HEMATOLOGIE, ONCOLOGIE ASPECTE CLINICE ŞI DE TRATAMENT ALE LIMFOAMELOR NEHODGKINIENE PRIMITIVE DE GRAD ÎNALT DE MALIGNITATE ALE TRACTULUI GASTROINTESTINAL ÎN STADIILE GENERALIZATE Larisa Musteaţă, Ion Corcimaru, Maria Robu, Elena Oleinicova, Vasile Musteaţă, Sanda Buruiană (Şef – prof. univ. Ion Corcimaru) Catedra Hematologie şi Oncologie USMF “N.Testemiţanu” Summary Clinical and Treatment Aspects of Primary High-grade Non-Hodgkin’s Lymphomas of the Gastrointestinal Tract in Generalized Stages The results of clinico-morphological study and application of different treatment approaches in 61 patients with primary high-grade gastric and intestinal non-Hodgkin’s lymphomas in generalized stages. To improve the treatment must be included program a palliative surgical intervention and a combined chemotherapy are presented. Rezumat Sunt prezentate rezultatele cercetărilor clinico- morfologice şi a diferitor metode de tratament ale limfoamelor nehodgkiniene primitive de grad înalt de malignitate gastrice şi intestinale în stadiile generalizate la 61 pacienţi. Pentru optimizarea eficacităţii nemijlocite şi la distanţă programul de tratament trebuie să includă intervenţia chirurgicală paliativă în combinaţie cu chimioterapie intensivă. Actualitatea Comunicările privitor la tactica de tratament al limfoamelor nehodgkiniene (LNH) primitive de grad înalt de malignitate ale tractului gastrointestinal în stadiile generalizate rămân contradictorii (1,2,5,7,8). Metoda de elecţie în tratamentul acestor tumori se consideră polichimioterapia (PChT), rezultatele căreia sunt nesatisfăcătoare (1,6,9,10,11). Se ştie, că focarul tumoral primar în tubul digestiv este mai puţin sensibil la tratamentul medicamentos, decât metastazele regionale şi la distanţă ale acestor LNH (8-10). Din cele expuse rezultă, că studierea posibilităţilor de tratament combinat chirurgical-chimioterapeutic al LNH primitive gastrice şi 331
Transcript
HEMATOLOGIE, ONCOLOGIE
ASPECTE CLINICE ŞI DE TRATAMENT ALE LIMFOAMELOR NEHODGKINIENE PRIMITIVE DE GRAD ÎNALT DE MALIGNITATE ALE TRACTULUI
GASTROINTESTINAL ÎN STADIILE GENERALIZATELarisa Musteaţă, Ion Corcimaru, Maria Robu, Elena Oleinicova,
Vasile Musteaţă, Sanda Buruiană(Şef – prof. univ. Ion Corcimaru)
Catedra Hematologie şi Oncologie USMF “N.Testemiţanu”
SummaryClinical and Treatment Aspects of Primary High-grade Non-Hodgkin’s
Lymphomas of the Gastrointestinal Tract in Generalized StagesThe results of clinico-morphological study and application of different treatment
approaches in 61 patients with primary high-grade gastric and intestinal non-Hodgkin’s lymphomas in generalized stages. To improve the treatment must be included program a palliative surgical intervention and a combined chemotherapy are presented.
Rezumat Sunt prezentate rezultatele cercetărilor clinico-morfologice şi a diferitor metode de
tratament ale limfoamelor nehodgkiniene primitive de grad înalt de malignitate gastrice şi intestinale în stadiile generalizate la 61 pacienţi. Pentru optimizarea eficacităţii nemijlocite şi la distanţă programul de tratament trebuie să includă intervenţia chirurgicală paliativă în combinaţie cu chimioterapie intensivă.
Actualitatea Comunicările privitor la tactica de tratament al limfoamelor nehodgkiniene (LNH)
primitive de grad înalt de malignitate ale tractului gastrointestinal în stadiile generalizate rămân contradictorii (1,2,5,7,8). Metoda de elecţie în tratamentul acestor tumori se consideră polichimioterapia (PChT), rezultatele căreia sunt nesatisfăcătoare (1,6,9,10,11). Se ştie, că focarul tumoral primar în tubul digestiv este mai puţin sensibil la tratamentul medicamentos, decât metastazele regionale şi la distanţă ale acestor LNH (8-10). Din cele expuse rezultă, că studierea posibilităţilor de tratament combinat chirurgical-chimioterapeutic al LNH primitive gastrice şi intestinale de grad înalt de malignitate în stadiile generalizate este actuală şi argumentată.
Material şi metode de investigaţiiParticularităţile evoluţiei clinice, rezultatele tratamentului combinat chirurgical-
chimioterapeutic şi ale chimioterapiei izolate au fost studiate pe un lot de 61 pacienţi (bărbaţi – 29, femei – 32) în stadiile generalizate ale LNH primitive de grad înalt de malignitate ale tractului gastrointestinal. Vârsta bolnavilor a variat de la 17 până la 70 de ani (media de vârstă – 42,5 ani). Pacienţii s-au aflat sub supravegherea IMSP Institutului Oncologic din Moldova în perioada anilor 1980-2005.
Diagnosticul de LNH de grad înalt de malignitate a fost confirmat prin examenul histologic cu identificarea variantei morfologice conform Clasificării Histologice şi Citologice Internaţionale a Tumorilor Ţesutului Hematopoietic şi Limfatic elaborată de O.M.S (1976). La 52 (85,2%) bolnavi a fost diagnosticată varianta limfoblastică, la 9 (94,8%) - varianta imunoblastică.
331
Gradul extinderii procesului neoplazic a fost precizat, utilizând complexul investigaţiilor obligatorii şi facultative în conformitate cu recomandările Comitetului Internaţional pentru stadializarea limfoamelor maligne (Ann-Arbor, 1971). Afectarea diferitor segmente ale tractului gastrointestinal a fost determinată în baza datelor examenului clinicoradiologic şi endoscopic. La 54 pacienţi informaţia despre extinderea LNH mai jos de diafragm a fost completată cu datele obţinute prin laparotomie. În 8 (13,1%) cazuri a fost stabilit stadiul III E şi în 53 (86,9%) - stadiul IV. Simptome de intoxicare generală s-au constatat la 32 (52,5%) pacienţi.
Afectarea primară a stomacului s-a depistat la 31 (50,8%) bolnavi, a intestinului subţire – la 12 (19,7%), a colonului – la 5 (8,2%). Implicarea concomitentă a câtorva segmente ale tractului gastrointestinal s-a observat în 12 (19,7%) cazuri, din ei interesarea stomacului şi a intestinului subţire, a stomacului şi a colonului fiind de o frecvenţă egală (respectiv câte 6 cazuri), interesarea intestinului subţire şi colonului s-a depistat într-un caz (1,6%). Afectarea extinsă a intestinului subţire a fost determinată la 9 din 12, a colonului – la 4 din 5 cazuri.
Până la tratamentul medicamentos la 34 pacienţi au fost efectuate operaţii paliative (tabelul 1) fără înlăturarea ganglionilor limfatici mezenteriali şi retroperitoneali din cauza afectării lor extinsî sau prezenţei metastazelor viscerale la distanţă (tabelul 2).
Tabelul 1Tipul intervenţiei chirurgicale paliative în stadiile generalizate ale limfoamelor nehodgkiniene primitive ale tractului gastrointestinal
În 27 cazuri s-a efectuat numai laparotomie diagnostică cu biopsia neoplaziei. Cazuri de deces postoperator nu s-au constatat. Chimioterapia a fost începută peste 2-3 săptămâni după intervenţia chirurgicală.
Programul tratamentului medicamentos a bolnavilor de LNH primitive ale tractului gastrointestinal a inclus 6 serii de PChT după schema COP (ciclofosfamidă, oncovin,
332
prednisolon) în ritmul intensiv de 5 zile, CHOP (ciclofosfamidă, adriablastină, oncovin, prednisolon) după modalitatea unanim recunoscută şi în doze standarde cu intervale între ele de 2-3 săptămâni. După obţinerea remisiunii complete au urmat cicluri de reinducere conform COP sau CHOP fiecare 3 luni pe parcurs de 3-5 ani.
Rezultate şi discuţiiRezultatele studiului au fost estimate utilizând Criteriile Standardizate Internaţionale de
apreciere a eficacităţii tratamentului pacienţilor oncologici, propuse de O.M.S. (6) şi Criteriile de evaluare ale EORTC (3). Pentru aprecierea rezultatelor la distanţă a fost folosită metoda life-table de formare a curbelor de supravieţuire propusă de Kaplan E şi Meier P. (4)
Semne clinice specifice ale LNH primitive de grad înalt de malignitate deosebite de cele ale altor tumori gastrointestinale nu s-au stabilit. La localizarea neoplaziei în stomac, de regulă, se depistau forme tuberoase – şi platinfiltrative de creştere cu un component ulceros pronunţat. A predominat implicarea corpului şi antrului, ce n-a distins LNH primitive ale stomacului de celelalte tumori gastrice.
LNH primitive ale intestinului subţire s-au răspândit preponderent în peretele intestinal, interesând ganglionii limfatici regionali şi altor grupe. În această localizare primară adesea se observă tabloul clinic al enteritei tranzitorie cu abdomenalgii. Ocluzia intestinală acută a complicat evoluţia LNH primitive ale intestinului subţire în 6 cazuri, perforaţia în regiunea defectului ulceros specific al mucoasei intestinale – într-un caz. Sindromul de malabsorbţie a fost depistat numai la 3 pacienţi.
La afectarea colonului tumora în mai mult de jumătate de cazuri a fost localizată în colonul ascendent şi transvers. În 5 cazuri s-a constatat ocluzia intestinală cronică.
La 10 (16,4%) bolnavi implicarea tubului digestiv în procesul tumoral a parcurs asimptomatic, fiind diagnosticată numai la examenul tuturor compartimentelor tubului digestiv.
Eficacitatea totală a tratamentului combinat chirurgical-chimioterapeutic al pacienţilor cu LNH primitive ale tractului gastrointestinal în stadiile generalizate (tabelul 3) a constituit 94,1% (remisiunile au fost obţinute la 32 pacienţi). Regresul complet al tumorii a fost atins la 21 (61,8%) cazuri. În grupul de pacienţi supuşi chimioterapiei izolate, remisiunile au fost obţinute numai la 17 (62,9%), din ei complete – la 8 (29,6%; p < 0,05).
Tabelul 3Rezultatele nemijlocite ale tratamentului în stadiile generalizate
ale limfoamelor nehodgkiniene în funcţie de metoda curativă aplicată
Metoda de tratament
Numărul de pacienţi
Remisiuni, abs. (%) Fără efect, abs. (%)
În total Complete Parţiale
Intervenţie chirurgicală şi chimioterapie
34 32 (94,1) 21 (61,8) 11 (32,3) 2 (5,9)
Chimioterapie izolată
27 17 (62,9) 8 (29,6) 11 (33,3) 10 (37,1)
Efectuarea operaţiilor paliative la bolnavii cu stadiile generalizate ale LNH ca etapă de tratament combinat a ameliorat atât rezultatele nemijlocite cât şi la distanţă. Pe fond de tratament combinat remisiunile complete peste 3 ani s-au menţinut la 86,9% de pacienţi, peste 5 ani – la 75,4% (tabelul 4). Toţi pacienţii la momentul actual sunt sub supraveghere.
În grupul bolnavilor trataţi prin chimioterapie izolată supravieţuirea fără recidivă peste 3 ani s-a cifrat la 33,9%, peste 5 ani – la 22,6% (p < 0,05). În aceşti termeni au supravieţuit respectiv 51,3% şi 36,9% de bolnavi cu regresul complet al tumorii (p < 0,05).
333
Tabelul 4Supravieţuirea fără recidive, supravieţuirea pacienţilor cu regresia completă a tumorii şi
supravieţuirea generală peste 5 ani a pacienţilor cu limfoame nehodgkiniene ale tractului digestiv în stadiile generalizate în funcţie de metoda curativă aplicată
Metoda de tratament
Numărul de pacienţi
Supravieţuirea fără recidive (%)
Supravieţuirea pacienţilor cu
regresia completă (%)
Supravieţuirea generală (%)
Intervenţia chirurgicală şi chimioterapie
34 75,4 100 65,2
Chimioterapie izolată
27 22,6 36,9 13,4
Supravieţuirea generală a pacienţilor cu LNH primitive de grad înalt de malignitate ale tractului gastrointestinal, supuşi operaţiilor paliative şi chimioterapiei, peste 3 şi 5 ani a constituit corespunzător 65,2%. Indicele respectiv la bolnavii trataţi prin chimioterapie izolată peste 3 ani a constituit 19,2%, peste 5 ani – numai 13,4%.
Concluzii 1. În LNH primitive de grad înalt de malignitate ale tractului gastrointestinal focarul
tumoral primar se dezvoltă preponderent în stomac, după care urmează intestinul subţire şi colonul.
2. Optimizarea rezultatelor nemijlocite şi la distanţă ale tratamentului LNH primitive de grad înalt de malignitate ale tractului gastrointestinal în stadiile generalizate indică necesitatea aplicării intervenţiei chirurgicale paliative în combinaţie cu chimioterapie.
Bibliografie 1. Aviles A., Nambo J., Neri N. et al. The Role of Surgery in Primary Gastric
Lymphoma // Ann. Surg., 2004; 240: 44-50.2. Chadran R., Raj E., Chaturvedi H. Primary gastrointestinal lymphoma: 30 year
experience at the Cancer Institute // J. Surg. Oncol., 1995; 60(1): 41-49.3. European Organization for Research and Treatment of Cancer // A Practical Guide to
EORTC Studies, Brussels, 1994: 110-112.4. Kaplan E., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observation // J. Am.
Statist. Ass., 1958, 457-481.5. Kodera Y., Yamamura Y., Nakamura S. et al. The role of radical gastrectomy with
systematic lymphadenectomy for the diagnosis and treatment of primary gastric lymphoma // Ann. Surg., 1998, 227: 45-50.
6. Kouroukis C., Browman G., Rosmin Esmail, Meyer R. Chemotherapy for Older Patients with Newly Diagnosed, Advanced – Stage, Aggressive – Histology Non-Hodgkin Lymphoma: A Sistematic Review // Ann. Intern. Med., 2002; 136: 144-152.
7. Ranaldi R., Goteri R., Baccarini M. et al. A clinicopathology study of 152 surgically treated primary analysis of 109 high grade tumours // J. Clin. Pathol., 2002, 55: 346-351.
8. Radman I., Kavasevic – Metelko J., Igor Aurer et al. Surgical Resection in the Treatment of Primary Gastrointestinal Non-Hodgkin’s Lymphoma: Retrospective study // Croatian Medical Journal, 2002, 43(5): 555-560.
9. Sano T. Treatment of primary gastric lymphoma: experience in the National Cancer Center Hospital, Tokyo In: Gastrointestinal lymphomas. Future perspectives // Berlin, Heidelberg: Springer, 2000, 104-107.
334
10. Speranza V., Lomanto D., Meli E. et al. Primary gastric lymphoma: a 15-year review // Hepatogastroenterology, 1995, 42: 371-376.
11. Vasilescu C. Limfomul gastric primitiv // Editura MED MUN, Bucureşti; 2002, 200 p.12. WHO: Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment // Geneva, 1979, 45 p.
ASPECTE CLINICE ALE LIMFOAMELOR NON-HODGKIN INDOLENTESanda Buruiană, Ion Corcimaru, Maria Robu, Larisa Musteaţă, Valentina Gladâş, Maria Chiu, Maria Popescu, Victor Munteanu
(şef – prof. univ. Ion Corcimaru)Catedra Hematologie şi Oncologie USMF “N.Testemiţanu”
SummaryClinical features of indolent non-Hodgkin’s lymphomas
The clinical features of indolent non-Hodgkin’s lymphomas (NHL) have been studied in 167 patients aged 20 to 80. It has been noticed that the indolent non-Hodgkin’s lymphomas rarely develop in young people, and the frequency increases with age, reaching the top in patients over 60. The onset of indolent NHL predominated in spleen (35.9%), peripheral lymph nodes (31.1%), Waldeyer’s lymphoid ring (19.2%). Most rarely the indolent NHL primarily developed in the gastrointestinal tract (9.0%), abdominal lymph nodes (3.6%), mediastinal lymph nodes (1.2%). The bone marrow was involved most often during the disease dissemination (84.0%). The overall 5-year survival in patients with indolent non-Hodgkin’s lymphomas was 55.3%.
Rezumat Au fost studiate manifestările clinice la 167 pacienţi cu limfoame non-Hodgkin (NHL)
indolente în vârsta de la 20 până la 80 de ani. S-a observat că LNH indolente rar se dezvoltă la persoanele tinere. Frecvenţa lor creşte odată cu vârsta, atingând maximum la pacienţi în vârsta de peste 60 de ani. Debutul LNH indolente a avut loc mai frecvent în splină (35,9%), ganglionii limfatici periferici (31,1%), inelul limfatic Waldeyer (19,2%). Rar s-a dezvoltat LNH indolente primar în tractul gastrointestinal (9,0%), ganglionii limfatici abdominali (3,6%) şi mediastinali (1,2%). La etapa de generalizare a LNH frecvent a fost afectată măduva oaselor (84,0%). Supravieţuirea pacienţilor cu LNH indolente peste 5 ani a fost egală cu 55,3%.
Actualitatea Limfoamele non-Hodgkin prezintă un grup de tumori care se deosebesc după proprietăţile
biologice, imunologice, structura morfologică, manifestările clinice, răspunsul la tratament şi prognostic.
LNH indolente se caracterizează printr-o progresare lentă, supravieţuire de durată mai mare cu o activitate de proliferare a celulelor mai joasă şi cu o sensibilitate moderată la chimioterapie. Tratamentul lor prezintă o problemă complicată şi rezultatele tratamentului nu se pot considera satisfăcătoare. Metodele standarde de tratament foarte rar pot obţine remisiune completă şi metoda de vindecare pentru majoritatea formelor nu sunt (5,6,7,8)
Rămân slab elaborate criteriile de determinare a volumului optimal şi durata tratamentului în focare caz concret.
În prez6ent direcţiile principale în căutarea factorilor care pot contribui la elaborarea tacticii de tratament a LNH sunt îndreptate spre cercetările moleculare, biologice, imunologice ale LNH (1,2,3,4). Însă un factor important în individualizarea programelor de tratament poate fi şi aspectul clinic (localizarea focarului tumoral primar, zonele de metastazare) ale LNH indolente. De aceea studierea LNH în acest aspect este actuală.
335
Scopul Studierea manifestărilor clinice ale LNH indolente, frecvenţei afectării primare a diferitor
grupuri de ganglioni limfatici, organe, ţesuturi şi zonelor de metastazare în funcţie de vârstă.
Material şi metodeCaracteristica clinică a fost studiată la 167 pacienţi cu LNH indolente în vârsta de la 20
până la 80 de ani.Diagnosticul în toate cazurile a fost confirmat morfologic. Gradul de răspândire în organism a procesului tumoral a fost determinat conform
Clasificării Clinice Internaţionale, adoptată în Ann-Arbor (SUA) în anul 1971. Pentru stadializarea procesului tumoral, evidenţierea zonelor de metastazare la etapa iniţială şi de generalizare a LNH s-au folosit examenul clinic, radiologic, ultrasonor, puncţia măduvei oaselor, trepanobiopsia cu cercetarea histologică a măduvei oaselor, cercetarea edoscopică şi radiologică a tractului gastrointestinal, fibroepifaringoscopia.
Pentru aprecierea supravieţuirii pacienţilor a fost folosită metoda life-table de formare a curbelor de supravieţuire propusă de Kaplan-Meier.
Rezultate şi discuţiiLa distribuirea pacienţilor cu LNH indolente în funcţir de vârstă s-a observat o frecvenţă
mai înaltă a LNH indolente la bolnavii în vârsta de peste 60 de ani (48,5%). La persoanele în vârsta de 40-59 de ani LNH indolente au fost diagnosticate în 37,7% cazuri, iar în vârsta de 20-39 de ani numai la 13,8% pacienţi (tabelul 1).
Tabelul 1Distribuirea bolnavilor de LNH indolente în funcţie de vârstă
Vârsta, ani Bolnavii de LNH indolenteabs. %
20 – 39 23 13,840 – 59 63 37,7
> 60 81 48,5În total 167 100
Aşadar LNH indolente rar se dezvoltă la persoanele tinere şi frecvenţa lor creşte odată cu vârsta, atingând maximum la pacienţii în vârsta de peste 60 de ani.
Studierea frecvenţei afectării primare a LNH indolente a diferitor grupuri de ganglioni limfatici, organe şi ţesuturi ne-a arătat că debutul LNH a avut loc mai frecvent în splină (35,9%), ganglionii limfatici periferici (31,1%), inelului limfatic Waldeyer (19,2%). Rar LNH s-au dezvoltat primar în tractul gastrointestinal (9,0%), ganglionii limfatici abdominali (3,6%) şi mediastinali (1,2%) (tabelul 2).
Tabelul 2Distribuirea bolnavilor de LNH indolente
în funcţie de localizarea focarului primar tumoral şi vârstă
Afectarea primară a ganglionilor limfatici periferici a avut loc mai frecvent la pacienţii în vârsta de peste 60 de ani (55,8%) spre deosebire de persoanele în vârsta de 40-59 de ani (32,7% şi 20-39 de ani (11,5%).
Independent de vârstă la majoritatea bolnavilor de LNH procesul tumoral s-a dezvoltat primar în ganglionii limfatici cervicali (69,2%). Debutul LNH în ganglionii limfatici inghinali şi axilari a avut loc cu mult mai rar (17,3% şi 13,5% respectiv).
LNH indolente cu afectarea primară a ganglionilor limfatici abdominali au fost diagnosticate numai la persoanele în vârsta de peste 40 de ani şi LNH mediastinale la pacienţii în vârsta de peste 60 de ani.
LNH indolente ale inelului limfatic Waldeyer s-au dezvoltat aproximativ cu aceeaşi frecvenţă la bolnavii în vârsta de 40-59 de ani şi peste 60 de ani (46,8% şi 40,6% corespunzător) şi mai rar la persoanele în vârsta de 20-39 de ani (12,5%). La pacienţii în vârsta de peste 40 de ani a predominat afectarea primară a amigdalelor palatina (82,1%), însă la persoanele tinere (20-39 de ani) amigdalelor palatina au fost afectate primar cu aceeaşi frecvenţă ca şi amigdala nazofaringiană (50,0% şi 50,0% respectiv).
LNH indolente lienale au fost diagnosticate preponderent la persoanele în vârsta de 40-59 de ani (40,0%), de peste 60 de ani (50,0%) şi numai în 10% cazuri la pacienţii în vârsta de 20-39 de ani.
LNH indolente cu afectarea primară a tractului gastrointestinal, spre deosebire de celelalte localizări primare au predominat la bolnavii în vârsta de 20-39 de ani (46,8%). La pacienţii în vârsta de 40-59 de ani şi de peste 60 de ani LNH digestive au avut loc cu aceeaşi frecvenţă (26,6% şi 26,6% (respectiv). Independent de vârstă în majoritatea cazurilor primar a fost afectat stomacul (86,6%).
Prin urmare LNH indolente s-au dezvoltat preponderent la persoanele în vârsta de peste 40 de ani cu excepţia LNH gastrointestinale, care au predominat la persoanele tinere (20-39 de ani).
Majoritatea pacienţilor cu LNH indolente au fost diagnosticaţi în stadiile generalizate, preponderent în stadiul IV (70,8%) şi numai în 20,9% cazuri în stadiile locale (tabelul 3).
Stadiile locale au fost constatate mai frecvent la pacienţii în vârsta de 20-39 de ani pe contul LNH cu afectarea primară a tractului gastrointestinal, care au predominat la această vârstă şi au fost identificate în stadiile locale (tabelul 4).
Este necesar de menţionat că LNH indolente lienale în 95,0% cazuri au fost diagnosticate în stadiul IV.
Semnele de intoxicare generală s-au observat la 50 (29,9%) pacienţi, care mai frecvent s-au înregistrat în cazurile de afectare primară a ganglionilor limfatici mediastinali (100%), abdominali (50%), tractului gastrointestinal (38%), inelului limfatic Waldeyer (31,2%). Semnele de intoxicare generală rar au avut loc în LNH indolente cu debutul în ganglionii limfatici periferici (11,5%).
337
Tabelul 4Distribuirea bolnavilor de LNH indolente
în funcţie de stadiul clinic şi localizarea focarului primar tumoral
În total 167 14 (8,3) 21 (12,6) 14 (8,3) 118 (70,8)
Independent de localizarea primară a LNH, vârstă la etapele iniţiale procesul tumoral în majoritatea cazurilor s-a răspândit în ganglionilor limfatici regionali (78,3%).
Focare extranodale la pacienţii la care procesul tumoral s-a dezvoltat până la stadiul IV şi au apărut preponderent în măduvă (84,0%).
Studierea afectării măduvei oaselor în funcţie de localizarea primară a LNH ne-a arătat că foarte frecvent măduva oaselor a fost interesată în LNH cu afectarea primară a splinei (96,5%), inelului limfatic Waldeyer (91,3%), ganglionilor limfatici abdominali (80%) şi periferici (71,4%).
Este necesar de accentuat că în LNH lienale destul de frecvent (34,5% cazuri) au avut loc metastaze în măduva oaselor direct din splină fără afectarea ganglionilor limfatici regionali sau/şi la distanţă.
În LNH gastrointestinale metastaze în măduva oaselor nu s-au înregistrat nici într-un caz.Supravieţuirea generală a pacienţilor cu LNH indolente peste 5 ani a fost egală cu 55,3%.
Supravieţuirea în aceşti termeni a fost mai înaltă la bolnavii de LNH cu afectarea primară a tractului gastrointestinal (87,4%) spre deosebire de pacienţii cu debutul LNH în inelului limfatic Waldeyer (66,1%), ganglionii limfatici periferici (55,5%), splinei (45,1%).
Aspectele clinice evidenţiate ne pot servi ca bază pentru elaborarea programelor diferenţiate de tratament.
Concluzii 3. LNH indolente rar s-au dezvoltat la persoanele tinere, frecvenţa lor a crescut odată ci
vârsta, atingând maximum la vârsta de peste 60 de ani. 4. Cele mai frecvente localizări primare ale LNH indolente au fost înregistrate în splină,
ganglionii limfatici periferici, inelul limfatic faringian.5. Afectarea primară a tractului gastrointestinal în LNH indolente a avut loc rar şi a
predominat la persoanele tinere (20-39 de ani).6. La etapa de generalizare a LNH indolente frecvent a fost afectată măduva oaselor
(84,0%).7. Supravieţuirea generală a pacienţilor cu LNH indolente peste 5 ani a constituit 55,3%.
Bibliografie 1.Alvaro T., Lejeune M., Solvado M.T. et al. Immunohistochemical patterns of reactive
microenvironment are associated with clinicobiologic behavior in follicular lymphoma patients. // J. Clin. Oncol. 2006 24 (34), 5350-5357.
338
2.Dave S.S., Weight G., Tan B. et al. Prediction of survival in follicular lymphoma bazed on molecular features of tumor – infiltrating immune cells. // N Engl J. Med. 2004, 35 (21), 2159-2169.
3.Farinha P., Masoudi H., Skinnider B.F. et al. Analysis of multiple biomarkers shows that lymphoma – associated macrophage (LAM) content is an independent predictor of survival in follicular lymphoma (Fl) Blood 2005, 106 (6), 2169-2174.
4. John P. Leonard, MD, Stephanie A. Gregory, MD, David G. Maloney, MD et al. Optimizing the Treatment of Patients with Rituximab – pretreated Recurrent Indolent Non-Hodgkin Lymphoma // Clinical Advances in Hematology si Oncology, 2008, 6, 437-445.
5.Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М. Место и роль флударабина в терапии больных неходжкинскими лимфомами // Русский Медицинкий журнал, 2002, 10, 24, 1-14.
6.Гершанович М.Л. Основные принципы лечения неходжкинских лимфом // Практическая Онкология, 2004, 5, 3, 185-193.
INFLUENŢA SARCINII ŞI NAŞTERII ÎN PERIOADA INDUCEREI REMISIUNII ŞI ÎN TIMPUL POSTERAPEUTIC PRECOCE ASUPRA PROGNOSTICULUI
LIMFOMULUI HODGKIN Elena Oleinicova, Ion Corcimaru, Tudor Gâţu, Natalia Sporâş,
Stela Pânzari, Galina Durbailova, Irina Mocanu(şef – profesor universitar Ion Corcimaru)
Catedra Hematologie şi Oncologie a U.S.M.F. “N.Testemiţanu”
SummaryInfluence of pregnancy and delivery during remission induction and in early
post therapeutic period in Hodgkin’s disease prognosisPregnancy and delivery influence in Hodgkin’s disease prognosis in 70 women during
remission induction phase and in early post therapeutic period had hcen studied. There were 18 cases of deliveries. All patients had Hodgkin’s disease progression. In 40 (57.1%) patients, there was a complete remission, in 21 (30%) – partial remission, in 9 (12.9%) clinical effect was not confirmed after specific adequate treatment. Life duration of them did not exceed 3 years. In 40.5% with partial remission survival period was 5 – years, in 7.2% - 10 – years survival. All of 40 patients with complete remission lived more than 15 years.
Thus, the pregnancy and delivery in active period of Hodgkin’s disease provokes progression of tumour process.
Key words: Hodgkin’s disease, pregnancy and delivery.
RezumatA fost studiată influenţa sarcinii şi naşterii asupra prognosticului limfomului Hodgkin la
70 femei în perioada inducerii remisiunei şi în timpul posterapeutic precoce. Optsprezece sarcini s-au finisat cu naşteri. La toate pacientele s-a dezvoltat progresarea procesului de bază. In urma tratamentului specific la 40 (57,1%) paciente a fost obţinută remisiune completă, la 21 (30%) – remisiune parţială, la 9 (12,9%) – efectul clinic a lipsit. Durata vieţii lor nu a depăşit 3 ani. Supravieţuirea de 5 ani a pacientelor cu remisiune parţială a constituit 40,5%, 10 ani – 7,2%. Cele 40 paciente cu remisiune completă au trăit mai mult de 15 ani fără recidive. Patologie în sarcină nici într-un caz nu s-a observat.
339
Prin urmare, sarcina şi naşterea în perioada activă a limfomului Hodgkin provoacă progresarea procesului tumoral.
Actualitatea Limfomul Hodgkin afectează femei preponderent în vârsta reproductivă. Problema
influenţei sarcinii şi naşteri asupra evoluţiei limfomului Hodgkin are o însemnătate deosebită. Sunt publicaţii, în care se menţionează că, graviditatea în perioada activă a maladiei
agravează evoluţia bolii [2, 3]. Alţi autori [3, 4] denotă, că sarcina la pacientele cu limfomul Hodgkin nu întotdeauna este urmată de acutizarea procesului tumoral.
Foarte mare importanţă are studierea evoluţiei şi prognosticului limfomului Hodgkin, când graviditatea are loc în perioada activă a bolii, în inducerea remisiunii sau în timpul postterapeutic precoce.
Scopul principal şi sarcinile cercetăriiScopul de bază al acestei lucrări constă în studierea influenţei sarcinii şi naşterii asupra
prognosticului limfomului Hodgkin în perioada inducerii remisiunii şi în timpul postterapeutic precoce şi decurgerea sarcinii pe fonul acestei maladii.
În realizarea acestui scop au fost trasate următoarele sarcini: 1. Studierea influenţei sarcinii asupra evoluţiei limfomului Hodgkin în perioada activă a
bolii.2. De a determina evoluţia gravidităţii la pacientele cu limfomul Hodgkin în perioada
inducerii remisiunii şi termenul postterapeutic precoce. 3. De cercetat recidivele procesului tumoral după graviditate şi naştere în termen diferit
după sarcină şi naştere în perioada activă a bolii. 4. De estimat posibilitatea obţinerii remisiunilor de lungă durată, de stabilit
supravieţuirea după graviditate şi naştere.5. De elaborat indicaţii pentru întreruperea sarcinii.
Materiale şi metode Au fost studiate 1770 de fişe de ambulator ale pacientelor cu limfomul Hodgkin, care
au primit tratament în Centrul Hematologic din anul 1965 până în anul 2005. La 70 femei limfomul Hodgkin a fost stabilit pentru prima dată în timpul sarcinii (40
femei) sau în perioada inducerii remisiunii (18 paciente) în timpul postterapeutic precoce – pe parcursul primului an după finisarea programului de tratament graviditatea a apărut la 12 paciente.
Tabelul 1Repartizarea pacientelor cu limfomul Hodgkin
conform variantei histologiceVarianta histologică Numărul de paciente
Diagnosticul limfomului Hodgkin în toate cazurile a fost verificat morfologic conform Clasificării Internaţionale adoptate la Conferinţa din Rye (1966).
340
Varianta cu predominare limfocitară (limfohistiocitară) a fost confirmată la 3 (4,3%) paciente, scleroză nodulară – la 27 (38,6%), mixtcelulară – la 34 (48,5%), depleţie limfocitară - la 6 (8,6%), subtip reticular la 5 paciente, subtip fibroză difuză – într-un caz (tabelul 1).
Stadiul clinic a fost stabilit în conformitate cu Clasificarea Clinică Internaţională a limfomului Hodgkin (Ann-Arbor, 1971). Stadiul IA a fost la 4 paciente, IB – la 1, IIA – la 17, IIB – la 30, IIIA – la 7, IIIB – la 5, IVA – la 3 şi IVB – la 3. Stadiile locale au fost la 52 (74,3%) paciente, stadiile generalizate – la 18 (25,7%). Simptome de intoxicaţie generală s-au observat la 39 (55,7%) paciente (tabelul 2).
Tabelul 2Repartizarea pacientelor cu maladia Hodgkin
în funcţie de gradul de răspândire a procesului patologic
Stadiul clinic Numărul de paciente
abs. %I A 4 5,7I B 1 1,4II A 17 24,3II B 30 42,9III A 7 10III B 5 7,1IV A 3 4,3IV B 3 4,3I – II 52 74,3
III – IV 18 25,7B 39 55,7
Femeilor, care au hotărât să păstreze sarcina, tratament specific nu s-a efectuat. Tratamentul s-a indicat celor ce au întrerupt sarcina şi celor ce au născut – peste 2-3 săptămâni după naştere. În scopul inducerii remisiunii în stadiile locale ale recidivelor la 22 (31,4%) femei s-au efectuat radioterapie după program radical (1965-1975) sau cu monochimioterapie cu vinblastin în prezenţa semnelor de intoxicaţie. Ganglionii ilio-inghinali şi ovarele nu au fost iradiate. In stadiul III (11 paciente) s-a efectuat radioterapia după programul desfăşurat. La 5 (7,1%) paciente, la care radioterapia după program radical nu a putut fi finisată, ne-am limitat la iradierea doar a focarelor afectate. La 32 (45,7%) paciente s-a aplicat trarament combinat de chimioradioterapie: în stadiile locale s-au administrat 3 cicluri de polichimioterapie CVPP, radioterapia după program radical, apoi iarăşi 3 CVPP. In stadiul III s-au indicat 6 CVPP, cu radioterapie ulterioară după program desfăşurat. În stadiul IV după 6 CVPP a urmat radioterapia la focarele reziduale (tabelul 3).
Tabelul 3Repartizarea pacientelor cu maladia Hodgkin
La toate pacientele s-a studiat numărul de sarcini şi naşteri, suportarea lor, s-a determinat dezvoltarea recidivelor maladiei de bază, obţinerea remisiunilor repetate, influenţa sarcinii asupra prognosticului limfomului Hodgkin.
Rezultate şi discuţiiDin cele 70 cazuri de graviditate în perioada activă a limfomului Hodgkin, la 28 femei
diagnosticul de limfom Hodgkin a fost stabilit, când sarcina era în trimestrul II şi III, din ele 18 s-au finisat cu naştere. Patologie în sarcină la nici una din aceste paciente nu s-a observat. Toate gravidităţile s-au dezvoltat normal. Naşterile au fost fără particularităţi. Toţi copiii s-au născut fără patologii, malformaţii şi s-au dezvoltat după naştere sănătoşi. Despre aceasta au menţionat şi alţi autori [5, 6]. La 42 femei sarcina a fost întreruptă în termeni precoci la iniţiativa hematologului (tabelul 4).
Tabelul 4Consecinţele obstetricale ale gravidităţii
la pacientele cu maladia Hodgkin în perioada activă a bolii
La toate 70 paciente în timpul sarcinii şi imediat după naştere s-a constatat progresarea procesului tumoral (tabelul 5).
Tabelul 5Influenţa sarcinii la evoluţia maladiei Hodgkin
Consecinţele sarcinii Numărul de paciente
abs. %Progresare, recidive 70 100
Influenţa negativă a sarcinii şi naşterii asupra evoluţiei limfomului Hodgkin în perioada activă au înregistrat şi alţi cercetători [2, 4, 6]. În urma tratamentului efectuat la 40 (57,1%) paciente s-a obţinut remisiune completă, la 21 (30%) – remisiune parţială. La 9 (12,9%) paciente efect clinic nu s-a observat, durata vieţii lor nu a depăşit trei ani. Toate pacientele cu remisiune parţială la fel au decedat de progresarea bolii. Supravieţuirea lor de 5 ani a fost 40,5%, de 10 ani – 7,2%, până la 15 ani nu a supravieţuit nimeni. Cele 40 paciente cu remisiuni complete au trăit mai mult de 15 ani fără recidivă (tabelul 6).
Tabelul 6Eficacitatea tratamentului recidivelor
după sarcinile suportate în perioada activă a limfomului HodgkinEficacitatea tratamentului Numărul de paciente
Aşadar sarcina si nasterea în perioada activă a limfomului Hodgkin provoacă dezvoltarea recidivelor, însă cu posibilitatea obţinerii remisiunei complete de lungă durată.
342
Concluzii1. În perioada activă a limfomului Hodgkin şi în remisiunea parţială şi de scurtă durata
sarcina şi naşterea influenţează negativ evoluţia acestui limfom.2. În această perioadă se recomandă întreruperea sarcinii.3. Inflluenţa negativă a limfomului Hodgkin asupra sarcinii nu a fost înregistrată.4. Tratamentul contemporan al limfomului Hodgkin în cazurile progresării maladiei de
bază după sarcină şi naştere permite obţinerea remisiunii complete de lungă durată.
Bibliografie1. Horani A, Ulitsky J, Kalish Y, Safadi R. Hodgkin's disease in pregnancy // Isr Med.
Assoc J. 2004 Aug;6(8):502-50З.2. Lepontre R. Maladie de Hodgkin et grossesse // Concours med., 1975, 25: 4698-4706.3. Демина Е.А., Сусулева Н.А., Каверзнева М.М., Ильяшенко В.В., Червонобаб
Ю.В. Течение лимфогранулематоза после родов у женщин в полной ремиссии // European School of Oncology, Москва, 2000: 18-2З.
4. Корчмару И.Ф., Параскова А.М. О влиянии беременности на течениелимфогранулематоза // Вопр. онкол., 1982, 7: З4-З8.
5. Переслегин И.А., Филькова А.М. Лимфогранулематоз // Медицина, 1975. 270 c.6. Чехарина Е.А., Пакулина Л.Е. Влияние беременности на течение
ACTUALITĂŢI ÎN MANAGEMENTUL LEUCEMIEI MIELOIDE CRONICE: EXPERIENŢA IMSP INSTITUTUL ONCOLOGIC ŞI REVIEWUL LITERATURII
Vasile Musteaţă Catedra Hematologie şi Oncologie a U.S.M.F. „N. Testemiţanu”
(Şeful catedrei – prof. univ., dr.hab.şt.med. I. Corcimaru),IMSP Institutul Oncologic (director – prof., dr.hab.şt.med. V. Cernat)
SummaryUpdates in the management of chronic myeloid leukemia: experience
of the institute of oncology and review of literatureThe contemporary management of chronic myeloid leukemia diversifies the diagnostic
and curative options with respect to the level of medical assistance. The treatment of chronic myeloid leukemia in the chronic phase and accelerated phase without complications may be realized in the outpatient department or in daily stationary. The treatment of chronic myeloid leukemia in the accelerated phase with complications (bleeding, thrombotic, infectious) and in the acute phase should be realized in the specialized departments of hematology. The drug Imatinib Mesylate constitutes the first-line therapeutic option in the chronic phase and in the accelerated phase, being superior to the conventional chemotherapy and α-Interferon due to the possibility of achievement of a fast complete clinico-hematologic response, complete cytogenetic response and due to the considerable increase of a life quality and longevity of patients.
RezumatManagementul contemporan al leucemiei mieloide cronice diversifică opţiunile
diagnostice şi curative în funcţie de nivelul asistenţei medicale. Tratamentul leucemiei mieloide cronice în faza cronică şi de accelerare fără complicaţii poate fi efectuat în condiţii de ambulator sau a staţionarului de zi. Tratamentul leucemiei mieloide cronice în faza de accelerare cu complicaţii (hemoragice, trombotice, infecţioase) şi acută se efectuează în secţiile specializate de hematologie. Medicamentul Imatinib Mesilat constituie opţiune terapeutică de prima linie în faza cronică şi de accelerare a leucemiei mieloide cronice, fiind net
343
superioară în raport cu chimioterapie convenţională şi α-IFN prin posibilitatea atingerii răspunsului clinico-hematologic complet rapid, răspunsului citogenetic complet şi creşterea semnificativă a calităţii vieţii şi longevităţii pacienţilor.
Actualitatea Leucemia mieloidă cronică (LMC) constituie un proces neoplazic clonal al sistemului
hematopoietic, care rezultă din transformarea malignă a celulei stem, cu menţinerea capacităţii de diferenţiere către toate liniile celulare. Patologia se caracterizează în special prin multiplicarea necontrolată a celulelor seriei mieloide, cu creşterea masei granulocitare totale şi a celei circulante. Marcherul citogenetic al acestei leucemii cronice serveşte cromozomul Philadelphia t(9;22), care se formează în urma translocaţiei reciproce a unei părţi de material genetic dintre cromozomii 9 şi 22 [1,2,4,5,16,20,21]. Identificarea genei de fuziune BCR/ABL şi a proteinei himerice p210 cu activitatea tirozinkinazică conturează LMC la nivel molecular [2,4,19,21]. Morbiditatea prin LMC variază între 0,6 – 1,6 cazuri la 100000 de populaţie [2,4,16,20,21]. LMC constituie o patologie oncologică relativ frecvent întîlnită în structura morbidităţii prin hemoblastoze, constituind 15 – 20% din toate leucemiile la adulţi şi fiind una dintre cele grave şi invalidizante maladii umane [2,4,5,20,21]. Cauza LMC nu este bine cunoscută. Iradierea (în special în doze mari) pare să reprezinte un factor favorizant. Argumentele sunt de ordin statistic: incidenţa crescută la personalul medical din radioterapie / radiologie care au activat fără protecţie adecvată, la pacienţii trataţi cu radioterapie şi în populaţia din Hiroshima şi Nagasaki după explozia bombei atomice [2,4,5,14,16,20,21]. Nu sunt evidenţiate dovezi demonstrative şi argumentate precum că agenţii chimici sau virusuri ar reprezenta factori favorizanţi ai LMC. Sunt identificate 3 stadii clinico-evolutive ale LMC: cronică, de accelerare şi acută [6,7,9,12,14,19]. În faza cronică oncopatologia respectivă este asimptomatică în 15 – 40% de cazuri, fiind depistată ocazional prin analiza generală a sîngelui. Tratamentul contemporan al LMC cuprinde chimioterapie, imunoterapie, citochine şi transplant medular alogenic [1,2,3,4,5,7,8,9,10,11,12,13,19,20]. Transplantul medular, precum şi inhibitorii tirozinkinazei sunt opţiunile curative de vindecare a pacienţilor cu leucemie mieloidă cronică în faza cronică [2,3,4,5,7,13,14]. Imatinib Mesilat sau Glivec® este inhibitor al tirozinkinazei, produse de gena himerică BCR-ABL situată pe cromozomul 22 şi se consideră ca „terapia în ţintă” [7]. Glivec® a fost implementat în practica clinică în anul 2001 şi în prezent constituie în multe instanţe ca tratament de prima linie a LMC [2,3,4,5,7,8,9,12,14]. Glivec®
International Patient Assistance Program (GIPAP) prezintă unul dintre cele mai generoase şi de lungă durată program în domeniul terapiei anti-cancer axat la asigurarea tratamentului cu Imatinib Mesilat a pacienţilor cu procese neoplazice maligne [8,11,12,15]. Totodată cercetările demonstrative privitor la eficacitatea nemijlocită şi inofensivitatea medicaţiei cu Glivec ® sunt reflectate în literatura periodică pe specialitate insuficient, majoritatea din aceste fiind bazate pe numărul neînsemnat de cazuri. Nu este relatată dinamica clinico-hematologică pe fond de terapie cu Imatinib Mesilat în raport cu chimioterapia convenţională. Nu s-au elaborat definitiv principiile de dozare a medicamentului în funcţie de eficacitatea şi durata chimioterapiei anterioare şi de datele examinărilor citogenetice şi moleculare ale măduvei osoase. Se întreprind studii clinice pentru evaluarea răspunsului la doze înalte de Imatinib Mesilat [3]. Lipseşte un algoritm optim de conduită a pacienţilor cu diferite faze ale LMC. Cele expuse au servit ca argumente întemeiate pentru realizarea studiilor în domeniul diagnosticului şi tratamentului LMC.
Obiectivele Studierea literaturii ştiinţifice mondiale în domeniul LMC; elaborarea algoritmului
eficient de conduită a bolnavilor de LMC în Republica Moldova; studierea rezultatelor nemijlocite şi la distanţă ale medicaţiei cu Imatinib Mesilat în LMC.
344
Material şi metode Tipul de studiu realizat este descriptiv (integral, cu elemente de studiu selectiv). Sunt
utilizate următoarele metode de cercetare: istorică, epidemiologică, analitică, transfer de date, statistica descriptivă [17]. Acumularea informaţiei pentru cercetare s-a efectuat prin anchetarea, extragerea datelor din documentaţia medicală, analiza datelor literaturii modiale şi ale statisticii oficiale [17]. Au fost studiate 21 surse bibliografice de referinţă. În studiul au fost încluşi 154 bolnavi (bărbaţi – 58, femei – 96) în vîrstă cuprinsă între 14 – 74 ani (media de vârstă – 40,7 ani), cu diferite faze ale LMC, care s-au aflat sub supravegherea Centrului Hematologic al IMSP Institutul Oncologic din Moldova în perioada anilor 2000 – 2009. Tipul procesului mieloproliferativ cronic a fost identificat în conformitate cu Clasificarea Internaţională a Neoplazmelor Mieloide propusă de O.M.S. în anul 2001 [6,18]. Stadiul cronic al LMC a fost diagnosticat în 76 (49,4%) cazuri, stadiul de accelerare şi cel acut (criza blastică) – în 78 (50,6%). În funcţie de rezultatele examinărilor citogenetice şi moleculare ale celulelor medulare 63 pacienţi (bărbaţi – 30, femei – 33) au fost calificaţi şi aprobaţi pentru GIPAP [11,12,15]. Rata celulelor medulare pozitive la Ph cromozom a variat între 20 – 100%, fiind în majoritatea absolută de cazuri (74,7%) în peste 75% de elemente celulare ale măduvei osoase. Gena himerică BCR-ABL p210 s-a detectat în celulele medulare la toţi bolnavii, la 3 (4,8%) din ei fiind determinată şi gena BCR-ABL p190. În sublotul investigaţional din cadrul GIPAP stadiul cronic al LMC a fost diagnosticat în 47 (74,6%) cazuri, stadiul de accelerare şi cel acut (criza blastică) – în 16 (25,4%). Pacienţii respectivi au urmat medicaţie cu Imatinib Mesilat [9,11,12,15]. Doza medicamentului a fost selectată în funcţie de stadiul clinico-hematologic evolutiv al bolii, constituind 400 mg în faza cronică, 600 mg în faza de accelerare şi 800 mg în criza blastică [1,4,5,7,8,9,19,20,21]. Medicaţie de start cu Imatinib Mesilat au primit 8 (12,7%) pacienţi primari. În 55 (87,3%) cazuri Imatinib Mesilat a fost administrat în lipsa răspunsului clinico-hematologic complet sau a celui citogenetic la chimioterapie convenţională şi la recidiva procesului leucemic. În scopul monitorizării răspunsului citogenetic la pacienţi peste 6 – 8 luni de tratament se efectua examinarea repetată a celulelor medulare la Ph-cromozom şi gena BCR-ABL p210 [5,9,12,14,16,19]. În sublotul investigaţional neinclus în GIPAP pacienţii au primit monochimioterapie cu Busulfan, Hidroxicarbamidă şi / sau α-Interferon (α-IFN) în faza cronică, monochimioterapie cu Citarabină în faza de accelerare şi polichimioterapie după diferite scheme în ceea acută, reieşind din tipul crizei blastice.
Rezultate obţinute şi discuţiiStudiul literaturii mondiale pe temă a demonstrat că incidenţa LMC în Europa şi America
de Nord constituie 1 – 2 cazuri la 100 000 de adulţi pe an [2,4,5,14,15,16,20,21]. În Republica Moldova morbiditatea de LMC se cifrează la 0,6 cazuri la 100 000 de populaţie [4,11,12]. Aglomerări de cazuri sau particularităţi geografice semnificative de răspîndire a acestei leucemii nu sunt înregistrate. Morbiditatea prin LMC creşte cu vîrstă, cu incidenţa maximă cuprinsă între 25 – 50 de ani, ce denotă afectarea preponderent a persoanelor apte de muncă. La majoritatea bolnavilor înrolaţi în studiile chimioterapeutice vîrsta variază între 50 – 60 ani, cu media ≈ 53 ani. LMC este rară sub 18 ani şi excepţională sub 5 ani (cînd se descrie forma „juvenilă”, atipică). S-a constatat o predominanţă uşoară a pacienţilor de sex masculin (bărbaţi : femei = 1,4 : 1). Nu s-au raportat transmiteri de la un caz la altul şu nu s-au descris cazuri familiale [1,2,4,5,16,20]. Aproximativ 4600 cazuri noi de LMC au fost diagnosticate în anul 2004, şi în 1570 cazuri a survenit decesul din cauza progresării procesului leucemic.
Prezintă interes experienţa mondială publicată în tratamentul LMC, care reflectă rezultatele aplicării diferitor opţiuni curative. În faza cronică a LMC pe fond de medicaţie cu α-IFN răspunsul clinico-hematologic complet poate fi obţinut în 81% de cazuri, răspunsul citogenetic complet – în 26% [16]. Supravieţuirea peste 5 ani a bolnavilor trataţi cu α-IFN constituie 57%, fiind superioară celei în cazurile cu chimioterapie (42%) [1,5,16]. În cadrul tratamentului chimioterapeutic convenţional longevitatea medie a pacienţilor cu LMC variază
345
între 4 – 5 ani, la 30% din ei depăşind 10 ani [4]. Totodată sunt descrise cazuri cu o durată a vieţii de 15 – 20 ani. Durata crizei blastice constituie în mediu 4,5 luni, cu extreme de 0,5 – 15 luni. Imatinib mesilat se aplică cu succes în toate fazele LMC, cel mai înalt răspuns clinico-hematologic şi citogenetic fiind atins în faza cronică a patologiei. Remisiunea clinico-hematologică completă pe fond de medicaţie cu Imatinib Mesilat poate fi obţinută în timp de 1 – 2 luni. Spre deosebire de chimioterapie convenţională şi α-IFN Imatinib Mesilat contribuie la atingerea remisiunii citogenetice majore în 65 – 85% şi celei complete în 45 – 80% de cazuri [5]. Supravieţuirea fără recidive constituie 89% peste 18 luni de tratament cu Imatinib Mesilat. Pînă la faza de accelerare calitatea vieţii bolnavilor este satisfăcătoare cu păstrarea capacităţii de muncă.
Managementul LMC în ţările în decurs de dezvoltare derulează cu implimentarea GIPAP, care a fost lansat în anul 2001 de Novartis Pharma AG ca program de donaţie şi înrolează bolnavii cu diferite faze ale leucemiei mieloide cronice, leucemie acută limfoblastică şi tumori gastro-intestinale stromale (GIST) maligne [8,9,14,15]. Identificarea şi recomandarea instituţiilor medicale, evaluarea şi calificarea pacienţilor pentru GIPAP, suportul informaţional şi logistic sunt efectuate de TMF şi Axios International. Novartis Pharma AG este responsabilă de aprobarea instituţiilor medicale pentru GIPAP şi de expedierea loturilor de medicament în calitate de donaţie (11,15). Peste 280 centre medicale de referinţă specializate în hematologie / oncologie sunt implicate în acest program internaţional. De la momentul lansării GIPAP a aprovizionat cu Imatinib Mesylate mai mult de 10000 pacienţi din peste 80 ţări, care nu aveau alte accese la acest remediu eficient şi bine tolerat.
Studiul efectuat în cadrul IMSP Institutul Oncologic a demonstrat că simptomele clinice şi aspectele hematologice ale bolii au fost determinate de faza LMC şi răspunsul la tratament anterior în cazurile secundare. Totodată semnele care au condus la depistarea patologiei s-au datorat splenomegaliei şi modificărilor specifice la examenul sângelui periferic. În grupul pacienţilor înrolaţi în GIPAP perioda de la stabilirea diagnosticului de LMC pînă la începutul medicaţiei cu Imatinib Mesilat a oscilat între 1 – 59 luni (media – 24,7 luni). La 6 (9,5%) bolnavi LMC s-a diagnosticat incidental în timpul examenului clinico-hematologic profilactic sau adresării la medic din cauza complicaţiilor infecţioase sub formă de pneumonie acută. Dimensiunile splinei au variat de la palparea polului lienal inferior la nivelul rebordului costal stâng pînă la crista iliacă. În 3 cazuri splenomegalia s-a evidenţiat numai la examenul cu ultrasunete al organelor cavităţii abdominale. Splina la palpare a fost puţin doloră, cu suprafaţa netedă şi consistenţa dur-elastică. La 21 (33,3%) bolnavi s-a depistat şi hepatomegalia, marginea inferioară a ficatului fiind palpabilă cu 0,5 – 7 cm de sub rebordul costal drept.
În hemogramă numărul de leucocite a variat între 12,2 – 315,0 x 10 9/l, de trombocite – 180,0 – 2340,0 x 109/l. În aspiratele medulare seria granulocitară a fost cuprinsă între 34,0 – 86,4%, celulele blastice – 1 – 69%.
Experienţa acumulată în managementul LMC în IMSP Institutul Oncologic atestă ca tratamentul LMC în faza cronică şi de accelerare fără complicaţii poate fi efectuat în condiţii de ambulator sau a staţionarului de zi. Tratamentul LMC în faza de accelerare cu complicaţii (hemoragice, trombotice, infecţioase) şi acută se efectuează în secţiile specializate de hematologie.
Răspunsul clinico-hematologic complet a fost obţinut în faza cronică tardivă şi accelerată la 49 (77,8%) pacienţi peste 1 – 2 luni de terapie cu Imatinib Mesilat. Micşorarea splenomegaliei, scăderea leucocitozei şi trombocitozei s-a dovedit mai rapidă în raport cu chimioterapia anterioară cu Busulfan, atingînd 50% din valorile dimensionale iniţiale în perioada de 7 – 10 zile. În cazurile de medicaţie cu Glivec ® tendinţa spre atingerea precoce a remisiunii complete a fost observată în faza cronică a LMC, cu perioada scurtă de la debutul maladiei pînă la confirmarea diagnosticului, cu leucocitoză şi trombocitoză moderate. Într-un caz cu criza blastică de tip limfoblastic cu remisiunea clinico-hematologică completă şi răspunsul citogenetic minor după polichimioterapie pe fond de Imatinib Mesilat s-a obţinut răspunsul citogenetic şi molecular complet. Numai în 5 (7,9%) cazuri de criză blastică a LMC nu s-a obţinut răspunsul clinico-hematologic la tratament. La bolnavii cu remisiunea clinico-
346
hematologică completă analiza citogenetică repetată a măduvei osoase, efectuată peste 6 – 8 luni de medicaţie cu Imatinib mezilat, a demonstrat scăderea ratei celulelor medulare pozitive la Ph-cromozom pînă la 5 – 35%, ce indică obţinerea remisiunii citogenetice majore. În 9 (14,3%) cazuri peste 12 – 18 luni de tratament s-a constatat eradicarea completă a clonei celulare medulare purtătoare de Ph-cromozom. De menţionat, că la majoritatea absolută a bolnavilor (80%) trataţi cu chimioterapie convenţională pînă la medicaţie cu Imatinib mesilat s-a obţinut răspunsul citogenetic minor (Ph-cromozom 60 – 100%), fiind confirmat prin examinarea citogenetică a măduvei osoase în procesul încluderii lor în GIPAP.
Conform criteriilor ECOG-WHO a fost studiată dinamica calităţii vieţii bolnavilor de LMC în funcţie de metoda aplicată de tratament (Tab. 1).
TABELUL 1. Calitatea vieţii bolnavilor de LMC în funcţie de metoda aplicată de tratament
Spre deosebire de chimioterapia convenţională pe fond de medicaţie cu Imatinib mesilat s-a ameliorat semnificativ calitatea vieţii pacienţilor, ce a permis continuarea sau reluarea activităţii profesionale la cei plasaţi în cîmpul muncii (ECOG-WHO scor – 0). S-a determinat diferenţă statistic semnificativă (p<0,05) între nivelul calităţii vieţii (0-1 conform criteriilor ECOG-WHO) după medicaţie cu Imatinib mesilat (82,5% de bolnavi) şi chimioterapie convenţională (9,5% de bolnavi).
A fost realizat studiul longevităţii pacienţilor cu LMC în funcţie de opţiunea curativă utilizată (Tab. 2).
TABELUL 2. Longevitatea bolnavilor de LMC în funcţie de metoda aplicată de tratament
Lotul bolnavilor supuşi medicaţiei cu Imatinib mesilat după chimioterapie convenţională (%)
Lotul bolnavilor supuşi medicaţiei cu Imatinib mesilat (%)
≤ 12 44.1 26.5 16,7
13 - 36 23.5 70.6 83,3
37 - 60 17.7 2.9 ---
≥ 61 14.7 --- ---
347
S-a constatat că longevitatea bolnavilor de LMC trataţi din start cu Imatinib Mesilat a fost net superioară indicelui respectiv în cazurile de chimioterapie convenţională cu / fără medicaţie ulterioară cu Imatinib Mesilat.
În rezultatul studierii literaturii periodice internaţionale, evaluării dinamice a datelor clinico-hematologice şi imagistice, precum şi a rezultatelor tratamentului pacienţilor cu LMC din subloturile investigate s-a conturat următorul algoritm de conduită în oncopatologia respectivă, care înglobează algoritmul diagnostic (Fig. 1) şi cel de tratament (Fig. 2).
În calitate de indicatori pentru monitorizarea implimentării algoritmului de tratament pot fi utilizate: proporţia pacienţilor cu LMC, la care s-a efectuat chimioterapia „de ţintă”, medicaţia citoreductivă şi/sau imunoterapia cu normalizarea analizei generale a sîngelui şi mielogramei în decurs de 3 luni, pe parcursul unui an; proporţia pacienţilor cu LMC, la care s-a efectuat chimioterapia „de ţintă” sau/şi imunoterapia cu dispariţia Ph-cromozomului şi genei de fuziune BCR-ABL respectiv în 12 şi 18 luni, pe parcursul unui an; proporţia pacienţilor cu LMC, la care s-a menţinut răspuns clinico-hematologic, citogenetic şi molecular complet pe parcursul unui an; proporţia pacienţilor cu LMC, la care s-a abrogat sau s-a redus gradul de invalidizare, pe parcursul unui an.
I. Suspectarea LMC
Splenomegalie corelantă cu numărul de leucocite – faza cronicăSindromul anemic (astenie, vertij, acufene, cefalee, paliditatea tegumentelor, dispnee la efort fizic, palpitaţii, tahicardie etc.) – faza cronică tardivă, de accelerare şi acutăSindromul hemoragic (peteşii şi echimoze pe piele şi mucoase, gingivoragii, epistaxis, meno- şi metroragii, etc.) – faza de accelerare şi acutăSindromul de complicaţii infecţioase (neutropenie febrilă, stomatită, otită, tonsilită, bronşită, pneumonie, infecţii perianale, etc.) – faza acută
II. Confirmarea LMC
1 Analiza generală a sîngelui cu trombocite şi reticulocite (anemia normocromă şi normocitară în faza de accelerare şi acută, leucocitoza cu / fără trombocitoză în faza cronică, trombocitopenia în faza acută, devierea formulei leucocitare în stînga pînă la celule blastice, asocierea eozinofilo-bazofilică)
2 Celularitatea aspiratului medular (polimorfă şi crescută cu predominarea seriei celulare granulocitare în faza cronică, crescută cu predominarea celulelor blastice în faza de accelerare şi acută)
3 Fosfataza alcalină leucocitară (scăzută sau absentă)4 Examinarea citogenetică a aspiratului medular şi a leucocitelor sîngelui periferic
(translocaţia t (9; 22) sau cromozomul Philadelphia)5 Determinarea markerilor molecular-genetici a clonelor tumorale (gena de fuziune BCR-
ABL responsabilă de producerea proteinei himerice p 210)
III. Determinarea cauzei LMC
1 Anamneza (expunere la iradierea ionizantă)2 Dozimetria individuală (în cazurile de expunere la iradierea ionizantă)
FIGURA 1. Algoritmul diagnostic în LMC
348
I etapă
II etapă
III etapă
FIGURA 2. Algoritmul de tratament în LMC
349
ScopulReducerea proliferării celulelor mieloide şi micşorarea dimensiunilor splinei
Metoda de tratamentFaza cronică precoce: MChT cu Busulfan 2 mg de 1 – 3 ori în săptămînă; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 400 mg/zi.Faza cronică tardivă: MChT cu Busulfan 4 – 6 mg/zi; MChT cu Hidroxicarbamidă 2 – 4 g/zi; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 400 mg/zi (terapia de durată).Faza de accelerare: PChT cu Mercaptopurină 50 – 100 mg/zi + Hidroxicarbamidă 2 g/zi sau Mercaptopurină 50 – 100 mg/zi + Busulfan 4 – 6 mg/zi; MChT cu Citarabină 20 mg/m2/zi 14 – 21 zile; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 600 mg/zi (terapia de durată).Faza acută: PChT conform protocolului de tratament al leucemiilor acute; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 800 mg/zi.
ScopulObţinerea remisiunii clinico-hematologice complete şi remisiunii citogenetice majore sau complete
Metoda de tratamentFaza cronică, înclusiv obţinută în rezultatul transformării după tratament din faza de accelerare şi acută: α-IFN 5 000 000 UI/m2 zilnic; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 400 mg/zi (terapia de durată); α-IFN 5 000 000 UI/m2 zilnic + Citarabină 20 mg/m2/zi (10 zile lunar). Faza de accelerare: α-IFN 5 000 000 UI/m2 zilnic + Citarabină 20 mg/m2/zi (10 zile lunar); MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 600 mg/zi.Faza acută: PChT conform protocolului de tratament al leucemiilor acute; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 800 mg/zi (terapia de durată).Transplantul medular alogeneic poate fi efectuat în toate fazele LMC în cazurile de ineficacitate a opţiunilor curative anterioare (în prezent nu este accesibil în Republica Moldova).
Profilaxia secundarăα-IFN 5 000 000 UI/m2 zilnic; MChT „de ţintă” cu Imatinib mesilat 400 – 800 mg/zi în funcţie de faza LMC (terapia de durată).După transplant medular alogeneic se recurge la medicaţie imunosupresivă cu Ciclosporină 300 mg/zi în combinaţie cu Imatinib mesilat 400 mg/zi sau α-IFN 5 000 000 UI de 2 – 3 ori în săptămînă.
ConcluziiManagementul contemporan al LMC diversifică opţiunile diagnostice şi curative în
funcţie de nivelul asistenţei medicale. Determinarea concomitentă a Ph cromozomului, genei de fuziune BCR/ABL şi a proteinei himerice p 210 / p 190 este de importanţă practică majoră atît pentru diagnosticul LMC, cît şi pentru evaluarea autentică a răspunsului la tratament. Tratamentul LMC în faza cronică şi de accelerare fără complicaţii poate fi efectuat în condiţii de ambulator sau a staţionarului de zi. Tratamentul LMC în faza de accelerare cu complicaţii (hemoragice, trombotice, infecţioase) şi acută se efectuează în secţiile specializate de hematologie. Medicamentul Imatinib Mesilat constituie opţiune terapeutică de prima linie în faza cronică şi de accelerare a LMC, fiind net superioară în raport cu chimioterapie convenţională şi α-IFN prin posibilitatea atingerii răspunsului clinico-hematologic complet rapid, răspunsului citogenetic complet şi creşterea semnificativă a calităţii vieţii şi longevităţii pacienţilor.
Bibliografie1. Baccarani M., Saglio G., Goldman J. et al., Evolving concepts in the management of
chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2006; 108 (6):1809 – 1820.
2. Butoianu E., Niculescu-Mizil E., Leucemia mieloidă cronică. In: Coliţă D., “Medicină Internă. Hematologie. Partea a II-a”. Bucureşti: Editura medicală, 1999: 48 – 68.
3. Castagnetti F., Palandri F., Amabile M. et al., Results of high-dose imatinib mesylate in intermediate Sokal risk chronic myeloid leukemia patients in early chronic phase: a phase 2 trial of the GIMEMA CML Working Party. Blood, 2009; 113 (15): 3428 – 3434.
4. Corcimaru I., Leucemia granulocitară cronică. In: Corcimaru I., “Hematologie”. Chişinău: Centrul Editorial – Poligrafic Medicina, 2007: 178 – 189.
5. Cortes E.J., List A., Kantarjian H., Chronic myelogenous leukemia. In: Pazdur R., Coia L.R., Hoskins W.J. et al., Cancer Management: A Multidisciplinary Approach. 8 th Edition. New York: CMP Healthcare Media, 2004: 773 – 786.
6. Cortes J.E., Talpaz M., O'Brien S. et al., Staging of chronic myeloid leukemia in the imatinib era: an evaluation of the World Health Organization proposal. Cancer, 2006; 106(6): 1306 – 1315.
7. Dressman M.A., Malinowski R., McLean L.A. et al., Correlation of major cytogenetic response with a pharmacogenetic marker in chronic myeloid leukemia patients treated with imatinib (STI 571). Clin. Cancer Res., 2004; 10: 2265 – 2271.
8. Durosinmi M.A., Faluyi J.O., Okany C.C. et al., Preliminary experience with imatinib mesylate therapy of Ph+ chronic myelocytic leukaemia in Ile-Ife Nigeria. Journal of Clinical Oncology, 2005; 23 (16S): 3216.
9. ESMO Gudelines Working Group, Chronic myelogenous leukemia: ESMO Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology, 2007; 18 (2): ii51 – ii52.
10. Kosmidis P.A., Schrijvers D., André F., Rottey S., ESMO Handbook of Oncological Emergencies. Taylor & Francis Group, 2005: 158 p.
11. Musteaţă V., Corcimaru I., Sofroni M. et al., GIPAP în Republica Moldova: realizări şi perspective. Buletinul Academiei de Ştiinţe a Moldovei. Ştiinţe Medicale, 2008; 2 (16): 226 – 228.
12. Musteata V., Corcimaru I., Targeted therapy of chronic myelogenous leukemia: experience of the Institute of Oncology of Moldova. Archives of the Balkan Medical Union, 2008; 43 (3): 154 – 155.
13. Niederwieser D., HSCT for chronic myeloid leukemia in adults. In: Apperley J., Carreras E., Gluckman E. et al., Haematopoietic Stem Cell Transplantation. European School of Haematology. The EBMT Handbook. 5th Edition. Paris: Herissey, 2008: 388 – 396.
14. O’Brien S., Berman E., Devetten M.P. et al., Chronic myelogenous leukemia. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. V 2.2009. National Comprehensive Cancer Network, Inc., 2008: 1 – 47.
15. Ramos J.D., Gleevec Patient Assistance Program USA. Patient Guide. Seattle: Cancer Resources & Advocacy, 2004: 1 – 5.
16. Richard R.E., Linenberger M., Chronic myeloid leukemia. In: American Society of Hematology Self-Assessment Program. Blackwell Publishing, 2005: 178 – 189.
17. Spinei L., Lozan O., Badan V., Biostatistica. Chişinău: Tipografia Centrală, 2009: 186 p.
18. Vardiman J.W., Harris N.L., Brunning R.D., The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood, 2002; 100: 2292 – 2302.
19. Xenocostas A., Chronic myelogenous leukemia (CML). Hematology Practice Guideline. London Health Sciences Centre. London Regional Cancer Program, 2007: 1 – 10.
21. Туркина А.Г., Хронический миелолейкоз. In: Воробьёв А.И. Руководство по гематологии. Москва: Ньюдиамед, 2003: 251 – 264.
PARTICULARITĂŢILE UNOR PROFILURI METILICE ALE PROMOTORULUI GENEI p15
LA PACIENŢII CU CANCER TIROIDIAN Victor Popescu 1, Andrei Ţâbârnă 2, Cristina Butovscaia 1 Laboratorul de Genetică al USMF „Nicolae Testemiţanu” 1
Catedra Hematologie şi Oncologie a USMF „Nicolae Testemiţanu” 2
SummaryPeculiarities of some methylic profiles of p15 gene
promoter in patients with thyroid cancerIn this study we have obtained some methylic profiles in DNA extracted from normal
tissue and thyroid malignant tumors (various morphologic subtypes). We have identified differences in the methylic profile of p15 gene promoter of the thyroid tumors compared with the profile of normal thyroid cells (peritumoral tissue). In conclusion we sustain that MM methylic profile of p15 gene promoter can be used as a high-risk molecular marker for the examined person who can be affected with thyroid cancer refering the day of sample collection.
RezumatÎn cadrul studiului au fost obţinute unele profiluri metilice atât la nivelul ADN-ului extras
din ţesutul normal al glandei tiroide cât şi din tumori maligne ale glandei tiroide (diverse subtipuri morfologice). Au fost identificate diferenţe ale profilului metilic la nivelul promotorului genei p15 al celulelor din tumori în comparaţie cu profilul celulelor normale (ţesutul peritumoral). S-a conchis că profilul metilic MM la nivelul promotorului genei p15 poate servi ca marker molecular al riscului sporit către cancer tiroidian, raportat la ziua prelevării probei biologice.
IntroducereÎn diverse tumori umane a fost detectată metilarea aberantă a genei p16 [Wong I., 2000;
Hoque M et al., 2005]. Gena p15 care este poziţionată în situsul cromozomial 9p21, în apropierea genei p16, la fel, se caracterizează adeseori printr-un grad avansat al metilării în neoplazmele umane [Gronbaek K et al., 1998]. A fost stabilită corelaţia între hipermetilarea promotorului genelor p15 /p16 şi stoparea transcripţiei în celulele neoplazice [Gonzalgo M et al., 1998].
Alterările profilurilor epigenetice şi genetice în cancer adeseori includ hipometilarea la nivelul întregului genom, hipermetilarea locală a genelor supresoare de tumori sau a genelor responsabile de reparaţia ADN, precum şi a genelor inhibitoare ale metastazării, mutaţii
351
punctiforme (substituţia 5-metilcitozinei cu timina) din cadrul insuliţelor CpG ale genei p53 [Wong I., 2001].
În cele mai multe cazuri de cancer la om este stabilită producerea unor dereglări în cadrul cascadei ciclina D / retinoblastom (Rb), implicate în reglarea ciclului celular [Ewen M et al., 1993]. Genele p16 şi p15 sunt gene supresoare în multe tumori solide sau neoplazii hematologice [Wong I., 2001]. Aceste gene codifică proteine-inhibitoare ale kinazelor ciclin-dependente care, la rândul lor, servesc drept reglatori ai fosforilării proteinei pRb.
Totuşi, deocamdată nu au fost găsite diferenţe semnificative între profilurile metilice ale tumorilor din diferite stadii [Costello J. et al. 2000], sugerându-se că alterările epigenetice au loc în stadiile precoce ale dezvoltării cancerului sau în momentul iniţierii tumorilor. Dereglarea unor căi critice precum Rb /p16 şi p53 /p14 /MDM2, sau altele, pot adeseori fi cauza creşterii neoplazice [Wong, 2001].
Perturbarea precoce a controlului ciclului celular prin metilarea p16 /p15, alterarea factorilor de transcripţie, pierderea aderenţei intercelulare în urma hipermetilarii genei E-caderina, depăşirea punctelor de control al ciclului celular în urma hipermetilarii genei p53, pot contribui la proliferarea necontrolată şi imortalizarea celulară [Baylin S. et al. 2000; Tîbîrnă Gh. 2003].
Scopul studiuluiCompararea particularităţilor profilurilor metilice ale promotorului genei p15 în ţesutul
normal al glandei tiroide şi în tumori maligne tiroidiene în vederea stabilirii unor markeri molecular-epigenetici noi de diagnostic presimtomatic al cancerului tiroidian.
Materialul biologic, metodele şi echipamentele utilizate În acest studiu a fost investigat un lot de 35 persoane afectate de cancer tiroidian (tumori
maligne din diverse subtipuri morfologice: carcinom medular, folicular, papilar) care au fost de acord cu includerea lor în prezenta cercetare ştiinţifică, fiind, anterior, diagnosticate primar şi internate în Secţia Tumori cap şi gât a Institutului Oncologic din Republica Moldova.
Medoda de bază utilizată în cercetarea dată a fost studiul molecular al metilării ADN la nivelul promotorului genei p15, supresoare în tumori, prin conversia citozinei nemetilate în uracil (tratarea ADN-ului cu bisulfit de sodiu şi amplificarea porţiunilor genice cu ajutorul perechilor de praimeri nonmetil-specifici şi metil-specifici prin tehnica MSP (methylation specific polymerase chain reaction) [Herman J., 1996; Protocol QIAGEN 04/2006].
Metodele şi accesoriile utilizate au fost specifice fiecărei etape de lucru, după cum urmează:
1) Prelevarea chirurgicală a fragmentelor din glanda tiroidă (fragment din ţesutul normal al glandei tiroide şi, separat, din tumoră) la pacienţii diagnosticati în prealabil cu cancer al glandei tiroide. Metoda: biopsie; Accesoriile: bisturiu, eprubete-criotub, container cu azot lichid.
2) Extracţia ADN genomic uman din fragmente ale glandei tiroide, separat tumori şi ţesutul normal. Metoda: digestia enzimatică cu proteinază K; Accesoriile: fragmente din tumori şi din ţesutul normal peritumoral al glandei tiroide, proteinază K şi soluţii tampon pentru liza celulelor şi proteinelor, pipete cu volum variabil, eprubete din plastic Eppendorf 1,5 ml, centrifugă 13.000 rot/min, termostat la 56ºC, congelator, frigider.
3) Modificarea ADN-ului prin conversia citozinei în uracil. Metoda: protocol Qiagen EpiTect Bisulfite Kit 04/2006; Accesoriile: ADN genomic uman extras şi purificat din ţesuturile de analizat, set de reactivi Qiagen EpiTect Bisulfite Kit 04/2006, etanol absolut, pipete cu volum variabil, eprubete din plastic echivalent Eppendorf 0,2 ml, centrifugă 13.000 rot/min, vortex, congelator, frigider.
4) Amplificarea prin tehnica MSP a ADN-ului conţinând uracil. Metoda: protocol PCR, Fermentas, Accesoriile: ADN purificat după conversia lui cu bisulfit de sodiu, PCR Master Mix Fermentas, Primeri - Us, Uas, Ms, Mas, pipete cu volum variabil, eprubete din plastic echivalent
352
Eppendorf 0,2 ml, centrifugă la 13.000 rot/min, baie cu gheaţă, aparat automat pentru amplificarea ADN - Termocyclor-Crocodile III Appligene, congelator, frigider.5) Analiza produşilor de amplificare şi interpretarea datelor.
Mersul lucrărilorPentru a putea analiza profilul metilic la nivelul ADN, care este principalul obiectiv al
prezentului studiu, am planificat următoarele etape de lucru:1. Prelevarea fragmentelor din glanda tiroidă (fragment din ţesutul normal al glandei tiroide şi,
separat, din tumoră);2. Extracţia ADN-ului genomic uman din fragmente ale glandei tiroide;3. Modificarea ADN-ului prin conversia citozinei în uracil;4. Amplificarea prin MSP a ADN-ului modificat, conţinând uracil;5. Analiza produşilor de amplificare şi interpretarea datelor.
Amplificarea ADN-ului modificat (aparţinând aceloraşi 35 persoane afectate de cancer tiroidian), conţinând uracil, a fost realizată cu ajutorul protocolului ce urmează.
a) Pregătirea amestecului pentru reacţia de amplificare în lanţ (PCR)Într-o eprubetă Eppendorf de 200 µl cu pereţi subţiri (se menţine pe gheaţă) se adaugă
componentele necesare în ordinea dată pentru a petrece reacţia controlului-pozitiv de amplificare a ADN:- Tampon PCR Master Mix, 2× (Echivalent Fermentas) – 25 µl ;
- Apă deionizată sterilă - volum variabil;Volumul amestecului de mai sus: 40 µl
- N 3 ADN modificat prin conversie ≈50 ng, 10 µl ADN în soluţie 5 ng/µlVolumul total al amestecului: 50 µl
N 1 Notă: În eprubete separate (varianta “N 2”) se introduc aceleaşi componente ale reacţiei de amplificare, cu excepţia praimerilor (se aplică praimerii metil-specifici - “N 2”) [Herman J., 1996]:
N 3 Notă: În reacţiile pentru controlul pozitiv al amplificării cu praimeri nonmetil-specifici şi, separat, cu praimeri metil-specifici, se introduce ADN neconvertit (≈50 ng). În prealabil, într-un tub, separat, au fost introduşi 11 µl ADN matriţă (5 ng/µl). Tubul a fost introdus în termociclor unde a fost denaturat 6 min la 95 °C. Apoi, din matriţa denaturată am luat 10 µl şi am adăugat în amestecul de reacţie. Tubul a fost apoi vortexat şi centrifugat 30 sec. În final, tubul a fost introdus în termociclor pentru a se asigura regimul de temperatură şi timpi după cum urmează (dacă aparatul termociclor nu este prevăzut cu capac termoactiv, se cere acoperirea amestecului de reacţie cu ulei mineral).
b) Tratarea termică pentru realizarea PCRReacţia PCR incepe cu tratarea termică programată a amestecului de reacţie 3 min, 95 °C,
după care demarează programul de 35 cicluri în regimul următor: 30 s - denaturare la 95 °C; 30 s - alinierea praimerilor la 60 °C şi 30 s - elongare (se asigură cu 1 s mai mult pentru fiecare ciclu subsecvent) la 72 °C; după decurgerea celor 35 cicluri, se asigură etapa finală de elongare - 4 min la 72 °C.
c) Protocolul pentru electroforeză
353
Pentru separarea electroforetică a ampliconilor generaţi cu ajutorul metodei MSP noi am utilizat geluri din agaroză echivalent Amresco, tip I (2,0%) dizolvată în tampon TBE (1×). Colorarea gelului a fost îndeplinită în soluţie bromură de etidiu (0,5 µg/ml) la temperatura de 45-50 ºC, dizolvată în tamponul TBE în care se gaseşte agaroza solubilizată, asigurând agitarea recipientului în care se prepară gelul.
1. În prealabil, am preparat 350 ml soluţie TBE (1×): Tris 89 mM, acid boric 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0-8,5.
2. Pentru a determina mobilitatea ampliconilor în gelul de agaroză am realizat electroforeza cu introducerea în gel, în godeuri separate, a ampliconilor generaţi cu ajutorul praimerilor non-metil-specifici „U” (reacţia PCR a avut loc în eprubete separate) şi, respectiv, şi a ampliconilor generaţi cu ajutorul praimerilor metil-specifici „M”. Electroforeza a decurs 15 min (25 0C), 10 V/cm.
3. În tuburi Eppendorf de 0,2 ml am preparat amestecul pentru încărcare în gel, în modul următor: 2 µl soluţie Loading dye (5×) (albastru de bromfenol, zaharoză, xilencianol), 8 µl soluţie conţinând ampliconi generaţi cu primeri M-specifici, în prima variantă, iar în alte eprubete - 8 µl soluţie conţinând ampliconi generaţi cu primeri U-specifici. Această proporţie a fost constituită şi pentru controlul U pozitiv şi M pozitiv.
În paralel, am preparat şi ADN-ul – marker de greutate moleculară: 2 µl soluţie 5× Loading dye, 8 µl apă ultrapură. Pentru obţinerea controlului negativ, ciclurilor de temperaturi a fost supus amestecul Master mix, fără ADN genomic. Acest amestec în proporţie de 8 µl şi Loading dye - 2 µl au fost adăugaţi într-un tub de 0,2 ml pentru a constitui controlul negativ.
4. Am preparat 350 ml soluţie TBE (1×): Tris 89 mM, Acid boric 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0-8,5.
5. Am introdus gelul în cuva aparatului de electroforeză şi am turnat în această cuvă soluţie TBE (1×) până când nivelul acestei soluţii deasupra gelului a constituit 3-4 mm.
6. Am încărcat godeurile gelului cu amestecurile (10 µl) preparate după cum am descris mai sus.
7.Am fixat capacul cuvei şi am conectat aparatul de electroforeză la 350V, durata–15 mind) Analiza produşilor de amplificareDupă încheierea electroforezei, gelul a fost amplasat pe suprafaţa transiluminatorului cu
ajutorul căruia am iradiat gelul cu lumină UV, lungimea de undă 312 nm. În lumină UV moleculele de ADN colorate cu bromură de etidiu ce emit fluorescenţă au fost inregistrate prin fotografiere cu ajutorul unui aparat foto digital (Exemple, Fig. 1A, B).
A.B.
Figura 1. Unele profiluri metilice la nivelul ADN-uluidin ţesutul normal al glandei tiroide (A) şi din tumori maligne (B)
(Foto, original)
354
Fotografiile-electroforegrame astfel obţinute au fost stocate în calculator şi au servit pentru interpretarea rezultatelor amplificării.
În baza datelor din electroforegramele obţinute (exemple, primele 8 specimene analizate, Fig. 1A, B), au fost stabilite particularităţile profilurilor metilice la nivelul ADN-ului din ţesutul normal al glandei tiroide şi din tumorile maligne (diverse subtipuri morfologice) tiroidiene.
Rezultate şi discuţiiÎn vederea formulării răspunsului la ipoteza fixată în scopul proiectului, stabilirea
particularităţilor profilurilor metilice ale promotorului genei p15 din ţesutul normal al glandei tiroide cât şi din tumori maligne (diverse subtipuri morfologice) ale glandei tiroide am analizat datele din electroforegrame din care rezultă că cele două specimene diferă.
Fragmentele de ţesut normal al glandei tiroide prezintă concomitent atât banda U cât şi banda M (profilul UM) în toate specimenele analizate 35/35 (100%). Fragmentele din tumori maligne ale glandei tiroide prezintă numai banda M (profilul MM) în toate specimenele analizate 35/35 (100%) semnificând starea metilată a ambelor alele în toate celulele materialului biologic analizat.
Această constatare conduce către două ipoteze: 1) în stare metilată la nivelul promotorului său, gena p15 este inactivă în celulele tumorilor glandei tiroide; 2) gena p15 are un aport direct în supresia transformării maligne a celulelor normale ale glandei tiroide.
Concluzii1. În cadrul studiului au fost obţinute unele profiluri metilice preliminare atât la nivelul ADN-
ului din ţesutul normal al glandei tiroide cât şi în ADN-ul specimenelor de carcinom medular tiroidian. Aceste profiluri pot servi în calitate de markeri moleculari pentru monitorizarea cancerului tiroidian (prognosticul, diagnosticul diferenţiat-epigenetic şi tratamentul individual).
2. Toate fragmentele din ţesutul normal al glandei tiroide au prezentat concomitent atât molecule nemetilate de ADN cât şi molecule metilate (profilul UM).
3. Spre deosebire de celulele normale ale glandei tiroide, toate specimenele de carcinom medular al glandei tiroide au prezentat ambele alele metilate (profilul MM) la nivelul promotorului genei p15.
4. Profilul metilic MM la nivelul promotorului genei p15 poate servi ca marker molecular al riscului sporit către cancer tiroidian, raportat la ziua prelevării probei biologice.
CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nat Genet 24: pp. 132–138.
2. Ewen ME, Sluss HK, Sherr CJ, Matsushime H, Kato J, Livingston DM (1993): Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell 73: pp. 487-497.
3. Gonzalgo ML, Hayashida T, Bender CM, et al. (1998): The role of DNA methylation in expression of the p19 /p16 locus in human bladder cancer cell lines. Cancer Res 58: pp. 1245-1252.
4. Gronbaek K, Nedergaard T, Andersen MK, et al. (1998): Concurrent disruption of cell cycle associated genes in mantle cell lymphoma: a genotypic and phenotypic study of cyclin D1, p16, p15, p53 and pRb. Leukemia 12: pp. 1266-1271.
5. Herman J. (1996) Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for metylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 93, pp. 9821-9826.
6. Hoque M.O., Rosenbaum E. et al. (2005) Quantitative assesment of promoter methylation profiles in thyroid neoplasms. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 90(7): pp. 4011-4018.
355
7. Tîbîrnă Gh. (2003) Ghid clinic de oncologie, Editura “Universul”, Chişinău, 828 p.8. Wong I. (2000) Aberrant p15 promoter methylation in adult and childhood acute
leukemias of nearly all the morphologic subtypes: potential prognostic implications. Blood, 95: pp. 1942-1949.
9. Wong I. (2001) Methylation profiling of human cancers in blood: molecular monitoring and prognostication (Review). International Journal of Oncology 19: pp. 1319-1324.
