UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CARO L DAVILA -BUCURETI

CORELAREA STUDIILOR DE IMUNO LOGIE I ULTRASTRUCTUR C U TERAPIA I EVOLU IA

HEPATITELOR CRONICE DE TIP B I C

Rezumatul tezei de doctorat

Conductor tiini fic: Prof. Dr. Alexandru Oproiu

Doctorand: Dr. Dnua Lenua Culcea

2007

2

Dedic aceast lucrare de cercetare tiinific n amintirea i recunotina Domnului Acad. Prof. Dr. Nicolae Cajal, pentru ndrumarea neobosit i ncurajarea deosebit cu care m -a susinut n calitate de coordonator tiinific pe parcursul primilor ani ai acestui studiu.

Profunda recunotin i alesele mele mulumiri se ndreapt ctre Domnul Prof.Dr. Alexandru Oproiu, pentru valoroasa ndrumare tiinific i ncrederea acordat n elaborarea acestei lucrri.

Autorul.

3

INTRODUC ER E

Hepatita croni c B (HCB) afecteaz mai mult de 350 milioan e oameni din ntraga lu me i n fi ecare an se nregistreaz mai mult de 1 million decese, urmare a ciro zei i can cerului hep atocelular. Supresi a replicrii virusului hepatitei B (VHB) este principala int a terapiei de lung durat a h epatitei cronice B. Istoria natural a h epatitei cronice B este fo arte het erogen . Vrsta l a care a fost achiziionat VHB este un factor major n d eterminarea istoriei naturale a in feciei cronice.

Vigoarea rspunsului imun al gazd ei la virus, factorii virali (genotip, mutaii ale pro motorului core, durat a replicrii virale) i factorii exogeni (al cool, supresia imun) , toi influ eneaz s everitat ea bolii. Scopul terapiei antivirale este sero conversi a A gHBe i preferabil seroconversia AgH Bs , care sunt aso ciate cu un control imun susinut i stoparea progresi ei bolii. Dei pegilatinterferon este considerat agent de pri m linie n terapia hep atitei cronice B cu AgH Be pozitiv, n cele mai multe cazuri exist ci rcu mstan e n care analogii nucleos(t)idici sunt indicai (boala hepatic deco mpensat , pacienii ce necesit chi miot erapi e sau infectai cu alti ageni i munosupresivi i pentru aceia cu contraindicaii la interferon). Majora provocare pentru clinician n ti mpul terapiei cu analogi nucleos(t)idici este evoluia pacientului ctre rezistena la terapia antiviral. Controlul imun de lung durat a replicrii virale este cheia mbuntirii rezultatelor pacientului. Doi analogi nucleosidici (lamivudina, entecavir), un analog nucleotidic (adefovir) i pegilatinterferon al fa (modulator i mun) au fost aprob ai ca terapie curent a HCB.

Hepatita croni c C (H CC) est e esti mat ca afect nd pest e 200 milioane oameni din ntraga lume urmare a in feciei cu virus ul hepatitic C (VHC). Dup descop erirea VHC n 1989 i ca u rmare a disponibilitii testelor pentru evid enierea anticorpilor mpotriva VH C n 1992, rata noilor cazu ri de infecie a sczut foarte mult. Peste 70% dintre persoanel e cu infecie acut progres eaz la statusul de infecie cronic. Evoluia ctre ciroz survine la 20-30 % dintre p acienii cu h epatit cronica C, n general dup 2 sau 3 decad e. Od at instalat ciroza, carcino mul hepato celular (CHC) se dezvolt la 1 -4 % pacieni pe an. VHC este rspndit sub forma a as e g enotipuri care variaz n secven a nucleotidelo r pn la 30-50 %. Cele mai co mune genotipuri ntlnite n Ro mnia sunt g enotipul 1 (cca.75 %), genotipul 2 (cca.15 %) i g enotipul 3 (cca.7 %).

Dei unii pacieni cu infecie acut VH C au un rspuns i mun su ficient pentru a eli min a virusul , infecia croni c (definit prin detectarea ARN -VH C pentru mai mult de 6 luni) se dezvolt n 55%-85% dintre pacieni. Injuriile hepato celulare observate in hepatita cronic C par sa nu fie dato rate efectului citopatic direct al virusului ci deteriorrilor medi ate i munologic produs e de celulele NK i T CD8+ care joac un rol central n patogen ez . Terapia curent reco mandat n hepatita croni c C este co mbinaia interfero n alfa i ribavirin.

Datorit avalanei de d escoperiri recent e n do meniul hepatologiei, n special al hepatitelor cronice postvirale, rolul punci ei biopsie hepatic s-a schi mb at permanent n ulti mii ani . Punerea la punct a uno r metod e tot mai fidele de diagnostic serologic a diferitelor tipuri de infecii virale precum i disponibilitatea pe scar tot mai larg a unor tehnici considerate cu puini ani n urm de do meniul labo ratoarelor de cercetare, n paralel cu refuzul pacieilor p entru o tehnic d e investigare inv aziv , a ridicat problema oportunitii diagnosticului histopatologic n hepatita cronic post viral. n ciuda metodelor de diagnostic modern e, punci a biopsie hepatic rmne standardul de aur al diagnosticului n hepatitele cronice.

Diagnosticul histopatologic pe materi al de puncie biopsie h epatic include mai multe elemente: stabilirea activitii necroinflamatorii; stabilirea gradului fibro zei (stadiul); evidentierea elementelor sugestive p entru diferite etiologii (hep atocite n sticl mat pentru infecie VHB, leziuni ductale,

nodularitate a in filtratului inflamato r portal i steatoz n ploaie n in fecia VHC, steatoz, corpi Mallory, fibro z p erip ortal cu sclerohialinizare n hepatita al coolic , leziuni ductal e flo ride n ciroza biliar pri mitiv , infiltrat plas mocitar n hepatita autoi mu n, etc).

evidenierea de modi ficri care pot influen a rspunsul la tratamentul cu interferon (de exemplu depunerea de hemosiderin n hepatita cronic VHC sau steatoza.

Aprecierea activitii necroinfl amatorii nu se poate face dect prin analiz histopatologic a mat erialului bioptic. S-a ncercat realizarea de corelaii ntre gradul activitii necroin flamato rii i nivelul transaminazelor (expresia biochi mic a citolizei hepatocitare) sau/i nivelul viremiei. Mai multe studii au pus n eviden faptul c nu exist nici o co relaie ntre aceste el emente. Ast fel pacieni cu transaminaze normal e sau puin mrite au p rezentat la puncia biopsie hepatic activitate necroin flamatori e uoar sau chi ar moderat; pacienti cu ncrctur viral n edetectabil au p rezentat la pun cia biopsie hepatic h epatit croni c, et c.

Dac n cele mai multe cazuri diagnosticul de ciroz hepatic poate fi stabilit prin metod e care s nu implice examin area histopatologic, grade mai puin av ansate ale fibro zei nu pot fi stabilite d ect microscopic. Mai multe studii au accentuat asupra necorelrii ntre gradul de fibroz i date bio chi mice sau virologice. Mai mult , pacieni asi mpto matici in fectai VHC, cu niveluri normale ale transaminazelor au prezentat la puncia biopsie hep atic grade variabile de fibroz, merg nd pn l a prezena de puni portoportale i portocentrale.

n plus, modi ficri h epatice care pot favoriza ag rav area fib rozeidepunere h epatocitar s au kup fferian de h emosiderin de exemplu nu pot fi evideniate dect prin exeminare histopatologic . Alte modifi cri cu potenial fib ropar, cu m ar fi steatoza hepatic, pot fi evideniat e i magisticechog rafi e hepatic, co mputer to mografi c, etc. Aceste metode pot preciza doar calitativ prezena s teatozei , pe cnd examenul histopatologic o fer in formaii mult mai complexe, cu m ar fitipul de v acuole, distribuia acestora, corelai a cu alte modi ficri i mportante: hialinizare intracitoplasmatic (co rpi Mallory martor d e consu m etanolic acut), incluzii intranucleare de glicogen ( nuclei glicogenai-di abet zaharat, dislipidemii), asocierea cu tipuri particulare de fibroz (fib roz perivenular , fibro z arahnoid periportal-hepatit toxi c , posibil al coolic) sau asoci erea cu in filtrat in flamator i tipul de in filtrat.

Fibroza esutului hepatic n h epatita cronic postviral este un factor de prognostic i mport ant pentru evoluia ulterioar s ub tratament cu interferon. Ast fel prezena unui grad ridicat de fibroz n hepatita cronic VHB, nainte de ncep erea terapi ei cu interferon, se asociaz cu un p rocent mai ridicat de rspuns favorabil (un nu mr mai mare de pacieni cu rspuns susinut). n schi mb , la pacienii infectai VHC, rata de recdere este mai mare d ac nainte de initierea terapiei puncia biopsie hepatic indic un grad ridicat d e fibro z

4

(puni fibroase portoportale sau po rtocentrale). Probabilitatea ap ariiei unui rspuns favorabil este mult mai mare dac gradul fibrozei este sczut (fibro z portal cu sau fr septuri d ar fr puni fibro ase ntre elementel e v asculare).

n acest context, urmrind progresele tiinifi ce nregistrate cu noile posibiliti tehnice ale labo ratoarelor de excelen i sintetiznd exp erien a acu mulat n decurs de 6-7 ani n diagnosticul, urmrirea evoluiei i tratamentul hepatitelor cronice de tip B i C la o categori e de pacieni cu activitate constant, am desprins interesul general dar i necesitatea dezvoltrii unor cercetri multifactori ale care s permit aprofundarea proceselor biologice caracteristice implicate n evoluia bolilor hepatice viral e, div ersitatea transformrilor morfostru cturale, fiziologice i imunitare, n intensitatea i expresia acestora, raportate la paci eni de diferite vrste precu m i la efectele trat amentelor aplicate.

Ca u rmare, scopul propus n cercetrile p roprii, n fun cie de condiiile oferite d e Spitalul Militar Bucureti i Institutul de Boli In fecioase Pro f.Dr. Mat ei Bal Bu cureti a vi zat u rmrirea a 1173 subieci diagnosticai cu hepatit cronic postviral.

Obiectivele concrete stabilite i rezultatele investigaiilor, analizelor i experi mentelor efectuate sunt sintetizate n lucrare pe nivelurile de abo rdare, i anu me:

1. Analiza co mparativ a datelor tiinifi ce i clinice de tratament viznd h epatitele cronice, interrelaiile organism-factori virali (virusurile hep atitice B, C, D ,) precu m i hep atita cronic postviral , pe nivel e de apro fund are (tisular, celular i molecular); corelarea modi ficrilor histopatologice i i munologice cu el emente d e diagnostic i trat ament; an aliza argumentelor privind utilizarea s corurilor semni ficative ca date eficient e alturi de histopatologie i biologia molecular n stabilirea stadiului hepatitei cronice postviral e; ci de transmitere, pro filaxia i tratamentul hepatitelor cronice B, C.

2. Cercet ri prop rii prezentate sintetic n partea a II -a a lucrrii, efectuat e pe baz de metode an alitice variate, care au cuprins: -Investigaii anatomo -patologice (l a nivel tisular, celular i subcelular), i munohistochi mice, serologice i i munologice; meto de

multifactori ale de analiz a evoluiei n ti mp a 1173 pacieni n funcie de tipul de infecie viral i grupele d e vrst , sex, tip de virus, tratament, profesie.

-Evidenierea trans fo rmrilor morfostructural e ale co mpon entelor esutului hepaticv (hep atocite, matrice extracelular) , a modi ficrilor distro fice h epatocitare, apoptoza, fibroza i evoluia n ecroinflamatorie; evaluarea i realizarea n scor semni fi cativ a aprecierii i analizei statistice a evoluiei hepatitei postvirale i a procesului necroin fl amator.

-Studiul i evaluarea mani festrilor structurale i i munohistochi mi ce di fereniate corelat cu modi fi cri de citoliz ale paren chimului hepatic n fun cie de tipul infeciei virale i stabilirea criteriilor de evaluare, susint de iconografia speci fic , util n diagnosticarea rapid i precis a pacienilor.

-Corelarea modi ficarilor histopatologice i particularitatilor i munohistochi mice i serologice sugestive pentru etiologia VH B i VH C.

-Strat egia d e tratament a infeciilor cronice cu VHB, VHC. -Rspunsul t erap eutic n hepatitele virale cronice d e tip B i C. -Interpretarea co mp arativ a rezultatelor cu accentuarea posibilitilor prezentat e n lucrare pentru perfecionarea sistemului de

biopsie i analiz histo i citopatologic ca metod exact de apreciere a modi ficrilor stru ctural e ap rute ca efect al reactivitii organis mului fa de infecia viral precum i fa de terapia aplicat .

-Corelarea rezultatelor obinute i fundament area unei baze de d ate i a unui sistem posibil de monitorizare i evaluare a un or msuri de prev enire i tratament.

Teza de doctorat cup rinde 285 pagini, 131 tabele, 218 s cheme i figuri, 36 de plan e cu 110 imagini de microscopie optic i electronic ce evideniaz particulariti a p este 100 biopsii hepatice, 376 citate bibliografice.

Nu merotarea capitolelor, subcapitolelor, figu rilor, tabelelor, relaiilor matematice din prezentul rezumat est e aceeai cu cea d in teza de doctorat. O serie d e referate s -au valori ficat sub form de lucrri publicate, comunicate sau susinute la mani festri tiinifice.

5

CU PRINS

INTRODUC ERE............................................................................................................................8 PARTEA G ENERA L

HEPATI TA CR ONIC EXPRESIE A PROCESELOR BIOLOGICE I A FACTORI LOR INTERNI I EXTERNI I MPLICAI N REACIILE MOR FOSTRUCTURA LE I

FUNCI ONALE ALE ORGA NISMULUI U MAN TRAU MATI ZAT.

CA P.1.TEN DINE N C LASI FICAR EA FOR MELOR DE HEPATIT CRONIC ........................................................................................................................12 1.1. CLASIFICRI A CTU ALE CU EVALUAREA UTILIZRII SCO RURILO R SEMNIFICATIVE N STA BILIREA STA DIULUI HEPATITEI CRO NICE VIRALE ............................................................12 CA P. 2.MODIFI CRI HI STOPA TOLOGICE N HEPATI TA CRONIC VI RA L (MI CR OSC OPI E OPTIC, MICR OSCOPIE ELECTR ONIC, I MUNOHI STOCHI MI E, BIOLOGI E MOLECU LAR ) .......................................................................................17 2.1. LEZIUNI HISTOPA TOLO GICE FUNDAMEN TALE.................................................17 2.1.1 . Infiltratul in flamator........................................................................................................ 18 2.1.2 . Leziunile hepatocitare......................................................................................................18

2.1.2 .1. Necroza h epatocitar...........................................................................................18 2.1.2 .2. Leziunile distro fice hep atocitare.........................................................................18 2.1.2 .3. Apoptoza hep atocitar.........................................................................................19

2.1.3 . Modi ficri sinusoidale......................................................................................................19 2.1.3 .1. Hipertrofi a i hiperplazia Kupfferian (activarea sinusoidal)...........................19 2.1.3 .2. In filtrarea limfocitar intrasinusoidal................................................................20 2.1.3 .3. Dilatarea sinusoidal...........................................................................................20

2.1.4 . Fibroza.............................................................................................................................20 2.2. LEGTU RA NTRE HEPATITA CRONIC VIRAL I CA RCINO GENEZ .......20 2.2.1 . Principii gen erale d e on cogenez viral n carcino mul hep atocelular.............................20 2.2.2 . Alterri hepato celulare pot enial premaligne...................................................................22

2.2.2 .1 Modi ficrile h epato citare cu celule mari..............................................................22 2.2.2 .2. Displazia hep atocitar cu celule mici ..................................................................23 2.2.2 .3. Alte tipuri de atipie celular................................................................................23

2.2.3 . Nodulii displazici.............................................................................................................24 CA P. 3. CORELAII ANATOMOCLINICE I ETIOLOGICE N HEPA TITA CRONIC VIR AL .......................................................................25 3.1. VIRU SU RILE HEPA TITICE..........................................................................................26 3.1.1 . Virusul hepatitic B (VH B)...............................................................................................26 3.1.2 . Virusul hepatitic C (VH C)...............................................................................................27 3.1.3 . Virusul hepatitic D (VHD)..............................................................................................27 3.1.4 . Virusul hepatitic G (VHG)...............................................................................................28 3.2. MOD IFICRI BIOCHIMICE N HEPATITA CRO NIC VIRAL.........................28 3.2.1 . Sindromul hep atopriv.......................................................................................................28 3.2.2 . Sindromul in flamator...................................................................................................... 29 3.2.3 . Sindromul de citoliz hepatocelular....................................................................... ...... 29 3.2.4 . Sindromul colestatic........................................................................................................ 29

3.3. MOD IFICRI IMUNOLOGICE GE NERALE N FUNCIE DE TIPUL DE VIRU S HEPA TITIC IMPLICAT.30 3.3.1 . Modi ficri i mune generat e d e in fecia cu VHC..30 3 .3.1 .1. Mecanisme i mune n hep atita cronic cu VHC.30 3 .3.1 .2. Crioglobulinemia n hep atita cronic cu VH C. .32 3 .3.1 .3. Glo merulonefrita i hepatita cronic cu VH C ..34 3 .3.1 .4. Lichenul plan i hepatita croni c cu VHC............................................................35 3 .3.1 .5. Porfiria cutanea tard a i h epatita cronic cu VHC ....36 3 .3.1 .6. Sindro mul Sjogren i hep atita cronic cu VHC......36 3 .3.1 .7. Tiroidita autoi mun i hep atita cronic cu VHC........37 3 .3.1 .8. Hepatita autoi mun i in fecia cu VH C.....37 3 .3.1 .9. Li mfo amele maligne nonhodgkiniene i hep atita cronic cu VHC..38 3 .3.1 .10. Alte cancere i hepatita croni c cu VH C.39

6

3.3.2 . Modi ficri i mune generat e d e in fecia cu VHB..39 3.3.3 . Modi ficri i mune generat e d e in fecia cu VHD..40 3.3.4 . Modi ficri i mune generat e d e in fecia cu VHG..40 3 .3.4 .1. AsociereaVHG crioglobulinemie40 3 .3.4 .2. Asocierea VHG glo merulonefrita memb ranoproli ferativ.....40 3 .3.4 .3. Asocierea VHG li mfo ame maligne nonhodgkinien e..40 3.4. ASPE CTE HISTOPATO LOGICE PA RTICULARE N HEPA TITA CRONIC VIRAL N FUNCIE DE TIPUL D E VIRU S HEPA TITIC IMPLICA T .41 3.4.1 . Hepatita cronic viral cu VH B...........41 3.4.2 . Hepatita cronic viral cu VH C...........41 3.4.3 . Hepatita cronic viral cu VH B i VHD43 CA P4.MODI FI CRI ULTRA STRUC TURALE ALE CELULEI HEPA TIC E I BI OLOGIA MOLECU LAR A REPLICRII VIRUSURI LOR HEPA TITICE B I C............................................44 4.1. TRANSFO RMRI ALE CELU LEI HEPATICE SU B INFLUENA VIRUSULUI HEPA TITE I...B.........................................................46 4.2. MODIFICRI UL TRA STRUCTURALE ALE CELULEI HEPA TICE SUB INFLUENA VIRUSULUI HEPA TITEI C......................................53 CA P5.PA RTICULARITI LE TER APIEI HEPATITELOR CR ONICE VIRA LE DE TIP B I C...64 5.1. ISTORIA NATURAL I TE RAPIA HEPA TITEI CRON ICE B...64 5.1.1 . Istoria natural a in feciei cronice VHB..64 5.1.2 . Scopul terapiei i p redicto rii rspunsului terap eutic............................................................66 5.1.3 . Particularitile terapiei h epatitei cronice B. Variante terapeutice..67 5.1.4 . Evaluarea rspunsului la t erapie i a durabilitii acestuia..69 5.1.5 . Monitorizarea i manag ementul rezistenei la t erapi e.71 5.2. ISTORIA NATURAL I TE RAPIA HEPA TITEI CRON ICE C..74 5.2.1 . Istoria natural a in feciei cu VHC..74 5.2.2 . Predictorii s everitii bolii n infecia cronic VHC............................................................79 5.2.3 . Patofiziologia i efectele terapiei.........................................................................................81 5.2.4 . Evidene clinice ale terapiei h epatitei cronice C..................................................................83 5.2.5 . Utilizarea clinic a terapi ei hepatitei cronice C...................................................................83 5.2.6 . Aspect e n ecunoscut e i di fi culti n terapia hep atitei cronice C........................................88 5.2.7 . E fectele adv erse ale terapiei h epatitei cronice C.................................................................89

7

PA RTEA a II -a CERC ETRI MULTI FAC TORIA LE ASU PRA IN FECIILOR

ESUTU LUI HEPATIC CU VHB I VHC I A METODELOR DE DIAGN OSTIC I TRA TA MEN T

STR ATEGIA C ERC ETRII......................................................................................................92 CA P.6.MATERIAL I METODE..............................................................................................93 6.1. MATE RIALUL IN VESTIGAT..........................................................................................93 6.2. METO DE DE IN VESTIGA RE .........................................................................................94 6.2.1 . Metod e histopatologice curente...........................................................................................94 6.2.2 . Metod e serologice................................................................................................................96 6.2.3 . Metod e de biologie molecular............................................................................................97 6.2.4 . Metod e biochi mice...............................................................................................................98 6.2.5 . Metod e i munohistochi mice.................................................................................................98 6.2.6 . Hibridizarea in situ...99 6.2.7 . Micros copia el ectronic de trans misie i i munoelectronomi croscopi e............................100 6.2.8 . Micros copia confo cal laser...........101 6.3. PROGRAME I TEHNICI DE PRELU CRARE A DATELOR..................................101 CA P.7.ANA LIZA I STABILIR EA CRI TERIILOR DE SELEC TAR E I ANALIZ A LOTURILOR DE PACIENI CU HEPATIT VIRAL..104 7.1. A SPECTE GENE RALE A SUPRA MODIFICRILO R HISTOPA TOLOGICE N HEPA TITA CRON IC VIRAL..............................................................................104 7.1.1 . Structura lotului an alizat.....................................................................................................104 7.1.2 . Ev aluarea activitii necroin flamatorii n scor semicantitativ............................................111

7 .1.2 .1. Evaluarea inflamaiilor portale..............................................................................111 7 .1.2 .2. Evaluarea hep atitei de interfa.............................................................................115 7 .1.2 .3. Evaluarea necro zei con fluent e...............................................................................117

7 .1.2 .4. Evaluarea activitii intralobulare (inflamai e, necroz focal i apopto z) .............................................................................................................................118 7 .1.2 .5 Ev aluarea activitii necroinflamato rii....................................................................121 7.1.3 . Stabilirea stadiului fibro zei.................................................................................................123 7.1.4 . An aliza modi fi crilor distro fice h epatocitare......................................................................126 7.1.5 . Constatri asupra d epunerilor de pig ment ..................................130 7.1.6 . D ate p rivind apoptoza celulelor esutului h epatic ..............................131 CA P.8.MODI FICRILE HISTOLOGICE CA RACTERISTIC E N FUNCIE DE TI PUL DE IN FECI E VIRA L; PA RTIC ULARITI I MUN OHI STOCHIMI CE N FUNCIE DE ETIOLOGIE.......................................132 8.1. TRAN SFORMRI SE MNIFICA TIVE CU IMPLICAII PENTRU E TIOLOG IA VHB..............................................................................................................132 8.1.1 . H epatocite cu aspect n sticl mat..................................................................................132 8.1.2 Nu clei nisipoi.....................................................................................................................133 8.2. TRAN SFORMRI SE MNIFICA TIVE CU IMPLICAII PEN TRU E TIOLOG IA VHC..............................................................................................................135 8.2.1 Steatoza...............................................................................................................................135 8.2.2 In filtratul inflamator port al nodular....................................................................................140 8.2.3 . L eziuni ductale....................................................................................................................142 8.3. STUDII IMUN OHISTO CHIMICE I SEROLOGICE LA PACIEN II CU IN FE CII HEPATICE VIRALE B I C...........................................142

CA P.9.STUDII C OMPARATIVE ASUPRA U NOR FACTORI CU I N FLUEN N EVALU AREA STADIILOR DE EVOLUIE A HEPA TITELOR VI RA LE....................................................................145 9.1. MRIMEA BIOPSIEI HEPA TICE; REPE RCURSIUNI ASUPRA INTE RPRETRII HISTOPATOLO GICE..........................................................145 9.2. EFICA CITATEA APRE CIE RII VERBALE.......................................................................148 9.3. COMPARAII N TRE SCORURI SEMNIFICA TIVE ....................................................150 CA P.10 .CORELAII CI TOHISTOPA TOLOGIC E I I MUN OHI STOCHIMI CE CU ETI OLOGIA VIR AL A HEPA TITEI (I DENTI FICAT SER OLOGIC) .......................................................153 10.1. PARA ME TRI DE ACTIVITATE I STADIU...............................................................153 10.1.1. H epatita d e interfa .............................................................................................................153 10.1.2. N ecro za conflu ent ..............................................................................................................154

8

10.1.3. A ctivitatea intralobular .......................................................................................................154 10.1.4. A ctivitatea necroin flamatorie...............................................................................................155 10.1.5. Fibroza.................................................................................................................................155 10.1.6. Repartiia activitii necroin fl amatorii i fib rozei................................................................156 10.2. PARA ME TRI CITOHISTOPATOLOGICI CU SPECIFICITATE E TIOLOG IC.....................................................................................................................159 10.2.1. Elemente sugestive pent ru etiologia VHB...........................................................................159 10.2.2. Elemente sugestive pent ru etiologia VHC...........................................................................161 10.3. CORELAII NTRE SEVE RITATEA AFECTRII CLINICE, I A CTIVITA TE A NECROIN FLA MA TORIE I STADIUL FIBROZEI..........................164 10.3.1. Citoliza n hepatita croni c VHB........................................................................................164 10.3.2. Citoliza n hepatita croni c VHC........................................................................................166 10.3.3. Citoliza n hepatita croni c n fun cie de stadiul fib rozei ...................................................168 10.4. ROLUL COMPONENTEI APOP TO TICE N LEZIUNILE HEPA TO CITARE DIN HEPATITA CRONIC VIRAL .............................................169 10.5. ELEMEN TE DE PROGNO STIC I RELA IA CU TUMO RIGENE ZA; LE ZIUNI PRE CANCEROA SE.......................................................171 CA P. 11. MODI FICRI ULTRA STRUC TUR ALE A LE CELULEI HEPATICE N HEPA TITELE CR ONICE VIRALE DE TI P B I C.......................................175 11.1. E VIDENE ALE REPLICRII VH B N HEPA TOCITE I CELULE LE NONPARENCHIMALE .....................................................................................................175 11.1.1. In fecia ocult cu VHB........................................................................................................175 11.2. E VIDENE ALE REPLICRII VH C N HEPA TOCITE , CELUL ELE NONPARE CHIMALE I MATRIXUL E XTRACELULA R............................................180 11.2.1. In fecia ocult cu VHC........................................................................................................180 11.2.2. In fecia cronic cu VHC......................................................................................................184 CA P. 12. TR ATAMENTUL HEPATI TELOR CR ONICE VIRALE DE TI P B I C...........191 12.1. TRATAME NTUL HEPATITEI CRONICE DE TIP B.....................................................191 12.1.1. Tratamentul cu peginterferon -2 a n hep atita cronic B, AgHBe pozitiv.......................191 12.1.2. Tratamentul h epatitei cronice B, AgH Be pozitiv, cu peginterferon -2a, lamivudin sau n co mbinaie .............................................................................................193 12.1.3. Tratamentul h epatitei cronice B, AgH Be negativ, cu lamivudin .......................................197 12.1.4. Tratamentul cu entecavir n hep atita cronic B, AgH Be-pozitiv, refractar la lamivudin........................................................................................................................202 12.1.5. Tratamentul h epatitei cronice B, AgH Be pozitiv, cu ad efovir dipivo xil.............................206 12.1.6. Terapi a co mbinat cu lamivudin i ad efovir dipivoxil n h epatita cronic B, AgHBe pozitiv, refractar la lamivudin ...........................................................................209 12.2. TRATAME NTUL HEPATITEI CRONICE DE TIP C......................................................211 12.2.1. Tratamentul h epatitei cronice C, genotip 1 cu peginterferon-2a i ribavirin ........................................................................................................................211 12.2.2. Tratamentul h epatitei cronice C, genotip 2/3......................................................................215 12 .2.2 .1. Terapia cu peginterferon -2 a i ribavirin ..........................................................215 12 .2.2 .2. Terapia cu peginterferon -2b i ribavirin..........................................................217 CA P. 13 . EVALUAR EA REZULTA TELOR ..........................................................................221 CONCLUZII..................................................................................................................................230 PARTIC ULA RITI HISTOPA TOLOGICE HEPATI CE N IMAGINI ..........................234 BIBLIOGRA FIE............................................................................................................................270

9

PA RTEA a II -a CERC ETRI MULTI FAC TORIA LE ASU PRA IN FECIILOR

ESUTU LUI HEPATIC CU VHB I VHC I A METODELOR DE DIAGN OSTIC I TRA TA MEN T

CA P. 6. MATERIA L I METODE

6.1. MA TERIALUL I NVESTIGAT Pentru ntocmirea prii person ale a acestei lucrri au fost studiate cazurile de hepatit cronic viral diagnosticate n Secia de

Anato mie Patologic a Spitalului Clinic Militar Central Bu cureti i Institutul de Boli Infecioase Prof.Dr. Mat ei Bal Bucureti, n decursul a 6 ani .

Mat erialul an alizat a fost n ntregi me esut hepatic u man . Iniial, n fun cie de metod a de recoltare, am inclus n lotul de studiu esut hepatic u man obinut prin: puncie biopsie hepatic (1173 cazu ri) i examen necroptic (5 cazuri). n scop demonstrativ, am ilustrat nodulii displazici n imagini efectuate la cazurile de necropsie cu ciroz dar nu am inclus cazurile menionate n lotul de studiu. n colaborare cu Toronto Regional Sunnybrook Cancer Cent er i Sunnybrook Res earch Institute of Canada am efectu at n decursul a 3 ani studiile pentru detecia variantelor Y MDD ale ADN -VH B, care induc rezistena la terapia antiviral, testele RT PCR pentru evidenierea ARN-VHC i ADN-VHB n hepatocite, studiile de hibridizare in situ i de microscopie con focal laser pentru evidenierea AgHCc, a proteinelor structurale E1, E2 n hepato citele i PBMC d e la pacienii cu hepatit ocult i cronic de tip C, t estele de hibridizare fluorescent in situ p entru evidenierea ADN -VH B n hepato cite i P BMC de la p acienii cu in fecie ocult i cronic cu VH B, studii experi ment ale pentru evidenierea eficien ei terapiei hepatitei croni ce B cu adefovir dipivoxil n combinaie cu lamivudina, studii experi mentale asup ra rspunsului virologic n terapia hepatitei croni ce C, genotip 2,3 cu durat stand ard i redus .

6.2. METODE DE INVESTIGAR E Metode histopatologice curente

Frag mentele h epatice recoltate au fost fixate n formaldehid tamponat 10%, imersarea n fi xato r fcndu -se i medi at du p recoltare; ti mpul de fi xare a fost variabil ntre 18 i 22 de ore, n funcie de mo mentul recoltrii.Biopsiile au fost ulterior prelucrate dup metodel e clasice privind fixarea, prelucrarea, incluzionarea i folosirea de tehnici specifice pent ru contrastarea i evidenierea caracteristicilor histo i citologice. Coloraiile d e rutin folosite au fost: hematoxilin-eozin, van Gieson, t ricro m Masson , G o mori i Perls; n cazuri p articulare, n funcie de aspectul n coloraiile d e rutin, s-au efectu at coloraii PAS, D -PAS, Best, Giemsa i ro damin.

Metode s erologice Pentru virusul hep atitei C prob ele de s nge au fost testate utiliznd trusele ELISA pentru decelarea antico rpilor antiVH C;

probele pozitive au fost con firmate prin RIBA (reco mbinan ant immuno bloting assays). Pentru determinarea serologic a genotipurilor VH C au fost folosite testele Murex H CV Serotyping 1- 6. Determinarea markerilor virali pentru in fecia VHB s-a efectu at utiliznd testele auto mat e EIA, cu nalt senzitivitate i sp eci fi citate p entru AgHBs , AgHBe, antiH Be, antiHBs , antiHBc.

Meto de de biologie mol ecular Determin area nivelului A RN-VHC i A DN-VHB s-a realizat utiliznd tehnica ampli ficrii genice (manu al co mpetitive reverse

transcriptas e-PCR; semi-auto mated co mpetitive reverse t ranscriptase-P CR) (Tabel 31).

Tabel 31. Teste de cuantificare a ARN-VHC i ADN-VHB

Metode biochimice Testarea nivelului ALT serice este metoda cea mai nonivaziv , ieftin dar rel ativ nesenzitiv pentru evaluarea activitii bolii

hepatice. Totui exist o larg asociere ntre nivelele nalte ale AL T serice i severitatea modifi crilor histopatologice obesrvate la biopsiile hepatice. Determinri n serie a nivelului AL T pot furniza o mai bun ev aluare n ti mp a injuriilor hepatice. Alte analize de laborator, ca teste noninvazive p entru evaluarea fibrozei i monitorizarea pacienilor cu in fecie cronic VH C, VHB includ t estele de biochi mie asociate fi catului (AST, Bilirubin, GGT), determinarea nu marului de tro mbocite, timpul de protro mbin , fib rinogen .

Meto de imuno histochimice Imunohistochi mi a a fost folosit n scopul evidenierii Ag HBs , Ag HBc, AgHD pe material inclus n parafin (Tabel 32).

10

Tabel 32. Tipuri de anticorpi utilizati in imunohistochimie

Hibridi za rea in situ n biopsiile hepatice, hibridizarea in situ s-a realizat utiliznd un produs PCR d e 546 bp corespunzto r regiunii X a genomul ui

VH B care a fost direct clonat ntr-un vector p CRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA ) pentru g enerarea plas midului pHBx. Inseria a fost excizat din plasmid prin digestie EcoRI i marcare cu digoxig enin-11-dUTP (Roch e Mol ecular Bioch emi cals) . Procentajul de celule infectat e a fost d eterminat prin inspecia vizu al i calculul a cel puin 2 000 de celule pe fiecare seciune hepatic.n PBMC, determinarea ADN-VHB prin hibridizare in situ s-a realizat folosind probe se snge peri feric hep arinizat Celulele au fost di vizate n dou alicote, una pentru d etecia ADN-VH B prin PCR i alta pentru hibridizarea fluorescent in situ (FISH) a ADN-VHB. Probele de PBMC au fost hibridizate cu acel eai probe VH B utilizate n hibridizarea in situ a esutului hepatic. Testele de hibridizare in situ au fost utilizate i pentru an aliza biopsiilor hepatice i a PBMC de la paci enii infectai cu VHC

Microsco pia electro nic de transmisie Pentru studiile de microscopie electronic am selecionat trei cazu ri de puncie biopsie hepaticun caz de hepatit croni c VHB

cu activitate necroin flamatorie minim grad 3 (A=1 , B=0, C=1, D=1 ), fib roz 1 scor Ishak i dou cazu ri de hepatit cronic VHC cu activitate necroin fl amatorie uoar, grad 8 (A=3 , B=0, C=2, D=3), fib roz 2 scor Ishak , cu leziuni ductale prezent e la nivelul majoritii spaiilor porte.

Microsco pia confocal laser Seciuni optice seriate au fost col ectate pentru pun erea n eviden a Ag HCc i proteinelor structurale E1, E2 din biopsiile

hepatice ale pacienilor cu in fecie cronic i o cult cu VH C. Prob ele au fost incubat e cu anticorpi monoclonali anti-AgHCc, o ri cu anti-E1, ori cu anti-E2. A dou a incubaie a fost realizat cu anti-IgG de oarece conjug ai cu FITC (diluie 1: 60 n PBS, Vector laboratories , In c.,Burlingame, CA, USA) apoi seciunile au fost contramarcate cu propidiu m idid. Dup marcarea i muno fluo rescent, probele de biopsii hepatice au fost vizionate la un microscop confo cal Nikon, cu obiectivul X60 , la care a fost at aat un sistem de scanare con focal cu laser MRC 600 , avnd n componen filtre pentru excitaiile de propidiu m iodid (554nm) i filtre pentru excitaiile de fluorescein (494nm).

6.3. PROGRAME I TEHNICI DE PRELUCRARE A DATELOR Rezultatele histopatologice au fost evaluate n paralel cu analiza probelor d e la laborator i a modi ficrilor clinice menionate n

foile d e observaie. Din an aliza foilor de obs ervaie au fost s elecionate pe lng dat e generale (sex, vrst) p rincipalele semn e i simpto me clinice i date de labo rator. n studiul mat erialului recoltat au fost urmrii mai muli parametri: lungi mea fragmentelor, nu mrul de sp aii porte, necroza hep atocitar periportal/periseptal i intralobular (focal i con fluent) , infiltratul in fl amator portal/septal i intralobular, apoptoza hepatocitar , modi ficrile sinusoidale, distro fiile h epatocitare, leziunile speci fice unui anu mit tip de virus, activitate n ecroinfl amatorie i fibroza.

Am studiat corelaii ntre aceti parametri i etiologia hep atitelor cronice, folosind pentru evalu area statistic testele 2 (CHITEST) i STU DEN T. Li mit a de semni ficaie st atistic luat n consideraie a fost P

11

CA P. 7. ANALIZA I STABILIR EA CRITERIILOR DE SELECTAR E I ANALI Z A LOTURI LOR DE PACIENI CU HEPA TIT VIRA L

7.1. ASPECTE GEN ERA LE ASU PRA MODI FICRI LOR HISTOPA TOLOGICE N HEPA TITA CRONIC VIRAL 7.1.1 . Structura lotului a nali zat

Lotul studiat include 1173 cazuri d e hepatit cronic viral; distribuia n fun cie de etiologie a fost urmto area (Tabel 3 3, Fig.29):

Tabel 33. Distribuia hepatitelor cronice n funcie de etiologie

Fig.29 E tiologia hepatitelor cronice virale

64,5%

1,8%3,2% 0,2%

30,2%

BD

B

C

BC

BC D

Ca sex ratio nu se remarc di ferene semni ficative n funcie de etiologie ns, corel area cu vrsta ca al treilea paramet ru independent de analiz arat rezultate interesante: n general vrsta medie d e prezentare este mai mic n cazul in feciei cronice VH B dect VHC, cu trei ani mai mi c n cazul brb ailor dect al femeilor, di ferena cres cnd la 5 ani n cazul in feciei mi xte VHB+VHC

(Fig. 35).

Fig. 35. Repartiia pacienilor n f uncie de vrst

0102030405060

0 17 22 27 32 37 42 47 52 57 62 67

nr. Pacieni

Avnd n vedere calea de trans mitere parenteral a infeciilor cu virusuri hepatitice am luat n considerare posibilitatea ca venirea permanent n contact cu snge i produse de snge, unele posibil infectate, s conduc la o frecv en mai mare a acestor tipuri de afeciuni n rndul person alului medical. A m s elecionat dintre p rofesiile pacienilor p e cel e din do meniul sanitar (inclusiv studenii la medicin general i sto matologie)10 ,008 % din total, procent care depete cu mult pro centul for ei de munc i mplicat n asisten sanitar din totalul fo rei de munc ocupate n Romnia (fig .41).

Fig.41 . Re pa rt iti a pe profesi i a pa cie nt ilor cu he pa tit a c ronica vira la

0 ,2%

1,5%

90%

3% 5% 0,2%

Medic As ist.med L abo ran t In gr ij.spit Stud ent Alt e prof.

Tipul i cantitatea de esut recoltat: Cele 1173 de biopsii hepatice au fost recoltate prin pun cie percutan . Marea majoritate a biopsiilor hep atice au avut mai mult de 4 spaii porte (mini mum necesar pentru evaluarea semicantitativ a activitii necroinfl amatorii i fib rozei hep atice cronice)1149 de cazu ri (97 ,95 %). Majoritatea biopsiilor hep atice au inclus ntre 0 ,6 i 2 cm de esut (765 cazuri64,88 %); cele mai multe dintre biopsiile hepatice cu mai puin d e 4 spaii porte au avut sub 0,5 cm lungime (20 cazuri 66,66% din totalul biopsiilor cu mai puin de 4 spaii porte) o trei me din biopsiile d e di mensiuni mici au fost cunti ficabile.

Etiologie Numr cazuri

1 B 355 2 C 756 3 BC 38 4 BD 21 5 BCD 3

12

7.1.2. Evaluarea a cti vitii necroi nflamatorii n scor semicantitati v 7.1.2.1. Evaluarea inflamaiilor portale (categoria D, sco r Isha k) n hep atita cronic VH B au predominat cazurile cu in fl amaie po rtal minim-mod erat (in flamaie portal 0-2 n 69 % din cazuri). n hepatita croni c VHC d e as emenea au predominat cazu rile cu in flamai e portal mini m-moderat (inflamai e portal 0-2 n 64%

din cazuri). n hepatita cronic VH B+VHC au predo min at cazu rile cu in flamaie port al mini m-moderat (inflamaie portal 0-2 n 68% din

cazu ri). diferene semnificative am ntlnit n cazul infiltratului inflamator po rtal foarte abundent (grad 4) mult mai frecvent n hepatita

cronic VHB (13 %) sau VH B+VHC (18,42%) fa de hep atita cronic VHC (5%). n hepatitele VHB+VHD in filtratul inflamator po rtal a fost mult mai abundent dect n celelalte situaii (in flamaie portal grad 3-4

57%). Polimorfis mul infiltratului inflamator a fost mai mare n hepatitele cronice cu VHB (11% din cazu ri fa de 4 % n hepatita cronic VH C). Se constat aceeai frecven mai mare, descris n literatur a plasmocitelor n in fecia VH B; eozinofil ele au fost mai nu meroase in cazul infeciilor VH C (85,71 %) s au VHC+VH B (100%) fa de h epatita cronic VHB (41,07%).

7.1.2.2 Evaluarea hepatitei de interfa (categoria A, sco r Isha k) n hepatita cronic VHB majo ritatea cazurilor au avut hepatit de interfa redus A ntre 0 i 2 (72,1 % din cazuri); de remarcat un

numr mare d e cazuri fr h epatit de interfa (14,08 %); hepatita de interfa s ever, grad 4, a fost foarte frecv ent (11,54% fa de numai 2 ,77% n h epatita cronic VHC).

n hepatita cronic VH C majoritatea cazurilor au avut hepatit de interfa redusA ntre 0 i 2 (75,51 % din cazuri); d ei nu a fost prezent un nu mr mare de cazuri cu hep atit de interfa foart e i mportant , A grad 4 (2 ,77 %), procentul de cazu ri cu hepatit de interfa continu este mare (A grad 3,4 n 24 ,46 %), si milar cu cel din h epatita cronic VHB (27, 87%).

n hepatita cronic VHB+VHC majoritatea cazurilor au avut hepatit de interfa redus A ntre 0 i 2 (68,42% din cazu ri); procentul de cazu ri cu hep atit de interfa continu este mare (A grad 3,4 n 31 ,57 %, superior in feciilor monovirale), dar diferen a nu este semni ficativ statististic pentru a putea trage o concluzie. Proporia de cazuri cu hepatit de interfa severa A grad 4 a fos t mare (10,52%), si milar cu cel din hepatita cronic VHB.

n hepatita cronic VH B+VHD proporia cazurilor care au avut h epatit de interfa redus A ntre 0 i 2 (85,70 % din cazu ri) a fost cea mai mare din toat e loturile studiate; de remarcat c nu au existat cazuri cu hepatit de interfa foart e important (A grad 4 ).

Fig. 56 Fig. 57

7.1.2.3 Evaluarea necrozei confluente (categoria B, scor Ishak) n hepatita cronic VH B s-a observat o proporie mai mare de cazu ri cu necro z con flu ent raportat la loturile cu in fecie VHC sau

VH B+VHD (15 ,5%); singurul lot n care am ntlnit necroz con fluent n punte (bridging necrosis; 2 ,24 % din cazuri) . n h epatita cronic VHC necro z confluent redus , categorie B 1-2 (5,68%). n h epatita cronic VHB+VH C nu am avut nici un caz cu necroz con fluent. n h epatita cronic VHB+VH D s-a obs ervat necroz con fluent redus , catego rie B1 (28, 51 %).

15

6

0 0 0 0 0

0

5

10

15

Fig.6 3.Ne croza confluent n hepa ti ta cronic VHB, D 0123456

7.1.2.4. Evaluarea activi tii intralobulare (i nflamaie, necro z focal i apo pto z- categoria C, scor Isha k) n hepatita croni c VH B n general activitatea intralobular a fost redus , gradul cat egoriei C 0-2 (85,06%). Au predominat celulele

inflamato rii de tip li mfo-mono citar (care au fost prezente n toate cazurile); dintre celelalte tipuri de celule mai nu meroas e au fost eozinofilele.

n h epatita cronic VHC: activitatea intralobular a fost foarte sczutnumai 5 ,55% din cazuri au avut activitate intralobular p este 3. Co mponena in filtratului inflamator intralobular a fost si milar lotului VH B.

n hepatita cronic VHB+VHC: activitatea intralobular a fost n general redus (C 0-2: 84,2 %). Intralobular nu au fost identifi cate dect li mfocite i mono cite.

n hepatita croni c VHB+VHD: apro ape ju mtate din cazu ri au avut activitate intralobular i mportant (peste 3): 42,85%. De asemenea, intralobular, nu au fost id enti ficate dect li mfo cite i monocite.

13

7.1.2.5. Evaluarea activi tii necroinflamatorii Din totalul de 1173 de cazuri studiate am exclus 31 de cazu ri care nu au avut numrul necesar de spaii porte pentru cunati ficarea

activitii necroinfl amatorii. Pentru cele 1142 cazuri rmase, distribuia activittii necroinflamato rii a fost u rmtoarea (Fig. 70- 74): Fi g.70. Act ivitate necroi nf lamatorie in hepat ite le cronice viral e

66%

12% 20%2%

minim uoar moder at sever

Marea majoritat e a cazu rilor au avut activitate necroinflamato rie redus mini m 20 % din cazuri i uoar 2/3 din cazu ri.

7.1.3. Stabilirea sta diul ui f ibro zei Majoritat ea cazurilor au avut g rade mici d e fib roz (5 % nu au avut fibroz portal colagen port al n li mite normale; pest e 60 % din cazuri au avut fibroz portal mini m/ moderat , eventual cu extensie sept al intralobular grad 1-2 ). 7,70 % din cazuri au prezent at ciroz hep atic (fib roz 6) .

Fig.75. Distribuia fibrozei n hepatitele cro nice virale

34%

4%3%

8% 5% 27%

19%

0 1 2 3 4 5 ciroza

14

FibrozaFibroza hepatica, grad 1 hepatica, g rad 1 sisi 33

7.1.4. A nali za modificrilor distrofice hepatocita re Am studiat frecv ena distro fiilor hidroprotidice hepatocitare n funcie de activitatea intralobular i etiologie.

0

42.8542.85

14.28

0

61.14

29.53

9.32

0

39.8

53.6

6.6

0

28.57

57.14

14.28

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4

Corelaia ntre dis trofiile hidroprotidice hepatoc itar e i activitatea intr alobular

(%),VHC

absente

minimemoderatemarcate

0

78.57

21.420

0

33.33 44.4422.22

00

83.33

16.66

00 00

02040

6080

100

1 2 3 4

Corelaia ntre distrofiile hidroprotidice hepatocitare i activitatea intralobular (%), VHB,C

absenteminimemoderatemarcate

2.01

67.78

26.17

4.02

0

35.29

62.74

1.960

25

56.25

18.75

0

40

0

60

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4

Corelaia ntre dis trofiile hidroprotidice hepatocitare i activita tea intra lobular (%),VHB

absenteminimemoderatemar cate

Fr ecventa distrofiilor hidropr otidice hepatocitar e in hepatita cronica B, C, BC .

n hep atita cronic VH B se obs erv c p rezena distro fiilor hidroprotidice se coreleaz cu creterea activitii intralobulare. n hepatita cronic VHC s e observ c prezena distro fiilor hidroprotidice se co releaz cu creterea activitii intralobulare n

contextul n care aceasta exist; pentru situaiile n care intralobular nu se observ necroz hepatocitar izolat , fo care de in fl amaie cronic sau apoptoz hep atocitar, exist o proporie important d e biopsii hepatice cu distrofii hidroprotidice moderate sau chiar marcate (57,13 %).

7.1.5. Constat ri as upra depunerilor de pigment n marea majoritate a cazurilor nu am observat d epunere de pig ment; cel mai frecvent a fost depistat hemosiderina. A m studiat frecv ena depunerii diferitelor tipuri de pigment n funcie de etiologie (pro cente relative n fun cie de numrul de cazuri din fi ecare subs et etiologic). Dei rezulatat ele obinute nu sunt semni ficative statistic se observ tendina mai mare de depunere a hemosiderinei n hepatitele VHC (infecie unic sau n co mbinaii) i d e lipofuscin n h epatitele VH B, VH B+VHD .

7.1.6. Date pri vi nd apo ptoza celulelo r esutul ui hepati c cele mai numeroase sunt hepato citele contractate, mai uor de identifi cat (71,09 %) i cei mai puin nu meroi sunt corpii apoptotici

intrasinusoidali (mici, cu durat de via mai mi c , n 6,90 % din cazuri). Corpii Coun cil man (forma cl asic a apoptozei hepatocitare) au fost p rezeni n 27,79% din cazu ri. Nu am identificat nici o fo rm de apoptoz hep atocitar n 8 ,69% din cazu ri (Fig.93).

n hep atita cronic VH B se obs erv creterea proporional a apoptozei odat cu creterea activitii intralobulare. n hepatita cronic VH C, pentru valori mici ale C de 0-2, creterea apoptozei este mai mi c d ect creterea C; practic cu ct necro za

hepatocitar i inflamaia intralobular cresc (constituind baza de cretere pentru activitatea intralobular), cu att ap optoza hepatocitar este mai rar . Pent ru C mai mare de 3 , apoptoza crete cu creterea activitii intralobulare.

n h epatita cronic VHB+VHC se observ creterea propo rional a apoptozei odat cu creterea activitii intralobulare, cu observaia c apoptoza este mult mai frecvent la v alori mici ale activitii intralobulare.

n hepatita cronic VHB+VHD la valori mi ci ale C (C =1) apoptoza est e absent , activitatea intralobular datorndu-se necro zei hepatocitare i in flamaiei intralobulare; ulterior, pentru valori mari al e activitii intralobulare (C=2-4) apoptoza crete cu creterea C.

0200400600800

1000

Fig. 93. Apoptoza hepatocitarabsent

hepatocitecontractatecorpiCouncilmancorpi apoptoticiintrasinusoidali

15

CA P. 8. MODI FICRI LE HISTOLOGICE CARACTERI STICE N FUNCI E DE TIPU L DE INFECIE VIR AL ; PAR TICU LARITI IMUNOHISTOCHI MIC E N FUNCIE DE ETI OLOGIE

8.1. TR ANSFORMRI SEMNI FIC ATI VE CU I MPLICAII PENTRU ETIOLOGIA VHB 8.1.1. Hepatocite cu as pect n sti cl mat Hepatocitel e cu asp ect n sticl mat au fost identificate nu mai n h epatocitel e croni ce postvirale care au avut ntre agenii etiologici infecia VH B; nu am avut nici un caz n care s ap ar i magini clare d e hepato cite cu aspect n sticl mat i etiologia in fec iei s fie nu mai VH C; n unele circumstane am avut hepato cite cu citoplasme parcelar omogene, ns acest lucru nu a fost considerat aspect de sticl mat; mai mult, acest asp ect a fost ntotdeaun a asoci at cu infecia VHB, cu excepia unui singur caz n care p aci entul era cunoscut cu un i cter cong enital Gilbert (Fig.94).

8.1.2. Nuclei nisipoi. Proporia d e nuclei nisipoi este foarte sczut n hepatita croni c VH B+VHD i oarecum simil ar n h epatitele VH B, VHB+VH C (Fig.98).

8.2. TRAN SFORMRI SEMNI FICATI VE CU IMPLICAII PENTRU ETIOLOGIA VHC 8.2. Steato za

n hepatita croni c VHB steatoza a fost prezent n apro xi mativ 60 % din cazu ri; n majoritatea cazurilor steatoza a fost mini m (63,63 % din cazurile cu steatoz) , di fuz distribuit (77 %), predo min ant macrov acuolar (27 ,80 %) s au n picturi de toate di mensiunile (15, 50 %).

n hepatita croni c VHC steatoza a fost prezent n apro xi mativ 68 % din cazu ri; n majoritatea cazurilor steatoza a fost mini m (59,38 % din cazuri cu steato z) , di fuz distribuit (60 %) dar aproape o trei me din cazuri avnd distribuie n ploaie, de asemenea predo minant macrovacuolar (53,27%) sau n pi cturi de to ate di mensiunile (24,83 %), Fig.111

n hepatita cronic VHB, C steatoza a fost prezent n apro ximativ 63% din cazuri; n majoritatea cazu rilor steatozei a fost minim (40 % din cazu rile cu steatoza), 68% din cazuri avnd distribuie n ploaie, de asemenea predomin ant macrov acuolar (45,45 %) sau n picturi d e toate di mensiunile (27,27 %), Fig .106

n hepatita cronic VHB, D steatoza a fost prezent n apro xi mativ 65% din cazuri; n majoritatea cazurilor steatoza a fost minim (73,33 % din cazu rile cu steatoz), 87 % din cazu ri avnd distribuie difuz sau focal , de asemenea predo minant macrovacuolar (33,33%) sau medio-macrovacuol ar (20 %).

8.2.2. Infiltratul inflamator portal no dular Am distins mai multe tipuri d e nodularitat e a infiltratului portal: vag nodular, nodular i folicul li mfoid cu centru germin ativ. n hepatita cronic VH B, 59% din cazuri nu au avut nodularitate. n h epatita cronic VHC, 2/3 din cazuri au avut nodularitate.

8.2.3. Lezi uni ductale Am d efinit ca leziune duct al modi ficarea epiteliului biliar care in clude leziuni distrofice hidroprotidice, anizocro mie, pluristraficri dar fr ntreruperea continuitii epiteliului ductal; de altfel, ntreruperea continuitii epiteliului biliar a fost ntlnit doar n trei cazuri n care, ulterior, au fost pui n eviden anticorpi antimitocondri ali

Prezena leziunilor ductale a fost s esizat n toate tipurile de hep atit cronic postviral ns, de departe cele mai frecvente au fost n in fecia VH Cap roap e ju mtate din cazuri; n infecia mixt VHB, C aproape o t rei me din cazuri au prezentat leziuni duct ale.

8.3. STU DII I MUNOHISTOC HI MIC E I SEROLOGIC E LA PACI ENII C U INFECII HEPA TICE VIRALE B I C

Pe un numr de 100 de cazu ri consecutive am efectuat teste i munohistochi mi ce i serologice pentru stabilirea etiologiei i corel area di feritelor rezultate cu aspectele morfop atologice.

16

Tabel 81. Distribuia markerilor virali n hepatita cronic VHB VHB SEROLOG IE ELISA / ORTHO AgHBs Ac antiHBc AgHBe Ac antiHBe Nr. Cazuri + - - - 14 + + - + 5 + + - + 2 + - + - 5 - + - + 2 Total 28 Etiologia VH B a fost con firmat s erologic n 28 de cazuri; dintre acestea ntr-un caz a fost identi ficat Ag HD n

hepatocite (infecie mixt VH B+VHD).

Tabel 82. Distribuia markerilor virali n hepatita cronic VHB, D VHB / VHD / IMUNOHISTOCHIMIE (DAKO) AgHBs AgHBc AgHD Nr. Cazuri + - - 8 - + - 2 + + - 6 + + + 1 Total 17 n lotul de 27 de cazuri cu etiologie VH B au fost identificate hepato cite cu aspect n sticl mat n 10 cazuri (coloraii

uzuale i tricro m Masson); i munohistochi mic, n lotul de 28 de cazuri, a fost confirmat prezena Ag HBs n 15 cazuri iar a Ag HBc n 9 cazuri .

Tabel 83. Distribuia markerilor virali n hepatita cronic VHB Hepatocite n sticl mat / pozitivitate IHC(VHB + / VHD -) Hepatocite n sticl mat Ag HBs Ag HBc Nr. Cazuri + + + 6 + + - 4 - + - 4 - - + 2 Total 16

P entru infecia VHC am identificat prezen a serologic a Ac antiVHC n 58 de cazuri. Tabel 84. Distribuia markerilor virali n hepatita cronic VHC

VHC SEROLOGIE ELISA / ORTHO Ac VHC 58

n 11 cazuri am evid eniat prezena in feciei duale VHB+VH C Tabel 85. Distribuia markerilor virali n hepatita cronic VHB, C VHB+VHC SEROLOG IE ORTHO / ELISA Ag HBs Ac anti HBc Ac anti VHC Nr. Cazuri + - + 6 + + + 2 - + + 3 Total 11 Nu mai n 2 cazuri am evideniat po zitivitatea IHC pentru AgH Bs i AgHBc (18,18 % - fa de 23 ,68 % n lotul iniial;

diferen a mare dintre cele dou situaii este datorat lotului mult mai restrns de cazuri nu mai 11 p acieni cu infecie dual): VHB IMUNOHISTOCHIMIE + VHC- SEROLOGIE ELISA / ORTHO Ag HBs Ag HBc Ac antiVHC Nr cazuri + + + 2 La pacienii cu hepatit croni c , cu activitate necroin flamatori e cel puin uoar am studiat rep artiia serotipurilor de

virus C utiliznd testele Western-blot. Tabel 86. Distribuia serotipuri n hepatita cronic VHC SEROTIPARE VHC (MUREX NS4) Serotip 1 33 Serotip 4 2 Serotip 6 1 Serotip 1+4 1 Serotip 1+2+5+6 1 Netipizabil 11 Total 49

CAP.9. STU DII COMPARA TIVE ASUPRA UNOR FACTORI CU INFLUEN N EVALUAREA STA DIILOR DE EVOLUI E A HEPATITELOR VIRA LE

9.1. MRI MEA BIOPSI EI HEPATICE; REPERCU RSIU NI ASU PR A IN TER PR ETRII HISTOPATOLOGIC E

17

Am analizat relaia ntre di mensiunile frag mentelor de esut hepatic (Fig.136), respectiv nu mrul sp aiilor porte (Fig.137) cu activitatea necroinflamatorie i fib roz:

Tabel 87. Distribuia biopsiilor hepatice pe dimensiuni Lungime I: Sub 0,5cm II: 0,6-1cm III: 1,1- 1,5cm

IV: 1,6-2cm V: peste 2 cm

Nr. cazuri 18 203 243 310 266 Rep artiia cazurilor n funcie de activitate este si milar pent ru loturile de puncii biopsii hepatice cu dimensiuni ntre

1,11,5 cm; 1,62 cm i resp ectiv peste 2 cm i scade p entru biopsiile cu lungime sub 1 cm. Scd erea este dramatic pentru cazurile cu lungi me sub 5cm. (P=0 ,013 lot IV-V; P=0,039 lot III/IV; P=0,262 lot II/ V; P=0,384 lotI/ V; loturile luate n calculmai puin lotul I18 cazuri conin mai mult de 200 d e cazuri mult peste li mita mini m statistic semni ficativ).

Aceleai observaii sunt valabile i pentru repartiia n fun cie d e fib roz-repartiia este si milar p entru loturile de puncii biopsii hepatice cu di mensiuni ntre 1,11,5 cm; 1,62 cm i respectiv peste 2 cm i scade p entru biopsiile cu lungi me sub 1 cm, resp ectiv sub 5 cm, ns n asocierea statistic nu mai este meninut P peste 0,05 n toate cazurile (P=0 ,07 lot IV/ V; P=0,22 lot III/ V; P=0,46 lot II/V; P=0 ,41 lot I/V). Trebuie menionat c n analiza n funcie de dimensiune am exlus cazurile de ciroz hepaticn care di mensiunea fragment elor tisulare a fost mi cde regul multiple, mi cro frag mente cu delimitare reticular continu peri feric . Excluderea complet a cazurilor cu ciroz hep atic nu p erturb reprezentativitatea loturilor ci, di mpotriv, o augmentez , ntruct diagnosticul de ciroz este cu att mai clar cu ct di mensiunea frag mentului tisular este mai mare p ractic eli minarea cazu rilor de ciro z (diagnosticate p e frag mente minuscule) eli min ansa de prelevare.

Comp araia ntre loturile cu dimensiuni 1,62 cm i peste 2 cm relev P foarte ap roape de limita semni ficaiei statistice0,07 fa d e 0,05; lotul III (1,11 ,5 cm) are repartiie oarecu m si milar a fibro zei dar calculul statistic indic valori dincolo de ci frel e semnificativeap recierea fibrozei p e o asemen ea biopsie este g rev at d e ris curi.

Practic o biopsie cu di mensiuni peste 1,5 cm mai mult ca sigur p rezint co rect gradul fibrozei de la nivelul ntregului fi cat p e cnd biopsiile cu di mensiuni sub 1 cm cel mai adesea indic un grad de fibro z in ferior celui real. n schi mb, aprecierea activitii necroin flamatorii se face cu acuratee chiar pe biopsii mai mici cu condiia ca acestea s aib di mensiuni peste 1 cm.

Analiza n funcie de numrul d e spaii porte: am constituit patru loturi, n funcie d e nu mrul de spaii porte; am luat drept reper lotul cu cele mai multe sp aii porte, considerat a fi mai apro ape de repartiia real a cazurilor (Tabel 88).

Tabel 88. Distribuia biopsiilor hepatice pe numr de spaii porte. Nr. sp. porte A: sub 5 B: 6-9 C: 10-14 D: peste 15 Nr. cazuri 201 447 253 136

Dac n cazul loturilor B, C, D repartiiile cazu rilor sunt relativ si milare (P=0,009 C/D, P =0,024 B/D) cu o distribuie aproap e identic n cazul loturilor B, respectiv C (spaii porte ntre 6 i 9, respectiv 10-14)P=9 x 10-5, n cazul lotului A (4 i 5 spaii porte) activitatea necroin flamatorie este net inferioar celei apreciate n biopsiile cu un numr mai mare de spaii porte (P=0,102 A/Dpeste 0,05 , n esemni ficativ statistic).

Aceleai observaii sunt valabile i pentru repartiia n funcie de fibro z . n cazul loturilor B, C, D rep artiiile cazurilor sunt de as emenea relative si milare (P=0,05 C/D, P= 0,000006 B/D ); n cazul lotului A (sub 6 spaii porte) P=0 ,85 A/D indic o distribuie diferitdin grafic se observ o scd ere a gradului fibrozei apreciat n puncii cu nu mr mic de sp aii porte.

Fig. 136 Fig. 137

9.2. EFICACITATEA APRECIERII VERBALE Am analizat efi cacitatea aprecierii verb ale fa d e cuanti ficarea realizat utiliznd scorul Ishak n cazul in flamaiei

portale; rep artiiile sunt cele ateptate trans ferului dintr-o ap reci ere n trei grade (mini m, moderat , marcat) ntr-una n patru grade (1-4 ). n cazul hep atitelor cu in fecii virale ductale, co respond ena verbal/nu meric a fost mai clar. Trebui e subliniat eficacitatea utilizrii denominrii v erbal e care, n diagnosticul histopatologic curent, n afara trialurilor terap eutice, are acuratee su ficient pentru ap recierea activitii necroin flamatorii, chiar fr folosirea d e scoruri d etaliate semni ficative. 9.3. C OMPAR AII N TR E SC ORU RI SEMNI FIC ATI VE

18

Pentru apreci erea unitar a activitii necroin flamato rii i fibrozei s-a ncercat cuantificarea acesteia cu ajutorul unor scoruri semnifi cative: Knodell, Ishak , ME TAVIR, Scheu er, Ludwig, etc.

Am considerat oportun reamintirea criteriilor de scori ficare din principalel e clasificri folosite n prezent n Ro mnia; Ishak, Knodell (HAI), META VIR. ncepnd din 1997 , con form reco mandrii de la Cong resul Naional de Gastroent erologie (Trgu Mure, iunie 1997), n Spitalul Clinic Militar Bu cureti s-au folosit, cu foart e bune rezultate, scorul Ishak . Deo arece n alte centre universitare, sau chiar n alte unitii spitaliceti din Bucureti sunt folosite sco rul Knodell (H AI) sau ME TAVIR, ulterior am trecut la aprecierea conco mitent n toate cele trei scoruri . Din acest motiv considerm i mportant compararea ntre aceste sco ruri, cu evidenierea prin cipalelor di ferene i coresponden e dintre el e.

Trebuie remarcat faptul c , n scorul META VIR, n aprecierea activitii necroinflamato rii, nu se iau n consideraie urmtoarele elemente:

- infiltratul in flamator din lobul (de regul in filtratul in flamator din lobul este asociat fo carelor de necro z hepatocitar i zolat spotty necrosis);

- apoptoza hepatocitar; - leziunile distro fice hidrop rotidice d e tipul degenerescenei b alonizante; - infiltratul infl amator din spaiul port. Practic, n aprecierea activitii necroin fl amatorii n scorul ME TA VIR, cea mai mare importan o prezint hep atita de

interfa , in flamaia po rtal nefiind luat n consideraie. Activitatea intralobular contribuie foarte puin la ap recierea severitii bolii, i aceasta nu mai n situaia n care depete un focar per lobul. D ac n cazul hepatitelor cronice VHC inflamaia portal este mai d egrab redus (afi rmaie susinut att de datele din literatur ct i de cele din lotul analizatcap. 7.1.2.1. Evaluarea in flamaiei portale), acest lucru nu mai este valabil pentru in feciile VHB, n care infiltratul inflamator port, ext rem de abundent este mult mai frecvent . Cu alte cuvinte utilizarea sco rului ME TA VIR n hepatita cronic VH C apreciaz relativ co rect activitatea necroin flamatorie, pe cnd n hepatita cronic VHB po ate g enera o subapreciere a activitii necroin flamatorii.

Comp araia ntre scorul HA I i Ishak: ACTIVITA TEA NECRO -IN FLA MA TORIE: * n g eneral activitatea necroinflamato rie apreciat n s corul HAI este cu 1 -2 unitii mai mi ci dect cea apreciat n Ish ak; * diferen e mai semnificative ap ar n cazul hepatitelor cronice cu activitate necroin flamato rie s ever, cnd di ferena po ate atinge trei unitii, de exemplu grad 12 HAI (mod erat) I=5, II=3 , III=4 este cu anti ficat grad 15 Ishak (sev er) A=3, B=5,

C=3 , D=4 . * o soluie similar (cu di feren e mari) apare n cazul hepatitelor cronice cu necroz con fluent dar fr formare d e puni

necrotice, de exemplu grad 10 HAI (moderat) I=3 , II=3, III=4 este cuantificat grad 13 Ishak (sev er) A=3 , B=3, C=3, D=4.

* scorul HAI nu apreciaz apoptoza, pe cnd sco rul Ishak nu i a n consideraie leziunile distrofi ce de tip distro fi e b alonizant . Fibroza n scorul Ishak este ap reci at mult mai atent . n scorurile cu fibroz apreciat pe o s cal de 4 grad e, sunt

ncadrat e n aceeai categorie situaii n care fibroza se li miteaz la formarea ocazional de puni si cazuri cu fibroz extrem de i mportant , cu izolare o cazional de noduli preciroz; trebui e s reinem i faptul c n pun ciile biopsii hepatice, d atorit modalitii de prel evare este fo arte g reu de apreciat ciro zad e regul ciroza hepatic postnecrotic est e macronodul ar. Impactul psihologic al folosirii unui scor pentru fibro z n 6 grade este su fici ent de mare nct s justifice respingerea involuntar a acestei metode de aprecierepentru un medic obinui s considere fibroz 4 =ciroz, etichetarea unei h epatite cronice (care p rezint un nu mr rezonabil d e puni fibroas e) d rept fibroz 4 este greu d e asimilat.

CA P. 10. C ORELAII CITOHISTOPA TOLOGICE I I MUN OHISTOC HIMICE CU ETIOLOGIA VIR AL A HEPA TITEI (I DEN TI FICA T SER OLOGIC)

10.1. PARA METRI DE A CTI VITA TE I STA DI U 10.1.1 Acti vita tea necroinflamatorie. A m an alizat co mparativ activitatea n ecroin flamatorie n funcie de etiologie(Tabel 96).

Tabel 96. Distribuia activitii necroinflamatorii n f uncie de etiologie minim uoar moderat sever B 34,37 45,73 16,47 3,41 C 13,81 77,83 7,38 0,95 B C 14,28 60 25,71 0 B D 14,28 38,09 47,62 0

*numerele din dreptul fiecrei categorii sunt procente relative n cdrul fiecrui lot n parte. Lotul cu cea mai mare activitate n ecroin fl amatorie aparine etiologiei VHB, D (co mparativ cu lotul VHB, P=3 x10-17); activitatea necroinflamato rie din lotul VH B,C este considerabil mai mare dect n cazul hepatitelor VHB (P=1,7x10-5) sau VH C (respectiv P=6 x10 -11); n cazul lotul de h epatite croni ce VH C, activitatea necroin flamato rie a fost cea mai redus (91,64 % din cazuri cu activitate necroinflamato rie mini m sau uo ar). 10.1.2 . Fibroza

Pentru a putea urmri mai uor v ariaiile fibrozei n fun cie de etiologie, am constituit trei categorii: fibroza po rtal absent/prezent eventual cu extensii sept ale (0-2), puni ntre elementele vas culare (3-4), nodularitate prezent (5 ,6).

19

01020304050607080

B C BC BD

Fig.150. Fib roza in f un ct ie de et iologi e

0-23-4.5-6.

Se ob eserv preponderena cazu rilor cu fibroz redus n cazul hepatitei cronice VH B (semni ficaie statistic P=0 ,04); n hepatita cronic VH C p este o trei me din cazuri au avut fib roz cel puin cu puni fibroas e ntre element ele v asculare (semni fi caie statistic P=0,059n esemni ficativ); etiologia mi xt a asociat preponderena cazurilor cu fib roz i mportant, co mp arativ cu h epatitele cronice monovirale (P=0,0003 VHB,C/ VHB; P=0,045 VH B,C/ VH C; P =0,0008 VHB,D/ B).

10.1.3 . Repartiia a cti vitii necroi nflamatorii i f ibro zei Cele mai multe cazu ri de hepatit croni c VHB tind s prezinte activitate necroin flamatorie mare, fibro z redus ; n

schimb, cel e mai multe cazuri de h epatit cronic VH C tind s prezinte activitate necroinflamato rie mic , fibroz redus. Totui cazurile cu cea mai mare activitate necroin flamatorie aparin lotului cu VHC i ar cazurile cu fibroz mare au activitate necroin flamatorie mai mare n cazul h epatitelor croni ce VHC dect VHB (Fig .152,153).

Fig.152 Fig.153

10.2. PARAMETRI CITOHISTOPATOLOGICI CU SPECI FICI TATE ETIOLOGIC 10.2.1 . Elemente s uges tive pentru etiologia VHB Speci ficitatea prezen ei att a h epato citelor n sticl mat ct i a po zitivitii pentru Ag HBs este d e 100% (nu am avut nici o situaie n care s apar rezulate fals pozitive); n ceea ce privete sensibilitatea, situaia este diferit dup cu m urmeaz (Tabel 98):

Tabel 98. Distribuia elementelor sugestive pentru etiologia VHB Sensibilitatea prezenei hepatocitelor n sticl mat n lotul general 37,04% Sensibilitatea prezenei hepatocitelor pozitive IHC pentru AgHBs n lotul general 51,85% Sensibilitatea prezenei hepatocitelor n sticl mat n lotul pozitiv IHC pentru AgHBs 71,42%

Se remarc faptul c , dei sensibilitatea prezenei hepato citelor n sticl mat nu este foart e mare, nici i munohistochi mic id entificarea celulelor AgH Bs pozitive nu este cu mult mai frecvent. Raportat la aceasta, fercv ena identificrii hepatocitelor n sticl mat este suficient de mare sensibilitate 71,42% pentru a putea fi folosit n diagnosticul etiologic. A m analizat corelaia dintre prezena acestora i activitatea necroin flamatori e a hepatitei cronice; proporia de hepatocite cu aspect n sticl mat scade odat cu creterea activitii necroin flamatorii a hepatitei. A m an alizat proporia hepatocitelor n sticl mat n funcie de activitatea intralobular- nu se remarc nici o corelaie ntre prezena hepatocitelor n sticl mata i activitatea intralobular n cazul hepatocitelor VHB, VH B+VHC; pentru hepatitele VH B+VHD numrul acestora s cade odat cu creterea activitii intralobulare.

10.2.2 . Elemente s uges tive pentru etiologia VHC Am studiat frecv ena asocierii steatoz / leziuni du ctale / nodularitate n funcie de etiologie:

asocierea steatoz/ leziuni ductale/nodularitate este cea mai frecvent in h epatita cronic VH C.

10.3. CORELAII N TRE SEVERITATEA A FECTRII C LINIC E I AC TIVI TA TEA NECROINFLAMATORIE I STADIUL FIBROZEI

10.3.1 . Citoliza n hepa tita cronic VHB

20

Am studiat corelaia ntre modi ficrile biochi mi ce i parametri histopatologici ai hepatitelor co rnice postvirale VHB pe un lot de 212 cazuri consecutive (Fig.166 ). Singurul p arametru care a prezentat modi fi cri bio chimice i mportant e a fost citoliza. Pentru aprecierea acesteia am luat n calcul nivelul TGP i am cercetat aso cierea nivelelor s erice ale TGP cu leziunile necrotice i infl amatorii.

Nu se poate stabili o corel aie ntre nivelul TGP i activitatea necroinflamatori e au existat i cazuri cu activitate mi c i niveluri mari ale TGP (de exemplu Ani 6 i TGP peste 600), resp ectiv situaii cu ANI mare 12 (moderat) i TGP crescut la valori sub de trei ori normalul; ncercarea d e a stabili o medie, chi ar cu riscul de a ls a n afara corelaiei extremele (pe care le-am fi putut considera excepii de l a regul), nu condu ce la un rezultat. ncercrile de corel are cu parametri intrinseci ai activitii necroinflamatorii au dat de asemenea gre. Cele mai mari valori ale TGP se ntlnesc la pacientii cu hepatit de intrefa , rel ativ redus cantitativ2, pe cnd hepatita d e interfa continu, p este 50 % din peri feria spaiului port, se asociaz att cu valori mi ci al e TGP (121 UI/L de 1,5 ori no rmalul), ct i cu valo ri mari (1000 UI/L).

Necro za con fluent de tip necroz n punte bridging necrosis a fost prezent inclusiv la valori mod este ale TGP ( 121 UI/L), pe cnd cea mai mare valoare a TGP a fost ntlnit la un caz fr necroz con fluent; este evident i lipsa corelrii ntre citoliz i activitatea intralobular sau infiltratul in flamator port al.

10.3.2 . Citoliza n hepa tita cronic VHC Am studiat co relaia ntre nivelul TGP i paramet rii histopatologici ai hepatitelor cronice postviral e VHC, p e un lot de

214 cazuri consecutive (Fig .171). Nu se poate stabili o corelaie ntre nivelul TGP i activitatea necroin fl amatorie. Ca si n cazul in feciei VHB, au existat i cazuri cu activitate necroin fl amatorie mi c i niveluri mari ale TGP, respectiv situaii cu ANI mare i TGP la valori cvasinormal e. D e as emenea, ncercarea d e a stabili o medie, chiar cu riscul de a l sa n afara co relaiei ext remele (pe care le-am fi putut considera excepii de la regul), nu conduce la un rezultat. Singurul el ement oarecu m constant, pare a fi tendina de cretere paralel a nivelurilor TGP si activitatea necroin flamatorie, la valori foarte mari ale citolizeipeste 400500UI/L. Din nefericire, o multitudine de cazuri cu ANI moderat , au asociat niveluri ale TGP depind cu piin normalul, fcnd i mposibil o corel are biunivoc. Ca i n cazul VHB, ncercrile de corelare cu p arametrii intrinseci ai activitii necroinfl amatorii au dat de as emenea gre.

Fig. 166 Fig. 171

10.4. R OLU L C OMPONEN TEI APOPTOTICE N LEZIUNI LE HEPATOCI TAR E DIN HEPATI TA C RONIC VIRAL

Am studiat corelaia ntre apoptoz i activitatea intralobular n funcie de etiologie: n h epatita cronic VHB se observ creterea proporional a apoptozei odat cu creterea activitii intralobulare (Fig.178). n hepatita cronic VH C, p entru valori mi ci ale C de 0, 1 respectiv 2, cret erea apoptozei este mai mi c dect creterea Cpractic cu ct necroza hep atocitar i inflamaia intralobular cres c (constituind baza de cretere pent ru activitatea intralobular), cu att apoptoza hepato citar este mai rar . Pentru C mai mare de 3 apoptoza cret e cu creterea activitii intralobulare (Fig.179). n hepatita cronic VHB, C se observ creterea proporional a apoptozei odat cu creterea activitii intralobulare, cu observaia c apopto za este mult mai frecv ent la v alori mici ale activitii intralobulare. n hepatita cronic VH B,D la valori mi ci ale C (C=1 ) apoptoza este abs entactivitatea intralobular se datoreaz n ecro zei hepatocitare i inflamaiei intralobulare; ulterior, pent ru valori mari ale activitii intralobulare (C=24 ), apoptoza crete cu creterea C.

Fig. 178 Fig. 179

21

10.5. ELEMEN TE DE PR OGN OSTIC I R ELAIA CU TUMORIGENEZA ; LEZIUNI PRECANC EROASE Am studiat prezena leziunilor de tip modi ficri hepatocitare cu celule mari i displazia hepatocitar cu celule mi ci.

Acestea au fost prezente n 20, respectiv 27 de cazuri (1,69 %, respectiv 2,29 %). Modi ficrile hep atocitare cu celule mari au fost prezente exclusiv n hepatita VHB (+/- VHD) (P=1 x10-54 < 0,001), pe cnd displazia hepatocitar cu celule mici a fost mai frecvent n hep atita VHC (P=9x 10-6 < 0,001), (Fig. 182 ).

Am studiat repartiia n funcie de etiologie i activitatea necroin fl amatorie, respectiv fibro z: calculul statistic relev asocieri statistic semni ficative pentru modi fi crile h epatocitare cu celule mari, activitatea necroin flamatorie mare i infecia VH B (P=2 x10-27), respectiv VHB+VHD (P =1x10-5) precu m i p entru displazi a hepatocitar cu celule mici , activitatea necroin flamatorie redus i in fecia VH C (P=2 x 10-6) i respectiv VH C+VHB (P=6 x10-6), (Fig. 185 -186).

De asemenea, cal culul statistic relev asoci eri statistic semni ficative pentru modi ficrile hepato citare cu celule mari, gradul mare de fibroz i nfecia VH B (P=4x10-31), respectiv VH B+VHD (P =2x10-17) precu m i pentru displazia h epatocitar cu celule mi ci, gradul mare de fibroz i in fecia VHC (P =1 x10-18), VHC (P=0 ,01) i respectiv VHC+VH B (P=1 x10-212), (Fig. 189-190).

n lotul celor 5 cazuri de ci roz (pi ese necroptice) am obs ervat prezena de noduli displazici n dou situaii: ntr-un caz (etiologie VHB) cu doi noduli displazici; nodulii macroregenerativi au fost ncadrai drept noduli de tip I (am acceptat prezena modi ficrilor hepatocitare cu celule mari ntre criteriile de definire a nodulului displastic de tip I); n cellalt caz (etiologie VH C) am ntlnit un singur nodul displastic de tip II cu displazie hepatocitar cu celule mici i cu prezena unui micro focar de carcino m hepatocelular cu cretere nodul n nodul. n ambele cazuri menionate, n fi catul cirotic am identi ficat noduli de 3, respectiv 5 cm diametru , de carcinom hepatocelular trabecular i pseudogl andular, n ambele situaii cu grad jos de anaplazie G1 (carcino m hepatocelular bine di fereniat grad Edmonson 2). Lotul a fost prea mic pentru a putea trage vre-o con cluzie; totui, procedural, frecvena modi ficrilor hepatocelulare cu celule mari i displaziei hepatocelulare cu celule mici este de 20 % -oarecu m apropiat de frecv ena acestor modi fi cri n grupul paci enilor cu ciro z din lotul de 1179 d e cazuri studiate.

Fig. 182. Lezi uni preca nceroas e

Fig. 185 Fig. 186

Fig. 189 Fig . 190

CA P. 11. MODI FICRI ULTRA STRUC TURALE A LE CELULEI HEPATICE N HEPATI TELE CRONICE VIRA LE DE TIP B I C

11.1. EVIDE NE ALE REPLICRII VHB N HEPATO CITE I CELULELE NONPA RENCHIMA LE 11.1.1. Infecia o cult cu VHB n acest studiu am evid eniat distribuia virusului hep atitei B n biopsiile hepatice i n celulel e mononucl eare din

sngele peri feric (PBMC) de la p acienii cu hepatit cronic B i de la pacienii cu in fecie VHB o cult (ADN-VHB prezent n ser, n absena AgHBs). Caract eristicile clinice i histologice ale pacienilor sunt sumarizat e n t abelul 99 .

Tabel 99. Caracteristicile clinice i histologice ale pacienilor cu HCB i inf ecie ocult VHB .

Caracteristi ci I nfecie ocult HCB VHB (n=5) (n=5)

22

Vrsta medie (ani) . 45,31 37 ,80 Sex (masculin/ feminin). 3/2 4/1 Durata in feciei tiut 92,36 64 ,55 (media luni). ALT (medi a, UI/L) 105,03 92,30 Markeri VHB (nr.p aci eni) anti-HBc pozitiv 1 5 anti-HBc n egativ 4 0 Diagnoza histologic (nr.pacieni) modi ficri mini me 4 0 hepatit cronic 1 5

La pacienii cu in fecie ocult VHB avui n observaie am d escoperit c viremia a fost mai mic dect l a pacienii cu infecie cronic VHB. A ceast observ aie indic faptul c replicarea vi ral este foarte redus la p acienii cu in fecie VHB ocult iar p rocentajul celulelo r artnd semnalele de hibridizare a fost mai mi c n prob ele h epatice de la pacienii cu infecie ocult dect n biopsiile hepatice ale pacienilor cu hep atit cronic B (fig.191). Referitor la detecia histochi mic a AgHBs i AgHBc, ambel e antigene au fost detectate n probele de esut hepatic d e la pacienii cu hepatit croni c B dar nu i la pacienii cu infecie o cult. n in fecia hep atic ocult cu VHB, virusul este cap abil de replicare, d ar l a o rat sczut, dup cum s -a evideniat prin nivelele de viremie sczute det ectate la pacienii cu infecie VHB ocult avui n observaie. Dei VH B este capabil s infecteze i s se replice n PBMC, acest fapt nu a fost observ at dect la o p arte dintre p acienii cu in fecie ocult VH B. n ti mp ce AD N-VHB a fost detectat n PBMC la toi pacienii cu hep atit cronic B, n cazul pacienilor cu infecie VH B ocult genoamele virale au putut fi detectate la nivelul PBMC nu mai la 50 % dintre pacieni (fig.193). Aceasta s e poate datora viremiei mult reduse detectate la aceti paci eni co mparativ cu pacienii cu hepatit cronic B. La nivel celular, reticulul endoplasmi c joac un rol pri mordi al n asambl area proteinelor virale ale VHB n virioni. Utiliznd micros copia electronic de transmisie am putut evidenia proteinele virale n form globular (particul ele Dane) sau tubular (AgH Bs) care co exist n cisternele reticulului endoplas mi c (fig.194 ). Proli ferarea reticulului endoplas mic i nu mrul foarte mare de particul e AgH Bs con fer hep atocitelor in fectate cronic cu VHB aspectul de hepatocite n sticl mat, considerat o marc histologic ntlnit ntr-o proporie de 100% la p acienii cu hepatit cronic B.

Fig.191. Detecia ADN -VH B prin hibridizare in situ n biopsiile hepatice d e la un pacient cu HCB (a,c), un pacient cu infecie VHB ocult (b,d ), un control n egativ(e). Sgeile indic exemple de hepatocite cu semnale d e hibridizare. Contramarcare cu safranin . (a,b) x 200; (c-e) x 400.

23

Fig.193. Hibridizare f luorescent in situ a ADN-VHB n PBMC de la un pacient cu HCB (a), de la un pacient cu inf ecie VHB ocult (b) i de la un control negativ (c). Contramarcare cu DAPI. Mrimea original x 1 000.

Fig. 194. (a) particule core nucleare. (b) Particule Dane (capul sgeilor) coexistnd cu AgHB s (sgeata) n cisternele R.E. (c) AgHBs n R.E., n hialoplasm (sgeile) i ntre fibrele de colagen (capul sgeilor) n spaiul Disse. m-mitocondrii.

Modi ficri datorat e infeciei cronice VHB au fost observat e prin micros copie elect ronic i la nivelul nucleului hepatocitar, evideniindu-se un nu mr masiv d e p articule core; cromatina este disp ersat de particulele core, fapt ce con fer aparena d e nu clei nisipoi (fig . 194a).

11.2. EVI DENE ALE R EPLI CRII VHC N HEPA TOCITE, CELU LELE NON PAR ECHIMA LE I MATRI XUL EXTRAC ELULAR

11.2.1. Infecia o cult cu VHC n acest studiu a fost examinat exp resia co mponentelor VHC n hepato cite i n PBMC de la pacienii pozitivi pentru

anticorpi anti-VHC i cu ARN -VH C seric negativ. Tabel. 100. Caracteristicile clinice, virologice i histologice ale pacienilor cu inf ecie VHC. P anti ARN- Vrsta Sex Trat ALT/ Hist ARN- ARN- ARN- ARN- VHC VHC GGT VHC VHC VH C VHC seric +ficat -ficat +PBMC PB MC C E1 E2 1 + + 34 M + + + + + + + + + + 2 + + 24 M + + + + + + + + + + 3 + + 74 M + + + + + + + + 4 + 25 M + + + nd nd + 5 + 35 F + + nd nd + + 6 + 33 F nd nd + + 7 + 30 F + + nd nd + 8 + 62 M + + + nd nd + 9 + 25 M + + + + nd nd + 10 + 53 F + + + nd nd + + + 11 + 23 M + + nd nd + + + 12 + 28 F + + + + + nd nd nd 13 + 32 F + + + + + nd nd nd 14 + 34 M + + + nd nd nd 15 + 46 M + + + + + + nd nd nd 16 + 42 M + + + + + + nd nd nd 17 + 55 F + + + + nd nd nd 18 + 36 F + + + + + nd nd nd 19 + 39 M + + + nd nd nd 20 + 36 M + + + + nd nd nd 21 + 48 F + + + + + nd nd nd 22 + 54 F + + + + + + nd nd nd 23 + 55 F + + + nd nd nd 24 + 42