidon, solu]ie 5% 2. acid clorhidric concentrat 3. reactiv Fehling I 4. reactiv Fehling II 5. hidroxid de sodiu, solu]ie 30%. Modul de lucru ~ntr-un pahar Berzelius se introduc 10 - 25 ml solu]ie de amidon. Se adaug\ 1 ml HCl concentrat [i se `nc\lze[te pe baia de ap\ la 80 - 90oC. Separat, pe o plac\ de por]elan cu cavit\]i, se picur\ `n fiecare cavitate câteva pic\turi de solu]ie de iod `n iodur\ de potasiu. Cu o baghet\, se ia `n momentul ini]ial o pic\tur\ de solu]ie de amidon din pahar [i se picur\ `n prima cavitate peste solu]ia de iod. Se observ\ apari]ia colora]iei albastre. Men]inând aceea[i temperatur\ `n baie, reac]ia se repet\ din timp `n timp cca 5 minute, notându-se culorile ob]inute. Apari]ia culorilor diferite indic\ diferite trepte ale hidrolizei. Hidroliza se consider\ terminat\ atunci când o pic\tur\ de hidrolizat nu se mai coloreaz\ cu iodul. Glucoza rezultat\ `n urma hidrolizei este pus\ `n eviden]\ prin reac]ia Fehling, executat\ cu o por]iune de solu]ie final\, neutralizat\ cu o solu]ie de NaOH 30%. Reac]ia va fi pozitiv\.
Metode cantitative de analiz\ Metodele pentru dozarea glucidelor sunt numeroase [i variate. Dup\ o prim\ clasificare se `mpart `n metode chimice [i metode fizico-chimice. Metodele chimice pentru dozarea glucidelor sunt cele mai utilizate. Ele se bazeaz\ mai ales pe capacitatea glucidelor reduc\toare de a fi oxidate u[or `n solu]ii alcaline de c\tre unii oxidan]i relativ slabi (oxizi de cupru [i mercur, ferocianur\ de potasiu, iod).
amidon amilodextrine eritrodextrine acrodextrine
maltodextrine maltoza glucoza
67
4. Dozarea glucidelor reduc\toare prin metoda iodometric\ Principiul metodei Metoda se bazeaz\ pe proprietatea pe care o au aldozele de a putea fi oxidate la acizii carbonilici (aldonici) corespunz\tori sub ac]iunea iodului `n mediu alcalin, conform reac]iilor:
Un volum determinat din solu]ia de analizat se trateaz\ la rece cu un exces dintr-o solu]ie de iod [i apoi iodul r\mas dup\ reac]ia cu aldoza se titreaz\ cu tiosulfat de sodiu, `n mediu acid.
Reactivi 1. solu]ie de acid sulfuric 4 n (111,2 ml acid , d = 1,84, la 1000 ml solu]ie) 2. amidon, solu]ie 1% 3. carbonat de sodiu 1 n (122 g carbonat de sodiu cristalizat la 1000 ml solu]ie) 4. solu]ie iod 0,1 n (12,7 g iod se dizolv\ `ntr-un vas `n care se g\sesc 25 g
iodur\ de potasiu [i 25 ml ap\; se agit\ pân\ la dizolvare, se filtreaz\ [i se aduce la volumul de 1000 ml cu ap\ distilat\;
5. tiosulfat de sodiu, solu]ie 1n (125 g tiosulfat de sodiu cristalizat se dizolv\ `ntr-un litru de ap\ distilat\ fiart\ [i r\cit\, apoi se aduce la volumul de 5 litri, tot cu ap\ distilat\ fiart\ [i r\cit\).
Modul de lucru Se pipeteaz\ 5 ml din solu]ia de analizat (care s\ nu con]in\ mai mult de 0,05 g glucoz\ sau 0,1 g maltoz\ sau lactoz\) `ntr-un flacon conic cu dop de sticl\ [lefuit. Se adaug\ 10 ml (V1) solu]ie de iod0,1n m\surat\ cu biureta [i 7 ml solu]ie de carbonat de sodiu 1n. Se astup\ flaconul cu dopul, se agit\ u[or [i se las\ `n repaus 20 de minute la temperatura camerei, `ntr-un loc ferit de lumin\. Dup\ scurgerea acestui interval se aciduleaz\ con]inutul flaconului cu 5 ml acid sulfuric 4n [i se titreaz\ excesul de iod cu o solu]ie de tiosulfat de sodiu0,1n `n prezen]a amidonului (V2). Calculul ra]ional Nota]ii utilizate: V1 = volumul de solu]ie de iod0,1n introdus ini]ial; f1 = factorul solu]iei de iod0,1n; V2 = volumul de solu]ie de tiosulfat de sodiu0,1n folosit la titrare; f2 = factorul solu]iei de tiosulfat de sodiu0,1n
I + 2 (Na + OH )+ -2 (Na + IO ) + (Na + I ) + H O+ - + -
2
R CO
H+ (Na + IO )
+ - R COOH + (Na + I )+ -
R CO
H+ I + 2 (Na + OH )+ -
2 R COOH + 2(Na+ + I- )+ H O2
I + 2 (2Na + S O )2+
2 32-
2 (Na + I ) + (2Na + S O )+ - +
4 62-
68
I. Calcularea excesului de iod
Solu]ia de tiosulfat de sodiu este 0,1 n, deci se poate scrie:
1000 ml sol. Na2S2O3 ................ 0,1.248 .f2 g Na2S2O3 V2 ml sol. Na2S2O3 ........... 0,1.248.V2f2/1000 g Na2S2O3
Conform reac]iei de titrare a excesului de iod rezult\: 1
322 OSNaE .......... 1 2I
E
248 g ..................... 127 g 0,1.248.V2f2/1000 g Na2S2O3 ............... x g I2
x = 0,1.V2f2 .127/1000 g I2
II. Cantitatea total\ de iod: se calculeaz\ numarul de grame de iod din 25 ml solu]ie 0,1n conform rela]iei:
0,1.127.V1.f1/1000 = b grame I2
III. Iodul consumat in reactia de oxido-reducere : b - a = c grame I2
IV. Cantitatea de glucid oxidat (glucoza) : 180 g glucoz\ .............2.127 g I2 90 g glucoz\ ................. 127 g I2 y g glucoz\ ....................... c g I2
y = 90.c/127 grame glucoz\ `n 10 ml solu]ie % glucoz\ = y.10
5. Determinarea polarimetric\ a amidonului dup\ Ewers-Grossfeld Principiul metodei Amidonul se dizolv\ `n acid clorhidric diluat [i se cite[te la polarimetru devia]ia planului luminii polarizate de c\tre solu]ia ob]inut\. Reactivi 1. acid clorhidric, solu]ie 1,124%; 57,5 - 58 ml acid clorhidric concentrat pur (d
= 1,19) se introduc `n circa 500 ml ap\ distilat\ [i se completeaz\ apoi volumul solu]iei cu ap\ distilat\ la 2,25 litri;
2. acid clorhidric, solu]ie 25%; se dilueaz\ 600 ml acid clorhidric concentrat (d = 1,19) cu ap\ distilat\, pân\ la un volum de 1000 ml;
3. solu]ie de fosfowolframat de sodiu; 120 g fosfat disodic cristalizat (Na2HPO4 .
12 H2O) [i 200 g wolframat de sodiu cristalizat (Na2WO4 . 2 H2O) se dizolv\
`n ap\ distilat\ [i se aduce la un volum de 1000 ml. Modul de lucru La balan]a analitic\, `ntr-o nacel\, se cânt\resc 5 g material fin m\cinat, care se trece, f\r\ pierderi, `ntr-un balon cotat de 300 ml, unde se amestec\ bine cu 25 ml acid clorhidric 1,124% pân\ nu se mai observ\ aglomer\ri de material. Se mai adaug\ 25 ml din aceea[i solu]ie de acid clorhidric (1,124%) pentru sp\larea gâtului balonului, se amestec\ u[or [i se introduce balonul `ntr-o baie de ap\ fierbinte, unde se ]ine exact 15 minute (fierberea nu trebuie s\ se opreasc\ dup\ introducerea balonului). Balonul se agit\ des `n primele 3 minute, f\r\ a-l scoate din baie. Se scoate apoi balonul, se toarn\ `n el imediat 20 ml ap\ distilat\ rece, se r\ce[te cât mai repede con]inutul pân\ la temperatura de 200 C cufundând [i agitând balonul `ntr-un cristalizor mare cu ap\ rece. Se adaug\ apoi 20 ml de acid clorhidric 25% [i 1 ml solu]ie fosfowolframat de sodiu. Se aduce con]inutul balonului la semn cu ap\ distilat\, se amestec\ [i se filtreaz\ printr-un filtru uscat, turnând filtratul `ntr-un vas uscat [i eliminând primii 10 ml. Se polarimetreaz\
69
filtratul limpede `ntr-un tub de 200 mm, având grij\ ca temperatura solu]iei s\ fie de 200 C. Calculul rezultatelor Cantitatea de amidon brut con]inut\ `n produsul de cânt\rit, exprimat\ `n grame, este dat\ de rela]ia:
A pl
p pD
=⋅
⋅=
⋅⋅
= ⋅100 100
2 18370 272220α ..
`n care: p = grade polarimetrice citite; l = lungmea tubului polarimetric, `n decimetri; αD
20 = devia]ia polarimetric\ specific\ amidonului, care `n cazul solu]iilor ob]inute `n modul de mai sus are valoarea medie de + 183,70.
6. Analiza calitativ\ a gliceridelor
Formarea [i identificarea acroleinei Acroleina se formeaz\ pe seama glicerolului prezent `n gliceride, precum [i `n glicerofosfolipide. Acroleina, aldehid\ nesaturat\, poate fi pus\ `n eviden]\ printr-o reac]ie specific\ aldehidelor (Tollens, Fehling). Reactivi 1. sulfat acid de potasiu, substan]\ solid\; 2. reactiv Tollens (vezi reac]ia Tollens). Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc câteva pic\turi de ulei vegetal [i circa 0,5 g sulfat acid de potasiu. Se `nc\lze[te eprubeta, amestecul din eprubet\ se `nnegre[te [i se degaj\ produse volatile (vapori de ap\, bioxid de carbon, acrolein\). La gura eprubetei, se a[eaz\ o fâ[ie de hârtie de filtru impregnat\ cu reactiv Tollens. Hârtia de filtru `n contact cu acroleina se `nnegre[te, datorit\ depunerii argintului metalic din reactiv.
CH2
CH
CH2
OH
OH
OH
CH
CH
CH2
OH
OH
CH2
CH
CH2
OH
OH
OH
C
CH2
CH2 OH
O
H
-H2O
C
CH
CH2
O
Htautomerizare
- H2O
C
CH
CH2
O
H+
acid acrilic
+ 2 Ag + 4NH3 +H2O
COOH
CH
CH2
2 OH-
+ 2 Ag(NH3)2
+
70
Saponificarea gliceridelor Prin hidroliz\, gliceridele se descompun `n glicerol [i acizii gra[i componen]i. ~n cazul hidrolizei `n mediul alcalin, rezult\ s\rurile acizilor gra[i numite s\punuri, de unde [i numele de saponificare.
Reactivi 1. hidroxid de sodiu, solu]ie 40 %; 2. clorur\ de sodiu, solu]ie saturat\. Modul de lucru ~ntr-o capsul\ de por]elan, se introduc 3 ÷ 4 g ulei vegetal [i 6 ÷ 7 ml solu]ie de hidroxid de sodiu de concentra]ie 40% (cu cilindrul). Con]inutul capsulei se fierbe la flac\ra unui bec, pe o sit\ de azbest, sau pe o baie de nisip, timp de 20 ÷ 30 minute, agitând continuu cu o baghet\ de sticl\. Din timp `n timp, se completeaz\ apa evaporat\, prin ad\ugare de ap\ fierbinte, `n a[a fel `ncât s\ se p\streze volumul ini]ial. Sfâr[itul saponific\rii se controleaz\ prin introducerea câtorva pic\turi din amestec, `ntr-o eprubet\, `n care se g\sesc 5 ÷ 6 ml ap\ fierbinte, se agit\; lipsa pic\turilor de gr\sime indic\ sfâr[itul saponific\rii. ~n acest moment se adaug\ 10 ÷ 15 ml solu]ie cald\ de clorur\ de sodiu, se agit\ cu bagheta [i se las\ s\ se r\ceasc\. S\punul se ridic\ la suprafa]a solu]iei, sub forma unui strat solidificat.
7. Determinarea indicilor ce caracterizeaz\ lipidele Determinarea unor caractere fizice sau chimice, cum sunt densitatea, punctul de topire, indicele de refrac]ie, de aciditate, de saponificare, de iod etc, ale gr\similor naturale, este important\ deoarece prin acestea se pot stabili: natura, originea, `nsu[irile tehnologice [i `n general valoarea diferitelor gr\simi, cu alte cuvinte caracterizarea lor.
Determinarea indicelui de aciditate Uleiurile [i gr\simile naturale con]in `ntotdeauna mici cantit\]i de acizi liberi organici, ap\rute prin hidroliza lor, din care cauz\ au o oarecare aciditate. ~n general, la materiile grase proasp\t preparate, ace[ti acizi se g\sesc `n propor]ie mic\, cantitatea de acizi liberi cre[te `ns\ odat\ cu `nvechirea gr\simii. Pentru aceste motive, determinarea acidit\]ii libere a unei gr\simi, exprimat\ prin "indice de aciditate", ne permite s\ apreciem gradul de conservare al gr\simii repective. Prin "indice de aciditate" `n]elegem cantitatea - `n mg - de hidroxid de potasiu necesar\ neutraliz\rii acizilor gra[i liberi, dintr-un gram de materie gras\. Principiul metodei Metoda se bazeaz\ pe neutralizarea acidit\]ii libere a unei anumite cantit\]i de gr\sime, cu o solu]ie alcoolic\ de hidroxid de potasiu de titru [i factor
+ 3 NaOH
CH2 OH
OHCH
OHCH2
+
s\punuri
R COONa
R' COONa
R'' COONa
CH2 O CO
R
R'
OCOCH
CH2 O CO
R''
71
cunoscut, `n prezen]a fenolftaleinei. Rezultatele se exprim\ `n mg de hidroxid de potasiu, la un gram de materie gras\. Determinarea se poate executa la rece sau la cald. Reactivi
1. solventul neutru: 1 volum alcool etilic + 2 volume alcool metilic, sau un volum alcool etilic + 4 volume eter etilic; 2. solu]ie alcoolic\ de hidroxid de potasiu 0,1 n: 5,6 g hidroxid de potasiu se
dizolv\ `n minimum posibil de ap\ distilat\ [i se aduce apoi la volumul de 1000 ml cu alcool etilic 96 %; 3. fenolftalein\ 1%: 1 g fenolftalein\ se dizolv\ `n 100 ml alcool etilic de
80%. Modul de lucru Determinarea la rece: se cânt\re[te la balan]a analitic\ 1 g material de analizat (ulei), se adaug\ 10 cm3 amestec solven]i (1 volum alcool etilic + 4 volume eter etilic). Se titreaz\ la rece, cu o solu]ie alcoolic\ de hidroxid de potasiu 0,1 n, `n prezen]\ de fenolftalein\, agitând mereu pân\ la completa neutralizare. Dac\ se presupune o aciditate liber\ mai mare de 5 %, este de preferat titrarea cu o solu]ie de hidroxid de potasiu 0,5 n. Calculul rezultatelor La titrare s-au folosit V ml hidroxid de potasiu 0,1 n, cu factorul de corec]ie f. Echivalentul gram al KOH este 56 g. Deci:
1000 ml KOH 0,1 n de factor f ...........................................................10
f56 × g KOH
V ml KOH .............................................................................................x
g 101000
f56Vx
×××
=
Valoarea lui x se `nmul]e[te cu 1000 pentru a exprima, conform defini]iei, indicele `n mg de KOH. Rezultatul se raporteaz\ la 1 g gr\sime. Deci valorea indicelui de aciditate se poate calcula conform rela]iei:
G
6,5fVIA
××=
`n care: IA reprezint\ indicele de aciditate; G reprezint\ masa de substan]\ luat\ `n studiu `n g.
Determinarea indicelui de saponificare Se nume[te indice de saponificare num\rul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru a saponifica un gram dintr-o gr\sime. Determinarea acestei valori va da indica]ii asupra greut\]ii moleculare medii a acizilor gra[i din gr\simea respectiv\. Principiul metodei Pentru determinarea indicelui de saponificare, se supune saponific\rii o cantitate cunoscut\ de gr\sime, prin fierbere cu o cantitate `n exces de hidroxid de potasiu 0,5 n (solu]ie alcoolic\). Dup\ terminarea saponific\rii se determin\, prin titrare cu un acid, hidroxidul de potasiu r\mas nereac]ionat (exces); se stabile[te,
72
prin diferen]\, cantitatea de hidroxid ce a fost folosit\ la neutralizarea [i saponificarea gr\simii. Se raporteaz\ la un gram de gr\sime. Reactivi
1. solu]ie alcoolic\ de KOH 0,5 n: 28 g KOH se dizolv\ `n cât mai pu]in\ ap\ fiart\ [i r\cit\ [i se completeaz\ la 1000 ml cu alcool etilic 96°; 2. solu]ie de HCl 0,5 n [i factor determinat: 41 ml HCl d = 1,19 se aduc la
volumul de 100 ml, cu ap\ distilat\; 3. fenolftalein\ 1 %, `n alcool etilic.
Modul de lucru Se cânt\resc la balan]a analitic\, prin diferen]\, `ntr-un flacon conic uscat, circa 2 ÷ 3 g gr\sime. Se adaug\ apoi `n flacon, cu o biuret\, exact 25 ml hidroxid de potasiu 0,5 n. La flacon se adapteaz\ un refrigerent ascendent r\cit cu aer. Se fierbe moderat, timp de 15 minute, agitând flaconul din când `n când. Hidroliza este terminat\ atunci când `n lichidul din flacon nu se mai v\d pic\turi de gr\sime. ~n acest moment se scoate refrigerentul, se adaug\ 2 ÷ 3 pic\turi de fenolftalein\, care va colora lichidul `n ro[u, se titreaz\ apoi repede, la cald, cu o solu]ie de HCl 0,5 n, pân\ la dispari]ia culorii ro[ii. ~n paralel, exact `n acelea[i condi]ii se execut\ o prob\ martor. Calculul rezultatelor Not\m: V1 - volumul de acid clorhidric 0,5 n folosit pentru proba martor, `n cm3; V2 - volumul de acid clorhidric folosit pentru titrarea excesului de hidroxid de potasiu, `n cm3; f - factorul de corec]ie al solu]iei de acid clorhidric 0,5 n; G - greutatea materiei grase luate `n analiz\, `n grame. EKOH = 56 grame; EHCl = 36,5 grame 1) V1 - V2 = V cm3 HCl 0,5 n reprezint\ volumul echivalent de hidroxid de potasiu consumat la saponificare; 2) 56 g KOH ...................................................................36,5 g HCl
y ......................................................................... g 10002
Vf5,36
×××
10002
Vf56y
×××
= g de KOH consuma]i la saponificare
y × 1000 = M mg KOH
G
MIS = `n care G = cantitatea de gr\sime luat\ `n analiz\.
Pentru aflarea indicelui de saponificare se raporteaz\ la 1 g gr\sime. Conform calculului ra]ional, ajungem la urm\toarea formul\ pentru calcularea indicelui de saponificare:
G
28f)VV(I 21
S
××−=
(la 1 cm3 acid clorhidric 0,5 n corespund 28 mg KOH).
73
Valorile indicelui de saponificare la principalele uleiuri vegetale: ulei de bumbac 191 ÷ 198; ulei de floarea soarelui 188 ÷ 194; ulei de in 188 ÷ 192; ulei de m\sline 189 ÷ 196; ulei de porumb 188 ÷ 198.
Determinarea indicelui de iod.
~n constitu]ia lipidelor naturale, intr\ [i diferi]i acizi gra[i nesatura]i, ca: oleic, linoleic, linolenic. Prezen]a `n molecula lipidelor a acestor acizi confer\ gr\similor proprietatea lor caracteristic\, nesaturarea. Dintre reac]iile de adi]ie pe care le pot da, importan]\ analitic\ o are adi]ia halogenilor la dubla leg\tur\, conform reac]iei: Se nume[te "indice de iod" cantitatea, `n grame, de iod pe care o poate adi]iona 100 g materie gras\. Valoarea indicelui de iod este una din constantele analitice importante, care serve[te la caracterizarea lipidelor naturale. Metodele de determinare a indicelui de iod se deosebesc prin natura halogenului [i a solventului `n care solu]ia acestuia este preparat\. Metoda Hanus ~n aceast\ metod\ se folose[te solu]ie de monobromur\ de iod (IBr) `n acid acetic glacial. Principiul metodei Se trateaz\ gr\simea respectiv\ cu un exces cunoscut de iod, cu care se las\ `n contact un anumit interval de timp, dup\ care se determin\, prin titrare, cantitatea de iod r\mas\ necombinat\. Prin diferen]a, fa]\ de iodul introdus ini]ial, se afl\ cantitatea de iod pe care s-a fixat gr\simea.
6423222
2
OSNaNaI 2OSNa 2I
IKBrIBrKI
+=++=+
Reactivi
1. cloroform; 2. reactiv Hanus: solu]ie de bromur\ de iod `n acid acetic concentrat; 3. solu]ie de KI 10 %, proasp\t preparat\; 4. solu]ie de tiosulfat de sodiu 0,1 n [i factor cunoscut; 5. solu]ie de amidon 0,5 %.
Modul de lucru Se cânt\resc `ntr-un flacon uscat, cu dop [lefuit, 0,1 ÷ 0,15 g ulei. Se dizolv\ uleiul `n 10 ml cloroform, se adaug\ 25 ml reactiv de halogenare, care `n cazul acestei metode este o solu]ie acetic\ de bromur\ de iod [i se las\ s\ reac]ioneze timp de 15'. Pentru uleiurile cu indici mai mari decât 120, se las\ timp de 1/2 ÷ 1 or\. Dup\ scurgerea acestui interval de timp, se adaug\ 15 ml de solu]ie apoas\ de iodur\ de potasiu 10 %, 50 ml ap\ [i se titreaz\ cu solu]ia de tiosulfat 0,1 n, `n prezen]\ de amidon. ~n paralel se execut\ exact `n acelea[i condi]ii o prob\ martor, prin care se determin\ titrul (`n iod) reactivului Hanus.
CH3 (CH2)7 CH CH (CH2)7 COOH
I Iacid oleicacid diiod stearic
CH3 (CH2)7 CH CH (CH2)7 COOH + I2
74
Calculul rezultatelor Dac\ not\m cu: V1 - volumul de tiosulfat de sodiu 0,1 n consumat la titrarea probei martor, `n ml; V2 - volumul de tiosulfat de sodiu 0,1 n consumat la titrarea probei cu ulei, `n ml; f - factorul de corec]ie al solu]iei de tiosulfat de sodiu 0,1 n; G - cantitatea de ulei luat\ `n analiz\, `n grame.
322 OSNaE = 248 g , EI = 127 g
1) V1 - V2 = V ml tiosulfat de sodiu echivalent volumului de iod adi]ionat 2) 127 g I ....................................................................................248 g Na2S2O3
x ...........................................................................................100010
fV248
×××
100010
fV127x
×××
= grame iod fixat de G grame de gr\sime
100G
xI I ×= `n care II = indicele de iod
Conform calculului ra]ional ajungem la urm\toarea rela]ie pentru calcularea indicelui de iod, cunoscând c\ 1 ml Na2S2O3 n/10 titreaz\ 0,01269 g iod.
100G
01269,0f)VV(I 21
I ×××−
=
Indicele de iod pentru câteva uleiuri vegetale: ulei de bumbac 102 ÷ 111 ulei de floarea soarelui 119 ÷ 134 ulei de in 176 ÷ 182 ulei de m\sline 79 ÷ 85 ulei de porumb 111 ÷ 130 ulei de ricin 81 ÷ 36
8. Reac]ii calitative pentru aminoacizi Reac]ia aminoacizilor cu ninhidrina Principiul metodei Aminoacizii particip\ `n reac]ie cu func]iunile amino [i carboxil, rezultând compu[i colora]i `n albastru-violet, cu excep]ia prolinei [i hidroxi-prolinei, care dau colora]ii galbene. Reac]ia se `ntâlne[te [i la proteine, peptide, amine etc. Printr-o reac]ie concomitent\ de decarboxilare [i dezaminare aminoacizii trec `ntr-o aldehid\ cu un atom de carbon mai pu]in.: Aceste reac]ii se petrec, `n cazul folosirii ninhidrinei ca reactiv de developare, la separarea cromatografic\ a aminoacizilor. Reactivi
Modul de lucru Se introduc `ntr-o eprubet\ 1-2 ml solu]ie de aminoacid [i se adaug\ câteva pic\turi de solu]ie de ninhidrin\. Apare colora]ia albastru-violet.
75
Reac]ia cu acidul azotos Principiul metodei
Aminoacizii, la fel ca [i aminele primare alifatice, se dezamineaz\ cu acidul azotos [i dau α -hidroxi-aminoacizi.
Reac]ia st\ la baza determin\rii aminoacizilor prin metoda van-Slyke. Reactivi
1. solu]ie apoas\ de glicocol, de concentra]ie 5-10%; 2. solu]ie apoas\ de azotit de sodiu, concentra]ie 5-10%; 3. acid acetic glacial.
Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc 2 ml solu]ie de glicocol, se adaug\ 2 ml solu]ie de azotit de sodiu [i câteva pic\turi de acid acetic glacial. Se observ\ degajarea azotului sub form\ de bule. Reac]ia cu aldehidele Principiul metodei Aminoacizii particip\ cu gruparea func]ional\ amino la reac]ii de condensare cu aldehidele, rezultând azometine (baze Schiff). Gruparea amino este blocat\, iar cea carboxilic\, liber\, va ioniza. Protonii rezulta]i (aciditatea) se pun `n eviden]\ cu ajutorul unui indicator adecvat.
Reactivi
1. solu]ie apoas\ de glicocol, concentra]ie 1-2%; 2. solu]ie apoas\ de formaldehid\, concentra]ie 20%; 3. solu]ie apoas\ de indicator ro[u de metil 0,1%.
O
O
OH
OH+ R-CH-COOH R-CHO +
NH2
3 + CONH 2 +
O
O
H
OH
AminoacidNinhidrina Ninhidrina redusa
O
O
H
OH
+ 2 NH3 +
O
O
OH
OH
O
O
C N C
O
ONH4Purpura lui Ruheman
R CH COOH
NH2
+ HONO R CH COOH
OH
+ N2 + H2O
R CH COOH
NH2
+ OCH R1 R CH COOH
N CH R1
+ H2O
76
Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc 2 ml solu]ie de glicocol [i se adaug\ 1-2 pic\turi de indicator. Se observ\ colorarea solu]iei `n galben deoarece pH>6 (indicatorul are intervalul de viraj la pH=4-6,2). Se adaug\ 2 ml solu]ie de formaldehid\ [i se observ\ schimbarea colora]iei solu]iei `n roz, datorit\ eliber\rii protonilor din gruparea carboxil (pH-ul devine<4). Aceast\ reac]ie st\ la baza metodei Sörensen de dozare a aminoacizilor. Diferi]i aminoacizi prezint\ reac]ii specifice de identificare, reac]ii date [i de peptide [i proteine, ce sunt descrise `n continuare.
Reac]ia cu s\rurile de cupru Principiul metodei Solu]iile apoase ale aminoacizilor dau cu s\rurile cuprice o colora]ie albastru `nchis datorit\ form\rii unor combina]ii complexe solubile (chela]i). Glicocolul formeaz\ urm\toarea combina]ie:
Reactivi
1. solu]ie de glicocol 1%; 2. solu]ie apoas\ concentrat\ de sare cupric\ (clorur\, acetat,etc).
Modul de lucru Solu]ia de aminoacid se trateaz\ cu o solu]ie neutr\ de sare cupric\. Dac\ se concentreaz\ [i se r\cesc solu]iile de chela]i formate, ace[tia se separ\ `n stare solid\, cristalin\.
9. Analiza cantitativ\. Metode de dozare a aminoacizilor
Dozarea aminoacizilor prin metoda Sörensen Principiul metodei Se bazeaz\ pe reac]ia aminoacizilor cu aldehidele, iar gruparea carboxil care ionizeaz\ poate fi titrat\ cu o solu]ie alcalin\ de concentra]ie [i factor cunoscute. Reactivi
1. solu]ie apoas\ de formaldehid\, concentra]ie 20%, neutralizat\ `n prezen]\ de fenolftalein\; 2. solu]ie hidroxid de sodiu 0,1 n, de factor cunoscut 3. solu]ie alcoolic\ de fenolftalein\ 1%; 4. solu]ie acid clorhidric 0,1 n; 5. solu]ie de aminoacid
Modul de lucru Din solu]ia de analizat (adus\ la volumul de 100 ml) se pipeteaz\ 10 ml, se introduc `ntr-un balon cotat de 100 ml [i se adaug\ 5 pic\turi solu]ie de fenolftalein\. Pentru aminoacizii cu reac]ie acid\ (cei neutri [i cei monoaminodicarboxilici) se neutralizeaz\ amestecul cu solu]ie de hidroxid de
77
sodiu 0,1 n. ~n cazul aminoacizilor cu reac]ie bazic\ `n solu]ie (cei diaminomonocarboxilici) se neutralizeaz\ amestecul cu solu]ie de acid clorhidric 0,1 n. Dup\ neutralizare se introduc 10 ml solu]ie formaldehid\ [i se titreaz\ cu solu]ie de hidroxid de sodiu 0,1 n pân\ la reapari]ia colora]iei roz palid, persistent\ timp de 30". Se introduc `nc\ 2 ml de solu]ie de formaldehid\, iar dac\ solu]ia r\mâne roz, reac]ia de ionizare a grup\rii carboxil este terminat\. Se cite[te volumul V de hidroxid de sodiu consumat la titrare. Dac\ la ad\ugarea celor 2 ml de solu]ie de formaldehid\ colora]ia roz dispare, se continu\ titrarea cu hidroxid pân\ la reapari]ia acesteia. Calculul rezultatelor Cantitatea de aminoacid exprimat\ sub form\ de grame de aminoacid la 100 ml solu]ie (%) se calculeaz\ conform ecua]iei:
% Aminoacid = nVfEa
×××
100
`n care: Ea - echivalentul chimic al aminoacidului de analizat; F - factorul de corec]ie volumetric\ al solu]iei de NaOH 0,1 n; V - volumul de NaOH consumat la titrare; n - volumul (ml) de prob\ luat\ pentru titrare.
10. Analiza calitativ\ a proteinelor. Reac]ii specifice. Reac]ii de identificare Proteinele sunt substan]e foarte reactive, datorit\ prezen]ei func]iunilor libere amino [i carboxil, a leg\turilor peptidice [i a naturii radicalilor aminoacizilor componen]i. Din multitudinea de reac]ii calitative, se execut\ acelea care dau ca produ[i de reac]ie compu[i colora]i sau precipitate. De aceea, `n tehnica de laborator, aceste reac]ii calitative sunt cuprinse `n dou\ grupe: a) Reac]ii de culoare b) Reac]ii de precipitare (denaturare). Reac]ii de culoare Sunt frecvent efectuate [i sunt prezente atât la holo cât [i la heteroproteine. Reac]ia biuretului Principiul reac]iei Solu]iile proteinelor, `n prezen]a sulfatului de cupru [i a mediului puternic alcalin, se coloreaz\ `n albastru-violet. Reac]ia se realizeaz\ pe seama leg\turilor peptidice, la nivelul c\rora se stabilesc leg\turi chelatice cu cuprul. Reac]ia conduce la formarea de compu[i chelatici colora]i [i `n cazul folosirii s\rurilor de cobalt sau nichel. Aceast\ reac]ie este `ntâlnit\ [i la peptide (`ncepând cu tripeptidele) [i la unii aminoacizi `n solu]ii concentrate (histidina, treonina, serina), precum [i la substan]ele care au `n molecul\ gruparea _ CSNH2. Se mai nume[te "reac]ia biuretului" fiind prezent\ [i la substan]a organic\ numit\ biuret. Reactivi:
1. hidroxid de sodiu, solu]ie apoas\ 10% 2. sulfat de cupru, solu]ie apoas\ 1%; 3. solu]ii proteice pentru analiz\:
− solu]ie de albumin\;
78
− solu]ie diluat\ de albu[ de ou; − solu]ie de cazein\ 1% etc.;
4. uree sub form\ de pulbere. Modul de lucru ~n dou\ eprubete uscate se introduc câte 0,2 g uree. Una dintre ele se `nc\lze[te la flac\ra unui bec de gaz [i se formeaz\ biuretul, cu degajare de amoniac. Se dizolv\ `n ap\ con]inutul ambelor eprubete [i `n fiecare se adaug\ câte 1 ml solu]ie de hidroxid de sodiu [i 5 pic\turi de solu]ie de sulfat de cupru. Se agit\ eprubetele [i se observ\ apari]ia unei colora]ii roz `n eprubeta cu biuret. Solu]ia din eprubeta cu uree se coloreaz\ `n albastru, culoarea sulfatului de cupru. ~n alte dou\ eprubete se vor lua diferite solu]ii proteice de analizat [i se urmeaz\ acelea[i etape. Dup\ agitarea solu]iilor se observ\ apari]ia unei colora]ii violacee `n ambele eprubete. ~n cazul peptidelor, colora]ia este roz-ro[ie. Reac]ia cu ninhidrina Ca [i aminoacizii, proteinele formeaz\ cu ninhidrina, `n solu]ie alcoolic\ sau acetonic\, o colora]ie albastru-violet. Reac]ia xantoproteic\ (reac]ia Mudler) Principiul reac]iei Prin tratarea solu]iilor de proteine cu acid azotic concentrat, se formeaz\ un precipitat galben, care la alcalinizarea solu]iei trece `n portocaliu. Acidul azotic, pe lâng\ ac]iunea de precipitare (denaturare), formeaz\ cu aminoacizii aromatici nitroderiva]i, ce dau culoarea galben\. Reac]ia se efectueaz\ pentru identificarea aminoacizilor aromatici (fenilalanin\, tirozin\) precum [i a celor heterociclici (triptofan) `n hidrolizatele proteice. ~n cazul triptofanului, colora]ia ob]inut\ este mai ro[ie. Reactivi
1. acid azotic, d=1,40; 2. hidroxid de sodiu sau amoniu, solu]ie apoas\ 30-40%.
Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ cu 1-2 ml solu]ie proteic\ se adaug\ 1 ml acid azotic concentrat. Apare un precipitat alb, care la fierbere se solubilizeaz\ par]ial, ap\rând colora]ia galben\. Dup\ r\cire, solu]ia se alcalinizeaz\ [i culoarea vireaz\ `n portocaliu. Reac]ia xantoproteic\ se poate realiza direct pe sec]iuni de material vegetal sau pe produse biologice animale: lân\, piele, pene, ser sangvin etc.
CH2-CH-COOHNH2
OH
+ HONO22
CH2-CH-COOHNH2
OH
NO2O2N
+ H O22
Tirozina Dinitrotirozina
79
Reac]ia Millon Principiul reac]iei Solu]iile proteice `nc\lzite cu reactivul Millon formeaz\ un precipitat ro[u-c\r\miziu. Reac]ia este dat\ de aminoacizii fenolici (tirozina) din proteine, care cu acidul azotos din reactivul Millon formeaz\ nitrozoderivatul colorat. Formarea precipitatului se datoreaz\ compozi]iei reactivului (azotat mercuric, acid acetic, acid azotos), cu ac]iune de precipitare a proteinelor. Reac]ia este dat\ de to]i compu[ii fenolici. Reactivi
1. reactivul Millon - livrat de firma produc\toare, `n sticle brune cu dop rodat,`nchise ermetic. Reactivul se prepar\ uzual dup\ urm\toarea re]et\:
- solu]ia a - solu]ie de sulfat mercuric 5% `n acid sulfuric de concentra]ie 5%. Prepararea solu]iei de acid sulfuric: `ntr-o capsul\ de por]elan se introduc 97,15 ml ap\ distilat\ [i se adaug\ 2,85 ml acid sulfuric concentrat (d=1,84) cu pic\tura, sub agitare continu\;
- solu]ia b - solu]ie apoas\ de azotat de sodiu 1%; Aceste dou\ solu]ii se p\streaz\ separat [i se prepar\ reactivul Millon `n momentul utiliz\rii astfel : peste 2 ml solu]ie a se adaug\ 1-2 pic\turi solu]ie b. Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se trateaz\ 2 ml solu]ie proteic\ (extract proteic vegetal, ser sangvin, albu[ de ou, cazein\ etc.) cu 5 pic\turi reactiv Millon. Apare un precipitat alb, care la `nc\lzire devine ro[u-c\r\miziu, cu structur\ spongioas\. Reac]ia sulfurii de plumb Principiul reac]iei Solu]iile proteice care con]in tioaminoacizi, la fierbere cu hidroxizi alcalini elibereaz\ sulful sub form\ de anion sulfur\. Acesta formeaz\ `n prezen]a cationului plumbos sulfura de plumb, brun-negricioas\. 1. R_SH + 2(Na+ + OH-) = (2Na+ + S2-) + H2O + R_OH 2. (2Na+ + S2-) + (Pb2+ + 2CH3
_COO-) = PbS + 2(Na+ + CH3_COO-)
Reactivi
1. solu]ie de hidroxid de sodiu 20-30% ; 2. solu]ie saturat\ de acetat de plumb ; 3. solu]ie proteic\ de analizat (albu[ de ou, hidrolizate proteice vegetale
bogate `n tioaminoacizi etc). Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se trateaz\ 2-3 ml de solu]ie proteic\ de analizat cu 2 ml solu]ie de hidroxid de sodiu. Se fierbe con]inutul timp de 2 minute, dup\ care se adaug\ 1 ml solu]ie de acetat de plumb. Apare precipitatul negru de sulfur\ de plumb.
80
Reac]ia Adamkiewicz Principiul reac]iei Solu]iile proteinelor care con]in triptofan dau cu acidul glioxilic, `n prezen]a acidului sulfuric concentrat, o colora]ie ro[ie-violet\. Eliberarea triptofanului are loc la hidroliza acid\ a proteinelor (`n prezen]a acidului sulfuric). Reactivi 1. acid glioxilic sau acid acetic glacial; 2. acid sulfuric concentrat, d=1,84; 3. solu]ie proteic\ de analizat : cazein\ 1% sau hidrolizat proteic vegetal. Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc 2 ml solu]ie de analizat, 10-15 pic\turi acid glioxilic, dup\ care se preling pe peretele eprubetei 2 ml acid sulfuric concentrat. La limita de separare a celor dou\ faze se formeaz\ un inel colorat `n ro[u-violet. Acidul glioxilic poate fi `nlocuit cu acidul acetic glacial (dup\ Schultz), caz `n care se folosesc `n reac]ie 3 ml [i este necesar\ o `nc\lzire u[oar\ a amestecului `nainte de ad\ugarea acidului sulfuric. Reac]ia Molisch Principiul reac]iei Glucoproteinele formeaz\ cu α-naftolul, pe seama glucidelor din compozi]ia lor, `n prezen]a acidului sulfuric concentrat, compu[i colora]i `n violet. Acidul sulfuric concentrat deshidrateaz\ aldohexozele la hidroximetil-furfurol, care prin condensare cu α-naftolul, formeaz\ compusul colorat. Reactivi
Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ uscat\ se trateaz\ 4 ml solu]ie de cazein\ cu 3-4 pic\turi solu]ie de α-naftol. Dup\ agitarea solu]iei se preling pe pere]ii eprubetei, `n por]iuni mici, 2 ml acid sulfuric concentrat. La suprafa]a de separare a celor dou\ faze se formeaz\ un inel colorat `n violet.
Reac]ii de precipitare (denaturare) Proteinele sunt precipitate (denaturate) sub ac]iunea unor factori fizici, chimici [i fizico-chimici, modificându-se solubilitatea lor `n ap\ sau `n solven]i specifici. Numeroase reac]ii de precipitare stau la baza unor metode de separare a proteinelor din extracte vegetale sau lichide biologice.
NH
CH2 - CH - COOH
NH2 +C = O
C = OH
H
NH
HOOC-CH-CH2
NH2
N
NH2
H
CH2-CH-COOH
CH2 + CO2 + H O2
Triptofan Acid glioxilic Produs de condensare rosu-violet
2
81
Reac]iile de precipitare pot fi reversibile sau ireversibile. ~n precipitarea reversibil\, denaturarea proteinelor nu este profund\ iar precipitatul format se redizolv\. Precipitarea ireversibil\ modific\ atât structura secundar\ cât [i cea ter]iar\, f\când imposibil\ refacerea structurilor denaturate. Substan]ele care produc precipitare reversibil\ sunt: solven]ii organici (alcool, aceton\, dioxan), s\rurile neutre (NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4). Agen]ii de precipitare ireversibil\ sunt: s\rurile metalelor grele (Pb, Cu, Ag, Cr, Hg etc.), reactivii de precipitare ai alcaloizilor (acidul picric, fericianura de potasiu etc.), acizii minerali tari, concentra]i, acizii organici (sulfosalicilic, wolframic, tricloracetic etc.), c\ldura etc. Precipitarea cu solven]i organici Principiul reac]iei Solven]ii organici miscibili cu apa deshidrateaz\ particulele coloidale care aglutineaz\ [i precipit\. Fiind o precipitare reversibil\, la ad\ugare de ap\ precipitatul se dizolv\. Reactivi
Modul de lucru ~ntr-o eprubet\ se introduc 2 ml de solu]ie proteic\, se adaug\ `n por]iuni mici 1-2 ml alcool [i se agit\ puternic pân\ la apari]ia precipitatului. Se adaug\ 10-15 ml ap\. Se agit\ amestecul [i se observ\ dizolvarea precipitatului. Se execut\ acelea[i opera]ii [i cu acetona. Precipitarea cu s\ruri neutre (salifierea) Principiul reac]iei S\rurile neutre ale unor metale alcaline [i alcalino-p\mântoase precipit\ reversibil proteinele. Acest fapt se datoreaz\ neutraliz\rii sarcinilor electrice ale particulelor coloidale cu sarcinile de semn contrar ale ionilor adsorbi]i pe suprafa]a particulelor, precum [i deshidrat\rii acestora de c\tre ionii s\rii. Reactivi
1. solu]ii saturate de NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4; 2. solu]ie proteic\ de analizat.
Modul de lucru ~n trei eprubete se introduc câte 2 ml solu]ie proteic\ de analizat [i se adaug\ `n fiecare câte 1 ml din reactivul respectiv de precipitare. Apar precipitate care la ad\ugare de ap\ se dizolv\. Precipitarea cu acizi minerali tari Principiul reac]iei Acizii minerali tari precipit\ ireversibil proteinele, iar precipitatele formate nu se dizolv\ la ad\ugare de ap\.
Modul de lucru ~n trei eprubete se introduc câte 2 ml solu]ie proteic\ de analizat. ~n fiecare eprubet\ se adaug\, de-a lungul pere]ilor, câte 1 ml acid mineral concentrat. ~n cazul acizilor clorhidric [i sulfuric, la suprafa]a de separare a celor dou\ faze se formeaz\ un inel alb (precipitat), care prin agitare se dizolv\ (dizolvare `n exces de reactiv). Precipitatul format la ad\ugarea de acid azotic nu se dizolv\ (insolubil `n exces de reactiv). Reac]ia cu acidul azotic (`n diferite concentra]ii) st\ la baza unei metode de dozare a albuminelor din urin\. Precipitarea cu acizi organici Principiul reac]iei Unii acizi organici au ac]iune specific\ asupra proteinelor, fiind folosi]i la precipitarea acestora din diferite lichide biologice. Reactivi
Modul de lucru ~n dou\ eprubete se introduc câte 2 ml solu]ie proteic\ de analizat. ~n prima se adaug\ `n pic\turi solu]ie de acid tricloracetic, sub agitare continu\, pân\ când se observ\ formarea unui precipitat alb, abundent. ~n cea de-a doua eprubet\ se introduce `n acela[i mod, acidul sulfosalicilic [i se observ\ formarea unui precipitat alb, afânat (cu aspect de nor). Precipitarea cu s\ruri ale metalelor grele Principiul reac]iei Unele s\ruri ale metalelor grele precipit\ ireversibil proteinele, modificând profund structura acestora. Reactivi
1. sulfat de cupru, solu]ie 5%; 2. clorur\ mercuric\, solu]ie 0,5-1%; 3. azotat de argint, solu]ie 0,5-1%; 4. acetat de plumb, solu]ie 10%; 5. solu]ie proteic\ de analizat.
Modul de lucru ~n patru eprubete se introduc câte 2 ml de solu]ie de analizat [i se adaug\ apoi solu]iile de s\ruri. Se observ\ formarea precipitatelor. Cele rezultate din reac]iile cu sulfatul de cupru [i acetatul de plumb sunt solubile `n exces de reactiv, iar celelalte dou\ sunt insolubile.
83
Precipitarea cu reactivii de precipitare ai alcaloizilor Principiul reac]iei Substan]ele care produc precipitarea alcaloizilor precipit\ ireversibil [i proteinele. Reac]ia are loc `n mediu acid (`n cel alcalin precipitatele se dizolv\). Reactivi
1. acid picric, solu]ie saturat\; 2. tanin, solu]ie apoas\ saturat\; 3. fericianur\ de potasiu, solu]ie apoas\ 10% 4. reactiv Mayer (complex de iodur\ mercuric\ [i potasiu) : se dizolv\ 1,35 g
clorur\ mercuric\ `n 60 ml ap\ distilat\, la care se adaug\ solu]ia de iodur\ de potasiu (5 g dizolvate `n 10 ml ap\ distilat\). Se completeaz\ cu ap\ distilat\ la 100 ml; 5. reactiv Esbach : se dizolv\ 1 g acid picric, 2 g acid citric `n ap\ distilat\,
cu care se completeaz\ pân\ la volumul de 100 ml; 6. acid acetic, solu]ie apoas\ 1%; 7. acid clorhidric, solu]ie apoas\ 10%; 8. solu]ie proteic\ de analizat.
Modul de lucru ~n cinci eprubete se introduc câte 2 ml solu]ie de analizat, apoi se adaug\ : - `n eprubeta I - 1-2 ml acid acetic [i 1-2 ml solu]ie de tanin. Se formeaz\ un precipitat alb. - `n eprubeta II - se aciduleaz\ solu]ia cu 1-2 ml acid acetic [i se adaug\ 1 ml acid picric. Apare un precipitat galben. - `n eprubeta III - dup\ acidularea cu acid acetic, se adaug\ 1 ml solu]ie de fericianur\ de potasiu. Se formeaz\ un precipitat ro[u-c\r\miziu. - `n eprubeta IV - 2 ml acid clorhidric [i 1 ml reactiv Mayer. Apare un precipitat ro[u-brun. - `n eprubeta V - 1 ml reactiv Esbach. Se formeaz\ un precipitat galben.
11. Determinarea azotului total [i a proteinei brute din plante (metoda Kjeldahl)
Proteina brut\ reprezint\ totalitatea substan]elor organice cu azot, din care fac parte proteinele [i substan]ele azotate neproteice (alcaloizi, pigmen]i cu azot, lipide complexe, amide etc.) Con]inutul `n protein\ brut\ se calculeaz\ dup\ con]inutul `n azot total organic din plant\. Principiul metodei Substan]ele azotate organice, la fierbere cu acid sulfuric, se descompun `n elementele componente : carbon, oxigen, hidrogen, azot, fosfor etc. Carbonul se elimin\ sub form\ de CO2, hidrogenul [i oxigenul sub form\ de H2O, iar azotul formeaz\ amoniacul. Acesta, `n prezen]a acidului sulfuric, se transform\ `n sulfat de amoniu (mineralizarea azotului organic). Sulfatul de amoniu rezultat se descompune ulterior, `ntr-un mediu puternic alcalin, cu formarea amoniacului [i a sulfatului alcalin. Amoniacul este separat prin distilare [i captat `ntr-un volum cunoscut [i `n exces de acid sulfuric de titru determinat. Excesul de acid se titreaz\ la sfâr[itul distil\rii cu o solu]ie de hidroxid de sodiu de titru [i factor cunoscute.
84
Diferen]a dintre cantitatea ini]ial\ de acid sulfuric [i excesul determinat la titrarea cu hidroxid de sodiu reprezint\ cantitatea de acid sulfuric ce a fixat amoniacul sub form\ de sulfat de amoniu. Se calculeaz\ cantitatea echivalent\ de azot care se exprim\ `n procente, raportat\ la masa substan]ei de analizat uscate `n prealabil la 105°C. Se pot folosi mai multe amestecuri de catalizatori pentru etapa de mineralizare : a) mercur metalic - 0,7 g pentru 1g produs (3 pic\turi) + K2SO4 -10 g b) amestec de CuSO4
.5H2O+K2SO4 `n propor]ie de 1:10, aprox. 10-15 g/prob\ c) amestec de CuSO4
. 5H2O+K2SO4+seleniu `n propor]ie de 4:16:1, cca 0,5 g/prob\ d) amestec b) + 10 ml peroxid de hidrogen 30%. ~n afar\ de catalizatorii men]iona]i, literatura de specialitate mai recomand\ [i oxidul de vanadiu, oxidul de mercur, oxidul de cupru etc. Reactivi
. 5H2O + K2SO4, cristale; 3. hidroxid de sodiu, solu]ie 30-40%; 4. acid sulfuric, solu]ie 0,1 n cu factor cunoscut; 5. hidroxid de sodiu, solu]ie 0,1 n cu factor cunoscut; 6. ro[u de metil, solu]ie 0,02% (indicator).
Modul de lucru A. Mineralizarea substan]ei de analizat Materia prim\ este m\run]it\ cât mai fin posibil [i omogenizat\. Cantitatea luat\ `n analiz\ este `n func]ie de con]inutul `n azot (cel mult 10 mg azot/prob\). Se cânt\resc la balan]a analitic\ - 0,1 g pentru semin]e; - 1 g pentru ierburi uscate, fân, paie; - 4-6 g pentru materiale bogate `n ap\ (fructe, tulpini suculente). Substan]a cânt\rit\ se trece `ntr-un balon Kjeldahl de 100 ml, se adaug\ 0,1-0,2 g CuSO4
. 5H2O (catalizator de mineralizare), 2-3 g de K2SO4 (are rolul de a ridica temperatura de fierbere a amestecului).[i 5-6 ml acid sulfuric concentrat. Balonul Kjeldahl se monteaz\ `n pozi]ie `nclinat\ pe un stativ metalic, pe sit\ de azbest, sub ni[\. La gura balonului se a[eaz\ o pâlnie mic\ de sticl\ ce are rolul de a `mpiedica pierderile prin stropire `n timpul fierberii. ~nc\lzirea se face la bec de gaz, la `nceput cu flac\r\ mic\, când con]inutul balonului devine negru [i spumos. Dup\ `ncetarea spum\rii se m\re[te flac\ra [i `ncepe degajarea unor vapori de dioxid de sulf. Se regleaz\ flac\ra astfel `ncât s\ aib\ loc o fierbere lini[tit\ [i uniform\, timp de câteva ore, `n func]ie de natura [i cantitatea materialului supus mineraliz\rii. Sfâr[itul acestei etape este indicat de colorarea `n verde a solu]iei din balon. Se recomand\ s\ se continue `nc\lzirea `nc\ 1-2 ore, pentru mineralizarea complet\ a compu[ilor heterociclici cu azot, care sunt `n general mai rezisten]i la descompunere. B. Distilarea amoniacului [i captarea `n acid sulfuric Distilarea amoniacului din sulfatul de amoniu rezultat la mineralizare se poate efectua `ntr-un aparat Parnas-Wagner (fig. 8 ) care este format din: - balon generator de vapori (1) - vas de siguran]\ (recipient intermediar) (2)
85
- vas de distilare (3) prev\zut cu o pâlnie cu robinet (4). Serve[te la sp\larea aparatului dup\ determinare.
- refrigerent ascendent (5). ~ntre vasul de distilare [i refrigerent se intercaleaz\ un separator de pic\turi (deflegmator).
Generatorul de vapori are o capacitate de 1-2 litri, `n care se introduce ap\ pân\ la 2/3 din volum. Este prev\zut cu dou\ tuburi de sticl\ (a,b). Tubul (a) poate fi prev\zut `n exterior cu o pâlnie cu
robinet prin care se introduce ap\; `n timpul distil\rii, robinetul va `nchide tubul. Prin tubul (b) vaporii de ap\ din generator vor trece `n vasul de distilare. ~nc\lzirea apei din generator se poate face electric sau la flac\ra unui bec de gaz. Tubul refrigerentului se introduce `ntr-un recipient de sticl\ (6) care poate fi un balon Erlenmayer, pahar Berzelius etc., `n care se g\se[te un volum m\surat exact de acid sulfuric 0,1 n de factor cunoscut [i 3-4 pic\turi de indicator ro[u de metil (colora]ia solu]iei trebuie s\ se men]in\ roz tot timpul distil\rii, ceea ce `nseamn\ c\ acidul sulfuric este `n exces). Cap\tul tubului refrigerentului trebuie s\ p\trund\ `n solu]ia de acid sulfuric. Balonul Kjeldahl cu con]inutul mineralizat se r\ce[te, dup\ care prin pâlnia de la gâtul s\u se introduc 5 ml ap\ distilat\. Pâlnia se cl\te[te pe ambele p\r]i cu pu]in\ ap\ distilat\, care se colecteaz\ tot `n balon. Se agit\ solu]ia sau se `ncalze[te u[or pentru solubilizarea reziduului, dup\ care se transvazeaz\ `n vasul de distilare, prin pâlnia cu robinet (4). Balonul Kjeldahl se spal\ de 2-3 ori cu câte 3 ml ap\ distilat\, care se introduce tot `n vasul de distilare. Se adaug\ prin pâlnie 40-50 ml hidroxid de sodiu de concentra]ie 30-40% [i câteva pic\turi de fenolftalein\, pân\ se observ\ culoarea roz-intens = mediu alcalin). ~n absen]a fenolftaleinei, se adaug\ hidroxid de sodiu pân\ se observ\ formarea unui precipitat albastru de hidroxid cupric. Se `nchide tubul (a) al generatorului de vapori. Vaporii de ap\ trec din generator prin tubul (b) `n vasul de distilare [i antreneaz\ amoniacul care se degaj\ [i este captat `n solu]ia de acid sulfuric din recipientul (6). Distilarea dureaz\ 20-30 minute, iar verificarea se face astfel: se scoate tubul refrigerentului din paharul cu acid sulfuric, se cl\te[te cu pu]in\ ap\ distilat\ care se colecteaz\ tot `n pahar, iar urm\toarea pic\tur\ de distilat se las\ s\ cad\ pe o hârtie de turnesol. Dac\ hârtia nu devine albastr\, distilarea este terminat\. O alt\ modalitate de a `ncerca sfâr[itul distil\rii este reac]ia cu reactivul Nessler, specific\ pentru amoniac (trebuie s\ fie negativ\). La sfâr[itul distil\rii se titreaz\ con]inutul recipientului (6) - excesul de acid sulfuric - cu o solu]ie de hidroxid de sodiu 0,1 n pân\ la virarea culorii indicatorului de la roz la galben. Calculul rezultatelor
% Ntotal = G
)1000,014xFVVxF( 11 ××−,
`n care: 0,0014 = cantitatea `n grame de azot care corespunde la 1 ml de acid sulfuric 0,1 n; V = volumul de acid sulfuric 0,1 n luat pentru captarea amoniacului;
86
F = factorul solu]iei de acid sulfuric; V1 = volumul de hidroxid de sodiu care a neutralizat acidul sulfuric r\mas `n exces; F1 = factorul solu]iei de hidroxid de sodiu; G = cantitatea `n grame de substan]\ uscat\ luat\ `n analiz\. Cantitatea de azot total se exprim\ `n grame la 100 grame substan]\ uscat\ (%). Con]inutul `n protein\ brut\ se determin\ astfel;
% Protein\ brut\ = % Ntotal × 6,25
12. Dozarea acidului ascorbic prin titrare cu 2, 6 - diclorfenolindofenol Principiul metodei Acidul ascorbic are proprietatea de a reduce 2, 6 - diclorfenolindofenolul (reactiv Tillmans) `n leucoderivatul corespunz\tor:
O O
OHHO
OH
HO+ N
OH
OClCl
O O
OO
OH
HO+ N
OH
OClCl
H
H
2, 6 - diclorfenolindofenol leucoderivat
Dozarea acidului ascorbic `n plante Reactivi 1. solu]ii de extrac]ie: acid oxalic, solu]ie 2% sau solu]ie de acid metafosforic [i acid acetic preparat\ astfel: `ntr-un balon cotat de 500 ml se introduc 15 g acid metafosforic, 40 ml acid acetic glacial [i 200 ml ap\. Se agit\ pân\ la dizolvare, dup\ care se aduce con]inutul balonului la semn, cu ap\ distilat\. Solu]ia se filtreaz\ prin hârtie de filtru cu porozitate mare, `ntr-o butelie de sticl\ care se `nchide cu dop rodat [i se p\streaz\ la temperatura de 0 - 5o C. Solu]ia poate fi utilizat\ timp de 7 - 10 zile de la preparare; 2. colorant indofenolic (2, 6 - diclorfenolindofenol) solu]ie: `ntr-un balon cotat de 200 ml se introduc 50 mg sare disodic\ de 2, 6 - diclorfenolindofenol [i 150 ml ap\ cald\ (50 - 60o C) `n care s-au dizolvat `n prealabil 42 mg carbonat acid de sodiu (NaHCO3). Se agit\ pentru dizolvare, se completeaz\ con]inutul balonului la semn, cu ap\ distilat\ [i se filtreaz\ cu hârtie de filtru cu porozitate mare. Solu]ia se p\streaz\ `ntr-un flacon de sticl\ brun\, la temperatura de 0 - 5o C, timp de max. 15 zile. Etalonarea solu]iei de colorant indofenolic se face astfel: se iau, cu pipeta, 5 ml din solu]ia etalon de acid ascorbic (concentra]ie 1 mg/ml), se introduc `ntr-un vas Erlenmeyer de 50 ml, se adaug\ 5 ml solu]ie de extrac]ie [i se titreaz\ repede cu solu]ie de colorant indofenolic pân\ la apari]ia colora]iei roz deschis, care persist\ 5 secunde.
87
Se repet\ aceast\ opera]ie [i se `nregistreaz\ volumul solu]iei de colorant utilizat de fiecare dat\, cu o precizie de 0,1 ml. Se calculeaz\ volumul mediu de solu]ie folosit la titrare. Se efectueaz\ o prob\ martor, `nlocuindu-se cei 5 ml solu]ie etalon de acid ascorbic cu 5 ml solu]ie de extrac]ie, procedându-se ca mai sus. Se scade volumul solu]iei de colorant ob]inut la titrarea probei martor din volumul mediu al solu]iei de colorant utilizat la etalonarea colorantului. Concentra]ia solu]iei de colorant indofenolic se exprim\ `n miligrame acid ascorbic la 1 ml solu]ie de 2, 6 - diclorfenolindofenol [i este dat\ de formula C = C1/V, `n care: C1 - cantitatea de acid ascorbic aflat\ `n 5 ml solu]ie etalon, `n miligrame; V - volumul solu]iei de 2, 6 - diclorfenolindofenol folosit la titrare, `n mililitri (din care s-a sc\zut volumul folosit la titrarea probei martor); 3. acid ascorbic, solu]ie etalon: se cânt\resc, cu precizie de 0,1 mg, 50 mg acid ascorbic, p\strat `n prealabil `ntr-un exicator, se transvazeaz\ cantitativ `ntr-un balon cotat de 50 ml [i se aduce la semn con]inutul balonului cu solu]ie de extrac]ie. Solu]ia con]ine 1 mg acid ascorbic `ntr-un mililitru. Solu]ia nu este stabil\ [i se prepar\ `n momentul utiliz\rii; 4. sulfat de cupru, solu]ie 1%; 5. albastru de metilen, solu]ie 0,05%; 6. indigocarmin, solu]ie 0,05%; 7. acid clorhidric, diluat 1 : 3. Modul de lucru Verificarea prezen]ei substan]elor interferente: Dac\ se presupune c\ `n prob\ sunt prezente substan]e interferente ca fier, cupru, reductoni, compu[i cu sulf, se procedeaz\ astfel: se adaug\ dou\ pic\turi de albastru de metilen, solu]ie 0,05% `n 10 ml amestec, con]inând volume egale din solu]ia probei pentru analiz\ [i din solu]ia de extrac]ie [i se agit\ pentru omogenizare. Dispari]ia colora]iei `n 5 - 10 secunde indic\ prezen]a substan]elor interferente. Staniul nu poate fi pus `n eviden]\ `n modul descris mai sus, [i `n acest caz se procedeaz\ astfel: se adaug\ 5 pic\turi de indigocarmin, solu]ie 0,05% la 10 ml solu]ie pentru analiz\, la care s-au ad\ugat 10 ml acid clorhidric diluat 1 : 3 [i se omogenizeaz\. Dispari]ia colora]iei `n 5 - 10 secunde indic\ prezen]a staniului sau a altei substan]e interferente. Extrac]ia ~n cazul produselor solide, semisolide [i cu con]inut solid-lichid, din proba pentru analiz\, preg\tit\ ca mai sus se cânt\resc cu o precizie de 0,1 mg, 10 - 100 g (m0) (`n raport invers cu con]inutul aproximativ de vitamin\ C a produsului respectiv), se introduc `ntr-un mojar, `n care se adaug\ solu]ie de extrac]ie, `n a[a fel `ncât, volumul solu]iei de extrac]ie ad\ugat, `n ml, s\ fie cuprins `ntre 1 : 1 [i 1 : 5 ori masa probei `n grame [i se mojareaz\ cât se poate de repede. Se trece cantitativ `n balon cotat de 100 - 250 ml. ~n cazul produselor lichide preg\tite conform metodei descrise se iau cu pipeta 10 - 100 ml (V), se introduc `ntr-un balon cotat de 100 - 250 ml (V3), `n care `n prealabil s-a introdus o solu]ie de extrac]ie, men]inând raportul de 1 : 1 - 1 : 5. Solu]ia ob]inut\ se filtreaz\, aruncând primii mililitri de filtrat.
88
Titrarea ~ntr-un vas Erlenmeyer de 50 ml se introduc 5 - 10 ml (V4) din extractul acid al probei [i se titreaz\ repede cu solu]ie de colorant indofenolic (V0), agitând continuu, pân\ la apari]ia colora]iei roz, care persist\ minimum 5 secunde. Se efectueaz\ dou\ determin\ri paralele din aceea[i prob\. ~n acela[i mod se face [i proba martor, `n care proba de analizat a fost `nlocuit\ cu acela[i volum de solu]ie de extrac]ie, [i se titreaz\ cu o solu]ie de colorant (V1). ~n cazul `n care proba supus\ analizei con]ine reductoni se procedeaz\ astfel: `ntr-un vas Erlenmeyer de 50 ml se introduce cu pipeta acela[i volum de extract acid al probei (V4), la care se adaug\ 1 ml de solu]ie de sulfat de cupru. Se omogenizeaz\ amestecul [i se `nc\lze[te pe o baie de ap\ adus\ la fierbere, timp de 10 minute. Dup\ r\cire, proba se titreaz\ cu o solu]ie de colorant indofenolic. Calculul rezultatelor Con]inutul de acid ascorbic, exprimat `n miligrame la 100 g produs, se calculeaz\ cu formula:
100mV
CV)VV(0VC.Vit
04
321×
×
××+−= (mg/100g)
`n care: m0 = masa probei luate pentru determinare (grame); C = cantitatea de acid ascorbic corespunz\toare unui ml solu]ie de colorant indofenolic (miligrame); V0 = volumul solu]iei de colorant indofenolic folosit pentru titrarea probei (ml); V1 = volumul solu]iei de colorant indofenolic folosit pentru titrarea probei martor (ml); V2 = volumul solu]iei de colorant indofenolic folosit pentru titrarea reductonilor (ml); V3 = volumul la care a fost adus\ proba luat\ pentru analiz\ (ml); V4 = volumul extractului acid al probei luate pentru analiz\ (ml).
13. Determinarea activit\]ii catalazei prin titrare permanganometric\ Principiul metodei ~n analiz\ se ia o cantitate `n exces de ap\ oxigenat\, exces care se determin\ prin titrare cu permanganat de potasiu. Ecua]ia dup\ care are loc titrarea este urm\torea: Reactivi
1. ap\ oxigenat\, solu]ie 1% proasp\t preparat\ din perhidrol [i ap\; 2. acid sulfuric, solu]ie 10%; 3. permanganat de potasiu, solu]ie 0,1 n; 4. extract vegetal cu catalaz\.
Modul de lucru Se pipeteaz\ `n dou\ pahare Berzelius câte 20 ml extract de catalaz\. Una din probe se fierbe pentru inactivarea enzimei. Dup\ r\cirea acesteia, `n ambele probe se introduc câte 10 ml ap\ distilat\ [i 3 ml ap\ oxigenat\. Se las\ `n repaus la temperatura camerei, timp de 30 minute. Se adaug\ câte 5 ml acid sulfuric 10 % [i se titreaz\ cu solu]ia 0,1 n de permanganat de potasiu pân\ la virajul colora]iei
`n roz pal. Se noteaz\ volumele de permanganat de potasiu utilizate la titrarea celor dou\ probe: martor [i cu catalaz\. Calculul rezultatelor Activitatea catalazei se exprim\ `n mg ap\ oxigent\ descompus\ `n 30 minute. V = ml permanganat de potasiu 0,1 n titrat la proba martor; V1 = ml permanganat de potasiu 0,1 n titrat la proba cu catalaz\; f = factorul solu]iei de permanganat de potasiu. 1 ml KMnO4 0,1 n, este echivalent cu 1 ml solu]ie H2O2 0,1 n. 1 ml solu]ie H2O2 con]ine 1,7 mg H2O2. Activitatea catalazei = (V - V1) × f × 1,7 = mg H2O2 descompus\ `n timp de 30 minute.
90
BIBLIOGRAFIE 1. Artenie, V. – 1991, Biochimie, Ed. Universit\]ii Al. I. Cuza, Ia[i 2. Bodea, C., F\rc\[anu, V., Nicoar\, Elena, Slusanschi, H. – 1964-1968, Tratat
de biochimie vegetal\, Editura Academiei R.S.R., Bucure[ti, vol. I – V
3. Dumitru, I.F. – 1980, Biochimie, Ed. Didactic\ [I Pedagogic\, Bucure[ti 4. Ivas, Elena – 1993, Biochimie animal\, centrul de multiplicare UAMV, Ia[I 5. Lehninger, A.L. – 1987, Biochimie, vol. I, Ed. Tehnic\, Bucure[ti 6. Neam]u, G. – 1993, Biochimie vegetal\, Ed. Didactic\ [I Pedagogic\, R.A.,
Bucure[ti 7. Neam]u, G. – 1997, Biochimie alimentar\, Ed. Ceres, Bucure[ti 8. Popescu, O. – 1992, Biochimie, centrul de multiplicare UAMV, Ia[I 9. Savu, Maria – 1994, Biochimie vegetal\, curs – uz intern, UAMV, Ia[i 10. Savu, Maria, Afusoae,Iulia, Nechita,Antoanela, Trofin, Alina, Marcu, I. –
