Post on 06-Feb-2018
transcript
1
RAPORTARE STIINTIFICA
Proiect 72-151/2008
NANOPARTICULE MAGNETICE FUNCTIONALIZATE PENTRU BIOSENSORI
RST - Raport stiintific si tehnic in extenso
CUPRINS
I. Obiective generale 2
II. Obiectivele etapei de executie 2
III. Rezumatul etapei 3
IV. Descrierea stiintifica si tehnica 5
IV.1. Introducere 5
IV.2 Obtinerea de vitroceramici cu proprietati magnetice din precursori vitrosi de tip
borosilicatic in vederea obtinerii de nanoparticule magnetice din Fe3O4, Fe2O3 6
IV.3. Caracterizare structurala 8
IV. 4. Morfologie 8
IV. 5. Spectroscopie Mössbauer 15
IV. 6. Magnetizare in curent alternative 20
IV. 7 Extragerea si conditionarea nanoparticulelor 24
IV.8. Investigatii prin microscopie de forta atomica. 26
IV.9. Iradierea cu radiatie gama a sticlelor precursoare 26
V. Introducerea de nanostructuri magnetice in MgB2 29
VI. Teste de functionalizare a nanoparticulelor magnetice in vederea
imobilizarii de substante biologic active (enzime si proteine) 33
VI.1. Introducere. Nanoparticulele magnetice. Aplicatii medicale 33
VI.2. Studiul privind functionalitatea unor suporturi nanocompozite pentru fixarea
diferitelor substante biologic active 35
VI.3. Imobilizarea diferitelor substante biologic active pe suporturi vitroceramice
39
VII. Rezultate experimentale 40
VII.1. Imobilizarea lipazei pe suporturi vitroceramice 40
VII.2. Imobilizarea tripsinei pe suporturi vitroceramice 45
VII.2.1. Materiale si metode 45
VII.2.2. Functionalizarea suportului vitroceramic BSF1 prin tratament cu
chitosan 48
VII.3. Imobilizarea acidului l-aspartic pe suporturile vitroceramice studiate 49
VII.4. Imobilizarea l-cisteinei pe suporturile vitroceramice studiate 53
VII.5. Concluzii 55
2
Bibliografie 56
Diseminare. Publicatii/Conferinte 60
I. Obiective generale
Obiectivul general al proiectului consta in valorificarea proprietatilor de
exceptie care apar la interfetele in interactie dintre materialel magnetice
nanostructurate si materia vie pentru fabricarea de mijloce in vederea biodetectiei
si biomanipularii. Proiectul are doua obiective specifice:
I. Producerea de precursori vitrosi cu proprietati magnetice, stimularea
proceselor de nucleatie si sinterocristalizarea acestora. Separarea nanoparticulelor
magnetice monodomeniale, selectarea lor dimensionala si tratarea lor in vederea
functionalizarii. Investigarea posibilitatii de realizare de sisteme cu arhitectura
dubla miez(magnetic)/camasa (nemagnetica) in vederea abordarii schemelor de
detectie duala optica si magnetica. Acest obiectiv presupune si efectuarea de
investigatii asupra stimularii nucleatiei prin iradiere gama.
II. Functionalizarea nanoparticulelor prin atasarea unui efector destinat unor
biomolecule tinta care sunt de interes in investigatii biomedicale. Avem in vedere
folosirea ca efector a annexinei V pentru fosfatidilserina ca receptor. Pe masura
dezvoltarii obiectivului se vor incerca si alte functionalizari cu tinta specifica.
II. Obiectivele etapei de executie
Obiectivul acestei etape il constituie conditionarea si functionalizarea
nanoparticulelor pentru biodetectie.
3
III Rezumatul Fazei
In Etapa IV a prezentului proiect a fost continuata caracterizara precursorilor
vitroceramici pentru intelegerea mai profunda a fenomenelor care au fost observat
in investigatiile precedent si care sa permita dezvoltari ulterioare ale metodei. In
acest sens s-au aprofundat investigatiile structurale care au confirmat datele
anterioare si s-a procedat la investigari de microscopie electronica de transmisie,
incluzand si difractia de electroni pentru confirmarea omogenitatii fazice a probelor.
Astfel s-a constatat ca probele mai bogate in Fe au tendinta spre formarea de
clusteri de nanoparticule indiferent de nucleator, pe cand la cele cu Fe redus (17.5
% Fe2O3) nucleatorul pe baza de Cr duce la formarea de nanocristale separate, bine
definite si uniform distribuite in masa vitroasa.
Un rezultat deosebit de valoros a fost dat de spectroscopia Mössbauer care a
evidentiat mecanismul care duce la formarea detaliilor de magnetizare la
temperaturi mai mici decat temperatura Verwey care a fost atribuit multor
mecanisme in trecut dar pentru care am reusit sa demonstram ca se datoreaza
relaxarii superpapramagnetice a cozii de distributie pe dimensiuni a nanoparticulelor
de magnetita.
Au fost efectuate de asemenea masuratori de susceptibiltate in curent
alternativ pentru caracterizarea proceselor dinamice legate de nanoparticule.
Acestea au relevat unele similitudini intre probele BSF 1 si BSF 5 precum si intre
probele BSF 3 si BSF 4. Este interesant ca datele de spectroscopie Mössbauer
confirma aceste similitudini in ceea ce priveste gradul aproape identic de populare a
al celor doua perechi, mai precis prima perche corespunde unei magnetite cu
pozitiile octaedrice complet ocupate in timp ce a doua pereche prezinta o sub
ocupare a a cestor pozitii (R=1.7).
Pentru aplicatii s-a studiat posibilitatea de extractie a magnetitei din matrice
vitroasa prin dizolvare in acizi.
Au continuat de asemenea investigatiile de microscopie de forta atomica.
Totusi estimam ca datele obtinute nu aduc informatii noi in cazul compozitelor
vitroceramice.
Efectul radiatiei gama (568 ore de iradiere) pare sa fie destul de sever si
duce la amorfizare suplimentara a probelor asa cum reiese din reducerea si chiar
disparitia histerezisului in masuratorile de magnetizare. Cele mai afectate sunt
probele cu granulatie mica.
O aplicatie suplimentara a constituit-o introducerea de nanostructuri
magnetice, fier incapsulat in carbon, in supraconductor de tip MgB2. Avantajul
acestei metode este dublu: pe de o parte din camasa exterioara a nanoparticulelor
se ia carbon care sa substituie borul si sa mareasca campul critic superior, iar pe de
alta parte camasa de carbon separa Fe metallic de matricea de MgB2 prevenind
interactia nedorita cu Fe care duce la formarea de boruri, deci la saracirea matricii
in bor. In plus nanoparticulele pot deveni centri pinning magnetic. Tranzitia normal-
4
supraconductor R(T) este ridicata, la 38.6 K la 38.3 K in functie de cantitatea de Fe.
Densitatea de curent critic a crescut pana la 1.1 MA/cm2 la 5 K si 1 T
Probele vitroceramice au fost apoi testate pentru imobilizarea unor enzime
ca: lipaza pancreatica, lipaza fungica din Aspergillus niger si tripsina pancreatica precum si a unor aminoacizi (acidul L-aspartic si L-cisteina).
Probele de suporturi vitroceramice provenite de la coordonator au fost
testate pentru imobilizarea unor enzime ca: lipaza pancreatica, lipaza fungica din
Aspergillus niger si tripsina pancreatica precum si a unor aminoacizi (acidul L-
aspartic si L-cisteina).
Metoda de imobilizare aplicata a fost aceea a adsorbtiei fizice, metoda
simpla, des utilizata in tehnicile de separare a produsilor prin cromatografia de
afinitate si in obtinerea biocatalizatorilor si a unor biosenzori. Pentru marirea
capacitatii de imobilizare a principiilor active pe acest tip de suporturi, s-a testat
functionalizarea lor prin tratare cu glutaraldehida, inainte sau dupa fixarea enzimei
pe suport, cat si prin cuplarea pe suprafata suportului a chitosanului urmata de
reticularea cu borohidrura de sodiu.
Metodele analitice aplicate au fost pentru determinarea activitatii enzimatice
a lipazei libere si imobilizate metoda titrimetrica, iar pentru activitatea enzimatica a
tripsinei metoda spectrofotometrica.
Rezultatele obtinute indica faptul ca in functie de tipul suportului (sticla
borosilicatica de baza, sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice si sticla
vitroceramica pe baza de cristale magnetice tratata chimic), si de tratamentul
aplicat, atat lipaza cat si tripsina se imobilizeaza cu diferite randamente.
Se constata ca lipaza pancreatica se imobilizeaza cu randamente ridicate pe
acest tip de suporturi, functie de durata adsorbtiei si tratamentul preliminar cu GA,
in timp ce lipaza fungica din Aspergillus niger prezinta randamente scazute.
In ceea ce priveste imobilizarea tripsinei pe acest tip de suporturi
randamentul aparent de imobilizare este de peste 99%, randamentul real fiind in
general mai scazut. Se constata ca acesta poate fi imbunatatit de pana la 11,6 ori
mai mare, in situatia in care suportul este activat prin tratarea cu GA 2,5%, urmat
apoi de adsorbtia enzimei.
Functionalizarea suporturilor vitroceramice prin tratament cu chitosan pentru
marirea capacitatii de fixare a tripsinei, indica faptul ca atat randamentul aparent
cat si cel real de imobilizare a tripsinei este mare, in situatia in care suportul este
activat in prealabil prin tratament initial cu GA.
Probele de suporturi testate prezinta de asemenea afinitate diferita pentru
aminoacizii testati, acidul L-aspartic si L-cisteina, datorita gruparilor functionale
diferite implicate in legaturile ce se formeaza intre suport si aminoacid.
5
Descrierea stiintifica si tehnica
IV. Conditionarea si functionalizarea nanoparticulelor
nanoparticulelor pentru biodetectie
IV. 1. Introducere
Cristalizarea sticlelor conduce la formarea unei clase speciale de
nanocompozite care constau din mici nanocristale inglobate intr-o matrice vitroasa.
Procesul de cristalizare ofera posibilitatea de obtinere de noi clase de materiale
nanostructurate in care proprietatile fazei nanocristaline pot fi modificate prin
alegerea nucleatorilor, a compozitiei oxidice a matricii vitroase si tratamente
termice [1-4]. Printre aceste compozite materialele vitroceramice cu faze cristaline
cu ordonare magnetic [3-6] prezinta interes special datorita unui camp extrem de
larg de aplicatii care se intinde de la dispozitive cu memorie magnetica
(vitroceramica este considerate ca materialul ideal 3D pentru memorii magnetice
datorita campului mare de coercitivitate) la medicina (hipertermie magnetica,
agenti de contrast pentru imagistica de rezonanta magnetica, magnetofectie,
biodetectie, etc). Aceasta gama larga de aplicatii este rezultatul flexibilitatii metodei
de producere de nanocompozite sticla-cristal care permite fabricarea de material cu
o mare varietate de forme, proprietati magnetice, si mecanice, durabilitate chimica
si biocompatibilitate.
In general aceste compozite se obtin pornind de la topitura unei sticle
polinare in care ingredientii sunt alesi cu grija. Aceasta presupune o alegere corecta
a compozitiei sticlei intrucat cei mai multi ioni magnetici se afla in topitura in mai
multe stari de valenta, iar fazele magnetice nanocristaline rezultate trebuie sa fie
aduse intr-o stare data de valenta. Este de asemenea importanta alegerea
nucleatorilor care controleaza procesul de formare si crestere a cristalitelor si a
procedurii concrete de treatment termic de cristalizare care are rol important in
dezvoltarea de faze magnetice uniform dispersate in matricea vitroasa.
Exista nenumarate materiale magnetice cu proprietati speciale obtinute sub
forma de nanocompozite vitroceramice cu proprietati magnetice dintre care
mentionam: feritele de litiu (LiFe5O8 [7]), BaFe12-2xTixCoxO19 [5, 8-10]) feritele de
calciu (Ca2Fe2O5 [11]), feritele de cobalt (CoxFe3-xO4 [12]), hexaferitele de bariu
(BaFe12O19) [13, 14], YIG (Y3Fe5O12) [15], SrFe12O19 [16] etc. Totusi, cele mai multe
investigatii s-au adresat magnetitei Fe3O4 care este unicul material acceptat pentru
aplicatii biologice in vitro.
Cand faza magnetica este magnetita, Fe3O4, problema raportului dintre
cationi este mai complexa intrucat presupune un echilibru precis intre ionii de fier
bivalent si trivalent, Fe2+ si Fe3+, pentru a obtine ocuparea perfecta a pozitiilor
6
octaedrice si tetraedrice. In general ambii ioni in topitura vitroasa exista in echilibru
cu oxigenul dizolvat fizic dar in echilibrul redox ar trebui introdusi si restul ionilor
prezenti in topitura. Din acest motiv au fost publicate numeroase rezultate asupra
comportarii fierului in sticla legate de termodinamica perechii redox [17-33]. La
temperature ridicate, starea redusa Fe2+ este favorizata in sticlele silicatice. In
sticlele boratice in schimb, procesul de reducere este si mai rapid datorita
vascozitatii mai reduse a acestor sticle la temperatura de topire care da
nastere unei convectii imbunatatite. In general oxizii de fier intra in reteaua
de sticla la concentratii rezonabile (sunt formatori de sticla) dar diferitele
valente prefea coordinatii diferite: ionul Fe3+ in sticla prefera coordinatiile
tetraedrice (FeO4) in timp ce ionul Fe2+ intra in coordinatie octaedrica (FeO6).
Diversi aditivi care au proprietati de formatori pot intra in competitie cu una din
cele doua stari de valenta prin coordinatia pe care o suporta. Un alt aspect apare
din faptul ca, pentru obtinerea de cantitati mari de particule de magnetita
nanocristalina, este necasara o concentratie de volum de Fe mai mare.
In acest proiect am utilizat sticle borosilicatice cu continut ridicat de Fe care
au fost supuse cristalizarii prin utilizarea Cr2O3 si a P2O5 ca nucleatori impreuna cu
Al2O3 and MgO2 in calitate de intermediator si repectiv modificator pentru
producerea de vitroceramici pe baza de magnetita din care ulterior am separat
magnetita pentru aplicatii. Este vorba de o magnetita speciala care sa aiba si o
camasa silicatica.
IV.2 Obtinerea de vitroceramici cu proprietati magnetice din
precursori vitrosi de tip borosilicatic in vederea obtinerii de nanoparticule
magnetice din Fe3O4, Fe2O3
Sticlele borosilicatice au fost fabricate dupa retetele prezentate in raportarile
anterioare (RIA faza 2/2009) din cantitati corespunzatoare de SiO2, H3BO3, Na2CO3
si Fe2O3 with nucleators (Cr2O3 sau P2O5) si mici cantitati de MgO or Al2O3. Nu
insistam asupra tehnologiei, care a fost prezentata pe larg, dar pentru o buna
intelegere redam tabelul cu datele compozitionale ale sticlelor utilizate la cristalizare
si transformare in vitroceramici pe baza de magnetita, date care sunt prezentate in
Tabelul 1. De notat ca proba BSF2 a fost eliminata din investigatii datorita
proprietatilor necorespunzatoare si a neuniformitatii in distributia si a fost inlocuita
cu proba BSF2a cu acelasi continut de Fe.
Alegerea nucleatorilor s-a bazat pe testarea a doua mecanisme diferite de
actiune. Cromul are o solubilitate rezonabila in topitura de sticla in care prezenta
sodiului favorizeaza starea de oxidare cea mai inalta Cr6+ in prezenta oxigenului
[34]. La scaderea temperaturii solubilitatea scade in timp ce intensitatea campului
imbunatateste rearanjarea structurii vitroase cu formarea de spineli pe baza de Cr
care devin nucleele ulterioare pentru cresterea de cristalite [35,36]. Fosforul este
7
un formator de sticla in care fiecare atom de fosfor este legat de un tetraedru de
oxigen din care unul formeaza o legatura terminala dubla P = O. Totusi, cand este
inserat intr-o sticla borosilicatica, in coordinare tetraedrica, diferenta de sarcina
dintre Si4+ si P5+ duce la separarea fosforului in combinatie cu un metal alcalin.
Legatura dubla P = O favorizeaza astfel formarea de faze fosfatice in reteaua
silicatica si astfel care duce la tendinta spre cristalizare [37].
Tabelul 1 PArametrii compozitionali si de process ai probelor vitroceramice
magnetice
Proba Composition Process parameters
Compozitia
de start
(wt%)
Nucleato
r
(wt%)
Intermedi
ant /
modifier
(wt %)
Temperatura
de topire (C)
/ timp (h)
Temperat
ura de
turnare
(C)
Temperat
ura de
tratament
termic
(C)/timp
(h)
BSF1 26.8B2O3
6.4Na2O3
17.5Fe2O3
47SiO2
0.5Cr2O3 1430/3 1400 560/2
BSF2a 26.8B2O3
6.4Na2O3
17.5 Fe2O3
43.5 SiO2
0.5Cr2O3 3.5Al2O3 1480/2.5 1470 560/8
BSF3 26.8B2O3
6.4Na2O3
17.5Fe2O3
46.5SiO2
1P2O5 1480/2.5 1470 560/2
BSF4 26.8B2O3
6.4Na2O3
24.5Fe2O3
36.5SiO2
0.5Cr2O3 3.5Al2O3 1480/2.5 1470 560/6
BSF5 26.8B2O3,
6.4Na2O3
24.5Fe2O3
39.5SiO2
1P2O5 1480/2.5 1470 560/2
8
IV.3. Caracterizare structurala
Pentru analiza structurala s-a folosit o instalatie de difractie de raze X tip
Bruker-AXS-D8 Advance cu radiatie Cu K si detector liniar de mare eficienta de tip
Lynx Eye. Probele au fost scanate in domeniul 15 – 100o, cu pas de 0.03 si timp de
inregistrare de 6 s pe pas. Fitarea dateleor s-a facut prin metoda Rietveld folosind
programul TOPAS V3: General profile and structure analysis software for powder
diffraction data. Profilul liniei instrumentale s-a determinat folosind pulbere tratata
termic de CeO2, testate ca sa nu aibe largimi suplimentare detectabile datorita
tensiunilor. Fondul amorf a fost aproximat din cele trei maxime largi situate la 23o,
45o si 60o, fitate pentru pozitie, arie si largime pentru fiecare proba. Gradul de
cristalinitate s-a determinat ca raportul dintre intensitatea fazei cristaline si
intensitatea totala. Datele de difractie sunt prezentate in Fig. 1.
Datele de difractie arata ca magnetita este faza dominanta sau unica in toate
probele (Fig. 1) cu mici cantitati de -Fe2O3 prezenta in proba BSF-1. Probele
obtinute cu Cr2O3 prezinta un grad de cristalinitate mai mare de 50 % care creste
cu cresterea cantitatii de Fe. Mai precis creste de la 52.4% in BSF-1, la 73.1% in
BSF 4. Desi P2O5 s-a dovedit a fi faza cu gradul cel mai ridicat de puritate
structurala (vezi studiile de spectroscopie n ucleara gama) este mai putin efficient
in formarea de probe cristaline. Ca si in Cr2O3, gradul de cristalinitate creste cu
continutul de Fe de la 38.2 % in cazul probei BSF-3 la 45.1% pentru BSF-5. Analiza
semilargimii maximelor de difractie arata ca nucleatorul pe baza de Cr2O3
favorizeaza cresterea de garaunti mari: 121; 77, 79 nm probele BSF-1, BSF2a si,
respectiv, BSF-4.
IV. 4. Morfologie
Datele de microscopie electronica au fost obtinute cu un microscop electroni
ce transmisie JEM 200CX TEM/SCAN. Micrografiile TEM arata ca in aceste probe sunt
doar graunti de magnetita. Datele TEM confirma datele de difractie dar furnizeaza
mai multe detalii asupra morfologiei interne a grauntilor cristalini cu diferente
majore intre cei obtinuti prin Cr2O3 si cei obtinuti via P2O5. Dimensiunea grauntilor
obtinuti prin aceasta metoda directa sunt ceva mai mici decat cea determinata din
difractie. Probele obtinute prin Cr2O3 au cristalite mai mari si uniform distribuite in
matricea vitroasa. De altfel din a cest punct de vedere cel mai bine se prezinta
proba BSF-1 cu monocrisatlite de magnetita bine formate si bine definite (Fig. 2).
Difractia de electroni arata ca proba este monofazica (Fig. 3).
Pe aceasi proba s-au obtinut si imagini de difractie de electroni
retroimprastiati (Fig. 4)
9
Fig. 1. Difractogramele probelor vitroceramice cu continut de magnetite
obtinute prin cristalizarea unei topituri de sticla borosilicatica cu continut de fier.
10
Fig. 2. Micrografie TEM pe proba BSF1 (nucleator Cr2O3)
Fig. 3. Difractograma de electroni pe proba BSF1. Spoturile indexate apartin
magnetitei.
11
Fig. 4. Imagine de microscopie de difractie de electroni retroimprastiati pe Proba
BSF-1
La cresterea cantitatii de fier inclus in proba de la 17.5 la 24.5 % (in procente de
Fe2O3) are loc o modificare structurala a grauntilor prin micsorarea lor si
aglomerarea in entitati mai mari cu suprafata mai dezordonata (Fig. 5). SI in acest
caz difractia de electron arata ca avem o singura faza: Fe3O4 (Figura 6).
In cazul probelor obtinute cu P2O5, probele prezinta clusteri de nanocristale
incepand cu concentratiile mici de fier (Fig. 7). Proba contine doar cristalite de
magnetita dupa cum arata difractia de electroni (Fig. 8) dar cu dimensiune medie
mult mai mica decat a celor din aglomerarilor produse de Cr2O3 (vizibile in proba
bogata in Fe, BSF-4) mai precis dimensiunea medie este de nm pentru proba BSF-
3. Proba BSF-5cu 24.5% Fe2O3 are o granulatie si mai fina si graunti mai mici (Fig.
9) de dimensiune 26 nm, iar nanoparticulele sunt numai magnetita (Fig. 10).
12
Fig. 5 Micrografie TEM pe proba BSF4 (nucleator Cr2O3)
Fig. 6. Difractograma de electroni pe proba BSF4. Spoturile indexate apartin
magnetitei.
13
Fig. 7 Micrografie TEM pe proba BSF3 (nucleator P2O5)
Fig. 8. Difractograma de electroni pe proba BSF3. Spoturile indexate apartin
magnetitei.
14
Fig. 9. Micrografie TEM pe proba BSF5 (nucleator P2O5)
Fig. 10. Difractograma de electroni pe proba BSF5. Spoturile indexate apartin
magnetitei.
15
IV. 5. Spectroscopie Mössbauer
Experimentele de spectroscopie nucleara gama (Mössbauer) au fost facute
atat la temperatura camerei, iar datele au fost deja prezentate in raportul anterior,
cat si la temperaturi intre 4.5 si 120 K iar datele sunt prezentate in continuare.
Pentru experimentare s-a folosit un spectrometru cu acceleratie constanta cu unda
de forma triunghiulara. Sursa folosita a fost 57Co(Rh) la care s-a asociat un contor
proportional cu xenon. Spectrele au fost fitate cu pachetul de programe NORMOS
[38] cu deplasarea izomerica raportata la -Fe la temperatura camerei.
Cel mai bun fit a fost obtinut prin prelucarea cu 6 subretele la temperaturi
scazute (sub 90 K) si cu 4 subretele la temperature mai ridicate (peste 100 K).
Diferenta provine de la faptul ca magnetitei mai bine formate I s-au atribuit, la
temperature joase, 4 subretele magnetice, in timp ce la temperature ridicate, I s-au
atribuit numai 2 subretele. Temperatura de trecere intre aceste configuratii (intre
90 K si 100 K) trebuie sa corespunda tranzitiei Verwey, a.i. semnificatia
subspectrelor magnetice este urmatoarea: sub tranzitie, pozitiile tetraedrice si
octaedrice pot fi ocupate de ioni de Fe2+ si Fe3+ distincti, rezultand astfel o
distributie mai larga de campuri hiperfine (in acest caz, 4 valori), in timp ce peste
temp de 100 K, activarea termica a delocalizarii termice conduce la ocuparea celor
doua pozitii, de catre ioni cu valenta intermediara (fiecare subretea magnetica, fiind
legata numai pe pozitia cristalografica ocupata de ionii de Fe). Cea de a doua
observatie se refera la componentele paramagnetice ale spectrelor (exista 2
componente, una atribuita ionilor de Fe3+ si alta, ionilor de Fe2+).
Spectrele Mössbauer ale probei BSF-4 obtinuta cu nucleatorul Cr2O3 sunt
prezentate in Fig. 11. Ele au fost achizitionate la temperature crescatoare, intre 5 K
si 130 K. In acest caz, componenta superparamagnetica (atribuita Fe3+) este
aproape neglijabila, in domeniul de temperaturi de la 5 K la 130 K.
In cazul probei BSF 5, se observa ca acea componenta atribuita ionilor de
Fe3+ creste sensibil in pondere la temperatura de 30 K (Fig. 12) ceea ce conduce la
idea atribuirii ei unei tranzitii superparamagnetice (existenta unei distributii de
dimensiuni a nanoparticulelor de magnetita implica si prezenta unor particule de
dimeniuni foarte mici, de 2-3 nm care se relaxeaza deja sub 30 K). Ca urmare, cele
2 tranzitii magnetice vor fi evidentiate si in curbele de magnetizare in functie de
temperatura M(T). Acestea pot fi atribuite astfel: cea de sub 40 K corespunde unei
tranzitii superparamagnetice, iar cea de la aprox 100 K, tranzitiei Verwey.
O situatie similara se observa si pentru proba BSF 3 (Fig. 13). Deosebirea
dintre cele 2 probe, consta in special in diferenta de pondere a componentei
superparamagnetice (la peste 30 K), aceasta fiind mult mai accentuata in proba
BSF 5 (in care datele TEM arata prezenta de graunti mai mici).
16
Fig. 11. Spectre Mössbauer pentru vitroceramica BSF4 masurata intre 5 si 130 K.
17
Fig. 12. Spectre Mössbauer pentru vitroceramica BSF5 masurata intre 5 si 120 K.
18
Fig. 13. Spectre Mössbauer pentru vitroceramica BSF3 masurata intre 5 si 120 K.
Tinand cont de cele mentionate mai sus, tranzitia de la 40 K, ar trebui sa fie din ce
in ce mai slaba, in ordinea proibelor BSF5, BSF 3 si BSF 4. Pentru toate probele se
observa tranzitia Verwey in jur de 100 K.
Reamintim ca la temperatura camerei (cf. RSI 3), analiza datelor arata ca
proba BSF-1 are o structura ocupationala apropiata de cea a magnetitei ideale cu o
19
usoara subpopulare a pozitiilor tetraedrice (R > 1) Proba BSF-3, are un raport de
ocupare R = 1.7 si un camp hiperfin Hhf = 45.8 T, valori consistente cu o
subpopulare a pozitiilor octaedrice dar in care ionii di- si trivalenti sunt distribuiti in
mod egal in pozitiile subretelei octaedrice.
La probele cu continut ridicat de Fe situatia este dependenta de nucleator.
Astfel proba BSF-4 are raportul R = 1.7 si campul hiperfin apropiat de valoarea
teoretica Hhf = 46.1 T fapt care sugereaza un grad de ocupare a celor doua pozitii A
si B similara cu cea din cazul precedent. In timp ce proba BSF-5 are o structura
ocupationala a pozitiilor tetraedrice si octaedrice ideala corespunzand unei
magnetite bine structurate din acest punct de vedere.
Dubletii paramagnetici arata ca 16% din cantitatea de ioni de Fe ramane
dispersat in cazul probei BSF-1. In cazul probei BSF-3, procentul de Fe cu raspuns
paramagnetic este de 25 % din care, conform parametrilor hiperfini, 22% din ioni
sunt in coordinatie tetraedrica ca Fe3+ si doar 3% este in coordinatie octaedrica ca
Fe2+. Din punctul de vedere al recuperarii fierului, proba BSF-4 prezinta doar 10%
din ionii de Fe ramasi dispersati in matricea vitroasa, majoritatea ca Fe3+. In sfarsit,
notam ca proba cea mai buna din punct de vedere structural BSF-5 are si cea mai
mare parte de fier cu raspuns paramagnetic 41 %.
Datele de masura la temperatura camerei sunt prezentate in Tabelul 2.
Tabelul nr. 2. Datele de spectroscopie Mössbauer
proba Componenta*
Deplasare Isomerica
(mm/s)
Despicare cuadrupol
(mm/s)
Bhf (T)
Largime de linie
(mm/s)
Arie relativa
(%)
BSF-1 S1 (T) 0.29 0.0 49.1(5) 0.28 26
S2(O) 0.66 0.0 45.9 0.49 58
D1 1.28 2.5(9) - 0.67 6
D2 0.72 2.0(4) - 0.81 10
BSF-4 S1 (T) 0.28 0.0 49.2 0.34 32
S2(O) 0.66 0.0(2) 46.0 0.49 56
D1 0.28 0.70 - 0.82 12
BSF-3 S1 (T) 0.29 0.0(0) 48.9 0.32 28
S2(O) 0.66 0.0(0) 45.8 0.42 46
D1 0.42 1.0(2) - 0.80 22
D2 0.83 2.5(7) - 0.31 3
BSF-5 S1 (T) 0.30 0.0(0) 48.7 0.34 19
S2(O) 0.65 0.0(1) 45.6 0.53 39
D1 0.34 1.0(0) - 0.70 32
D2 0.88 2.4(3) - 0.95 9
*S1 (T): sextet / coordinare tetraedrica; S2(O): sextet / coordinare octaedrica; D1,
D2 dubleti paramagnetici
20
IV. 6. Magnetizare in curent alternativ
Dinamica nanoparticulelor magnetice asa cum este ea reflectata in datele de
susceptibilitate magnetica ’(T) si ”(T) au fost determinate cu ajutorul unui
magnetometru cu SQUID de tip MPMS (Quantum Design). Datele au fost colectate
prin incalzire de la 5 la 150 K. Pentru comparatie, vom prezenta si datele de
magnetizare satatica.
Fig. 14. prezinta datele de magnetizare pentru proba BSF1: Fig. 14a prezinta
datele de magnetizare in curent alternativ masurate la frecvente cuprinse intre 30
si 1030 Hz, iar figura 14b datele de magnetizare specifica masurate in curent
continuu. Susceptibilitatea in curent alternative prezinta maxime atat pentru ’(T)
cat si pentru ”(T) si toate se deplaseaza la temperaturie mai mari cu cresterea
frecventei asa cum apare si in alte cazuri raportate in literatura [39]. Totusi
deplasarea maximului larg al partii reale a susceptibilitatii ’(T) este prea mic
pentru a fi atribuit vreunui proces activat. In consecinta acest maxim nu poate fi
atribuit temperaturii de blocare ci mai degraba temperaturii Verwey TV (90.4 K la 30
Hz). De notat ca datele de difractie si de microscopie arata ca aceasta proba are
cristalite destul de mari, cca 120 nm. In jurul probei de 23 K este prezent un umar,
vizibil in partea imaginara a susceptibilitatii ”. Bałanda et al. [40] considera ca fiind
rezultatul proceselor electronice care apar in urma relaxarii de domenii (tunelare
incoerenta intre Fe+2 si Fe+3 sau excitari ale starii Fe+2). Datele de spectroscopie
Mössbauer arata insa ca acest umar este mai degraba un fenomen de relaxare a
particulelor superparamagnetice din coada de distributie dimensionala.
Analiza dependentei de frecventa in termeni de activare (Arrhenius) conduce la un
timp de proba extrem de mic 0 10-23 s in comparatie cu datele din literatura [41].
Proba BSF3 prezinta o tranzitie Verwey foarte bine precizata atat in datele de
curent alternativ cat si in magnetizarea statica (Fig. 15 a si b). Temperatura Verwey
este bine definite la 122 K in concordanta si cu datele de spectroscopie Mössbauer.
O a doua tranzitie este bine precizata la 39 K unde componenta disipativa ”
prezinta un maxim. De notat ca dependneta de frecventa este neglijabila.
Proba BSF4 prezinta si ea o tranzitie Verwey bine definite la TV = 116 K
masurata la 30 Hz dar frecventa este tot slaba ca si in cazul precedent (Fig. 16). ”
scade in amplitudine cu cresterea frecventei ca si in cazul probei BSF-3. In acelasi
timp, umarul de la temperaturi joase evolueaza intr-un maxim (21.12 K la 30 Hz).
Un al doilea umar este vizibil la temperaturi mai ridicate (85 K la 30 Hz). De notat
ca datele de spectroscopie Mössbauer arata subocupari identice ale pozitiilor
octaedrice pentru BSF 3 si BSF 4 (R= 1.7).
21
a
b
Fig. 14. Proprietatile magnetice ale probei BSF1: a) susceptibilitatea in curent
alternativ masurata la frecvente intre 30 si 1030 Hz; b) magnetizarea specifica
masurata la 50 Oe.
a
b
Fig. 15. Proprietatile magnetice ale probei BSF3: a) susceptibilitatea in curent
alternative masurata la frecvente intre 30 si 1030 Hz; b) magnetizarea specifica
masurata la 50 Oe.
22
Proba BSF5, care are cristalitele cu cele mai fine nanocristale (26 nm)
prezinta tranzitia Verwey la TV = 112 K (la 30 Hz). Este interesant ca ” este foarte
larg cu maximul la o temperatura ceva mai mica decat TV adica la 104 K (la 30 Hz)
si amplitudini crescatoare cu frecventa (ca in cazul probei BSF-1). Dimensiunea de
graunti sugereaza faptul ca nanocristalitele sunt monodomeniale fiind sub limita de
extensie a domeniului. [42], unde A este constanta de
rigiditate de schimb, iar ms magnetizarea de saturatie. Pentru aceasta compozita
datele de spectroscopie Mössbauer sunt consistente cu o magnetite cu grad de
ocupare aproape perfect cu R = 2. De notat ca proba BSF1 cu R = 2.1, prezinta, in
mod similar, o crestere cu cresterea frecventei a amplitudinii maximului
componentei imaginare ”.
De notat ca magnetizarea specifica la tranzitia Verwey variaza destul de
consistent intre probele la care nucleatorul este Cr2O3 fata de cele la care
nucleatorul este P2O5.
a
b
Fig. 16. Proprietatile magnetice ale probei BSF4: a) susceptibilitatea in curent
alternative masurata la frecvente intre 30 si 1030 Hz; b) magnetizarea specifica
masurata la 50 Oe.
23
a
b
Fig. 17. Proprietatile magnetice ale probei BSF5: a) susceptibilitatea in curent
alternative masurata la frecvente intre 30 si 1030 Hz; b) magnetizarea specifica
masurata la 50 Oe.
Si aceasta dependenta se poate explica prin datele de spectroscopie
Mössbauer. Daca consideram fractia de ioni de fier care ramane sub forma
paramagnetica, rezulta ca, in cazul probelor BSF3 si BSF5, cantitatea de magnetita
care da rapunsul magnetic este mult mai redusa. O reprezentare a magnetizarii
specifice raportata la continutul total de Fe mFe in functie de fractia de fier
paramagnetic asa cum rezulta din datele hiperfine, se observa o scadere monotona
a acesteia cu cresterea cantitatii de Fe paramagnetic (Fig. 18). Prin urmare, proba
BSF-5 cu cea mai mare fractie de Fe paramagnetic, x = 41 %, prezinta cea mai
mica valoare a mFe in timp ce proba BSF-4 cu cel mai mic continut de ioni de Fe in
stare paramagnetica prezinta cea mai mare valoare a mFe. Abaterile de la liniaritate
pot fi puse pe faptul ca popularea subretelor octaedrice (in principal) este
insuficienta in cazul probelor BSF3 si BSF 4.
24
Fig. 18. Dependenta magnetizarii specifice raportata la cantitatea totala de ioni de
Fe mFe in functie de fractia de ioni paramagnetici de Fe.
IV. 7 Extragerea si conditionarea nanoparticulelor
Prin tratament termic de cristalizare sticlele bazate pe compozitii
chimice in sisteme borosilicatice pot prezenta o separare in faze mai bogate
in SiO2 respectiv in R+, B2O3 alaturi de cristalele dezvoltate in natricea
vitroasa initiala. Ultima faza este relativ solubila in diferite medii de solventi,
inclusiv acizi minerali ( HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4) iar in atare conditii, prin
atac chimic, precipitatul rezultat poate contine faza insolubila bogata in SiO2
(amorfa sau partial cristalizata) si faza cristalina specifica. Prin atac chimic
se urmareste indepartarea fazei solubile nesilicioasa si a fazelor cristaline
neincorporate in faza de SiO2 de ex. faze cristaline pe baza de Fe2O3. O
temperatura putin peste TG este necesara pentru a permite mobilitate in
interiorul fazei vitroase in vederea cresterii fazei cristaline. Este de
asemenea posibil ca alte cristale fata de cele magnetitice, dorite pentru
structura cristalizata, sa fie dezvoltate in matricea vitroasa,pe durata racirii
topiturii sau cea a tratamentului termic de cristalizare. De exemplu, faze
nonmagnetice secundare, de tipul hematitei (α-Fe2O3) pot fi generate, dupa
cum rezulta, in cantitati nesemnificative, din rezultatele dr difractie de raze X
pentru unele probe. Pentru compozitii de baza in sisteme borosilicatice poate
rezulta si o faza cristalina bogata in SiO2, de ex. cristobalit. Cresterea
25
cristalelor pe durata cristalizarii determina corespunzator reducerea fazei
vitroase deoarece constituentii fazei cristaline sunt separati de compozitia
amorfa. Chiar si in conditiile unei cristalizari masive, cel putin o parte din
fazele care contin fier sunt incorporate (imbracate, invelite) in faza bogata in
SiO2 chiar daca este predominant cristalina [43]. Proportia si tipul fazelor
dezvoltate pe durata racirii topiturii si a tratamentului termic de cristalizare
depinde de: compozitia sticlei de baza, metoda de racire a topiturii si
parametrii tratamentului termic aplicat sticlei de baza. Chiar si pentru
aceeasi compozitie a sticlei de baza, tipul, proportia si dimensiunea
cristalitelor depind de istoria termica care cuprinde topirea, formarea si
tratamentul ulterior de cristalizare.
Probele de sticla BSF au fost supuse tratamentelor chimice de
solubilizare a fazei boratice, bogata in R+, B2O3. Pulberea vitroceramica
adusa la granulatie sub 40 microni a fost tratata chimic cu solutie 3N HNO3
prin imersie timp de 3 h la 1000C urmata de spalari repetate cu apa distilata
si sonificare. In etapa a 2 a pulberea se introduce in solutie 1,25 N NaOH cu
palier de mentinere intre 30-90 min la temperatura camerei urmata de
spalare repetata in apa distilata pana la obtinerea unui pH <8. Prin
seeparare magnetica s-a urmarit obtinerea mostrelor cu faza cristalina
bogata in SiO2 si Fe3O4.
Comportarea probelor de pulbere a fost diferita pe durata atacului
chimic. In cazul probelor BSF2a si BSF5 a rezultat un precipitat de culoare
neagra, bine delimitat si decantat la spalare in apa distilata (ramasa limpede
la suprafata) dupa atac acid/baza. Celelalte probe au prezentat o tenta
rosiatica specifica hematitei iar separarea in solutia de spalare s-a facut cu
dificultate (solvent tulbure). Figura 19 prezinta difractograma pulberii
obtinuta prin acest procedeu din proba BSF2a care arata fara indoiala
existenta doar a magnetitei ca produs final.
26
Fig. 19. Difractograma de raze X a unei nanoparticulelor extrase din proba
BSF2a prin tratament chimic de dizolvare a amatricii vitroase.
IV.8. Microscopia de forta atomica (AFM)
Investigatii de microscopie de forta atomica au fost efectuate pe proba BSF3
si pe BSF4 folosind un microscop AFM de tip MultiMode NanoScope IIID Controller
(Digital Instruments Veeco Metrology Group, Santa Barbara, CA, USA). Scanarea s-
a facut in modul de contact intermitent la o frecventa de 300 kHz la temperatura
camerei iar imaginile de toptografie a suprafetei a fost obtinuta cu o rezolutie de
256x256 pixeli si o frecventa de 0.5 Hz. Pentru prelucrarea imaginilor s-a folosit
softul NanoScope (531r1). Datele de microscopie de forta atomica sunt prezentate
in Figurile 20 si 21.
a) Proba BSF3. Figurile 20 a si b prezinta imagini tridimensionale ale
suprafetei probei luate in doua moduri diferite: direct si unghiular.
Figurile 21a si 21b prezinta imagini tridimensionale ale suprafetei probei
BSF4 luate in doua moduri diferite: direct si unghiular.
IV.9. Iradierea cu radiatie gama a sticlelor precursoare
Probele vitroceramice au fost supuse iradierii gama la iradiatorul IRASM de la
IFIN-HH. Durata tratamentului a fost de 568 de ore. Cutia de probe a fost plasata
pe masa de iradiere, langa conveior, intr-o geometrie stationara la distanta de cca
27
125 cm de sursa de 60Co. Pentru masurarea dozei absorbite de probe a fost plasat
un dozimetru ECB (B 3016) in cutia de probe, intr-o pozitie de doza medie pentru
geometria de iradiere utilizata. Dozimetrul a fost scos si masurat dupa 49h50 min
de iradiere. Pentru estimarea dozei totale absorbite, s-au insumat timpii de iradiere
corespunzatori fiecarei luni de expunere, iar debitul dozei absorbite calculat a fost
corectat lunar scazandu-l cu 1,011%. Sistemul dozimetric de masura a fost de tip
ECB (IRASM, lot B0 –cu trasabiitate la Risø-HDRL si NPL Anglia (cert. 06C-50)
a
b
Fig.20 Imagine AFM asupra probei BSF3. a) aspect general; b) Imagine unghiulara
de faza si de inaltime
a
b
Fig.21 Imagine AFM asupra probei BSF4. a) aspect general; b) Imagine
unghiulara de faza si de inaltime
Doza absorbita: Conform masuratorilor dozimetrice efectuate (Buletin ECB
22/09.02.2009) debitul dozei absorbite in perioada 28.01.2009-08.02.2009,
evaluata cu un nivel de incredere de 95% este D=(61.74.4) kGy la un debit de
28
Debit (1.3120.094) kGy/h. Prin urmare in cazul probelor de vitroceramica
magnetica doza totala absorbita, evaluata cu un nivel de incredere de 95 % este
Dtotal = (66847) kGy.
Iradierea se realizeaza pe baza unor proceduri de lucru specifice tipului de
iradiator, proceduri elaborate in cadrul sistemului de asigurare a calitatii de catre
responsabilul cu managementul calitatii din compartimentul respectiv.
Dupa iradiere probele au fost stocate cateva saptamani la temperatura camerei
si apoi s-au prelevat esantioane pentru masuratori magnetice. Datele de masura
sunt prezentate in Figurile 22-24.
Se observa ca probele la care s-a folosit Cr2O3 in calitate de nucleator sufera o
reducere in dimensiunea de graunti fara insa sa le aduca in stare
superparamagnetica (Fig. 22 pentru BSF1 si 24 pentru BSF-4). Proba BSF1 care
initial are graunti mari are si histerezisul mai dezvoltat astfel incat s-a putut
determina si campul de coercivitate (Fig.23).
Fig. 22. Curbele de histerezis pentru
proba BSF-1 iradiata gama masurata
intre 2 si 120 K
Fig. 23. Dependenta de temperatura a
magnetizarii probelor iradiate si
neiradiate de vitroceramica BSF-2
In cazul probelor la care nucleator a fost P2O5 alterarile sunt serioase si proba
este practic superparamagnetica la temperaturi foarte joase (6K) (Fig. 25).
Cresterea continutului de Fe conduce la reaparitia histerezisului (Fig. 26).
29
Fig. 24. Dependenta de temperatura a
magnetizarii probelor BSF-4 iradiate gama
Fig. 25. Dependenta de temperatura a
magnetizarii probelor BSF-3 iradiate gama
Fig. 26. Dependenta de temperatura a magnetizarii probelor BSF-5 iradiate gama
V. Introducerea de nanostructuri magnetice in MgB2
In incercarea de a extinde aplicatiile nanostructurilor cu proprietati magnetice am
testat efectul acestora asupra proprietatilor MgB2 in speranta imbunatatirii
30
pinningului prin adaugarea mecanismului de pining magnetic. In acest scop s-au
adaugat la MgB2 nanoparticule de fier incapsulat in carbon (FIC) si apoi s-a
procedat la sinterizare prin metoda plasmei de scanteie (spark plasma sintering-
SPS). S-au obtinut astfel nanocompozite supraconductoare. Avantajul acestei
metode este dublu: pe de o parte din camasa exterioara a nanoparticulelor se ia
carbon care sa substituie borul si sa mareasca campul critic superior, iar pe de alta
parte camasa de carbon separa Fe metalic de matricea de MgB2 prevenind
interactia nedorita cu Fe care ar duce la formarea de boruri, deci la saracirea
matricii in bor [44], si de asemenea pot deveni centri pinning magnetici [45].
Probele s-au fabricat prin amestecul de FIC si MgB2 si ulterior sinterizarea lor prin
SPS. Pulberea de FIC a fost obtinuta la INFLPR prin decarbonoilarea secventiala a
Fe(CO)5 prin piroliza laser [46]. Nanoparticulele astfel obtinute au un miez de -Fe
imbracat in cateva straturi de grafit. S-au fabricat trei tipuri de probe cu diferit
continut de fier metalic: 0.35 wt % (MFC-03), 0.6 wt % (MFC-06), si 1.0 wt %
(MFC-10). Probele au densitate ridicata comparativ cu cele preparate prin
sinterizare clasica. Mai precis, daca densitatea ideala a monocristalului este 0 =
2.62 g/cm3 atunci densitatile relative r = /0 ale probelor produse prin SPS sunt
destul de apropiate de unitate, mai précis r = 0.954, 0.988, 0.985, si 0.873 pentru
proba martor MgB2, si respectiv pentru MFC-03, MFC-06, si MFC-10.
DIfractia de raze X indica probe monofazice cu usoare urme de MgO. Mai precis
cantitatea de MgO este de 4.9, 5.5, si 6.2 % wt pentru MFC-03, MFC-06 si,
respective, MFC-10. Analiza maximului de difractie (110) arata o deplasare spre
unghiuri mai mari consistent cu scaderea parametrului de retea a. Descresterea se
datoreaza substitutiei borului de catre carbon cu formarea unui compus de tip
Mg(B1-xCx)2. Analiza datelor de difractie da pentru x valorile 0.013, 0.026 si 0.019
for MFC-03, MFC-06 si, respective, MFC-10.
Tranzitia normal-supraconductor R(T) este prezentata in Fig. 27 in care
rezistenta a fost normata la rezistenta la temperature camerei R300k. Dupa cum ne
asteptam rezistenta reziduala creste cu continutul de FIC. De notat ca temperature
critica este foarte inalta pentru nivelul de dopare cu carbon extras din datele de
difractie [47-50] ea scade de la 38.8 K pentru MgB2 pur la doar 38.6 K, 38.41, si
38.3 K pentru MFC-03, MFC-06 si, respectiv MFC-10. A doua caracteristica
interesanta o reprezinta dezvoltarea unei a doua tranzitii la temperaturi ceva mai
coborate (insetul la Fig. 27) care devine cu atat mai bine definita cu cat creste
cantitatea de FIC. Aceasta comportare sugereaza o structura complexa a grauntilor,
mai precis grauntii au un miez curat din material nedopat cu carbon si o patura
externa mai bogata in carbon.
31
Fig. 27. Dependenta de temperatura a rezistentei electrice normalizate R/R300 K a
compozitelor de MgB2 si FIC. In inset: detaliile tranzitiei supraconductoare.
Campul critic superior Bc2 a fost determinat din rezistenta electrica, iar
dependenta acestuia de temperatura redusa t = 1-T/Tc urmeaza o lege de tip
putere pentru t < 0.5, Bc2(T) = A(1-T/Tc) unde 1.5 si A o constanta cu unitati
de camp magnetic (Fig. 28). Marimea A creste cu continutul FIC de la 27.88 (pentru
proba nedopata) la 28.04, 32.15 si 31.20 T pentru probele MFC-03, MFC-06 si,
respectiv, MFC-10.
Densitatea critica de curent a fost obtinuta din datele de magnetizare M(B)
folosind metoda Bean [23]:
Jc=2ΔM/[a(1-a/3b)]
unde a si b sunt dimensiunile probei perpendiculare pe directia campului aplicat iar
M este diferenta dintre magnetizarea pe ramurile descendenta si ascendenta ale
curbei de histerezis. Dependenta densitatii critice de curent Jc de campul magnetic
este prezentata in figura 29 la campurile de 5, 20 si 30 K pentru toate probele. O
observatie este demna de mentionat in raport cu aceste curbe: proba cu cel mai
mic continut de FIC (MFC-03) prezinta cel mai mare Jc pentru toate temperaturile
32
pentru B < 8 T atingand valori mai mari de 1.1 MA/cm2 la 5 K si 1 T. La B > 8 T in
limita temperaturilor joase, cea mai mare valoare o prezinta proba MFC-06.
FIG. 28. Dependenta de temperatura redusa t = 1-T/Tc a campului Bc2. In inset:
dependenta de temperatura a campului critic superior.
33
Fig. 29. Dependenta densitatii critice de curent de campul aplicat la 5, 20 si 30 K:
-MgB2, -MFC-03, -MFC-06, si -MFC-10. Inset: campul Bcr la care curentul critic
al probei nedopate devine egal cu curentul critic al probelor MFC-06 si, respectiv,
MFC-10
Un alt parametru important este campul de ireversibilitate Birr si dependenta
lui de temperatura. O estimare corecta a acestui camp poate sa dea informatii
asupra naturii pinningului si a evolutiei lui creterea temperaturii sau campului.
Aceasta marime a fost extrasa din dependenta de camp a densitatii critice de curent
cu criteriul Jc = 100 A/cm2. Resultatele sunt prezentate in Fig.30.
Fig. 30. Dependenta de temperatura a campului de ireveribilitate Birr
Aceste rezultate impreuna cu datele Jc-B indica faptul ca pinningul este in
mod evident imbunatatit prin comparatie cu proba nedopata cu maximul pentru
proba MFC-03.
VI. Teste de functionalizare a nanoparticulelor magnetice in vederea
imobilizarii de substante biologic active (enzime si proteine)
VI.1. Introducere. Nanoparticulele magnetice. Aplicatii medicale.
In ultimii ani, cercetarile in domeniul nanoparticulelor sunt de mare
actualitate datorita perspectivelor largi de utilitate pe care le deschid.
34
Astfel fixarea substantelor biologic active (enzime, acizi nucleici, anticorpi,
antigene) pe nanosuporturi solide reprezinta o directie moderna pentru obtinerea
de biosenzori si biocatalizatori performanti, utilizati in bioanaliza si in biotehnologia
substantelor cu potential biomedical.
In acest context nanomaterialele ceramice ca atare precum si cele
magnetizate sunt tot mai des utilizate ca suporturi pentru imobilizarea enzimelor si
a altor produsi biologic activi.
Nanoparticulele magnetice al caror diametru este cuprins in intervalul 5-
100nm, sunt alcatuite din substante cu un caracter magnetic pronuntat (fier, oxizi
de fier-magnetita, diverse ferite), microparticule ce prezinta un moment magnetic
mare, ce permite atasarea diverselor entitati nemagnetice, cum ar fi celule,
substante biologic active, agenti patogeni, xenobiotice etc. Proprietate ce si-a gasit
aplicatii de interes pentru multe domenii.
Aplicatiile nanoparticulelor în domeniul medical.
Descoperirile nanoparticulelor cu aproape cinci decenii în urma a deschis noi
orizonturi pentru oamenii de stiinta si a determinat aparitia a numeroase aplicatii
biomedicale.
Multe teste de diagnostic in vitro cum ar fi: teste de latex aglutinare, teste
de celularitate analitica si teste de fagocitoza au devenit teste de rutina. Toate
acestea s-au dezvoltat pe baza particulelor mici legate de molecule biologic active
si a marcherilor fluorescenti si radioactivi. In prezent, cercetarile continua, fiind
axate pe aplicatiile nanoparticulelor polimerice în controlul si directionarea
transportului de medicamente la nivelul sistemelor vii.
In cadrul clasei nanoparticulelor, o importanta deosebita o au acelea care
care contin înglobat un miez magnetic.
Acoperirea particulelor magnetice cu polimeri sintetici biodegradabili si
biocompatibili este una dintre cele mai noi directii de cercetare de o importanta
deosebita pe plan international în acest domeniu datorita avantajelor extrem de
importante ce privesc biocompatibilitatea (nefiindu-le detectate nici un efect acut
sau subacut toxic prin studii histologice si serologice) si posibilitatea adsorbtiei si
legarii chimice de substante biologic active pe care le ofera utilizarea acestor
polimeri ca strat de acoperire a particulelor sensibile magnetic.
Pe masura ce studiile trec de la faza cercetarilor de laborator in vitro si
in vivo, pe animale de laborator, în cea de studiu clinic, folosirea
microparticulelor magnetice în domeniul oncologiei devine din ce în ce mai
evidenta ca o metoda de mare viitor, cu un potential cu totul fantastic.
De asemenea acest tip de substante ofera posibile aplicatii atractive în
biomedicina.
Avand dimensiuni controlabile de la câtiva nanometri pâna la zeci de
micrometri, care le plaseaza într-un domeniu de dimensiuni comparabile cu cele
35
ale celulelor (10-100µm), virusurilor (20-450nm), a proteinelor (5-50nm) sau a
genelor (2nm latime si 10-100nm lungime) putand veni în contact cu o entitate
biologica tinta si întradevar, ele pot fi acoperite cu molecule biologice, si au
capacitatea de a interactiona.
Deci, in concluzie particulele magnetice si-au gasit o sfera larga de
aplicabilitate:
- extractia, purificarea si concentrarea acizilor nucleici;
- purificarea culturilor de celule;
- drept componenta a biosenzorilor pentru detectarea unor anumite tipuri de
molecule;
- pentru controlul adsorbtiei sau desorbtiei unor molecule;
- în analizele imunologice.
În ce priveste primul domeniu, acela al extractiei si concentrarii acizilor
nucleici respectiv a AND si ARN, purtatorii magnetici si-au adus a importanta
contributie în automatizarea procesului.
Fie ca sunt folosite particule supermagnetice uniforme ca dimensiuni
[48,49], fie latexuri magnetice hidrofile [50]. în ambele cazuri se fac manipulari
ale încarcarii electrice a suprafetei particulei magnetice prin alegerea unor grupari
chimice, spaceri si agenti de blocare adecvati scopului propus, acela de a imobiliza
oligonucleotidele. Prin folosirea gruparillor -NH2 si -SH pentru legarea de
suprafata purtatorului magnetic.
VI.2 Studiul privind functionalitatea unor suporturi nanocompozite
pentru fixarea diferitelor substante biologic active.
Pe baza studiului datelor de literatura privind functionalizarea suporturilor
magnetice, prezentam rezultatele semnificative obtinute de diversi cercetatori:
Ugur Tamer et al. [51], au raportat pentru prima dată sinteza la
temperatura camerei a nanoparticulelor de fier cuplate cu aur în soluţie apoasă.
Nanoparticulele rezultate au fost caracterizate prin microscopie electronica de
transmisie (TEM), spectroscopie de electroni pentru analiza chimică (ESCA),
spectroscopie UV-VIS şi difractie de raze X (XRD). Au determinat, de asemenea,
incarcaturile de suprafaţă şi proprietăţile magnetice ale nanoparticulelor.
Nanoparticulele magnetice au atras atenţia datorita aplicaţiilor în imagistică
prin rezonanţă magnetică (RMN); [52, 53, 86], stocare a datelor, livrare la tinta a
medicamentelor [54-58].
Numeroase lucrări de cercetare au fost efectuate pentru a evalua utilizarea
nanoparticulelor magnetice pentru tratarea celulelor cancerigene din tumorile pe
creier si celulelor de cancer mamar [59].
Progrese importante s-au facut în ceea ce priveste aplicaţii biomedicale,
inclusiv separarea şi purificarea de biomolecule matriceale [60-62].
36
Metodele de sintetizare chimica pentru nanoparticulele magnetice sunt
simple, iar controlul dimensiunii, formei şi compoziţiei nanoparticulelor depinde de
tipul de săruri folosite, raportul Fe+2 şi Fe+3, pH-ul şi tăria ionică a mediului [63].
Investigaţii ample asupra nanoparticule de aur, ca materiale la scara nanometrica şi
dispozitive, sunt în curs de desfăşurare şi există multe metode sintetice pentru a
obtine nanoparticule de aur [64-69].
Zhou et al. [87] au preparat nanoparticulele de fier filmate cu aur folosind
micelele inverse caracterizate prin microscopie electronica de transmisie (TEM).
Formarea unui film de aur pe nanoparticule magnetice a fost, de asemenea,
efectuata printr-o metoda de reducere cu hidroxilamina ca reducător [70].
Proprietatile optice si magnetice ale silicei fluorescent-filmate cu nanoparticule de
aur şi nanocristale magnetice au fost, de asemenea, raportate [71].
Caracterizarea nanoparticulelor, folosind TEM este reprezentata in fig 31 si
32.
Fig.31. Imagini TEM ale nanoparticulelor Fe3O4.
Fig.32. Imagini TEM ale nanoparticulelor Fe3O4-Au
Pregătirea nanoparticulelor de aur si fier în soluţie apoasă pare a fi
convenabila pentru diverse aplicaţii, in timp ce modificarea suprafeţei ar putea fi
efectuata prin bine-cunoscuta metoda cu tiol.
37
Pentru pregătirea acoperirii cu aur, experimentele initiale au fost efectuate
prin reducerea directă aur (III) în prezenţa nanoparticulelor Fe3O4. După reducere,
morfologia nanoparticulelor de aur-fier nu a fost uniformă.
S-a observat formarea de aglomerari mari, cresterea dimensiunii particulelor
dupa reducere.
Takuya Kinoshitaa et al. [72], indica nanoparticulele magnetice ca materiale
atractive pentru biologie şi biomedicina. Datorita dimensiunilor variind de la câtiva
nanometri pana la cateva zeci de nanometri, dimensiuni care sunt comparabile cu
cele ale unei proteine, anticorpi, ADN sau ARN, acestea se pot lega cu astfel de
biomolecule. Proprietăţile lor magnetice conduc la suporturi magnetice pentru
aplicatii biomedicale, cum ar fi purificarea ADN-ului şi ARN-ului, separarea celulelor,
livrarea magnetica a medicamentelor, hipertermie şi imagistica prin rezonanta
magnetica (IRM) îmbunătăţirea contrastului [63, 88-91].
Pentru aceste aplicaţii, suprafaţa particulelor trebuie modificată de către un
compus biocompatibil, cum ar fi polietilen glicol, alcool polivinilic, dextran sau dioxid
de siliciu [91]. Aceste modificări de suprafaţă acţionează pentru a proteja
particulele magnetice din microclimat şi pentru a fixa pe ele biomolecule [92, 93].
În general, aurul se combină ferm cu biomolecule care au grupuri de sulf,
cum ar fi grupurile mercapto, prin intermediul legaturilor Au-S [94] şi prezintă o
culoare roşiatică într-o soluţie coloidală datorită absorbţiei suprafatei plasmonilor.
Agregarea nanoparticulelor de aur cauzata de reticulare, cum ar fi
hibridizarea ADN-ului, poate schimba culoarea soluţiei coloidale in purpuriu, făcând
astfel posibila o detectie colorimetrica a ADN-ului [95-97].
Arthur Taylor et al. [73] au studiat functionalizarea nanoparticulelor de fier
incapsulate cu carbon.
Nanoparticulele magnetice incapsulate cu carbon reprezinta o noua clasa de
materiale in cazul carora miezul nanoparticulelor magnetice este protejat de
reacţiile cu mediul său prin invelisuri de grafit. Având o structură similară cu
nanotuburile de carbon, aceste nanoparticule ar putea fi functionalizate utilizând
metode care sunt deja aplicate pentru aceste structuri. Au fost prezentate efectele
tratamentelor acide pe baza de HCl, HNO3, H2SO4 asupra acestor nanoparticule,
evidenţiind impactul asupra proprietăţilor magnetice şi de suprafaţă. S-a aratat că
tratamentele acide bazate pe HNO3 pot fi aplicate cu succes pentru generarea de
grupari carboxilice pe suprafaţa nanoparticulelor.
Gasindu-si o gamă largă de aplicaţii, inclusiv stocare a datelor [74], pompe
magnetice (Ando et al. [76]), purificarea apei (Yavuz et al. [77]), biocipuri (Graham
et al. [98]) şi biomedicina (Shubayev et al. [78]).
Diferite metode recente de preparare au permis sintezele de structuri miez-
invelis în care nanoparticulele metalice sunt incapsulate de metale preţioase,
polimeri, silice sau carbon [75] pentru a preveni oxidarea lor şi, prin urmare, pentru
păstrarea proprietăţilor lor magnetice.
38
In aplicatii medicale, prezinta interes functionalizarea suprafaţei
nanoparticulelor magnetice cu molecule biologic relevante, cum ar fi proteinele sau
acizii nucleici. În caz de structurilor miez-invelis, acestea ar fi posibile prin
modificarea invelisului nanoparticulelor pentru legare covalenta.
In acest sens exista functionalizarea metilaminei. Metoda ce se bazează pe
activarea grupurilor carboxilice cu ECD (carbodiimida).
ECD reacţionează cu grupurile carboxilice formand amine reactive, o-acil-iso-
uree intermediare, care pot reacţiona cu un grup amino pentru a forma o legătură
amidica stabilă.
Tomoko Yoshino et al. [99], o metoda foarte recenta este aceea de a separa
magnetic celulele dintr-un amestec eterogen, aceasta metoda fiind mult mai rapida,
mai simpla, comparativ cu trierea celulelor prin activare fluorescenta (FACS) [100-
102].
Particulele magnetice folosite in acest tip de separare au dimensiuni cuprinse
in intervalul micrometri şi nanometri, ceea ce ofera numeroase avantaje in ceea ce
priveste sensibilitatea metodei de dozare, rapiditatea, precizia şi reducerea
toxicităţii celulare.
O alta utilitate a nanoparticulelor a fost raportata de Yean S. et al. [103],
acestia au cercetat purificarea apei potabile cu ajutorul nanoparticulelor magnetice
cu afinitate maxima pentru indepartarea arsenicului din apa de baut.
Balan V [79, 80], a studiat particulele magnetice de tip compozit magnetită-
chitosan obtinute prin gelifierea ionică a chitosanului cu tripolifosfat de sodiu (TPP),
în prezenţa magnetitei si folosite pentru legarea biotinei prin intermediul unei
carbodiimide solubile in apa (EDAC) cu rol de activator al gruparii carboxil a biotinei
ca sistem biologic.
Morfologia particulelor de magnetită a fost studiată prin tehnica TEM-
microscopie electronica de transmisie si este redata in figura 33.
Fig. 33. Imagine TEM a particulelor de magnetita.
De asemenea in brevetul de invenţie RO 122194 B1 [81]; este prezentat un
compozit vitroceramic pentru imobilizarea acidului L-aspartic si a L-asparaginazei.
39
VI.3. Imobilizarea diferitelor substante biologic active pe suporturi
magnetice, vitroceramice.
Din studiul datelor de literatura privind imobilizarea de substante biologic
active pe suporturi vitroceramice, prezentam rezultatele semnificative obtinute de
diversi cercetatori.
Imobilizarea enzimelor, inclusiv pe suprafete de siliciu, a fost
efectuata cu mai multi ani in urma [82].
Roger A. Sheldon, [83] a studiat imobilizarea lipazei Mucor javanicus (EC
3.1.1.3) pe nanoparticule de silice functionalizate.
Autorul a studiat stabilitatea termica a lipazei imobilizate pe acest tip de
suport si activitatea enzimatica la diferite valori ale pH-ului.
Figura 34 . Imobilizarea lipazei Mucor javanicus pe nanoparticule de siliciu.
S-a obtinut o stabilitate termică crescută şi o pastrare mai mare a activitatii,
într-o gamă mai largă de pH-uri (Figura 34).
Wang şi Caruso [104] au imobilizat catalaza (EC 1.11.1.6) pe sfere de siliciu
nanoporoase, având o suprafaţă de 630 m2 g-1 şi mesopori cu o dimensiune a
porilor de până la 40nm, şi asamblate ulterior intr-un invelis de acoperire nano-
compozit, compus din trei straturi de clorură de poli-dimetildialilamoniu (PDM) şi
nanoparticule de siliciu de 21nm.
40
Imobilizatul rezultat a prezentat o activitate de 75 ori mai mare fata de
catalaza imobilizata pe sfere de siliciu mezoporoase.
Legarea covalenta a α-chemotripsinei (EC 3.4.21.2) pe o sticla mezoporoasa
sol-gel, a fost modificata prin reacţia grupări hidroxi la suprafaţă cu 3,3,3-
trimetoxipropanal, a rezultatt un catalizator imobilizat cu un timp de înjumătăţire
mult mai ridicat fata de enzima libera.
Allan E. David [84] a studiat imobilizarea termolizinei pe silica gel activate cu
glutaraldehida GA, silica gelurile furnizeaza zone de suprafaţă si porozitate mare.
Activitatea termolizinei a fost determinata colorimetric utilizand azocazeina (Sigma-
Aldrich, Catalogue Number A-2765) ca substrat. Acest substrat contine cazeina
modificata cu un colorant. Termolizina libera si imobilizata a fost incubata cu un
volum de 4 mL solutie azocazeina 5%. Pentru precipitarea azocazeinei s-au
adaugat 500 μL acid tricloracetic 15% (TCA). Precipitatul rezultat a fost centrifugat
la 12 000 G timp de 5 minute.
Activitatea enzimatica este proportionala cu colorantul ramas in solutie,
pentru determinarea acesteia, s-a masurat extinctia la 440 nm.
In brevetul de inventie RO 122364 B1 [85], este prezentat un procedeu de
imobilizare a tripsinei pe suport biopolimeric pe baza de chitosan prin metoda
includerii in gel urmata de reducere cu borohidrura de sodiu.
VII. Rezultate experimentale.
VII.1. Imobilizarea lipazei pe suporturi vitroceramice.
In faza anterioara s-au analizat o serie de suporturi pentru imobilizarea
lipazei pancreatice si a lipazei fungice din Aspergillus niger si anume:
-suport sticla borosilicatica de baza (Lot I)
-suport sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice (Lot II),
-suport sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice tratata chimic(Lot
III)
Asa cum am precizat anterior, metoda de imobilizare aplicata a fost cea de
adsorbtie. In scopul suplimentarii puntilor de legare, prin formarea de baze Schiff
cu gruparile aminice ale enzimei, suportul vitroceramic a fost tratat in prealabil cu
solutie de glutaraldehida 2,5%. Suportul vitroceramic s-a adaugat progresiv in
solutia de enzima, cu agitare ocazionala, sistemul mentinanadu-se la temperatura
de 5ºC, pana la plafonarea valorii asctivitatii enzimatice in supernatant.
Activitatea lipazei s-a determinat prin metoda titrimetrica utilizand ca
substrat uleiul de masline, descrisa in paragraful 4.2. din raportul /2010.
Randamentul de imobilizare s-a determinat prin formula:
η = (Ai/ Af) x 100
41
unde: Ai este activitate initiala introdusa exprimata in U lipazice, Af este (Activitatea
initiala - Activitatea din supernatant)
Rezultatele obtinute pe loturile de probe sunt prezentate in tabelele: 3, 4 si
5, (detalierea tabelului 5 din Faza /2010).
Pentru imobilizarea lipazelor pe suport vitroceramic s-au utilizat doua tipuri
de lipaza: lipaza pancreatica (FLUKA) si lipaza din Aspergillus niger (FLUKA).
Tabelul 3. Imobilizarea lipazei pe suport sticla borosilicatica de baza (Lot I).
Nr.
crt.
Proba
Cantitate
suport
(mg)
Timp
adsorbtie
(ore)
Activitate lipazica
Rand.
de
imob.
(%)
Obs. Initiala
(Utotal
e)
Imob.
(Utotal
e)
U/g
suport
1. I-1LP 1 000 24,0 12
098,0
5 102,5 5 102 42,17
2. I-1LP-GA 3 000 20,0 12
098,0
4 602,5 1 534 38,04
3. I-1LP-GA 500 2,0 2 956,0 589,0 1 178 19,92
4. I-1LP-GA 500 18,0 2 956,0 642,0 1 284 21,71
5. I-1LP-GA 1 000 20,0 2 956,0 1662,5 1 662,5 56,24
6. I-1LAN-
GA
500 16,0 9 389,0 0 0 0
LP- Lipaza pancreatica.
LAN-lipaza Aspergillus niger.
Din analiza rezultatelor obtinute privind randamentul de imobilizare in
corelatie cu durata de adsorbtie si incarcarea enzimatica pe gram suport, cele mai
bune rezultate se obtin cu proba I-1LP (lipaza pancreatica imobilizata pe suport lot
I, proba 1) fara adaos de aldehida glutarica (GA), ca agent suplimentar de legare,
desi conduce la un randament de imobilizare aparent mai mare, incarcarea
enzimatica se situeaza practic la valori mai mici, indiferent de timpul de adsorbtie
folosit.
In ceea ce priveste lipaza de origine microbiana din Aspergillus niger
rezultatele privind imobilizarea acesteia pe suport ceramica simpla au fost negative.
Tabelul 4. Imobilizarea lipazei pe suport sticla vitroceramica pe baza de
cristale magnetice (Lot II).
42
Nr.
crt.
Proba Cantita
te
suport
(mg)
Timp
adsorbt
ie
(ore)
Activitate lipazica Rand.
de
imob.
(%)
Obs.
Initiala
(Utotal
e)
Imobiliza
ta
(Utotale)
U/g
supor
t
1. II-6LAN-
GA
500 20,0 7 758,5 131,5 263 1,69
2. II-6LAN 500 16,0 9 389,0 263,0 526 2,82
3. II-7LAN 500 20,0 9 389,0 868,0 1 736 9,24
4. II-7LP 500 2,0 12
098,0
723,0 1 446 5,97
5. II-7LAN 500 20,0 9815,0 1 394,0 2 788 14,05 *Reads
orbit
6. II-7LP-GA 500 20,0 12
098,5
3 577,0 7 154 29,56
7. II-7LP 1 000 20,0 12
098,5
3 077,5 3 077 25,43
In ceea ce priveste imobilizarea pe suporturile din lotul II rezultatele indica
faptul ca proba 6, lipaza din Aspergillus niger se imobilizeaza in general cu
randamente mici, usor mai ridicat daca nu este tratata cu GA. Pe proba 7 se obtine
un randament de 9,24% si prin readsorbtia supernatantului randamentul creste la
14,05%. Lipaza pancreatica se imobilizeaza pe acest tip de suport dupa 20 de ore
de adsorbtie cu un randament ridicat de 29,56% si la o valoare a incarcarii
enzimatice ridicate de 7 154 U/g suport, daca este tratata cu GA in concentratie
de 2,5% in tampon fosfat 0,01M, pH=7,0; comparativ cu proba netratata, unde
desi randamentul de imobilizare se situeaza aproximativ la aceeasi valoare,
incarcarea enzimatica per gram suport este sub 50% din aceasta valoare.
In cazul imobilizarii lipazei pancreatice pe suport, proba 1 lotul III, valoarea
randamentului de imobilizare, cat si cea a incarcarii enzimatice, sunt ridicate de
33,48% si respectiv 4 050 U/g, daca suportul este adaugat in 2 prize cu
mentinerea la aceeasi valoare a timpului de adsorbtie, acesta poate creste pana la
63,34% comparabil cu datele din literatura pentru acest tip de enzima.
In ceea ce priveste lipaza microbiana din Aspergillus niger, valorile
randamentului de imobilizare cat si a incarcarii enzimatice sunt scazute atat la
proba tratata cat si la proba netratata cu GA.
Referitor la imobilizarea lipazei pe cele 3 loturi de probe, comparand
rezultatele obtinute anterior, se poate concluziona faptul ca lipaza pancreatica se
imobilizeaza cu un randament relativ ridicat, peste 42% si incarcare enzimatica
mare 5102U/g suport pe lotul I, fara nici un tratament iar pe lotul III prin tratare cu
43
GA 2,5%. Valorile randamentului de imobilizare a lipazei fungice din Aspergillus
niger sunt foarte scazute pe toate loturile de probe indiferent de faptul ca acestea
au fost activate sau nu cu GA.
Tabelul 5. Imobilizarea lipazei pe suport sticla vitroceramica pe baza de
cristale magnetice tratata chimic (Lot III).
Nr.
crt.
Proba
Cantita
te
suport
(mg)
Timp
adsorbt
ie
(ore)
Activitate lipazica
Rand.
de
imobiliza
re
(%)
Initiala
(Utotal
e)
Imob.
(Utotal
e)
U/g
supor
t
1. III-1LP 1 000 20,0 12
098,0
2 051,5 2 051 16,95
2. III-1LP-GA 1 000 20,0 12
098,0
4 050,0 4 050 33,48
3. III-1LP-GA 500 2,0 2 956,0 841,5 1 682 28,46
4. III-1LP-GA 1 000
18,0
2 956,0 1 115,0 2 230 37,71
5. III-1LP-GA 1 000 20,0 2 956,0 1 872,5 3 745 63,34
6. III-1LAN-
GA
1 000 20,0 7 758,0 237,0 237 3,05
7. III-1LAN 1 000 20,0 9 915,0 894,5 894,5 9,02
Ca urmare in experimentele urmatoare s-a utilizat numai lipaza pancreatica
(FLUKA).
Dintre metodele fizice, imobilizarea prin adsorbtie este cel mai des utilizata,
reprezentand cel mai economic si simplu procedeu de imobilizare a enzimelor.
Enzimele sunt fixate la suprafata suportului datorita:
- interactiunilor Van der Waals,
- punti de hidrogen
- transferului de sarcina –toate interactiunile intre substante electrofile si
nucleofile
- schimb ionic
Cantitatea de enzima legata de suport in cazul adsorbtiei depinde de
urmatorii parametrii:
- concentratia proteica a solutiei enzimatice influent, masa de enzima fixata
creste proportional cu concentratia pana la o valoare limita, cand adsorbantul
se satureaza, valoarea acestuia este data de izoterma Freundlich:
m=k1 Ck2
unde: m-masa legata, C- concentratia la echilibru, k1, k2- constantele de
echilibru
44
- timpul de contact: viteza de adsorbtie este determinata de caracteristicile
fizico-chimice ale suportului si ale proteinei adsorbite (dimensiunile
moleculelor si ale particulelor suportului, prezenta si natura sarcinilor
electrice). In conditii obisnuite, timpul necesar pentru obtinerea unui
preparat enzimatic imobilizat este, in general scurt, nedepasind cateva ore.
- temperatura de reactie: viteza de adsorbtie, depinde de caracteristicile
difuzionale ale moleculelor, deci va creste cu temperatura pana la o valoare
optima a acesteia.
- pH-ul: s-a constatat experimental ca de regula in apropierea pH-ului
izoelectric al enzimei, adsorbtia este maxima.
In experimentele ulterioare efectuate s-a tinut cont de toti acesti parametrii.
Astfel s-a testat dinamica imobilizarii lipazei pe setul de suporturi primite in
cursul acestui an pe baza modului de lucru descris in cele ce urmeaza.
In vase Erlenmayer de 100 mL continand cate 0,5 g din proba de suport,
cate 50 mL solutie lipaza 0,3% in tampon fosfat 0,01M, pH=7,0 cu 241,9 UL/mL
activitate. S-a lucrat la temperatura de 5°C sub agitare continua, timp de 3 ore
prelevandu-se probe din ora in ora pentru determinarea activitatii enzimatice, a
randamentului de imobilizare, precum si a incarcarii enzimatice /g de suport pe
baza metodei descrise anterior.
Rezultatele obtinute sunt prezentate in Tabelul nr. 6.
Tabelul 6. Dinamica imobilizarii lipazei pe suporturi ceramice.
Nr.
crt.
Proba
Activitate lipazica
1 ora 2 ore 3 ore
Utotale % Utotale % Utotale %
1. BSF1 5527 45 5768 48 6490 54
2. BSF2 4685 39 5335 44 6490 54
3. BSF4 5245 43 5960 49 7717 64
4. BSF5 3482 29 4396 36 4781 39
5. BSF6 3770 31 4853 40 5745 47
6. BSF7 5239 43 8150 67 9353 77
7. ITC 4515 37 4709 39 8583 71
Asa cum se poate observa, suporturile ceramice cu afinitate ridicata pentru
lipaza pancreatica sunt in ordine descrescatoare : BSF7, ITC, BSF4, BSF2 si BSF1,
care dupa 3 ore de adsorbtie fixeaza 77, 71, 64 si respectiv 54% din activitatea
enzimatica initiala, rezultate confirmate si de valorile ridicate ale incarcarii enzimei
pe unitatea de suport (Fig. 35).
45
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
1 2 3 4 5 6 7
Activ. lipazica
Fig. 35. Activitatea lipazica pentru cele 7 probe (1-BSF1, 2-BSF2, 3-BSF4, 4-
BSF5, 5-BSF6, 6-BSF7, 7-ITC.
Cea mai ridicata valoare a incarcarii enzimatice dupa 3 ore de adsorbtie de
42915 U/g suport este prezenta la proba ITC, urmata de proba BSF7-18520U/g,
BSF4-15281 U/g si BSF1-12226 U/g respectiv BSF2-12153U/g.
Activitatea ridicata a acestor suporturi se manifesta chiar in prima ora de
adsorbtie, probele BSF4 si BSF7 adsorbind 43% din activitatea enzimatica initiala.
VII.2. Imobilizarea tripsinei pe suporturi vitroceramice.
VII.2.1. Materiale si metode.
Pentru imobilizarea tripsinei pe suporturile ceramice studiate s-a utilizat
aceeasi metoda de imobilizare si anume adsorbtia fizica.
Pregatirea suportului:
Probele de suport s-au mojarat si s-au mentinut in tampon fosfat 0,1 M ,
pH=7, timp de 21 de ore, dupa care s-au uscat la etuva. Pentru adsorbtie s-a luat
in lucru 0,5 g de suport astfel pregatit.
Tripsina utilizata pentru adsorbtie (SIGMA) a fost sub forma de solutie 0,055
in acid clorhidric 0,001 M, pH=6, cu activitate tripsinica de 264,27 U/mL si 12,60
mg/mLcontinut proteic.
Adsorbtia s-a efectuat prin adaugarea cantitatii de suportin 50 mL solutie de
tripsina, cu agitare ocazitionala, timp de o ora, la temperatura de 5°C. S-a analizat
activitatea enzimatica si continutul de proteine in supernatant, pentru estimarea
randamentului aparent de imobilizare:
ηa=Ai-As/Aix100
unde: Ai- activitatea initiala, UTotale iar As-activitate in supernatant, UTotale
Activitatea enzimatica a tripsinei s-a determinat pe baza metodei
spectrofotometrice utilizand substrat BAPNA.
46
Determinarea activitatii tripsinei cu substrat sintetic N-benzoil-L-
arginin-4-nitroanilina, (BAPNA).
Principiul metodei:
Metoda se bazeaza pe actiunea tripsinei asupra substratului sintetic, N-
benzoil-L-arginin-4-nitroanilina, (BAPNA), pe care il scindeaza cu formarea de 4-
nitroanilina, care adsoarbe la 405 nm.
1 U tripsina catalizeaza transformarea a 1μmol de substrat/minut in
conditiile de reactie.
Calculul activitatii tripsinei se face utilizand urmatoarea formula:
Activitatea (μmoli/min)=∆Exd/ x V
unde: ∆E = suma extinctiilor, d = factor de dilutie, acolo unde este cazul; ε = 0,001
si reprezinta modificarea extinctiei la 405 nm intr-un minut; V= volumul de proba
luat in lucru (mL) sau cantitatea de imobilizat (mg). Rezultatele obtinute sunt
prezentate in Tabelul nr. 7.
Tabelul 7. Imobilizarea prin adsorbtie a tripsinei pe suporturi vitroceramice.
Nr.
crt.
Proba
SUPERNATANT IMOBILIZAT Rand.
imob. Activ. Protei
ne
Activita
te
Protei
ne
Asp. Activita
te
(UT) (mg) (UT) (mg) (U/m
g)
(U/mg
support
)
%
1. BSF1
60,17
5
3,475 13153,
325
626,5
2
21 26,307 99,54
2. BSF2
35,65
0
3,995 13177,
850
626,0
05
21 26,356 99,73
3. ITC
7,440 0,324 7920 377,6
7
21 26,400 99,89
4. BSF4
45,87
5
419 13167,
625
211 62 26,330 99,65
5. BSF5
37,90
0
421 13175,
600
209 63 26,350 99,71
6. BSF6
44,33
5
444,5 13169.
165
185,5
00
71 26,330 99,66
7. BSF7
46,72
5
345,7
1
13166,
775
284,2
90
46 26,330 99,66
Rezultatele obtinute la imobilizarea prin adsorbtie a tripsinei (SIGMA) pe
suporturile studiate indica valori ridicate ale randamentului aparent de imobilizare,
peste 99% si ale incarcarii enzimatice pe suport, peste 26 300 U/g suport. Se
constata ca unele probe de suport sunt selective pentru tripsina intrucat o
47
imobilizeaza cu activitate specifica ridicata de 71, 63, 62, 46 U/mg respectiv
probele BSF6, BSF5 si BSF7.
Imobilizatele astfel obtinute au fost separate din mediul de adsorbtie prin
filtrare sub vid pe palnie Buchner, si testate pentru activitatea reala imobilizata.
Activitatea reala imobilizata s-a determinat prin produsii de reactie eliberati
de 100 mg imobilizat pe 12,5 mL substrat BAPNA conform metodei descrise
anterior.
Rezultatele sunt prezentate in tabelul nr. 8.
Tabelul 8. Activitatea reala a tripsinei imobilizate.
Nr.
crt.
Proba Activitate
practica
(UT)
Activitate
teoretica
(UT)
% din
teoretic
1. BSF1 13,7620 13153,325 0,1
2. BSF2 5,500 13177,850 0,04
3. ITC 42,5571 7920 0,5
4. BSF3 58,0710 13167,625 0,44
5. BSF4 357,1425 13175,600 2,93
6. BSF5 19,7140 13169,165 0,14
7. BSF6 18,4285 13166,775 0,13
Din analiza rezultatelor se constata ca activitatea reala imobilizata la
majoritatea probelor testate se situeaza la valori scazute raportate la activitatea
teoretica imobilizata a tripsinei, probele BSF 4 prezentand o stabilitate ceva mai
buna respectiv 2,93% activitate.
S-a testat in continuare efectul reticularii cu glutaraldehida asupra
randamentului de imobilizare a tripsinei pe suporturi ceramice, in doua variante de
lucru:
1) adsorbtia initiala a tripsinei pe suportul vitroceramic urmata de tratarea
cu GA solutie 2,5%.
2) tratarea suportului cu GA solutie 2,5% si apoi imobilizarea tripsinei pe
acesta. Solutia initiala de tripsina a avut 1171,66 UT activitate.
Rezultatele sunt prezentate in tabelul nr. 9.
Din rezultatele prezentate in tabel reiese faptul ca desi randamentele de
adsorbtie aparenta se situeaza la valori ridicate de peste 93%, randamentele reale
sunt mai mari in cazul variantei II, cand suporturile vitroceramice studiate sunt mai
intai tratate cu GA 2,5% si dupa aceea folosite pentru adsorbtia lipazei pancreatice.
In aceste conditii proba BSF5 prezinta valoarea cea mai mare a
randamentului de imobilizare de 20,88%.
48
Tabelul 9. Influenta tratamentului cu GA asupra randamentului de imobilizare.
Nr
.
crt
.
Proba
Varianta I
Varianta II
Activ.
imob.
Rand.
apare
nt
Rand.
real
Activ.
imob.
Rand.
aparent
Rand.
real
(UT) (%) (%) (UT) (%) (%)
1. BSF1
0,774
2
97,65 0,06 45,292 96,64 11,59
2. BSF2
4,166
6
93,35 0,35 44,885 95,77 16,64
3. BSF5
11,80
12
97,95 1,00 45,287 96,63 20,82
VII.2.2. Functionalizarea suportului vitroceramic BSF1 prin tratament
cu chitosan.
Functionalizarea suportului vitroceramic cu chitosan s-a efectuat prin metoda
complexarii cationice a acestuia cu compusi anionici, urmata de formarea de
particule sferice prin tratare cu agent reducator GA sau borohidrura de sodiu.
Modul de lucru abordat a constat in :
S-au luat 500 mg din suportul vitroceramic BSF1, mojarat sub forma de
pulbere fina si la care s-a adaugat 10 mL solutie chitosan 0,1% in acid acetic,
acetat de sodiu, s-a omogenizat timp de 30 minute la temperatura de 50°C, dupa
care pentru indepartarea apei s-a tinut la etuva la 60°C timp de 24 ore.
Suportul astfel pregatit a fost prelucrat in continuare in doua variante de
lucru:
Varianta I- suportul s-a tratat cu GA 2,5% in tampon acetat de sodiu 50
mM, pH=6 in raport greutate, suport:chitosan:GA, de 50:1:50, agitare ocazionala
si pastrare pentru perfectarea reticularii timp de 3 ore la temperatura camerei. S-a
filtrat pe palnie cu hartie de filtru, s-a spalat in continuare cu o solutie de L-lizina
0,1 M in tampon fosfat 0,05M, pH=7,4; pentru indepartarea glutaraldehidei
nereactionata.
Imobilizarea tripsinei s-a facut prin suspendarea suportului astfel pregatit
intr-o solutie de tripsina pancreatica (SIGMA) 0,05% in acid clorhidric 0,001M cu
agitare ocazionala la temperatura de 5°C, timp de 24 ore.
Imobilizatul vitroceramic s-a separat prin filtrare si s-a spalat cu solutie de L-
lizina.
Activitatea tripsinica imobilizata s-a calculat pe baza bilantului dintre
activitatea initiala si activitatea tripsinica neadsorbita din supernatant si apele de
spalare.
49
Varianta II- pe suportul pregatit initial s-a imobilizat prin adsorbtie tripsina
sub forma de solutie 0,05% in acid clorhidric 0,001M, cu agitare ocazionala, timp
de 4 ore la temperatura de 5°C. Imobilizatul este separat prin filtrare, spalat cu
solutie tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4; dupa care este tratat cu GA 2,5% in solutie
tampon acetat de sodiu 50 mM, pH=6 in acelasi raport ca la varianta I, spalare cu
solutie de L-lizina 0,1M in tampon fosfat 0,05M, pH=7,4; pentru indepartarea GA in
excess urmata de tratarea cu borohidrura de sodiu 0,5% in tampon TRIS-HCl,
50mM, pH=7,5; pentru fixarea covalenta a tripsinei.
Rezultatele obtinute sunt prezentate in tabelul nr. 10.
Tabelul 10 Functionalizarea cu chitosan.
Nr.
crt.
Indicator Varianta
I
Varianta
II
1. Suport BSF1 g 500 500
2. Glutaraldehida g 500 500
3. Chitosan g 10 10
4. Borohidrura de sodiu - 30
5. Solutie tripsina initiala.
Activitate U totale
8768 8768
6. Activitate tripsinica
supernatant
58 166
7. Activitate tripsinica
adsorbita
8710 8602
8. Randament de imobilizare
aparent (%)
99,33 98,10
9. Randament real de
imobilizare (%)
19,36 3,63
Din rezultatele prezentate reiese faptul ca atat randamentul aparent cat si cel
real de imobilizare a tripsinei pe suport functionalizat cu chitosan este mai mare in
varianta I de 99,33%, respectiv 19,36%. Acest lucru denota faptul ca prin
tratarea suportului vitroceramic cu chitosan, urmata de reticularea cu GA, cresc
gruparile functionale apte pentru fixarea tripsinei, randamentul de imobilizare
creste de 1,66 ori fata de proba netratata cu chitosan.
VII.3. Imobilizarea acidului L-aspartic pe suporturile vitroceramice
studiate.
Imobilizarea acidului L-aspartic pe suporturi vitroceramice s-a facut astfel:
suporturile vitroceramice s-au mojarat manual in mojar de portelan pana s-a
obtinut o pudra fina. Pentru activare acestea au fost mentinute in solutie de tampon
fosfat 0,01 M pH=7, timp de 24 ore, s-au filtrat si s-au uscat la etuva la 60°C.
50
Probele astfel pregatite s-au suspendat in solutie de acid L-aspartic 0,05% in acid
clorhidric 0,05M in raport suport:acid L-aspartic, g/v, 1:2. S-a agitat ocazional timp
de o ora la temperatura ambianta, nivelul de adsorbtie al aminoacidului pe suport
fiind controlat prin metoda cromatografiei in strat subtire utilizand placi de silicagel
(FLUKA). Pe placa s-au pipetat cate 10 μL de supernatant, comparativ cu o solutie
etalon de acid L-aspartic 0,05%.
Suporturile s-au uscat, placile s-au imersat apoi in sistemul de migrare
butanol: acid acetic: apa in raport 4:1:5,. Dupa evaporarea solventilor organici,
cromatogramele au fost relevate prin pulverizare cu solutie de ninhidrina 0,3% in
acetona si pastrate timp de 2-3 minute la 105°C cand sunt evidentiate spoturi de
culoare rosu-violet. Cantitatea de acid L-aspartic adsorbita pe suporturile
vitroceramice luate in lucru a fost estimata prin scaderea intensitatii culorii si a
dimensiunii, comparativ cu proba martor, arata un maximum de semne (+).
Interpretarea calitativa a cromatogramelor relevate este reprezentata in
Tabelul 11 comparativ cu spotul probei martor.
Tabelul 11 Adsorbtia acidului L-aspartic pe suporturi vitroceramice.
Nr.
crt.
Proba Intensitate
culoare
Rezultat
adsorbtie
1. Etalon acid L-
aspartic
+ + + + + 0
2. BSF1 + + Buna
3. BSF2 + + + Relativ buna
4. ITC + + + + Slaba
5. BSF4 + + + + Slaba
6. BSF5 + + + Relativ buna
7. BSF6 + + Buna
8. BSF7 + + + + Slaba
Pe baza aprecierii cromatogramelor rezulta ca probele BSF1 si BSF6 fixeaza
cel mai bine acidul L-aspartic din solutie si intr-o proportie mai mica probele BSF2 si
BSF5 lucru evidentiat si in cromatogramele printate, figurile 36 si 37.
51
1. 2. 3. 4. 5.
Figura 36 – Cromatograma acidului L-aspartic pe suport vitroceramic (probele 1, 2,
3,4)
52
1. 2. 3. 4. 5.
Figura 37 – Cromatograma acidului L-aspartic pe suport vitroceramic (probele 5,6
si 7)
53
VII.4. Imobilizarea L-cisteinei pe suporturile vitroceramice studiate.
Se lucreaza identic ca in modul descris la imobilizarea acidului L-aspartic,
singura deosebire fiind aceea ca raportul adsorbant: adsorbit (g/v) este de 1: 1 si
solutia de L-cisteina este de concentratie mai mare respectiv de 0,1%.
Cromatogramele obtinute au fost interpretate calitativ din punct de vedere al
intensitatii culorii spoturiloe relevate, comparativ cu spotul martor. Scaderea
intensitatii culorii indica adsorbtia L-cisteinei pe suport, Tabelul 12 si
cromatogramele din fig. nr. 38 si 39.
Tabelul 12. Adsorbtia L-cisteinei pe suporturi vitroceramice.
Nr.
crt.
Proba Intensitate
culoare
Rezultat
adsorbtie
1. Etalon acid L-
cisteina
+ + + + + 0
2. BSF1 + + + + Slaba
3. BSF2 + + + + Slaba
4. ITC + + + + + Foarte slaba
5. BSF4 + + Buna
6. BSF5 + + Buna
7. BSF6 + + + Relativ buna
8. BSF7 + + + + Slaba
Rezultatele obtinute indica faptul ca L- cisteina se adsoarbe cel mai bine pe
suporturile BSF4 si BSF5 si bine pe suportul BSF6.
54
1. 2. 3. 4. 5.
Figura 38 – Cromatograma L-cisteina pe suport vitroceramic (probele 1, 2, 3 si 4).
55
1. 2. 3. 4. 5.
Figura 39 – Cromatograma L-cisteina pe suport vitroceramic (probele 5,6,7)
56
VII.5. CONCLUZII
Rezultatele obtinute conform planului de realizare al proiectului din cadrul
prezentei etape, conduc la urmatoarele concluzii:
Probele de suporturi vitroceramice provenite de la coordonator au fost
testate pentru imobilizarea unor enzime ca: lipaza pancreatica, lipaza fungica din
Aspergillus niger si tripsina pancreatica precum si a unor aminoacizi (acidul L-
aspartic si L-cisteina).
Metoda de imobilizare aplicata a fost aceea a adsorbtiei fizice, metoda
simpla, des utilizata in tehnicile de separare a produsilor prin cromatografia de
afinitate si in obtinerea biocatalizatorilor si a unor biosenzori. Pentru marirea
capacitatii de imobilizare a principiilor active pe acest tip de suporturi, s-a testat
functionalizarea lor prin tratare cu glutaraldehida, inainte sau dupa fixarea enzimei
pe suport, cat si prin cuplarea pe suprafata suportului a chitosanului urmata de
reticularea cu borohidrura de sodiu.
Rezultatele obtinute indica faptul ca in functie de tipul suportului (sticla
borosilicatica de baza, sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice si sticla
vitroceramica pe baza de cristale magnetice tratata chimic), si de tratamentul
aplicat, atat lipaza cat si tripsina se imobilizeaza cu diferite randamente.
Se constata ca lipaza pancreatica se imobilizeaza cu randamente ridicate pe
acest tip de suporturi, functie de durata adsorbtiei si tratamentul preliminar cu GA,
in timp ce lipaza fungica din Aspergillus niger prezinta randamente scazute.
In ceea ce priveste imobilizarea tripsinei pe acest tip de suporturi
randamentul aparent de imobilizare este de peste 99%, randamentul real fiind in
general mai scazut. Se constata ca acesta poate fi imbunatatit de pana la 11,6 ori
mai mare, in situatia in care suportul este activat prin tratarea cu GA 2,5%, urmat
apoi de adsorbtia enzimei.
Functionalizarea suporturilor vitroceramice prin tratament cu chitosan pentru
marirea capacitatii de fixare a tripsinei, indica faptul ca atat randamentul aparent
cat si cel real de imobilizare a tripsinei este mare, in situatia in care suportul este
activat in prealabil prin tratament initial cu GA.
Probele de suporturi testate prezinta de asemenea afinitate diferita pentru
aminoacizii testati, acidul L-aspartic si L-cisteina, datorita gruparilor functionale
diferite implicate in legaturile ce se formeaza intre suport si aminoacid.
Bibliografie
1. Z. Strnad, Glass–Ceramic Materials, Elsevier, Amsterdam, 1986. 2. R. Müller, R. Hiergeist, H. Steinmetz, N. Aqoub, M. Fujisaka, W. Schüppel,
J. Magn. Magn. Mater., 201 (1999) 34. 3. P. A. Mariño-Castellanos, J. C. Somarriba-Jarque, J. Anglada-Rivera,
Physica B 362 (2005) 95
57
4. D. D. Zaitsev, P. E. Kazin, A. V. Garshev, Yu. D. Tret’yakov, and M. Jansen, Inorg. Mater., 40 (2004). 881
5. Y.-K. Lee and S. Y. Choi, J. Am. Ceram. Soc. 79 (1996) 992. 6. P. Görnert et al., IEEE Trans. Magn. 26 (1990) 12
7. N. Rezlescu, E. Rezlescu, P. Pasnicu, M.L. Crans, J. Magn. Magn. Mater. 131 (1994) 274.
8. B. T. Shirk, W. R. Buesseln, J. Am. Ceram. Soc. 53 (1970) 192.
9. W. J. S. Blackburn, B. P. Tilley, J. Mater. Sci. 9 (1974) 1265. 10.Th. Klupsch, E. Steinbeiss, R. Müller, C. Ulbricht, W. Schüppel, H.
Steinmetz, T. Höche, J. Magn. Magn. Mater. 196&197 (1999) 264. 11.Tetsuaki Nishida, Shiro Kubuki, Morihiro Shibata, Yonezo Maeda and
Toyomi Tamaki , J. Mater. Chem., 7 (1997) 1801
12.R. Müller and W. Schüppel, J. Magn. Magn. Mater., 155 (1996) 110 13.M. Pal, P. Brahma, D. Chakravorty, D. Bhattacharyya, H. S. Maiti,
Nanostructured Materials 8, (1997) 731 14.G. J. Chen, L. Y. Jian, Y. S. Chang, C. Y. Chung and Y. L. Chai, J..Cryst.
Growth, 277 (2005), 457
15.G. J. Chen, H. M. Lee, Y. S. Chang, Y. J. Lin, Y. L. Chai, J. Alloys Comp. 388 (2005) 297
16.D. D. Zaitsev, P. E. Kazin, Yu. D. Tret'yakov, Yu. V. Maksimov, I. P. Suzdalev and M. Jansen, Inorg. Mater. 40 (2004) 1111
17.A. Paul, R.W. Douglas, Phys. Chem. Glasses 6 (1965) 207. 18.H.V. Lauer Jr., R.V. Morris, J. Am. Ceram. Soc. 60 (1977)443. 19.G. Jeddeloh, Phys. Chem. Glasses 25 (1984) 163.
20.A. Paul, J. Non-Cryst. Solids 71 (1985) 269. 21.H.D. Schreiber, S.J. Kozak, R.C. Merkel, G.B. Balazs,P.W. Jones, J. Non-
Cryst. Solids 84 (1986) 186. 22.K. Takahashi, Y. Miura, J. Non-Cryst. Solids 80 (1986) 11. 23.A. Sasahira, T. Yokokawa, Electrochim. Acta 30 (1985)441.
24.M. Maric, M.P. Brungs, M. Skyllas-Kazacos, Phys. Chem.Glasses 30 (1989) 5.
25.C. Montel, C. Rüssel, E. Freude, Glastech. Ber. 61 (1988)59. 26.C. Rüssel, E. Freude, Glastech. Ber. 63 (1990) 149. 27.E. Freude, C. Rüssel, Glastech. Ber. 63 (1990) 193.
28.M. Zink, C. Rüssel, H. Müller-Simon, K.W. Mergler,Glastech. Ber. 65
(1992) 25.
29.C. Rüssel, Glastech. Ber. 66 (1993) 93.
30.R. Pascova, C. Rüssel, Glastech. Ber. Glass Sci. Technol.67C (1994) 93.
31.H. Müller-Simon, K.W. Mergler, Glastech. Ber. Glass Sci.Technol. 68
(1995) 273.
32.O. Claußen, C. Rüssel, Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100(1996) 1475; 69
(1996) 95.
33.C. Rüssel, Glastech. Ber. Glass Sci. Technol. 70 (1997) 17.
34.H. Khedim, R. Podor, C. Rapin and M. Vilasi, J. Am. Ceram. Soc. 91
(2008) 3571.
35.R. Harizanova, G. Volksch and C. Russel, J. Mater. Sci. 45 (2010) 1350.
58
36.R. Muller, J. Eur. Ceram. Soc. 19 (1999) 1547.
37.R. D. Rawlings, Glass-Ceramic Materials-Fundamentals and Applications
Series of Monographs on Material Science, Engineering and Technology,
Mucchi Editore, Modena, 1997, pp. 115-133.
38.R. A. Brand, Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B 28, (1987) 398
39.D.D. Zaitsev, S.E. Kushnir, P.E. Kazin, Yu. D. Tretyakov and M. Jansen, J.
Magn. Mag. Mater. 301, (2006) 489.
40.M. Bałanda, A. Wiecheć, D. Kim, Z. Kąkol, A. Kozłowski, P. Niedziela, J.
Sabolb, Z. Tarnawski, and J.M. Honig, Eur. Phys. J. B 43 (2005) 201
41.J. L. Dormann, D. Fiorani, and E. Tronc, J. Magn. Magn. Mater. 202 (1999)
251
42.W. F. Brown Jr., J. Appl. Phys. 39 (1968) 993
43.US patent 4 233 169
44.C. R. M. Grovenor, L. Goodsir, C. J. Salter, P. Kovac, and I. Husek,
Supercond. Sci. Technol. 20, (2004) 479
45.A. Snezhko, T. Prozorov, and R. Prozorov, Phys. Rev. B 71 (2005) 024527
46.F. Dumitrache, I. Morjan, R. Alexandrescu, R. E. Morjan, I. Voicu, I.
Sandu, I. Soare, M. Ploscaru, C. Fleaca, V. Ciupina, G. Prodan, B. Rand,
R. Brydson, and A. Woodword, Diamond & Rel. Mater. 13, 362 (2004)
47.D.-X. Chen, J. Nogues, and K. V. Rao, Cryogenics 29, 800 (1989)
48.M. Bosnes, D. Arne, A. Rian, L. Korsnes, F. Larsen, "Magnetic separation
in molecular biology, Scientific and clinical application of magnetic
carriers, Plenum Press, New York, 269-85 (1997).
49.J. Oster, J. Parker, L. A. Brassard, J. Magn. Mag. Mater. 225, (2000) 145.
50.A. Elaissari, M. Rodrigue, F. Meunier, C. Herve, J. Magn. Mag. Mater. 225
(2001) 127.
51.Ugur Tamer, Y. Gundogdu, I. Hakkı Boyacı, K. Pekmez, J. Nanopart. Res.
12 (2010) 1187.
52.W.S. Seo, J.H. Lee, X.M. Sun, Y. Suzuki, D. Mann, Z. Liu, M. Terashima,
P.C. Yang, M.V. Mcconnell, D.G. Niohimura, H.J. Dai, Nat. Mater 5 (2006)
971.
53.J.H. Lee, Y.M. Huh, Y.W. Jun, J.W. Seo, J.T. Jang, H.T. Song et al),. Nat
Med 13 (2007) 95.
54.C. Chouly, D. Pouliquen, I. Lucet, J.J. Jeune, P. Jallet J Microencapsul 13
(1996) 245.
55.G. Storm, S.O. Belliot, T. Daemen, D.D. Lasic Adv Drug Deliv Rev 17
(1995) 31.
56.Y. Zhang, N. Kohler, M.Q. Zhang Biomaterials 23 (2002) 1553–1561.
57.M. Yamazaki, M. Ito Biochemistry 29 (1990) 1309.
58.K.J. Widder, A.E. Senge, D.F. Ranney, Cancer. Res. 40 (1980) 3512.
59
59.K. Subramani, H. Hosseinkhani, A. Khraisat, M. Hosseinkhani, Y. Pathak,
Curr Nanosci 5 (2009) 134.
60.H. Xu, L. Cui, N. Tong, H. Gu, J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 15582.
61.F.C. Meldrum, B.R. Heywood, S. Mann, Science 257(5069) (1992)522
62.T. Tanaka, T. Matsunaya Anal Chem 72 (2000) 3518.
63.A.K. Gupta, M. Gupta Biomaterials 26 (2005) 3995.
64.L.O. Brown, J.E. Hutchison, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 12384
65.L.O. Brown, J.E. Hutchison, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 882.
66.M.G. Warner, S.M. Reed, J.E. Hutchison, Chem Mater 12 (2000) 3316.
67.W.W. Weare, S.M. Reed, M.G. Warner, J.E. Hutchison, J. Am. Chem. Soc.
122 (2000) 12890
68.T. Yonezawa, K. Yasui, N. Kimizuka, Langmuir 17 (2001) 271.
69.M.Q. Zhao, L. Sun, R.M. Crooks, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 4877.
70.J. Jeong, T.H. Ha, B.H. Chung, Anal. Chim. Acta. 569 (2006) 203.
71.A.T. Heitsch, D.K. Smith, R.N. Patel, D. Ress, B.A. Korgel, J. Solid State
Chem. 181 (2008) 1590.
72.Takuya Kinoshitaa, S. Seinoa, Y. Mizukoshib, T. Nakagawaa, T. A.
Yamamotoa, J. Magn. Mag. Mater. 311 (2007) 255–258.
73.A. Taylor, Y. Krupskaya, S. Costa, S. Oswald, K. Krämer, S. Füssel, R.
Klingeler, B. Büchner, E. Borowiak-Palen, M. P. Wirth, J. Nanopart. Res.
12 (2010) 513
74.S.K. Lim, K.J. Chung, Y-H. Kim, C.K. Kim, C.S. Yoon, J. Colloid. Interface
Sci. 273 (2004) 517.
75.A-H. Lu, E.L. Salabas, F. Schüth, Angew. Chem. Int. Ed. 46 (2007)1222.
76.B. Ando, A. Ascia, S. Baglio, N. Pitrone, Development of novel ferrofluidic
pumps. In: Engineering in Medicine and Biology Society EMBS 2006. 28th
Annual International Conference of the IEEE, pp 2828–2831.
77.C.T. Yavuz, J.T. Mayo, W.W. Yu, A. Prakash, J.C. Falkner, S. Yean, L.
Cong, H.J. Shipley, A. Kan, M. Tomson, D. Natelson, V.L. Colvin, Science
314 (2006) 964.
78.V.I. Shubayev, T.R. Pisanic, S. Jin, Adv. Drug. Deliv. Rev. 61 (2009) 467.
79.V. Balan, Teza de Doctorat-“Micro si nanoparticule magnetice
functionalizate cu aplicatii in detoxifierea sangelui”, Vera Balan -2011).
80.V. Bălan, A. M.Vasi, M. Butnaru, V. Badescu, M. I. Popa, L. Verestiuc, 4th
International Conference Biomaterials, Tissue Engineering and Medical
Devices, ISSN 2069-0193, Sinaia, Romania, 23-25 Septembrie 2010.
81.L. Tcacenco, I. Lupescu, E.-D. Teodor, D. Pomponiu, Brevet de inventie
RO 122364 B1; „Procedeu de imobilizare a tripsinei pe suport
biopolimeric”
82.H.H Weetall, Appl. Biochem. Biotechnol. 41 (1993) 157.
83.R. A. Sheldon, Enzyme Immobilization : The quest for optimum performance. Reviews, 2007.
60
84.A.E. David, Lucrare de dizertatie: Immobilization of enzymes on nanoporous silica compozites, 2004.
85.L. Tcacenco, I. Lupescu, C. Stan, E. Teodor, Brevet de invenţie RO 122194 B1 „Compozit vitroceramic si procedeu de imobilizare a acidului L-
aspartic si L-asparaginaza “ 86.R. Weissledel, A. Moure, U. Mahmood, R. Bhorade, M. Benveniste, E.
Chiocca et al., Nat. Med. 6 (2000) 351
87.W.L. Zhou, E.E. Carpenter, J. Lin, A. Kumbhar, J. Sims, C.J. O’Conner, Eur. Phys. J. D 16 (2001) 289.
88.U.O. Häfeli, G.J. Pauer, J. Magn. Magn. Mater. 194 (1999) 76. 89.M. Shinkai, J. Biosci. Bioeng. 94 (2002) 606. 90. S. Mornet, A. Vekris, J. Bonnet et al., Mater. Lett. 42 (2000) 183.
91.Q.A. Pankhurst, J. Connolly, S.K. Jones, et al., J. Phys. D 36 (2003) 167 92.M.C. Daniel, D. Astruc, Chem. Rev. 104 (2004) 293.
93.K. Sato, K. Hosokawa, M. Maeda, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003), 8102. 94.R.G. Nuzzo, D.L. Allara, J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) 4481. 95.C.A. Mirkin, R.L. Letsinger, R.C. Mucic et al., Nature 382 (1996) 607
96.S. Seino, T. Kinoshita, Y. Otome, et al., Chem. Lett. 32 (2003) 690. 97.Y. Mizukoshi . S. Seino, K. Okitsu, et al, Ultrason. Sonochem.12 (2005)
191 98.D.L. Graham, H.A. Ferreira, P.P. Freitas, Angrew Chem. Int. Ed. 46 (2004)
4909 99.T. Yoshino, H. Hirabe, M. Takahashi, M. Kuhara, H. Takeyama, T.
Matsunaga, Magnetic Cell Separation Using Nano-Sized, Bacterial
Magnetic Particles With Reconstructed Magnetosome Membrane, Biotechnology Bioengineering, 2008.
100. M. Cobbold, N. Khan, B. Pourgheysari, S. Tauro, D. McDonald, H. Osman, M. Assenmacher, L. Billingham, C. Steward, C. Crawley et al.. J. Exp. Med. 202 (2005) 379.
101. Z. Dembic, J.A. Rottingen, J. Dellacasagrande, K. Schenck, B. Bogen, Blood 97 (2001) 2808
102. M. Kuhara, H. Takeyama, T. Tanaka, T. Matsunaga, Anal. Chem. 76 (2004) 6207
103. S. Yean, L. Cong, C.T. Yavuz, J.T. Mayo, A.T. Kam, V.L. Colvin, M.B.
Tomson, Magnetite Nanoparticles as Adsorbents for Arsenic Removal and Magnetic Separation
104. Y. Wang, F. Caruso, Chem. Commun. 2004, 1528 – 1529
Diseminare
1. V. Sandu, M. S. Nicolescu, V. Kuncser, S. Popa, I. Pasuk, C. Ghica, E. Sandu,
Structure and Magnetic Properties of Nanosized Magnetite Obtained by Glass Recrystallization, Journal of Nanoscience and Nanothechnology (accepted)
2. V. Sandu, E. Cimpoiasu, G. Aldica, S. Popa, E. Sandu, N. Hurduc, and I. Nor,
Fabrication and Superconducting Properties of MgB2 Doped with Polysiloxane
61
Based Copolymers, IEEE transactions on Applied Superconductivity, vol. 21, issue 3(3), 2631-2634 2011
3. V. Sandu, G. Aldica, S. Popa, P. Badica, E. Cimpoiasu, F. Dumitrache, E. Sandu, Transport Properties of Superconducting MgB2 Composites with Carbon-
Encapsulated Fe Nanospheres, acceptat la J. Applied Physics 4. V. Sandu and I. Ivan On the scaling of pinning force in ceramic MgB2 acceptat la
J. Physics: Conf. Series
5. E. Berteanu, V. Sandu, S.M. Nicolescu, M.I. Enache, A.L. Zuav, L. Tcacenco, The study of some enzymes immobilization on magnetic nanoparticles” International
Journal of Nano and Biomaterials (in curs de redactare). 6. V. Sandu, M.S. Nicolescu, S. Popa, V. Kuncser, N. Aldea, E. Sandu Effect of P2O5
on the Growth of Nanosized Magnetite in a Glassy Matrix, prezentata la
International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT) – Singapore, 26th June/1st July 2011
7. V. Sandu, M. S. Nicolescu, V. Kuncser, I. Ivan, E. Sandu, Magnetite in glassy Matrix, The 18th International Conference on Compozite Materials (ICCM18) August 21-26, 2011, Jeju Island, Korea
8. V. Sandu, Advanced Superconducting Ceramics by Spark Plasma Sintering, IUPAC 7th International Conference on Novel Materials and Synthesis (NMS-VII)
& 21st International Symposium on Fine Chemistry and Functional Polymers (FCFP-XXI) in Shanghai, China on 16th~21st October
9. E. Berteanu, V. Sandu, S. M. Nicolescu, L. Tcacenco, Studiul imobilizarii lipazelor pe nanoparticole magnetice, Simpozionului Naţional cu Participare Internaţională - PRIORITĂŢILE CHIMIEI PENTRU O DEZVOLTARE DURABILĂ
PRIOCHEM, ediţia a VII-a, 27-28 octombrie 2011, Bucureşti 10.F.Tolea, M. Tolea, M. Sofronie, A.D.Crisan, A. Birsan, M.Valeanu, Influence of
thermal treatments on the martensite-austenite transformation in Ni-Fe-Co-Ga
melt-spun ribbons, First Central and Eastern European Conference on Thermal
Analysis and Calorimetry (CEEC-TAC1) Craiova, Romania 7th to the 10th of
September 2011
Date despre conferintele la care s-a participat:
1. International Conference on Materials for Advanced Technologies or ICMAT
(ICMAT) – Singapore, 26th June/1st July 2011.
Lucrare prezentata:V. Sandu, M.S. Nicolescu, S. Popa, V. Kuncser, N. Aldea, E. Sandu Effect of P2O5 on the Growth of Nanosized Magnetite in a Glassy Matrix.
Conferinta a avut urmatoarele sectiuni:Nanoscience and technology
(Nanostructured Oxides, Interfaces, Heterostructures and Devices, Synthesis and Architecture of Nanomaterials, Graphene: Calling all Chemists; Toxicology of Engineered Nanomaterials; NEMS/MEMS and microTAS; Nanodevices and
Nanofabrication; Semiconductor Nanowires and Heterostructures: Synthesis, Properties and Multifunctions; Nanoscale Patterning, Assembly, and Surface
Modification; Nanotechnology with Soft Matter; Memory, Nanomagnetics, Materials and Devices); Energy and the environment (Nanonets and Nanomaterials for
62
Energy Harnessing and Storage; Advanced Materials for Energy Storage Systems - From Fundamentals to Applications; Photovoltaic Materials and Devices; Membrane Materials and Technologies for Emerging Applications); Functional materials
(Interfacial Chemistry and Engineering and Their Applications for Molecular and Organic Electronics; Organic, Flexible, and Printed Electronics; Metamaterials;
Advanced Structural and Functional Materials for Protection; Compozites and Nanocompozites; 3D TSV Process and Design Challenges; Reliability and Variability of Emerging Devices for Future Technologies and ULSI Circuits and Systems);
Bio/soft materials (Advanced Biomaterials for Delivery of Therapeutics; Biomaterials and Tissue Engineering; Sustainable Biobased Polymers); Imaging
(Frontiers in Optical Bio-imaging and Microscopy; Nanoscale Imaging, Fabrication and Materials Modification Using Ion Beams; Nanophotonics and Imaging); Crystal growth and crystal technology
La aceasta conferinta am fost contactati de Prof. Liangliang Li de la departamentul
de Stiinta Materialelor si inginerie al Universitatii Tsinghua din Beijing care s-a arata
interesat de o colaborare in domeniul nanostructurilor magnetice pe baza de
magnetita.
2. The 26th International conference on Low Temperature Physics. A fost tinuta in
Beijing, China, 10-17 August 2011.
Lucrare prezentata: V. Sandu and I. Ivan On the scaling of pinning force in ceramic
MgB2 acceptat la J. Physics: Conf. Series Conferinta a avut 5 linii directoare : A. Quantum Gases, Fluids and Solids; B.
Superconductivity; C. Magnetism and Quantum Phases; D. Electronic Quantum
Transport in Condensed Matter; and E. Cryogenic Techniques and Applications.
La aceasta conferinta am fost contactati de Dr. Alexei Suslov de la Florida State
University care ne-a solicitat probe pentru masuratori la de absorbtie de ultrasunete
in campuri magnetice intense la Talahassee.
3. 18th International Conference on Compozite Materials (ICCM18) August 21st- 26th
Jeju, Korea
Lucrare prezentata: V. Sandu, M. S. Nicolescu, V. Kuncser, I. Ivan, E. Sandu,
Magnetite in glassy matrix, Conferinta a avut cu urmatoarele obiective: Active and Passive Health Monitoring;
Applications of Composites, Bio-inspired Composzites; Biomedical Compozites;
Carbon and Ceramic Matrix Composites; Damage and Fracture; Durability and
Aging; Emerging NDE Technology and Reliability Issues; Energy Technology
Applications; Environmental Awareness and Life Cycle Analysis; Experimental
Techniques; Fibres, Matrices and Interfaces; General Industrial Applications; Green
Compozites; Health Monitoring; Impact and Dynamic Response; Information
Technology Applications; Infrastructure; Interlaminar reinforcements; Joints and
Bearing Behavior; Life Cycle Analysis and Sustainability; Low Cost Technologies;
Mechanical and Physical Properties; Metal Matrix Composites; Multi-functional
63
Composites; Nanocomposites; NDE Technologies.
La aceasta conferinta si-a manifestat interesul pentru probele de magnetita Prof. .
Hyungsun Kim de la Inha University din incheon seul, corea. Urmand sa stabilim o
modalitate de colaborere.
3. IUPAC 7th International Conference on Novel Materials and Synthesis (NMS-VII)
& 21st International Symposium on Fine Chemistry and Functional Polymers (FCFP-
XXI), Shanghai, China on 16th~21st October, 2011 Topics: biomaterials, functional
polymers, energy storage and conversion materials, nano materials, ceramic
materials, metallic materials, other novel materials and application of neutron
scattering.
Lucrare prezentata V. Sandu, Advanced Superconducting Ceramics by Spark Plasma
Sintering,
4. First Central and Eastern European Conference on Thermal Analysis and
Calorimetry (CEEC-TAC1) Craiova, Romania 7th to the 10th of September 2011
Lucrare prezentata: F.Tolea, M. Tolea, M. Sofronie, A.D.Crisan, A. Birsan,
M.Valeanu, Influence of thermal treatments on the martensite-austenite
transformation in Ni-Fe-Co-Ga melt-spun ribbons.
Topics: Kinetics and catalysis; Thermophysical properties and thermal reactivity of
solids. Nanomaterials; Metals, alloys, intermetallics & high temperature materials;
Thermally stimulated processes in ceramics; from electroceramics & magnetic
materials to thermoelectrics; Functional soft inorganic, organic and macromolecular
materials (polymers, complex precursors, dyes, textiles, etc.); Thermal
investigation of thin films and other minute materials; Thermochemistry and
calorimetry; Thermodynamics of biomolecules; from stability to interactions;
Metastability in polymers; Combustion, fuels & biofuels. Alternative sources for
energy; Materials for energy conversion and storage; Energetic materials, thermal
hazards & fire safety; Advanced materials processing and applied thermal
engineering; Composites in extreme conditions and environments; Instrumentation
and theory; coupled, complementary and alternative techniques: sample controlled
thermal analysis, microcalorimetry, emanation thermal analysis, nanoTA, PulseTA,
laser pyrolysis, thermochromatography, etc.; Thermal analysis and calorimetry in
life sciences, natural products, fertilizers, soil science, geosciences, pharmaceutics,
forensics and arts.
5. Simpozionului Naţional cu Participare Internaţională - PRIORITĂŢILE CHIMIEI PENTRU O DEZVOLTARE DURABILĂ PRIOCHEM, ediţia a VII-a, 27-28 octombrie 2011, Bucureşti
Lucrare prezentata: E. Berteanu, V. Sandu, S. M. Nicolescu, L. Tcacenco, Studiul imobilizarii lipazelor pe nanoparticole magnetice,